CN106795545A - 用于生物缀合物产生的修饰宿主细胞和杂合寡糖 - Google Patents

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Abstract

本文提供能够产生杂合寡糖和多糖的宿主细胞，其中所述杂合寡糖和多糖在其第一重复单元的还原末端不包含己糖。本文还提供可由本文所述的宿主细胞产生的杂合寡糖或多糖和生物缀合物，其中所述生物缀合物包含与杂合寡糖或多糖连接的载体蛋白，所述杂合寡糖或多糖在其第一重复单元的还原末端不包含己糖。

Description

用于生物缀合物产生的修饰宿主细胞和杂合寡糖
1-引言
本文提供能够产生杂合寡糖和多糖的宿主细胞，其中所述杂合寡糖和多糖在其第一重复单元的还原末端不包含己糖。本文还提供可由本文所述的宿主细胞产生的杂合寡糖和多糖和生物缀合物，其中所述生物缀合物包含与杂合寡糖或多糖连接的载体蛋白，所述杂合寡糖或多糖在其第一重复单元的还原末端不包含己糖。
2-背景
糖基化是将碳水化合物分子或糖(单糖、二糖、寡糖或多糖)连接至蛋白或多肽中的不同氨基酸残基的侧链以产生糖蛋白的过程。
N-连接的蛋白糖基化(N-糖基化)--发生在真核生物内质网中的最常见的翻译后修饰类型--是将碳水化合物分子添加至靶蛋白的多肽链中的天冬酰胺残基的过程。该过程通过酶促的寡糖基转移酶复合体(OST)完成，所述寡糖基转移酶复合体(OST)在内质网中负责将来自脂质载体(磷酸多萜醇)的预装配寡糖转移至新生蛋白保守序列Asn-X-Ser/Thr(其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸)内的天冬酰胺残基。随后糖链在高尔基体中经历其他修饰。本质上，N-连接的糖基化出现在真核生物和古细菌中，但是在细菌中罕见。
O-连接的糖基化是在真核生物、古细菌和细菌中出现的糖基化形式。其由将糖分子连接至蛋白靶标中的氨基酸残基中的氧原子组成。
宿主细胞产生包含与碳水化合物分子或糖连接(例如N-连接)的载体蛋白的生物缀合物的用途是本领域已知的。然而，尽管使用原核宿主细胞产生生物缀合物的进展，仍然需要在宿主细胞中生物缀合物产生的改进方法。
3-发明概述
本领域已知，来自空肠弯曲杆菌(PglB)的寡糖基转移酶对在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖的聚糖(寡糖或多糖)具有低亲和力(Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 May2;103(18):7088-93)。因此，宿主细胞***产生生物缀合物的用途通常限于产生由与寡糖或多糖连接的载体蛋白构成的生物缀合物，所述寡糖或多糖在第一重复单元的还原末端不包含己糖单糖。然而，因为许多细菌寡糖/多糖抗原在第一重复单元的还原末端含有己糖单糖(例如葡萄糖)，本领域已知的宿主细胞生物缀合物产生***不足以产生包含此类寡糖/多糖抗原的生物缀合物。
本申请的发明人已经鉴定了修饰宿主细胞的新型方法，其使得宿主细胞能够产生衍生自供体寡糖或多糖的杂合寡糖或多糖。供体寡糖或多糖是在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖(例如葡萄糖)的那些寡糖或多糖，而杂合寡糖或多糖在第一重复单元的还原末端不包含己糖，而是包含己糖单糖衍生物。此类己糖单糖衍生物是PglB的适当底物，因此在适当的宿主细胞背景中可以与载体蛋白连接，以产生生物缀合物，其可用于例如治疗细菌性疾病/感染和/或针对细菌性疾病/感染接种疫苗。重要的是，本申请的发明人已令人惊讶地发现，由于聚合酶(wzy)和翻转酶(wzx)酶的松弛特异性，可以在包含异源糖基化机制(例如，翻转酶，聚合酶)的宿主细胞中完成本文所述的杂合寡糖和多糖的转位和聚合。总之，本文所述的发现允许产生能够产生高产量的生物缀合物的修饰的宿主细胞，所述生物缀合物在本发明人的发现之前不能以高产量生产。
本发明由下面呈现的实施方案进行概述。
实施方案1：原核宿主细胞，其包含：
a) 编码产生寡糖或多糖重复单元的糖基转移酶的核酸，其中所述重复单元在还原末端不包含己糖，且其中所述寡糖或多糖重复单元衍生自在还原末端包含己糖的供体寡糖或多糖重复单元；
b) 编码包含N-糖基化共有序列的载体蛋白的核酸；和
c) 编码寡糖基转移酶的核酸。
实施方案2：原核宿主细胞，其包含：
a) 编码产生寡糖或多糖重复单元的糖基转移酶的核酸，其中所述重复单元在还原末端不包含己糖，且其中所述寡糖或多糖重复单元衍生自在还原末端包含己糖的供体寡糖或多糖重复单元；
b) 编码包含N-糖基化共有序列的载体蛋白的核酸；
c) 编码寡糖基转移酶的核酸；和
d) 编码聚合酶(wzy)的核酸，其中所述聚合酶催化杂合寡糖或多糖的产生，其中所述杂合寡糖或多糖(i)在所述第一重复单元的还原末端包含己糖单糖衍生物，且(ii)在所有其他重复单元的还原末端包含己糖单糖。
实施方案3：实施方案1或2的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含足以合成所述供体寡糖或多糖重复单元的糖基转移酶。
实施方案4：实施方案3的宿主细胞，其中所述足以合成所述供体寡糖或多糖重复单元的糖基转移酶作为操纵子或基因簇或其部分存在于所述宿主细胞中。
实施方案5：实施方案1-4中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够产生杂合寡糖或多糖，其中所述杂合寡糖或多糖与所述供体寡糖或多糖相同，除了所述杂合寡糖或多糖在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖衍生物，代替通常存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖。
实施方案6：实施方案1-4中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够产生杂合寡糖或多糖，其中所述杂合寡糖或多糖与所述供体寡糖或多糖相同，除了以下事实：所述杂合寡糖或多糖，除了包含所述供体寡糖或多糖的所有单糖之外，在第一重复单元的还原末端还包含己糖单糖衍生物。
实施方案7：实施方案1-4中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含(i)将己糖单糖衍生物组装至焦磷酸十一异戊烯基酯(UND-PP)上的糖基转移酶和(ii)能够将单糖添加至组装在UND-PP上的己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶。
实施方案8：实施方案7的宿主细胞，其中所述己糖单糖衍生物是其C-2位被乙酰氨基修饰的任何单糖，诸如N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧己糖(DATDH)、N-乙酰岩藻糖胺(FucNAc)、N-乙酰异鼠李糖胺(QuiNAc)；或实施方案7的宿主细胞，其中所述己糖单糖衍生物为N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。
实施方案9：实施方案7或8的宿主细胞，其中所述将己糖单糖衍生物组装至UND-PP上的糖基转移酶与宿主细胞异源和/或与催化所述供体寡糖重复单元的基因异源。
实施方案10：实施方案7-9中任一项的宿主细胞，其中所述将己糖单糖衍生物组装至UND-PP上的糖基转移酶来自埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。
实施方案11：实施方案7-10中任一项的宿主细胞，其中所述将己糖单糖衍生物组装至UND-PP上的糖基转移酶是wecA。
实施方案12：实施方案11的宿主细胞，其中所述wecA来自大肠杆菌。
实施方案13：实施方案7-12中任一项的宿主细胞，其中所述己糖单糖是半乳糖(Gal)。
实施方案14：实施方案7-13中任一项的宿主细胞，其中所述能够将单糖添加至所述己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶是来自鲍氏志贺氏菌(Shigella boyedii)的半乳糖基转移酶(wfeD)。
实施方案15：实施方案7-13中任一项的宿主细胞，其中所述能够将单糖添加至所述己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶是来自大肠杆菌O28的半乳糖呋喃糖基转移酶(WbeY)。
实施方案16：实施方案7-13中任一项的宿主细胞，其中所述能够将单糖添加至所述己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶是来自大肠杆菌O167的半乳糖呋喃糖基转移酶(WfdK)。
实施方案17：实施方案7-13中任一项的宿主细胞，其中所述能够将单糖添加至所述己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶是来自大肠杆菌O28的半乳糖呋喃糖基转移酶(WbeY)和来自大肠杆菌O167的半乳糖呋喃糖基转移酶(WfdK)。
实施方案18：实施方案3、4或6-17中任一项的宿主细胞，其中所述足以合成所述供体寡糖或多糖的重复单元的糖基转移酶包含来自肺炎链球菌CP14的WchL(N-乙酰葡糖胺转移酶)和WchM(半乳糖基转移酶)。
实施方案19：实施方案18的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够产生杂合寡糖或多糖，其中所述杂合寡糖或多糖与肺炎链球菌CP14相同，除了以下事实：所述杂合寡糖或多糖在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖衍生物，代替通常存在于肺炎链球菌CP14的第一重复单元的还原末端的己糖单糖。
实施方案20：实施方案3、4或6-17中任一项的宿主细胞，其中所述足以合成所述供体寡糖或多糖的重复单元的糖基转移酶包含来自肺炎链球菌CP33F的WciB、WciC、WciD、WciE和WciF。
实施方案21：实施方案20的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够产生杂合寡糖或多糖，其中所述杂合寡糖或多糖与肺炎链球菌CP33F相同，除了以下事实：所述杂合寡糖或多糖在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖衍生物，代替通常存在于肺炎链球菌CP33F的第一重复单元的还原末端的己糖单糖。
实施方案22：实施方案1-4中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含(i)将己糖单糖衍生物组装至焦磷酸十一异戊烯基酯(UND-PP)上的糖基转移酶和(ii)将供体寡糖或多糖重复单元组装至己糖单糖衍生物上的糖基转移酶。
实施方案23：实施方案22的宿主细胞，其中所述己糖单糖衍生物为N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)；或者所述己糖单糖衍生物是其C-2位被乙酰氨基修饰的任何单糖，诸如N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧己糖(DATDH)、N-乙酰岩藻糖胺(FucNAc)、N-乙酰异鼠李糖胺(QuiNAc)。
实施方案24：实施方案22或23的宿主细胞，其中所述将己糖单糖衍生物组装至UND-PP上的糖基转移酶与所述宿主细胞异源。
实施方案25：实施方案22-24中任一项的宿主细胞，其中所述将己糖单糖衍生物组装至UND-PP上的糖基转移酶来自埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。
实施方案26：实施方案22-25中任一项的宿主细胞，其中所述将己糖单糖衍生物组装至UND-PP上的糖基转移酶是wecA。
实施方案27：实施方案26的宿主细胞，其中所述wecA来自大肠杆菌。
实施方案28：实施方案22-27中任一项的宿主细胞，其中所述将供体寡糖或多糖重复单元组装至己糖单糖衍生物上的糖基转移酶包含能够将存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖添加至与磷酸十一异戊烯基酯连接的己糖单糖衍生物的糖基转移酶。
实施方案29：实施方案28的宿主细胞，其中所述能够将存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的所述己糖单糖添加至与磷酸十一异戊烯基酯连接的单糖的糖基转移酶是葡糖基转移酶诸如WciQ、WfaM、WfaP、WeiL、WelO、WffJ、WfgD、WbdN、WcmM。
实施方案30：实施方案29的宿主细胞，其中所述葡糖基转移酶是来自大肠杆菌O21的WciQ、来自大肠杆菌O24的WfaM、来自大肠杆菌O56的WfaP、来自大肠杆菌O61的WeiL、来自大肠杆菌O102的WelO、来自大肠杆菌O130的WffJ、来自大肠杆菌O152的WfgD、来自大肠杆菌O157的WbdN和来自大肠杆菌O173的WcmM。
实施方案31：实施方案28-30中任一项的宿主细胞，其中所述将供体寡糖或多糖重复单元组装至己糖单糖衍生物上的糖基转移酶包含能够将邻近于存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖的单糖添加至存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖的糖基转移酶。
实施方案32：实施方案31的宿主细胞，其中所述能够将邻近于存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖的单糖添加至存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖的糖基转移酶是葡糖基转移酶(诸如WciP或wciQ)。
实施方案33：实施方案32的宿主细胞，葡糖基转移酶是来自大肠杆菌O21的wciQ或来自大肠杆菌O21的半乳糖基转移酶WciQ。
实施方案34：实施方案32-33中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞进一步包含能够修饰单糖的酶。
实施方案35：实施方案34的宿主细胞，其中酶是差向异构酶或消旋酶。
实施方案36：实施方案35的宿主细胞，其中所述差向异构酶来自埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。
实施方案37：实施方案36的宿主细胞，其中所述差向异构酶来自大肠杆菌。
实施方案38：实施方案37的宿主细胞，其中所述差向异构酶是来自大肠杆菌O157的Z3206。
实施方案39：实施方案22-38中任一项的宿主细胞，其中所述足以合成所述供体寡糖或多糖的重复单元的糖基转移酶包含来自肺炎链球菌CP14的wchL和wchM。
实施方案40：实施方案39的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够产生杂合寡糖或多糖，其中所述杂合寡糖或多糖与肺炎链球菌CP14相同，除了以下事实：所述杂合寡糖或多糖，除了包含肺炎链球菌CP14的所有单糖残基之外，在第一重复单元的还原末端还包含己糖单糖衍生物。
实施方案41：实施方案1-40中任一项的宿主细胞，其中所述非己糖单糖或所述己糖单糖衍生物是在位置2包含乙酰氨基的单糖。
实施方案42：实施方案41的宿主细胞，其中所述非己糖单糖或所述己糖单糖衍生物为GlcNAc、HexNAc、脱氧HexNAc、FucNAc、GalNAc、QuiNAc、ManNAc或2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧己糖。
实施方案43：实施方案1-42中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码荚膜多糖聚合酶(wzy)或O抗原聚合酶(wzy)的核酸。
实施方案44：实施方案43的宿主细胞，其中所述聚合酶与所述宿主细胞异源，和/或所述聚合酶与编码用于合成供体寡糖或多糖重复单元的酶的基因簇异源。
实施方案45：实施方案43-44的宿主细胞，其中所述聚合酶来自埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。
实施方案46：实施方案45的宿主细胞，其中所述聚合酶来自肺炎链球菌。
实施方案47：实施方案46的宿主细胞，其中所述聚合酶来自肺炎链球菌 CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A和B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15(A、B、C、F)、CP16(A、F)、CP17(A、F)、CP18(A、B、C、F)、CP19(A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22(A、F)、CP23(A、B、F)、CP24(A、B、F)、CP25(A、F)、CP26、CP27、CP28(A、F)、CP29、CP31、CP32(A、F)、CP33(A、B、C、D、F)、CP34、CP35(A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41(A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47(A、F)或CP48。
实施方案48：实施方案1-47中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码翻转酶(wzx)的核酸。
实施方案49：实施方案48的宿主细胞，其中所述翻转酶与所述宿主细胞异源，和/或所述翻转酶与编码用于合成供体寡糖或多糖重复单元的酶的基因簇异源。
实施方案50：实施方案48-49的宿主细胞，其中所述翻转酶来自埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。
实施方案51：实施方案50的宿主细胞，其中所述翻转酶来自肺炎链球菌。
实施方案52：实施方案51的宿主细胞，其中所述翻转酶来自肺炎链球菌 CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A和B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15(A、B、C、F)、CP16(A、F)、CP17(A、F)、CP18(A、B、C、F)、CP19(A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22(A、F)、CP23(A、B、F)、CP24(A、B、F)、CP25(A、F)、CP26、CP27、CP28(A、F)、CP29、CP31、CP32(A、F)、CP33(A、B、C、D、F)、CP34、CP35(A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41(A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47(A、F)或CP48。
实施方案53：实施方案1-52中任一项的宿主细胞，其中所述寡糖或多糖来自埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。
实施方案54：实施方案1-53中任一项的宿主细胞，其中所述多糖是荚膜多糖(CP)。
实施方案55：实施方案54的宿主细胞，其中所述荚膜多糖来自肺炎链球菌。
实施方案56：实施方案45的宿主细胞，其中所述肺炎链球菌荚膜多糖是CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A、B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15 (A、B、C、F)、CP16 (A、F)、CP17 (A、F)、CP18 (A、B、C、F)、CP19 (A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22 (A、F)、CP23 (A、B、F)、CP24 (A、B、F)、CP25 (A、F)、CP 26、CP27、CP28 (A、F)、CP29、CP31、CP32 (A、F)、CP33 (A、B、C、D、F)、CP34、CP35 (A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41 (A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47(A、F)或CP48。
实施方案57：实施方案56的宿主细胞，其中所述肺炎链球菌荚膜多糖是CP8、CP15A、CP16F、CP22F、CP23A、CP24F、CP31、CP33F、CP35B或CP38。
实施方案58：实施方案56的宿主细胞，其中所述肺炎链球菌荚膜多糖是CP14。
实施方案59：实施方案56的宿主细胞，其中所述肺炎链球菌荚膜多糖是CP33F。
实施方案60：实施方案54的宿主细胞，其中所述荚膜多糖来自金黄色葡萄球菌。
实施方案61：实施方案60的宿主细胞，其中所述金黄色葡萄球菌荚膜多糖是CP5或CP8。
实施方案62：实施方案54的宿主细胞，其中所述荚膜多糖来自无乳链球菌(GBS)。
实施方案63：实施方案62的宿主细胞，其中所述无乳链球菌荚膜多糖是无乳链球菌(组B，GBS) CPIa、CPIb、CPII、CPIII、CPIV、CPV、CPVI、CPVII或CPVIII。
实施方案64：实施方案54的宿主细胞，其中所述荚膜多糖来自粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。
实施方案65：实施方案64的宿主细胞，其中所述粪肠球菌荚膜多糖是CPA、CPB、CPC或CPD。
实施方案66：实施方案1-65的宿主细胞，其中所述产生在第一重复单元的还原末端不包含己糖的寡糖或多糖的糖基转移酶中的至少一种与所述宿主细胞异源。
实施方案67：实施方案1-66的宿主细胞，其中所述载体蛋白与所述宿主细胞异源。
实施方案68：实施方案1-67中任一项的宿主细胞，其中所述寡糖基转移酶与所述宿主细胞异源。
实施方案69：实施方案1-65的宿主细胞，其中所述产生在第一重复单元的还原末端不包含己糖的寡糖或多糖的糖基转移酶、所述寡糖基转移酶和所述载体蛋白中的至少一种与所述宿主细胞异源。
实施方案70：实施方案1-69中任一项的宿主细胞，其中所述寡糖基转移酶来自空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)。
实施方案71：实施方案70的宿主细胞，其中所述寡糖基转移酶是空肠弯曲杆菌的pglB基因。
实施方案72：实施方案71的宿主细胞，其中所述空肠弯曲杆菌的pglB基因被整合至宿主细胞基因组中。
实施方案73：实施方案1-72中任一项的宿主细胞，其中所述寡糖基转移酶衍生自真核生物或古细菌生物。
实施方案74：实施方案3-73中任一项的宿主细胞，其中所述足以合成所述供体寡糖或多糖的重复单元的糖基转移酶被整合至宿主细胞基因组中。
实施方案75：实施方案1-74中任一项的宿主细胞，其中所述载体蛋白是脱毒的绿脓假单胞菌外毒素A(EPA)、CRM197、麦芽糖结合蛋白(MBP)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌的溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚基(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌Sat蛋白、大肠杆菌Sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌多组氨酸三联蛋白D(PhtD)、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素和其脱毒变体(dPly)、空肠弯曲杆菌AcrA、空肠弯曲杆菌天然糖蛋白、PcrV(又名LcrV、EspA、SseB)、PopB (YopB、YopD、FliC)或OprF、OprI。
实施方案76：实施方案1-75中任一项的宿主细胞，其中宿主细胞的至少一种基因已被功能失活或缺失。
实施方案77：实施方案76的宿主细胞，其中宿主细胞的waaL基因已被功能失活或缺失。
实施方案78：实施方案77的宿主细胞，其中宿主细胞的waaL基因已被编码寡糖基转移酶的核酸替代。
实施方案79：实施方案78的宿主细胞，其中宿主细胞的waaL基因已被空肠弯曲杆菌pglB替代。
实施方案80：实施方案1-79中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
实施方案81：实施方案1-80中任一项的宿主细胞，其中作为包含产生在第一重复单元的还原末端不包含己糖的寡糖或多糖的糖基转移酶的结果，与表型相同、但包含供体寡糖或多糖的宿主细胞相比，所述宿主细胞能够产生更高产量的生物缀合物，所述生物缀合物包含与寡糖或多糖N-连接的载体蛋白。
实施方案82：实施方案81的宿主细胞，其中与表型相同、但包含供体寡糖或多糖的宿主细胞相比，所述宿主细胞产生至少或约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%或500%更多的生物缀合物，其中所述生物缀合物包含与寡糖或多糖N-连接的载体蛋白。
实施方案83：实施方案81的宿主细胞，其中与表型相同、但包含供体寡糖或多糖的宿主细胞相比，所述宿主细胞产生至少或约5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的生物缀合物，其中所述生物缀合物包含与寡糖或多糖N-连接的载体蛋白。
实施方案84：产生生物缀合物的方法，所述生物缀合物包含与在第一重复单元的还原末端不包含己糖的寡糖或多糖N-连接的载体蛋白，所述方法包括(i)在适合于产生蛋白的条件下培养实施方案1-83中任一项的宿主细胞和(ii)分离所述生物缀合物。
实施方案85：通过实施方案84的方法产生的生物缀合物。
实施方案86：实施方案85的生物缀合物，其包含与荚膜多糖(CP)连接的载体蛋白。
实施方案87：实施方案86的生物缀合物，其中所述荚膜多糖来自肺炎链球菌。
实施方案88：实施方案87的生物缀合物，其中所述肺炎链球菌荚膜多糖是CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A、B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11(A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15 (A、B、C、F)、CP16 (A、F)、CP17 (A、F)、CP18(A、B、C、F)、CP19 (A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22 (A、F)、CP23 (A、B、F)、CP24 (A、B、F)、CP25(A、F)、CP 26、CP27、CP28 (A、F)、CP29、CP31、CP32 (A、F)、CP33 (A、B、C、D、F)、CP34、CP35(A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41 (A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47(A、F)或CP48。
实施方案89：实施方案88的生物缀合物，其中所述肺炎链球菌荚膜多糖是CP8、CP15A、CP16F、CP22F、CP23A、CP24F、CP31、CP33F、CP35B或CP38。
实施方案90：实施方案88的生物缀合物，其中所述肺炎链球菌荚膜多糖是CP14。
实施方案91：实施方案88的生物缀合物，其中所述肺炎链球菌荚膜多糖是CP33F。
实施方案92：实施方案86的生物缀合物，其中所述荚膜多糖来自金黄色葡萄球菌。
实施方案93：实施方案92的生物缀合物，其中所述金黄色葡萄球菌荚膜多糖是CP5或CP8。
实施方案94：实施方案86的生物缀合物，其中所述荚膜多糖来自无乳链球菌(GBS)。
实施方案95：实施方案94的生物缀合物，其中所述无乳链球菌荚膜多糖是无乳链球菌(组B，GBS) CPIa、CPIb、CPII、CPIII、CPIV、CPV、CPVI、CPVII或CPVIII。
实施方案96：实施方案86的生物缀合物，其中所述荚膜多糖来自粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。
实施方案97：实施方案96的生物缀合物，其中所述粪肠球菌荚膜多糖是CPA、CPB、CPC或CPD。
实施方案98：包含实施方案85-97中任一项的生物缀合物的组合物。
实施方案99：治疗或预防个体中的细菌感染的方法，其包括向个体施用实施方案98的组合物。
实施方案100：诱导个体中针对细菌菌株的免疫应答的方法，其包括向个体施用实施方案98的组合物。
实施方案101：实施方案99或100的方法，其中所述个体是人。
实施方案102：合成以下结构的寡糖或多糖的方法
(B)n—A→
其中A是在还原末端具有己糖单糖衍生物(通过箭头表示)的寡糖重复单元；
其中B是寡糖重复单元；
其中A和B是不同的寡糖重复单元；且
其中n为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或至少20；
所述方法包括：将A和B与多糖聚合酶孵育。
实施方案103：实施方案102的方法，其中所述接触步骤在体外进行。
实施方案104：实施方案102的方法，其中所述接触步骤在原核细胞中进行。
实施方案105：实施方案102的方法，其中所述接触步骤在原核细胞的周质中进行。
实施方案106：实施方案102的方法，其中所述多糖聚合酶是wzy多糖聚合酶。
实施方案107：实施方案102的方法，其中A在还原末端具有己糖单糖衍生物(通过箭头表示)，且B在还原末端具有己糖，且其中A和B在其他方面相同。
实施方案108：实施方案102至107中任一项的方法，其中所述非己糖单糖或所述己糖单糖衍生物为GlcNAc、GalNAc、FucNAc、QuiNAc、ManNAc、HexNAc、脱氧HexNAc或2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧己糖。
实施方案109：实施方案102的方法，其中A与B具有相同的结构，其中一个差别是A在还原末端具有额外单糖。
实施方案110：实施方案109的方法，其中所述额外单糖是己糖单糖衍生物。
实施方案111：实施方案109至110中任一项的方法，其中所述额外单糖是GlcNAc、HexNAc、脱氧HexNAc或2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧己糖。
实施方案112：实施方案102至111中任一项的方法，其中所述聚合酶来自埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。
实施方案113：实施方案102至111中任一项的方法，其中所述供体寡糖或多糖重复单元是肺炎链球菌荚膜多糖CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A、B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15 (A、B、C、F)、CP16 (A、F)、CP17 (A、F)、CP18 (A、B、C、F)、CP19 (A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22 (A、F)、CP23(A、B、F)、CP24 (A、B、F)、CP25 (A、F)、CP 26、CP27、CP28 (A、F)、CP29、CP31、CP32 (A、F)、CP33 (A、B、C、D、F)、CP34、CP35 (A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41 (A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47 (A、F)或CP48的重复单元。
实施方案114：药物组合物，其包含通过实施方案102至111中任一项的方法合成的寡糖或多糖。
实施方案115：包含与杂合寡糖或多糖N-连接的载体蛋白的生物缀合物，其中所述杂合寡糖或多糖与供体寡糖或多糖相同，除了以下事实：所述杂合寡糖或多糖，除了包含所述供体寡糖或多糖的所有单糖之外，在第一重复单元的还原末端还包含己糖单糖衍生物。
实施方案116：实施方案115的生物缀合物，其中所述己糖单糖衍生物是其中C-2位被乙酰氨基修饰的任何单糖，诸如N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧己糖(DATDH)、N-乙酰岩藻糖胺(FucNAc)或N-乙酰异鼠李糖胺(QuiNAc)。
实施方案117：实施方案116的生物缀合物，其中所述己糖单糖衍生物为N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。
实施方案118：实施方案115或116或117的生物缀合物，其中所述杂合寡糖或多糖与***荚膜糖相同，除了以下事实：所述杂合寡糖或多糖在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖衍生物，代替通常存在于所述***荚膜糖的第一重复的还原末端的己糖单糖。
实施方案119：实施方案118的生物缀合物，其中所述***荚膜糖是组A链球菌荚膜糖、组B链球菌荚膜糖、肺炎链球菌荚膜糖、肠球菌荚膜糖或金黄色葡萄球菌荚膜糖。
实施方案120：实施方案119的生物缀合物，其中所述***荚膜糖是肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、12A、12B、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、26、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35D、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F或48荚膜糖。
实施方案121：实施方案120的生物缀合物，其中所述***荚膜糖是肺炎链球菌血清型8、14、15A、16F、22F、23A、24F、31、33F、35B或38荚膜糖。
实施方案122：实施方案118的生物缀合物，其中所述***荚膜糖是金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜糖。
实施方案123：实施方案118的生物缀合物，其中所述***荚膜糖是无乳链球菌(组B链球菌)血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII或VIII荚膜糖。
实施方案124：实施方案118的生物缀合物，其中所述***荚膜糖是粪肠球菌血清型A、B、C或D荚膜糖。
实施方案125：实施方案115-124中任一项的生物缀合物，其中所述载体蛋白是脱毒的绿脓假单胞菌外毒素A(EPA)、CRM197、麦芽糖结合蛋白(MBP)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌的溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚基(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌Sat蛋白、大肠杆菌Sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素和其脱毒变体、空肠弯曲杆菌AcrA、空肠弯曲杆菌天然糖蛋白、PcrV(又名LcrV、EspA、SseB)、PopB (YopB、YopD、FliC)或OprF、OprI。
实施方案126：具有以下结构的杂合寡糖或多糖
(B)n—A→
其中A是含有至少2、3、4、5、6、7或8个单糖的寡糖重复单元，其在还原末端具有己糖单糖衍生物(通过箭头表示)；
其中B是含有至少2、3、4、5、6、7或8个单糖的寡糖重复单元；
其中A和B是不同的寡糖重复单元；且
其中n为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或至少20。
实施方案127：实施方案126的杂合寡糖或多糖，其中所述B寡糖重复在所述重复的还原末端含有己糖单糖。
实施方案128：实施方案127的杂合寡糖或多糖，其中在所述重复的还原末端的己糖单糖选自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、***糖醇、岩藻糖和甘露糖。
实施方案129：实施方案126-128中任一项的杂合寡糖或多糖，其中A的寡糖重复单元和B的寡糖重复单元的不同仅在于在所述重复的还原末端含有不同的单糖。
实施方案130：实施方案126-129中任一项的杂合寡糖或多糖，其中A的寡糖重复单元是***荚膜糖的荚膜糖的重复单元，所述***荚膜糖例如组A链球菌荚膜糖、组B链球菌荚膜糖、肺炎链球菌荚膜糖、肠球菌荚膜糖或金黄色葡萄球菌荚膜糖。
实施方案131：实施方案126-130中任一项的杂合寡糖或多糖，其中A的寡糖重复单元是肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、12A、12B、12F、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、26、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35D、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F或48的荚膜糖的重复单元；或其中A的寡糖重复单元是肺炎链球菌血清型2、3、6A、6B、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、26、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35D、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F或48的荚膜糖的重复单元。
实施方案132：生物缀合物，其包含与实施方案126-131中任一项的杂合寡糖或多糖连接的载体蛋白。
3.1 术语
OPS：O多糖；革兰氏阴性细菌的O抗原。OPS在本文中也称为O抗原。
CP：荚膜多糖
LPS：脂多糖。
waaL：编码具有位于周质中的活性位点的膜结合酶的O抗原连接酶基因。所编码酶将磷酸十一异戊烯基酯(UPP)结合的O抗原转移至脂质A核心，形成脂多糖。
RU：重复单元。如本文所使用，RU设定为等于生物重复单元BRU。BRU描述O抗原的RU，因为O抗原在体内合成。
Und-PP：焦磷酸十一异戊烯基酯。
LLO：脂质连接的寡糖。
如本文所使用，术语“生物缀合物”是指在宿主细胞背景中制备的蛋白(例如载体蛋白)和抗原(例如寡糖或多糖)之间的缀合物，其中宿主细胞机构将抗原连接至蛋白(例如N-连接)。
当结合数值使用时，术语"约"是指在所提及数值的±1、±5或±10%内的任一数值。
如本文所使用，在向个体施用治疗(例如本文描述的组合物)的背景中，术语"有效量"是指具有预防和/或治疗效应的治疗的量。在某些实施方案中，"有效量"是指足以实现一种、两种、三种、四种或更多种以下效应的治疗的量：(i)降低或改善细菌感染或与其相关的症状的严重度；(ii)缩短细菌感染或与其相关的症状的持续时间；(iii)预防细菌感染或与其相关的症状的进展；(iv)引起细菌感染或与其相关的症状的消退；(v)预防细菌感染或与其相关的症状的发生或发作；(vi)预防细菌感染或与其相关的症状的复发；(vii)减少与细菌感染相关的器官衰竭；(viii)减少具有细菌感染的个体的住院；(ix)缩短具有细菌感染的个体的住院长度；(x)提高具有细菌感染的个体的存活；(xi)消除个体的细菌感染；(xii)抑制或减少个体中的细菌复制；和/或(xiii)增强或改善另一治疗的预防或治疗效应。
如本文所使用，在向个体施用两种或更多种治疗的背景中，术语"组合"是指使用多于一种治疗。术语"组合"的使用不限制向个体施用治疗的顺序。例如，第一治疗(例如本文描述的组合物)可在向个体施用第二治疗之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、与其同时或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用。
如本文所使用，术语"个体"是指动物(例如鸟类、爬行动物和哺乳动物)。在另一个实施方案中，个体是哺乳动物，包括非灵长类动物(例如骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类动物(例如猴、黑猩猩和人)。在某些实施方案中，个体是非人动物。在一些实施方案中，个体是农场动物或宠物(例如狗、猫、马、山羊、绵羊、猪、驴或鸡)。在一个具体实施方案中，个体是人。术语"个体(subject)"、"个体(individual)"和"患者(patient)"在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“供体寡糖或多糖”是指由其衍生寡糖或多糖的寡糖或多糖。如本文所用的供体寡糖和多糖在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖(例如葡萄糖)。术语供体寡糖或多糖的使用并不意味着暗示原位修饰寡糖或多糖。相反，术语供体寡糖或多糖的使用意指在其野生型状态下为寡糖基转移酶(例如，PglB)活性的弱底物或不是寡糖基转移酶(例如，PglB)活性的底物的寡糖或多糖。示例性供体寡糖或多糖包括来自细菌的那些，所述细菌包括肺炎链球菌CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A、B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15 (A、B、C、F)、CP16 (A、F)、CP17 (A、F)、CP18 (A、B、C、F)、CP19 (A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22 (A、F)、CP23(A、B、F)、CP24 (A、B、F)、CP25 (A、F)、CP 26、CP27、CP28 (A、F)、CP29、CP31、CP32 (A、F)、CP33 (A、B、C、D、F)、CP34、CP35 (A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41 (A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47 (A、F)和CP48。本领域技术人员将能够容易地确定寡糖或多糖是否在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖(例如，葡萄糖)，因此此类寡糖或多糖是否是如本文涵盖的供体寡糖或多糖。
如本文所用，术语“己糖单糖衍生物”是指可以是寡糖基转移酶活性的底物的非己糖单糖。通常，己糖单糖衍生物包含在位置2包含乙酰氨基的单糖。示例性己糖单糖衍生物包括GlcNAc、HexNAc、脱氧HexNAc或2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧己糖。
如本文所用，术语“杂合寡糖或多糖”是指在第一重复单元的还原末端不包含己糖的工程改造的寡糖或多糖，而是在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖衍生物或非己糖单糖。
4-附图简述
图1描绘了肺炎链球菌荚膜多糖(CP) 14和CP33F的重复单元的结构。
图2描绘了肺炎链球菌CP14野生型簇的基因组织的示意图和每种基因的推定功能。
图3描绘了用于产生可以有效地通过寡糖转移酶转移至蛋白载体的修饰的肺炎链球菌CP14聚合物的合成糖基化途径。A：肺炎链球菌CP14的野生型生物合成途径。B：与野生型亚基相比，在其还原末端单糖不同的CP14的工程改造的亚基的生物合成。C：野生型CP14多糖的聚合和单个工程改造的亚基上野生型多糖的组装。
图4描绘了适用于肺炎链球菌CP14工程改造的亚基的产生和转位的组分，以及证实生产和转位的数据。A：合成糖工程改造的CP14亚基所必需的糖基转移酶的示意图：鲍氏志贺氏菌wfeD的半乳糖基转移酶、肺炎链球菌CP14的GlcNAc转移酶(wchL)和肺炎链球菌CP14的半乳糖基转移酶(wchM)。B：可合成与(A)相同、但添加肺炎链球菌CP14的翻转酶基因(wzx)的CP14的糖工程改造的亚基的糖基转移酶的示意图。C：用包含(A)的基因的质粒(“pGVX1190)”(泳道1)或包含(B)的基因的质粒(“pGVX1366”)(泳道2)转化的大肠杆菌Sф874的蛋白酶K消化后的脂寡糖的银染色。在银染前，将样品在4-12% SDS-PAGE凝胶中分离。描绘的结果表明，肺炎链球菌荚膜多糖的翻转酶具有松散的聚糖特异性，并且可以将工程改造的亚基从胞浆转移至周质中。D：工程改造的CP14亚基的结构。箭头指示相应的糖基转移酶。
图5描述了在大肠杆菌中产生的工程改造的CP14亚基的分析。提取脂质连接的寡糖(LLO)并用2AB标记，并进行与荧光检测器联用的HPLC。A：从用质粒pGVX1366或其对应的空载体(指示空载体的峰)转化的大肠杆菌Sф874 (ΔwaaL)提取的CP14工程改造的亚基LLO的HPLC色谱图。箭头(在57.6)指示对应于进行质谱分析的CP14工程改造的亚基的峰。B，57.5分钟峰的MS/MS分析。离子片段与工程改造的CP14亚基的预期结构相匹配。
图6显示工程改造的CP14亚基是空肠弯曲杆菌寡糖基转移酶PglB的底物。对蛋白进行Western印迹分析，所述蛋白提取自用用于表达PglB的质粒(pGVX970)和用于表达AcrA的质粒(pGVX1；载体蛋白)以及用于产生CP14的质粒(pGVX1366)或空载体(pGVX8)转化的大肠杆菌Sф874 (ΔwaaL)。诱导后，收获细胞，并从周质提取蛋白，并通过固定化金属亲和色谱(IMAC)富集，并通过含有咪唑的Tris缓冲液洗脱。A：纯化的样品进行SDS-PAGE(4-12％凝胶)并电印迹至硝酸纤维素膜上，所述硝酸纤维素膜通过抗His显影。泳道1，未糖基化的AcrA；泳道2，具有单个CP14工程改造的亚基的糖基化AcrA。B：完整的未糖基化的AcrA(i)和糖基化的AcrA(ii)的质谱扫描。39957.74 Da的质量与未糖基化的AcrA相匹配，且39227.27Da对应于具有一个工程改造的CP14亚基的糖基化AcrA。
图7描绘了合成基因簇(pGVX1433)的示意图，所述基因簇已被合成用于产生工程改造的CP14亚基。箭头指示已经一起组装在质粒pGVX81中用于产生工程改造的CP14亚基的基因。灰色箭头显示来自鲍氏志贺氏菌的wfeD基因，其表达经由β(1,4)键将Gal形式UDP-Gal组装至GlcNAc-P-P-十一异戊烯基的半乳糖基转移酶(J Bacteriol.2011; 193(2):449-59)。黑色箭头指示产生CP14簇的所有必需肺炎链球菌基因(除了引发Glc转移酶wchA)(相反，内源性大肠杆菌wecA充当引发转移酶，其将GlcNAc组装在焦磷酸十一异戊烯醇上，因此不是质粒的部分)。
图8描绘了在大肠杆菌宿主细胞中通过野生型和异源途径的组合产生杂合肺炎链球菌CP14。CP14野生型簇被整合至用CP14工程改造的质粒(pGVX1433)或空载体(pGVX81)转化的大肠杆菌W3110 ΔwaaL的可拉酸中。A：蛋白酶K消化的用CP14糖工程改造的质粒(泳道1)或空质粒(泳道2)转化的全细胞大肠杆菌W3110可拉酸::CP14 Δ waaL的Western印迹分析。将样品(LLO)在4-12％ SDS凝胶中分离，并印迹在膜上。使用血清分型抗CP14抗体作为一抗用于显现CP14。B：从用CP14糖工程改造的质粒(实线)或空质粒(虚线)转化的大肠杆菌W3110 (可拉酸::CP14)提取LLO并通过2AB标记。收集指示的峰(通过箭头)并进行MS分析。在糖工程改造的CP14聚合物中，在所有样品中发现的工程改造的亚基仅是第一亚基，而没有工程改造的亚基被鉴定为聚合物或在聚合物的中间。
图9表明PglB可将工程改造的CP14聚合物(而不是野生型CP14聚合物)转移至蛋白载体。将大肠杆菌W3110可拉酸::CP14 ∆waaL ∆wecA-wzzE和大肠杆菌W3110 可拉酸:CP14 ΔwaaL用包含RcsA(CP14合成的活化物)的质粒、pGVX970(表达PglB)、pGVX1(表达AcrA蛋白载体)转化；诱导后收获细胞。对全细胞蛋白酶K消化和IMAC富集的周质提取物进行Western印迹分析，所述提取物通过SDS-PAGE(4-12％凝胶)分离，电印迹至硝酸纤维素膜上，并与CP14抗体一起孵育。A：转化的大肠杆菌W3110可拉酸:CP14 ΔwaaL(泳道1)和大肠杆菌W3110可拉酸::CP14 ∆waaL ∆wecA-wzzE(泳道2)的蛋白酶K消化的样品的Western印迹。B：转化的大肠杆菌W3110可拉酸:CP14 ΔwaaL(泳道1)和大肠杆菌W3110可拉酸::CP14∆waaL ∆wecA-wzzE(泳道2)的IMAC富集样品的Western印迹分析。在小图A中，所有菌株都产生LLO并被抗CP14抗体识别。然而，在小图B中，仅在菌株大肠杆菌W3110可拉酸::CP14,∆waaL中仅检测到糖蛋白(CP14-AcrA)，而对于大肠杆菌W3110可拉酸::CP14, ∆waaL, ∆wecA-wzzE则不检测到，所述大肠杆菌W3110可拉酸::CP14, ∆waaL, ∆wecA-wzzE由于缺乏wecA(编码引发转移酶，所述引发转移酶将GlcNAc添加至UndP)而不能产生CP14工程改造的亚基，因此仅产生野生型CP14结构(其由于在第一重复单元的还原末端存在己糖而不是PglB的底物)。
图10表明，工程改造的CP14聚合物可以被PglB转移至不同的载体蛋白。将大肠杆菌W3110可拉酸::CP14, ∆waaL用CP14工程改造的质粒(pGVX1433)和用于表达RcsA的质粒(pGVX970，表达PglB)和pGVX538(表达载体蛋白EPA)转化。诱导后收获所有样品，并从周质提取蛋白，并通过IMAC富集。通过SDS-PAGE(4-12％凝胶)分离富集的蛋白样品，并将其电印迹至硝酸纤维素膜上，并与作为一抗的抗His抗体(A)或CP14抗体(B)一起孵育。
图11表明用工程改造的CP14聚合物糖基化的EPA的产生和纯化。将大肠杆菌W3110可拉酸::CP14 ∆waaL用CP14工程改造的质粒(pGVX1433)和用于表达PglB (pGVX970)和EPA (pGVX538)以及RcsA (用于活化CP14合成)的质粒转化。转化菌株用于发酵，并收集生物量。提取周质蛋白并进行IMAC和凝集素亲和色谱(蓖麻(Ricinus communis)凝集素-琼脂糖)以将CP14-EPA缀合物纯化至均匀。将纯化的样品进行SDS-PAGE并电印迹至硝酸纤维素上。使用抗His(b)或抗CP14血清分型抗体(B)进行Western印迹分析。C：纯化的CP14-EPA生物缀合物的考马斯染色凝胶。
图12描绘了肺炎链球菌CP33F野生型簇的基因组织的示意图和每种基因的推定功能。通过替代大肠杆菌W3110的可拉酸簇将所述簇的部分(除了调节基因之外的基因)整合至大肠杆菌W3110中。
图13表明表达肺炎链球菌CP33F胶囊的大肠杆菌菌株的开发。A：大肠杆菌W3110可拉酸被CP33F替代。使用CP33F分型抗体的蛋白酶K消化的全细胞提取物的Western印迹分析，所有克隆都表达CP33F。B：大肠杆菌菌株的脂多糖连接酶(waaL)用pglB替代以产生大肠杆菌W3310 CA::CP33F waaL::pglB。转化菌株用于发酵，并收集生物量。使用CP33F分型抗体进行蛋白酶K消化的全细胞提取物的Western印迹分析。测试两个不同的克隆(A，B)。
图14描绘了合成基因簇(并入质粒pGVX2342)的示意图，所述基因簇被合成用于产生工程改造的CP33F亚基。A：箭头指示在质粒pGVX81中组装用于产生工程改造的CP33F亚基的基因。灰色箭头表示来自不同大肠杆菌菌株的基因，其表达Galf-转移酶(wfdK和wbeY)，其将Galf形式UDP-Galf添加至GlcNAc-P-P-十一异戊烯基和galE(UPD-半乳糖差向异构酶)和glf(UDP-吡喃半乳糖变位酶)。黑色箭头表示产生CP33F簇所必需的肺炎链球菌基因(除了引发Glc转移酶wchA)(相反，内源性大肠杆菌wecA充当引发转移酶，其将GlcNAc组装在焦磷酸十一异戊烯醇上，因此不是质粒的部分)。B：CP33F的工程改造的亚基的结构，箭头指示来自不同细菌的相应的糖基转移酶。
图15表明肺炎链球菌CP33F工程改造的亚基的产生和转位。A：用没有CP33Fwzx翻转酶的质粒pGVX2098(泳道1)或含有CP33Fwzx翻转酶的pGVX2342(泳道2)转化的大肠杆菌W3110的蛋白酶K消化后的脂寡糖的银染。在银染或Western印迹前，将样品在4-12% SDS-PAGE凝胶中分离。B：使用分型CP33F抗体作为一抗的与上面相同的样品的Western印迹分析。该数据表明，肺炎链球菌荚膜多糖的翻转酶具有松散的聚糖特异性，并且可以将工程改造的亚基从胞浆转移至周质中。
图16表明在大肠杆菌中产生的工程改造的CP33F亚基的产生。提取脂质连接的寡糖(LLO)并用2AB标记，并进行与荧光检测器联用的HPLC。A：CP33F工程改造的亚基的HPLC色谱图。从用eng. CP33F质粒、pGVX2342或空载体转化的大肠杆菌Sф874 ΔwaaL纯化LLO。箭头指示对应于收集用于MS分析的CP33F工程改造的亚基的峰。B：70.5分钟峰的MS/MS分析。离子片段与工程改造的CP33F亚基的预期结构相匹配。
图17表明，工程改造的CP33F亚基可以由PglB转移。蛋白样品的Western印迹分析：用PglB表达质粒(pGVX970)、蛋白载体AcrA表达质粒(pGVX1)和空质粒(pGVX1387)或质粒pGVX2306(表达CP33F的工程改造的亚基)转化的大肠杆菌W3110 ΔwaaL。在诱导后收获细胞，并从周质提取蛋白，通过IMAC富集，纯化的样品进行SDS-PAGE (4-12％凝胶)，并电印迹至硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜通过作为一抗的抗His(A)或分型CP33F抗体(B)显色。泳道1，来自携带空质粒的大肠杆菌菌株的蛋白样品；泳道2，来自携带工程改造的CP33F质粒(pGVX2306)的大肠杆菌菌株的蛋白样品。
图18表明PglB可以将工程改造的CP33F聚合物转移至蛋白载体，但不能转移野生型CP33F。分别用RcsA质粒(CP33F合成的活化物)和表达EPA(蛋白载体)的pGVX2310和空载体(泳道1,2)或CP33F工程改造的质粒(pGVX2346)(泳道3和4)转化的大肠杆菌W3110可拉酸::CP33F waaL::PglB的蛋白酶K消化的全细胞(A)和IMAC富集的周质提取物(B和C)的Western印迹分析(小图A和B)。所有样品都通过SDS-PAGE(4-12％凝胶)分离，并将其电印迹至硝酸纤维素膜上，并与分型CP33F抗体(A和B)和抗His抗体(C)一起孵育。如小图A中所示，所有菌株都产生由抗CP33F抗体识别的LLO；然而，仅在表达CP33F Eng的菌株中检测到糖蛋白(CP33F-EPA)，验证PglB仅可以转移CP33F，所述CP33F被修饰以便在第一重复单元的还原末端不包含己糖。
图19A：描绘了肺炎链球菌CP14野生型簇的基因组织的示意图和每种基因的推定功能。虚线框指示通过替代大肠杆菌W3110可拉酸簇而整合至大肠杆菌W3110染色体中的簇的部分。B：野生型CP14的一个重复单元(RU)的结构，其中指示负责组装的酶。
图20 A：描绘了用于产生工程改造的CP14亚基的合成簇的示意图。箭头指示一起组装在***糖诱导型质粒中用于产生工程改造的CP14亚基的基因。浅灰色箭头表示来自大肠杆菌O21的wciP(半乳糖基转移酶，其将Gal从UDP-Gal组装至Glc)和wciQ(葡糖基转移酶，其将Glc从UDP-Glc组装至GalNAc-UndPP)基因。深灰色箭头表示将GlcNAc-UndPP(大肠杆菌wecA的产物)转化为GalNAc-UndPP的Z3206差向异构酶(Rush JS, Alaimo C,Robbiani R, Wacker M, Waechter CJ. J Biol Chem. 2010 Jan 15;285(3):1671-80)。黑色箭头表示来自肺炎链球菌CP14的wchL(编码GlcNAc转移酶)和wchL(编码半乳糖基转移酶)。白色箭头表示空肠弯曲杆菌翻转酶，pglK。B：杂合CP14的一个重复单元(RU)的结构，其中指示负责组装的酶(此处，己糖单糖衍生物作为单糖存在于还原末端，其中将完整的野生型CP14重复单元组装至己糖单糖衍生物上)。
图21描绘了说明用于产生可由寡糖基转移酶(例如空肠弯曲杆菌PglB)转移的杂合CP14聚合物的方法的示意图。A：显示并入大肠杆菌中的CP14的野生型生物合成途径。B：说明使用不同糖基转移酶生物合成CP14的一个工程改造的亚基以合成GalNAc-焦磷酸十一异戊烯基酯上的CP14的一个完整的野生型亚基。C：显示野生型CP14多糖在一个工程改造的亚基的顶部上的聚合。该杂合聚合物由PglB以高效率转移。
图22表明PglB可以将工程改造的CP14聚合物转移至蛋白载体。将大肠杆菌W3110可拉酸::CP14 ∆waaL用RcsA质粒(CP14合成的活化物)、用于产生工程改造的CP14亚基的质粒、表达PglB的质粒和表达EPA(蛋白载体)的质粒转化。使细胞生长并在诱导后收获。提取周质蛋白，并通过亲和色谱富集EPA缀合物(将从用非糖基化纯化的EPA蛋白注射的山羊血清纯化的IgG与来自Bior-Rad的Affi-Gel ®偶联)。富集的蛋白样品通过SDS-PAGE(4-12％凝胶)分离并电印迹至硝酸纤维素膜上。A：与抗His单克隆抗体孵育的印迹。B：与肺炎链球菌分型CP14抗体孵育的印迹。在两次Western印迹分析中，显现梯样条带，其对应于CP14-EPA缀合物。
图23表明CP14-EPA纯化。将大肠杆菌W3110可拉酸::CP14∆waaL用用于表达RcsA(CP14合成的活化物)、用于产生CP14的工程改造的亚基、表达空肠弯曲杆菌PglB(寡糖基转移酶)和EPA-6His(蛋白载体)的质粒转化。使转化的大肠杆菌细胞在生物反应器中生长，并在诱导后收获细胞。通过渗透冲击从周质提取蛋白，并用IMAC、凝集素亲和色谱法(蓖麻(Ricinus communis)凝集素)、大小排阻色谱法和Source Q色谱法纯化。纯化的样品通过SDS-PAGE(4-12％凝胶)分离，并进行考马斯染色(A)或电印迹在硝酸纤维素膜上，其使用作为一抗的抗His单克隆抗体(B)或用作一抗的分型抗CP14抗体(C)。
图24描绘了与已知的肺炎链球菌疫苗(Prevnar 13; Wyeth/Pfizer)相比，分析CP14-EPA生物缀合物的免疫原性的实验设计。
图25表明与Prevnar 13相比，针对CP14-EPA生物缀合物产生的抗体的免疫原性和功能性。将CP14-EPA缀合物与氢氧化铝(佐剂)一起以两种剂量(0.4 µg CP14和2.2 µgCP14)分别注射至三只不同的兔(参见图24)。作为对照，将Prevnar 13 (2.2 µg)注射至三只不同的兔中。A：显示兔的CP14特异性抗体浓度。使用野生型CP14荚膜多糖进行ELISA(基于相应的人血清归一化)。B：通过调理吞噬作用指数显示的相应血清对A的功能性。
图26描绘了显示糖工程改造的(杂合)荚膜多糖与其野生型对应物(其在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖)相比的产生的图。
图27描绘了肺炎链球菌CP15A基因簇。
图28描绘了肺炎链球菌CP15A的重复单元结构。
图29在A中描绘了：用于工程改造CP15A的质粒pGVXN3058的遗传组织且在B中描绘了：工程改造的CP15A的糖结构。
图30表明在pGVXN3058(工程改造)载体存在的情况下CP15A-AcrA生物缀合物的产生。A：使用抗CP15A抗体的全细胞蛋白酶K消化的提取物的Western印迹分析；B：使用抗CP15A抗体的从周质提取且通过IMAC富集的蛋白的Western印迹分析；C：使用抗His抗体的从周质提取且通过IMAC富集的蛋白的Western印迹分析。
5-发明详述
通过通常在肺炎链球菌细胞的CP簇中编码的一组酶的协同，在载体脂质上合成肺炎球菌荚膜多糖(Whitfield C, Roberts IS: Structure, assembly and regulation ofexpression of capsules in Escherichia coli. Mol Microbiol 1999, 31(5):1307-1319)。wzy依赖的CP的合成从在膜的胞浆侧将单糖磷酸酯添加至磷酸十一异戊烯基酯(Und-P)开始。短寡糖通过不同的糖基转移酶从活化的糖核苷酸连续的添加单糖而延长，并且连接脂质的寡糖通过翻转酶翻转穿过膜。抗原-重复单元(RU)通过由蛋白wzy执行的酶促反应聚合。随后将多糖转移至最终的受体结构。据信聚合和转运至细胞表面由位于CPCP簇5'端的一组3至4种酶控制。
在大多数情况中，糖基转移酶、聚合酶wzy、翻转酶wzx和单糖磷酸酯转移酶在dexB至aliA簇内编码，而核苷酸活化的单糖生物合成途径在一般的持家活性情况下在基因组的别处编码，而当单糖对CP特异时其特定在CP簇中编码(Bentley SD, Aanensen DM,Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D,Murphy L, Quail MA等人: Genetic analysis of the capsular biosynthetic locusfrom all 90 pneumococcal serotypes. PLoS genetics 2006, 2(3):e31)。
产生CP的大多数生物合成途径使用核苷酸二磷酸(NDP)活化的单糖作为底物，即UDP-Glc和UDP-GlcNAc。这些NDP糖通过持家基因在革兰氏阴性和革兰氏阳性宿主中提供，并且因此可作为用于特定的糖的合成的起始材料得到。用于特定的NDP-糖的合成或其他修饰的生物合成基因几乎总是在CP簇中编码。
O抗原合成和CP合成在生物合成的最后步骤不同。O抗原通过连接酶WaaL添加至脂质A核心，并且进一步运输至外膜，而CP作为荚膜结构出现在细胞上。平均地，最终的O抗原糖长度比CP短得多。
将肺炎链球菌CP分类为组I CP(由于导致其合成的特定生物化学途径)。革兰氏阴性细菌也含有组I CP途径，其由于存在负责外膜转运的另外的膜转运蛋白基因而与肺炎球菌组I簇不同。例如，这些是可拉酸(CA)生物合成机制基因簇wca，(Stevenson G,Andrianopoulos K, Hobbs M, Reeves PR: Organization of the Escherichia coli K-12 gene cluster responsible for production of the extracellularpolysaccharide colanic acid. J Bacteriol 1996, 178(16):4885-4893)和K30 CP簇(Whitfield C: Biosynthesis and assembly of capsular polysaccharides inEscherichia coli. Annu Rev Biochem 2006, 75:39-68)。
已经描述了经由大肠杆菌的染色体整合和遗传修饰产生肺炎链球菌的野生型荚膜多糖的方法。参见国际专利申请号WO2014/072405，其以其整体通过引用并入本文。然而，尽管野生型革兰氏阳性荚膜多糖的成功产生，由于超过90％的肺炎球菌荚膜多糖在还原末端含有己糖(例如葡萄糖)(其为PglB的次优底物)的事实，使用寡糖基转移酶(空肠弯曲杆菌PglB)在大肠杆菌中有效产生肺炎球菌CP生物缀合物受到阻碍(Proc Natl Acad Sci US A. 2006 May 2;103(18):7088-93)。
如上文章节3、以下实施例和所附权利要求中所述，本申请的发明人已经鉴定了用于产生修饰的寡糖和多糖(包括肺炎球菌荚膜多糖)的新型方法，其允许生物合成在附接至十一异戊烯醇-焦磷酸酯的还原性单糖上的杂合寡糖和多糖，所述十一异戊烯醇-焦磷酸酯为PglB的合适底物。因此，本文所述的方法首次允许使用修饰的宿主细胞来产生高产量的生物缀合物，其与细菌抗原(寡糖和多糖)连接，所述细菌抗原通常不是寡糖基转移酶、例如PglB(例如，空肠弯曲杆菌PglB)的底物(或是寡糖基转移酶的弱底物)。
在一个实施方案中，本文提供用于产生多糖的工程改造的革兰氏阴性细菌，其中革兰氏阴性细菌包含整合在革兰氏阴性细菌的染色体中的荚膜多糖基因簇的途径。在某些实施方案中，革兰氏阴性细菌包含荚膜多糖基因簇的开放阅读框的至少25%、50%、75%、85%、90%或至少95%。在某些实施方案中，革兰氏阴性细菌包含完整的荚膜多糖基因簇。在某些实施方案中，多糖包含荚膜多糖的表位。
在一个实施方案中，本文提供用于产生工程改造的亚基的革兰氏阴性细菌，其中革兰氏阴性细菌包含用于产生荚膜多糖的工程改造的重复单元的途径。在某些实施方案中，革兰氏阴性细菌包含荚膜多糖基因簇的开放阅读框的至少25%、50%、75%、85%、90%或至少95%。在某些实施方案中，所述革兰氏阴性细菌包含编码来自不同革兰氏阴性细菌和阳性细菌的糖基转移酶的几种基因。
在某些实施方案中，前述段落的革兰氏阴性细菌选自埃希氏菌属、大肠杆菌、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、耶尔森氏菌属、奈瑟氏菌属、弧菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、气单胞菌属和变形杆菌属。在一个具体实施方案中，革兰氏阴性细菌是大肠杆菌。
在某些实施方案中，前述段落的***选自链球菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、肠球菌属和乳球菌属。
在某些实施方案中，工程改造至前述任一段落的革兰氏阴性细菌中的***的荚膜多糖基因簇是肺炎链球菌。在一个具体实施方案中，所述肺炎链球菌调节基因来自肺炎链球菌14型。在一个具体实施方案中，所述肺炎链球菌调节基因来自肺炎链球菌33F型。
在本发明的一个具体实施方案中，所述肺炎链球菌调节基因来自肺炎链球菌8型、12F型、15A型、16F型、22F型、23A型、24F型、31型、33F型、35B型和38型。
在某些实施方案中，任何前述段落的革兰氏阴性细菌包含寡糖基转移酶。在一个具体实施方案中，寡糖基转移酶与革兰氏阴性细菌异源。
在某些实施方案中，任何前述段落的革兰氏阴性细菌包含至少一种异源糖基转移酶。在一个具体实施方案中，异源糖基转移酶是原核糖基转移酶。在一个具体实施方案中，糖基转移酶与调节基因获得自相同的***。
在某些实施方案中，任何前述段落的革兰氏阴性细菌包含革兰氏阴性细菌天然的一种或多种基因的缺失或失活。在一个具体实施方案中，一种或多种缺失的基因包含waaL基因。在一个具体实施方案中，一种或多种缺失的基因包含与革兰氏阴性细菌中O抗原生物合成相关的全部基因。
在某些实施方案中，任何前述段落的革兰氏阴性细菌包含革兰氏阴性细菌天然的一种或多种基因的替代。在一个具体实施方案中，一种或多种替代的基因包含waaL基因。在一个具体实施方案中，waaL被寡糖基转移酶替代。在一个具体实施方案中，waaL被空肠弯曲杆菌pglB替代。
在某些实施方案中，任何前述段落的革兰氏阴性细菌包含编码含有糖基化的共有序列的载体蛋白的核酸。在一个具体实施方案中，编码载体蛋白的核酸与革兰氏阴性细菌异源。在一个具体实施方案中，载体蛋白是脱毒的铜绿假单胞菌外毒素A、CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌溶血素A、凝集因子 A、凝集因子 B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚基(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域、空肠弯曲杆菌AcrA、空肠弯曲杆菌天然糖蛋白和肺炎链球菌肺炎球菌溶血素。在一个具体实施方案中，载体蛋白是肺炎链球菌蛋白，例如肺炎链球菌肺炎球菌溶血素、肺炎链球菌NOX、肺炎链球菌PspA、肺炎链球菌PcpA、肺炎链球菌PhtD、肺炎链球菌PhtE、肺炎链球菌Ply或肺炎链球菌LytB。在一个具体实施方案中，载体蛋白通过寡糖基转移酶缀合至多糖。
在某些实施方案中，工程改造至革兰氏阴性细菌中的糖基转移酶基因产生以下荚膜多糖工程改造的亚基之一：肺炎链球菌CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A和B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15(A、B、C、F)、CP16(A、F)、CP17(A、F)、CP18(A、B、C、F)、CP19(A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22(A、F)、CP23(A、B、F)、CP24(A、B、F)、CP25(A、F)、CP26、CP27、CP28(A、F)、CP29、CP31、CP32(A、F)、CP33(A、B、C、D、F)、CP34、CP35(A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41(A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47(A、F)或CP48；或金黄色葡萄球菌CP5或CP8；无乳链球菌(组B、GBS) CPIa、CPIb、CPII、CPIII、CPIV、CPV、CPVI、CPVII或CPVIII；或粪肠球菌CPA、CPB、CPC或CPD。
在一个具体实施方案中，前述段落的革兰氏阴性细菌包含寡糖基转移酶。在一个具体实施方案中，寡糖基转移酶与革兰氏阴性细菌异源。
在一个具体实施方案中，前述段落的革兰氏阴性细菌包含与革兰氏阴性细菌异源的至少一种糖基转移酶。在一个具体实施方案中，糖基转移酶是原核糖基转移酶。在一个具体实施方案中，糖基转移酶是古细菌或真核糖基转移酶。
在一个具体实施方案中，前述段落的革兰氏阴性细菌包含编码含有糖基化的共有序列的载体蛋白的核酸。在一个具体实施方案中，编码载体蛋白的核酸与革兰氏阴性细菌异源。在一个具体实施方案中，载体蛋白是脱毒的铜绿假单胞菌外毒素A、CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌溶血素A、凝集因子 A、凝集因子 B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚基(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域、空肠弯曲杆菌AcrA和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白。在一个具体实施方案中，载体蛋白通过寡糖基转移酶缀合至多糖。
在一个具体实施方案中，前述段落的***的多糖是肺炎链球菌的荚膜多糖。
在一个具体实施方案中，前述段落的革兰氏阴性细菌的多糖是大肠杆菌的O抗原(O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186、O187)、沙门氏菌种(肠道沙门氏菌亚种Enterica、肠道沙门氏菌亚种Salamae、肠道沙门氏菌亚种arizonae、肠道沙门氏菌亚种Diarizonae、肠道沙门氏菌亚种Houtenae、帮戈沙门氏菌(S. bongori)和肠道沙门氏菌亚种Indica，以及O型1-67)、假单胞菌种(铜绿假单胞菌O血清型1-20)、克雷伯氏菌种(特别是肺炎克雷伯氏菌血清型O1、O2(和血清亚型)、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12)、不动杆菌O抗原(特别是鲍氏不动杆菌O抗原)、沙眼衣原体O抗原(血清型A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L1、L2、L3)、霍乱弧菌O抗原O1至155、李斯特氏菌种（特别是单核细胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes)1、2、3、4型及其血清亚型）、嗜肺军团菌血清型1至15 O抗原、副百日咳博得特氏菌O抗原、鼻疽伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌O抗原、土拉热弗朗西斯氏菌，弯曲菌种(空肠弯曲菌)的O抗原；艰难梭状芽胞杆菌(血清型A、G、H、K、S1、S4、D、Cd-5，以及产气荚膜梭状芽胞杆菌血清型A、B、C、D和E)、金黄色葡萄球菌5和8型、化脓链球菌(组B链球菌荚膜血清型多糖)、大肠杆菌、无乳链球菌(组A链球菌荚膜多糖)、脑膜炎奈瑟氏菌(血清型A、B、C、W、Y、X)、白色念珠菌、流感嗜血杆菌、粪肠球菌荚膜多糖I-V型的荚膜多糖；以及其他表面多糖结构，例如伯氏疏螺旋体糖脂)、脑膜炎奈瑟氏菌菌毛蛋白O聚糖和脂寡糖(LOS)、流感嗜血杆菌LOS、硕大利什曼原虫脂磷聚糖、肿瘤相关碳水化合物抗原、疟疾糖基磷脂酰肌醇或结核分枝杆菌***甘露聚糖。
在一个具体实施方案中，糖基转移酶来自前述段落的革兰氏阴性细菌的多糖基因簇，是大肠杆菌的O抗原(O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186、O187)、沙门氏菌种(肠道沙门氏菌亚种Enterica、肠道沙门氏菌亚种Salamae、肠道沙门氏菌亚种arizonae、肠道沙门氏菌亚种Diarizonae、肠道沙门氏菌亚种Houtenae、帮戈沙门氏菌(S.bongori)和肠道沙门氏菌亚种Indica，以及O型1-67)、假单胞菌种(铜绿假单胞菌O血清型1-20)、克雷伯氏菌种(特别是肺炎克雷伯氏菌血清型O1、O2(和血清亚型)、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12)、不动杆菌O抗原(特别是鲍氏不动杆菌O抗原)、沙眼衣原体O抗原(血清型A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L1、L2、L3)、霍乱弧菌O抗原O1至155、李斯特氏菌种（特别是单核细胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes)1、2、3、4型及其血清亚型）、嗜肺军团菌血清型1至15 O抗原、副百日咳博得特氏菌O抗原、鼻疽伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌O抗原、土拉热弗朗西斯氏菌，弯曲菌种(空肠弯曲菌)的O抗原；艰难梭状芽胞杆菌(血清型A、G、H、K、S1、S4、D、Cd-5，以及产气荚膜梭状芽胞杆菌血清型A、B、C、D和E)、金黄色葡萄球菌5和8型、化脓链球菌(组B链球菌荚膜血清型多糖)、大肠杆菌、无乳链球菌(组A链球菌荚膜多糖)、脑膜炎奈瑟氏菌(血清型A、B、C、W、Y、X)、白色念珠菌、流感嗜血杆菌、粪肠球菌荚膜多糖I-V型的荚膜多糖；以及其他表面多糖结构，例如伯氏疏螺旋体糖脂)、脑膜炎奈瑟氏菌菌毛蛋白O聚糖和脂寡糖(LOS)、流感嗜血杆菌LOS、硕大利什曼原虫脂磷聚糖、肿瘤相关碳水化合物抗原、疟疾糖基磷脂酰肌醇或结核分枝杆菌***甘露聚糖。来自金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、无乳链球菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌、乳酸乳杆菌、乳脂乳杆菌的磷壁酸和表多糖。
在具体实施方案中，本文提供由前述任一段落的革兰氏阴性细菌产生的重组糖蛋白。
在具体实施方案中，本文提供产生重组糖蛋白的方法，其包括在适合于产生蛋白的条件下培养任一前述段落的革兰氏阴性细菌。在一个具体实施方案中，所述方法进一步包括纯化重组糖蛋白。
在某些实施方案中，已经在体内组合不同的同源和异源糖基转移酶以产生肺炎链球菌CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A和B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15(A、B、C、F)、CP16(A、F)、CP17(A、F)、CP18(A、B、C、F)、CP19(A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22(A、F)、CP23(A、B、F)、CP24(A、B、F)、CP25(A、F)、CP26、CP27、CP28(A、F)、CP29、CP31、CP32(A、F)、CP33(A、B、C、D、F)、CPS34、CP35(A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41(A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47(A、F)、CPS48和(Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E,Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA等人:Genetic analysis ofthe capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes.PLoS genetics 2006, 2(3):e31)中提及的所有额外荚膜的工程改造的荚膜多糖重复单元。具体地，这些荚膜多糖包括肺炎链球菌CP14和CP33F。
在本发明的一个具体实施方案中，疫苗产品包含肺炎链球菌血清型CP8、CP15A、CP16F、CP22F、CP23A、CP24F、CP31、CP33F、CP35B和CP38的工程改造的荚膜多糖重复单元。
在其他实施方案中，可以使用本发明的方法修饰具有己糖或任何其他单糖的其他***的荚膜多糖。其他***包括金黄色葡萄球菌和无乳链球菌(GBS)。此类荚膜多糖的实例包括金黄色葡萄球菌CP5、CP8，无乳链球菌(组B，GBS) CPIa、CPIb、CPII、CPIII、CPIV、CPV、CPVI、CPVII、CPVIII，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CPA、CPB、CPC、CPD。
在某些实施方案中，本文描述的细菌宿主细胞和通过本文描述的此类细菌宿主细胞产生的缀合物具有有利的特性。例如，在某些实施方案中，本文描述的细菌宿主细胞(其包含衍生自***的调节基因，其中所述调节基因参与寡糖或多糖生物合成)能够产生增加长度的糖抗原(作为存在所述调节基因的结果)，例如，寡糖和/或多糖。此外，相比于缺乏衍生自***的调节基因的革兰氏阴性细菌宿主细胞，本文描述的细菌宿主细胞能够产生增加量的糖抗原，例如寡糖和/或多糖。这些特征的每一个均是有利的，因为通过细菌细胞产生的缀合物具有更高的糖抗原与蛋白比例且因为细菌细胞产生更大量的缀合物。
在某些实施方案中，本文描述的细菌宿主细胞比具有相同特性、但缺乏来自***的参与寡糖或多糖生物合成的调节基因的细菌宿主细胞产生约5%、10%、15%、20%、约25%、约30%、约40%、约50%或大于50%更多的缀合物。在某些实施方案中，本文描述的细菌宿主细胞比具有相同特性、但缺乏来自***的参与寡糖或多糖生物合成的调节基因的细菌宿主细胞产生5%至10%、10%至20%、20%至30%、30%至40%或40%至50%更多的缀合物。
在某些实施方案中，本文描述的细菌宿主细胞比具有相同特性、但缺乏来自***的参与寡糖或多糖生物合成的调节基因的细菌宿主细胞产生约5%、10%、15%、20%、约25%、约30%、约40%、约50%或大于50%更多的糖抗原，例如寡糖和/或多糖。在某些实施方案中，本文描述的细菌宿主细胞比具有相同特性、但缺乏来自***的参与寡糖或多糖生物合成的调节基因的细菌宿主细胞产生5%至10%、10%至20%、20%至30%、30%至40%或40%至50%更多的糖抗原，例如寡糖和/或多糖。
在某些实施方案中，本文描述的细菌宿主细胞产生糖抗原，例如寡糖和/或多糖，其比通过具有相同特性、但缺乏来自***的参与寡糖或多糖生物合成的调节基因的细菌宿主细胞产生的糖抗原、例如寡糖和/或多糖长约5%、10%、15%、20%、约25%、约30%、约40%、约50%或大于50%。在某些实施方案中，本文描述的细菌宿主细胞产生糖抗原，例如寡糖和/或多糖，其比通过具有相同特性、但缺乏来自***的参与寡糖或多糖生物合成的调节基因的细菌宿主细胞产生的糖抗原、例如寡糖和/或多糖长5%至10%、10%至20%、20%至30%、30%至40%或40%至50%。
多种测定可以用于表征本文描述的缀合物(例如，表征载体蛋白、连接的糖抗原(例如，寡糖和/或多糖)，或两者，所述测定包括，例如，高效大小排阻色谱、等电聚焦、SDS-PAGE和Western印迹、通过MS的分子量确定、N末端测序、氨基酸分析、反相液相色谱、电喷雾质谱、串联质谱(MS/MS)和在胰蛋白酶消化后通过质谱的肽作图。
5.1 宿主细胞
可使用本领域技术人员已知的任何宿主细胞产生本文描述的杂合寡糖和多糖和包含本文描述的杂合寡糖和多糖的生物缀合物，包括古生菌(archea)、原核宿主细胞和真核宿主细胞。用于产生本文描述的杂合寡糖和多糖和包含本文描述的杂合寡糖和多糖的生物缀合物的示例性原核宿主细胞包括但不限于埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属和梭状芽孢杆菌(Clostridium)属。在一个具体实施方案中，用于产生本文描述的杂合寡糖和多糖和包含本文描述的杂合寡糖和多糖的生物缀合物的宿主细胞为大肠杆菌。
在某些实施方案中，用于产生本文描述的杂合寡糖和多糖和本文描述的生物缀合物的宿主细胞进行工程改造以包含异源性核酸，例如编码一种或多种载体蛋白的异源性核酸和/或编码一种或多种蛋白的异源性核酸(例如编码一种或多种蛋白的基因)。在一个具体实施方案中，可将编码参与糖基化途径(例如，原核和/或真核糖基化途径)的蛋白的异源性核酸引入本文描述的宿主细胞中。此类核酸可编码蛋白，包括但不限于寡糖基转移酶、差向异构酶、翻转酶、聚合酶和/或糖基转移酶。可使用本领域技术人员已知的任何方法(例如电穿孔、通过热休克的化学转化、天然转化、噬菌体转导和缀合)将异源性核酸(例如，编码载体蛋白的核酸和/或编码其他蛋白(例如参与糖基化的蛋白)的核酸)引入本文描述的宿主细胞中。在具体实施方案中，使用质粒将异源性核酸引入本文描述的宿主细胞中，例如，通过质粒(例如表达载体)使异源性核酸表达于宿主细胞中。在另一个具体实施方案中，使用国际专利申请号PCT/EP2013/068737 (公开为WO 14/037585)中描述的***方法将异源性核酸引入本文描述的宿主细胞中。
在某些实施方案中，可将额外修饰引入(例如，使用重组技术)本文描述的宿主细胞中。例如，编码形成可能竞争或干扰糖基化途径(例如，竞争或干扰一种或多种重组引入宿主细胞中的参与糖基化的异源性基因)的一部分的蛋白的宿主细胞核酸(例如基因)可在宿主细胞背景(基因组)中以使其失活/功能失调的方式缺失或修饰(即，缺失/修饰的宿主细胞核酸不编码功能蛋白或无论如何不编码任何蛋白)。在某些实施方案中，当核酸从本文提供的宿主细胞的基因组缺失时，其由所需序列(例如可用于糖蛋白产生的序列)代替。
可在宿主细胞中缺失(和在一些情况下被其他所需核酸序列代替)的示例性基因包括参与糖脂生物合成的宿主细胞的基因，诸如waaL(参见例如Feldman等人，2005, PNASUSA 102：3016-3021)、脂质A核心生物合成簇(waa)、半乳糖簇(gal)、***糖簇(ara)、可拉酸簇(wc)、荚膜多糖簇、十一异戊烯醇-p生物合成基因(例如，uppS、uppP)、und-P再循环基因、参与核苷酸活化的糖生物合成的代谢酶、肠杆菌普通抗原簇和原噬菌体O抗原修饰簇(如gtrABS簇)。
5.2 载体蛋白
可在本文中使用适用于产生缀合物疫苗(例如用于疫苗中的生物缀合物)的任何载体蛋白，例如，可将编码载体蛋白的核酸引入本文提供的宿主细胞中用于产生包含连接至杂合寡糖和多糖的载体蛋白的生物缀合物。示例性载体蛋白包括但不限于脱毒的绿脓假单胞菌外毒素A(EPA；参见例如Ihssen等人(2010) Microbial cell factories 9,61)、CRM197、麦芽糖结合蛋白(MBP)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌的溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚基(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌Sat蛋白、大肠杆菌Sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素和其脱毒变体、空肠弯曲杆菌AcrA和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白。对于EPA，各种脱毒蛋白变体已描述于文献中且可用作载体蛋白。
在某些实施方案中，将用于生成本文所述的生物缀合物的载体蛋白修饰，例如以使得蛋白具有更小毒性和/或更易于糖基化的方式修饰。在一个具体实施方案中，将用于生成本文所述的生物缀合物的载体蛋白修饰，使得载体蛋白中糖基化位点的数目最大化，其方式允许施用更低浓度的蛋白(例如，在免疫原性组合物中，以其生物缀合物形式)。
在某些实施方案中，将本文描述的载体蛋白修饰，以相比于通常与载体蛋白相关的糖基化位点(例如相对于与其原始/天然(例如"野生型")状态的载体蛋白相关的糖基化位点数)多包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个糖基化位点。在具体实施方案中，通过在蛋白一级结构的任何地方***糖基化共有序列(例如Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸；或Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(参见WO 2006/119987))来引入糖基化位点。可通过(例如)以下方式来引入此类糖基化位点：将新氨基酸添加至蛋白一级结构(即，完全或部分地添加糖基化位点)，或突变蛋白中的现有氨基酸以生成糖基化位点(即，不向蛋白添加氨基酸，但突变蛋白的所选氨基酸以形成糖基化位点)。本领域技术人员应认识到，可使用本领域已知的方法(例如包括修饰编码蛋白的核酸序列的重组方法)来容易地修饰蛋白的氨基酸序列。在具体实施方案中，将糖基化共有序列引入载体蛋白的特异性区域中，例如蛋白的表面结构，蛋白的N或C末端和/或由蛋白基础处的二硫桥键稳定的环中。在某些实施方案中，典型5氨基酸糖基化共有序列可通过赖氨酸残基延伸以用于更有效糖基化，且因此***的共有序列可编码5、6或7个应***或代替受体蛋白氨基酸的氨基酸。在一个具体实施方案中，载体蛋白是包含4个共有糖基化序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr的脱毒EPA。
在某些实施方案中，用于生成本文描述的生物缀合物的载体蛋白包含"标签"，即允许分离和/或鉴定载体蛋白的氨基酸序列。例如，向本文描述的载体蛋白添加标签可用于纯化该蛋白且因此纯化包含标记的载体蛋白的缀合物疫苗。可用于本文中的示例性标签包括但不限于组氨酸(HIS)标签(例如六组氨酸标签或6Xhis-标签)、FLAG-TAG和HA标签。在某些实施方案中，本文使用的标签是可去除的，例如一旦不再需要它们(例如在纯化蛋白之后)，就通过化学试剂或通过酶促方式去除。
在某些实施方案中，本文描述的载体蛋白包含使载体蛋白靶向至表达载体蛋白的宿主细胞的周质间隙的信号序列。在一个具体实施方案中，信号序列来自大肠杆菌DsbA、大肠杆菌外膜孔蛋白A(OmpA)、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MalE)、胡萝卜软腐欧文氏菌果胶酸裂合酶(PelB)、FlgI、NikA或芽孢杆菌属种木聚糖内切酶(XynA)、不耐热大肠杆菌肠毒素LTIIb、芽孢杆菌木聚糖内切酶XynA或大肠杆菌鞭毛蛋白(FlgI)。
5.3 糖基化机制
本文提供的宿主细胞包含和/或可被修饰为包含这样的核酸，其编码能够产生杂合寡糖和/或多糖的遗传机制(例如，糖基转移酶、翻转酶、聚合酶和/或寡糖基转移酶)，以及能够将此类杂合寡糖和/或多糖与载体蛋白连接的遗传机制。
糖基转移酶
本文提供的宿主细胞包含编码产生寡糖或多糖重复单元的糖基转移酶的核酸，其中所述重复单元在还原末端不包含己糖，且其中所述寡糖或多糖重复单元衍生自在还原末端包含己糖的供体寡糖或多糖重复单元。本领域技术人员将能够容易地确定哪些糖基转移酶可被工程改造至宿主细胞中，以便使宿主细胞能够产生基于目标供体寡糖或多糖的杂合寡糖或多糖的重复单元。实际上，糖基转移酶是本领域众所周知的。
在一个具体实施方案中，本文提供的宿主细胞包含编码将己糖单糖衍生物组装至焦磷酸十一异戊烯基酯(UND-PP)上的糖基转移酶的核酸。所述糖基转移酶可以衍生自例如埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。在一个具体实施方案中，所述糖基转移酶是wecA。
在一个具体实施方案中，本文提供的宿主细胞包含编码足以合成所述供体寡糖或多糖重复单元的糖基转移酶的核酸。一旦已选择讨论中的供体寡糖或多糖重复单元，此类糖基转移酶就对于本领域技术人员将是显而易见的。在一个具体实施方案中，所述足以合成所述供体寡糖或多糖的重复单元的糖基转移酶包含来自肺炎链球菌CP14的wchL和/或wchM。在一个具体实施方案中，所述足以合成所述供体寡糖或多糖的重复单元的糖基转移酶包含来自肺炎链球菌CP33F的wciC、wciD、wciE和/或wciF。
在一个具体实施方案中，本文提供的宿主细胞包含编码能够将单糖添加至在UND-PP上组装的己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶的核酸。在一个具体实施方案中，所述能够将单糖添加至所述己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶是来自鲍氏志贺氏菌(Shigella boyedii)的半乳糖基转移酶(wfeD)。在另一个具体实施方案中，所述能够将单糖添加至所述己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶是来自大肠杆菌O28的半乳糖呋喃糖基转移酶(wbeY)。在另一个具体实施方案中，所述能够将单糖添加至所述己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶是来自大肠杆菌O167的半乳糖呋喃糖基转移酶(wfdK)。在另一个具体实施方案中，所述能够将单糖添加至所述己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶是来自大肠杆菌O28的半乳糖呋喃糖基转移酶(wbeY)和来自大肠杆菌O167的半乳糖呋喃糖基转移酶(wfdK)。
在另一个具体实施方案中，本文提供的宿主细胞包含编码将供体寡糖或多糖重复单元组装至己糖单糖衍生物上的糖基转移酶的核酸。
在一个实施方案中，所述将供体寡糖或多糖重复单元组装至己糖单糖衍生物上的糖基转移酶包含能够将存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖添加至己糖单糖衍生物的糖基转移酶。示例性糖基转移酶包括半乳糖基转移酶(wciP)，例如来自大肠杆菌O21的wciP。
在一个实施方案中，所述将供体寡糖或多糖重复单元组装至己糖单糖衍生物上的糖基转移酶包含能够将邻近于存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖的单糖添加至存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖的糖基转移酶。示例性糖基转移酶包括葡糖基转移酶(wciQ)，例如来自大肠杆菌O21的wciQ。
寡糖基转移酶
寡糖基转移酶将脂质-连接的寡糖转移至包含N-糖基化共有基序(例如Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸；或Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸)的新生多肽链的天冬酰胺残基(参见WO 2006/119987)。参见例如WO 2003/074687和WO 2006/119987，其公开内容以其整体通过引用并入本文。
在某些实施方案中，本文提供的宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸。编码寡糖基转移酶的核酸可对宿主细胞是天然的，或可使用遗传方法引入宿主细胞中，如上文所描述。寡糖基转移酶可来自本领域已知的任一来源。在一个具体实施方案中，寡糖基转移酶是来自弯曲杆菌(Campylobacter)的寡糖基转移酶。在另一个具体实施方案中，寡糖基转移酶是来自空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的寡糖基转移酶(即pglB；参见例如Wacker等人，2002, Science 298：1790-1793；还参见例如NCBI基因ID：3231775, UniProt登录号O86154)。在另一个具体实施方案中，寡糖基转移酶是来自红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)的寡糖基转移酶(参见例如NCBI基因ID：7410986)。
翻转酶
在某些实施方案中，将翻转酶(Wzx)引入本文所述的宿主细胞(即，翻转酶与宿主细胞异源)。各种生物体的翻转酶(例如细菌翻转酶)是本领域已知的。翻转酶将野生型重复单元和/或其相应的工程改造(杂合)重复单元从胞浆转运至宿主细胞(例如大肠杆菌)的周质中。
在一个具体实施方案中，将荚膜多糖生物合成途径的翻转酶引入本文所述的宿主细胞。
在另一个具体实施方案中，将肺炎链球菌的荚膜多糖生物合成途径的翻转酶引入本文所述的宿主细胞。在某些实施方案中，引入本文所述的宿主细胞的翻转酶是来自肺炎链球菌CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A和B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15(A、B、C、F)、CP16(A、F)、CP17(A、F)、CP18(A、B、C、F)、CP19(A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22(A、F)、CP23(A、B、F)、CP24(A、B、F)、CP25(A、F)、CP26、CP27、CP28(A、F)、CP29、CP31、CP32(A、F)、CP33(A、B、C、D、F)、CP34、CP35(A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41(A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47(A、F)或CP48的荚膜多糖基因簇的wzx基因。在一个具体实施方案中，引入本文所述的宿主细胞的翻转酶是来自CP8、CP15A、CP16F、CP22F、CP23A、CP24F、CP31、CP33F、CP35B或CP38的荚膜多糖基因簇的wzx基因。
可以引入本文所述的宿主细胞的其他翻转酶来自以下中描述的肺炎链球菌：Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M,Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA等人: Genetic analysis of the capsularbiosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes. PLoS genetics 2006, 2(3):e31)。
在某些实施方案中，引入本文所述的宿主细胞的翻转酶来自埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。
聚合酶
在某些实施方案中，将聚合酶(Wzy)引入本文所述的宿主细胞(即，聚合酶与宿主细胞异源)。各种生物体的聚合酶(例如细菌聚合酶)是本领域已知的。
在一个具体实施方案中，将荚膜多糖生物合成途径的聚合酶引入本文所述的宿主细胞。
在另一个具体实施方案中，将肺炎链球菌的荚膜多糖生物合成途径的聚合酶引入本文所述的宿主细胞。
在某些实施方案中，引入本文所述的宿主细胞的聚合酶是来自肺炎链球菌CP1、CP2、CP4、CP5、CP6 (A和B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15(A、B、C、F)、CP16(A、F)、CP17(A、F)、CP18(A、B、C、F)、CP19(A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22(A、F)、CP23(A、B、F)、CP24(A、B、F)、CP25(A、F)、CP26、CP27、CP28(A、F)、CP29、CP31、CP32(A、F)、CP33(A、B、C、D、F)、CP34、CP35(A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41(A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47(A、F)或CP48的荚膜多糖基因簇的wzy基因。在一个具体实施方案中，引入本文所述的宿主细胞的聚合酶是来自CP8、CP15A、CP16F、CP22F、CP23A、CP24F、CP31、CP33F、CP35B或CP38的荚膜多糖基因簇的wzy基因。
可以引入本文所述的宿主细胞的其他聚合酶来自以下中描述的肺炎链球菌：Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M,Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA等人: Genetic analysis of the capsularbiosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes. PLoS genetics 2006, 2(3):e31)。
在某些实施方案中，引入本文所述的宿主细胞的聚合酶来自埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。
修饰单糖的酶
在某些实施方案中，将能够修饰单糖的酶引入本文所述的宿主细胞(即，能够修饰单糖的酶与宿主细胞异源)。此类酶包括例如差向异构酶和消旋酶。
各种生物体的差向异构酶和消旋酶(例如细菌差向异构酶和消旋酶)是本领域已知的。在某些实施方案中，引入本文所述的宿主细胞的差向异构酶和/或消旋酶来自埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。
在一个具体实施方案中，将来自大肠杆菌O157的差向异构酶Z3206引入本文所述的宿主细胞。
5.4 生物缀合物
在某些实施方案中，可使用本文描述的宿主细胞来产生包含连接至载体蛋白的本文描述的杂合寡糖或多糖的生物缀合物。使用宿主细胞产生此类生物缀合物的方法是本领域已知的。参见例如WO 2003/074687和WO 2006/119987，其各自以其整体通过引用并入本文。
如本文描述的生物缀合物具有优于化学产生的糖缀合物的有利性质，例如，生物缀合物在制造中需要更少化学品且在生成的最终产物方面更一致。因此，生物缀合物优于化学产生的糖缀合物。
本文所述的宿主细胞和方法允许产生新型杂合糖结构，其中特定糖的通常重复单元用于大多数最终糖，但第一重复单元在还原末端含有己糖单糖衍生物。此类杂合糖具有保留大多数糖的天然结构的优点，使得保留通常抗原，但在组装的寡糖或多糖的还原末端存在己糖单糖衍生物使其为糖基转移酶诸如PglB的适当底物，允许增加此类杂合糖与载体蛋白附接以产生生物缀合物的效率。下述特征适用于本发明的杂合寡糖或多糖或合成本发明的寡糖或多糖的方法。
本发明的一个进一步实施方案是具有以下结构的杂合寡糖或多糖
(B)n—A→
其中A是含有至少2、3、4、5、6、7或8个单糖的寡糖重复单元，其在还原末端具有己糖单糖衍生物(通过箭头表示)；
其中B是含有至少2、3、4、5、6、7或8个单糖的寡糖重复单元；
其中A和B是不同的寡糖重复单元；且
其中n为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、100或至少200：或
其中n为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、100或至少200。
在一个实施方案中，A是含有不超过20、15、12、10、9或8个单糖的寡糖。在一个实施方案中，B是含有不超过20、15、12、10、9或8个单糖的寡糖。在一个实施方案中，A和B是含有不超过20、15、12、10、9或8个单糖的寡糖。在一个实施方案中，n为不超过500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5。
在一个实施方案中，A是含有至少3个单糖的寡糖重复单元，且B是含有至少3个单糖的寡糖重复单元。在一个实施方案中，A是含有至少3个单糖的寡糖重复单元，且B是含有至少3个单糖的寡糖重复单元，且n为至少5。在一个实施方案中，A是含有至少3个单糖的寡糖重复单元，且B是含有至少3个单糖的寡糖重复单元，且n为至少20。
在一个实施方案中，A是含有至少4个单糖的寡糖重复单元，且B是含有至少4个单糖的寡糖重复单元。在一个实施方案中，A是含有至少4个单糖的寡糖重复单元，且B是含有至少4个单糖的寡糖重复单元，且n为至少5。在一个实施方案中，A是含有至少4个单糖的寡糖重复单元，且B是含有至少4个单糖的寡糖重复单元，且n为至少20。
在一个实施方案中，A是含有至少5个单糖的寡糖重复单元，且B是含有至少5个单糖的寡糖重复单元。在一个实施方案中，A是含有至少5个单糖的寡糖重复单元，且B是含有至少5个单糖的寡糖重复单元，且n为至少5。在一个实施方案中，A是含有至少5个单糖的寡糖重复单元，且B是含有至少5个单糖的寡糖重复单元，且n为至少20。
在一个实施方案中，A是含有至少6个单糖的寡糖重复单元，且B是含有至少6个单糖的寡糖重复单元。在一个实施方案中，A是含有至少6个单糖的寡糖重复单元，且B是含有至少6个单糖的寡糖重复单元，且n为至少5。在一个实施方案中，A是含有至少6个单糖的寡糖重复单元，且B是含有至少6个单糖的寡糖重复单元，且n为至少20。
在一个实施方案中，A是含有2-8个单糖的寡糖重复单元，且B是含有2-8个单糖的寡糖重复单元。在一个实施方案中，A是含有2-8个单糖的寡糖重复单元，且B是含有2-8个单糖的寡糖重复单元，且n为至少5且不超过500。在一个实施方案中，A是含有2-8个单糖的寡糖重复单元，且B是含有2-8个单糖的寡糖重复单元，且n为至少20且不超过100。
在一个实施方案中，A是含有2-10个单糖的寡糖重复单元，且B是含有2-10个单糖的寡糖重复单元。在一个实施方案中，A是含有2-10个单糖的寡糖重复单元，且B是含有2-10个单糖的寡糖重复单元，且n为至少5且不超过500。在一个实施方案中，A是含有2-10个单糖的寡糖重复单元，且B是含有2-10个单糖的寡糖重复单元，且n为至少20且不超过100。
在杂合寡糖或多糖的一个实施方案中，所述B寡糖重复在所述重复的还原末端含有己糖单糖。在杂合寡糖或多糖的一个实施方案中，在所述重复的还原末端的己糖单糖选自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、***糖醇、岩藻糖和甘露糖；适当地，选自葡萄糖和半乳糖。
在杂合寡糖或多糖的一个实施方案中，A的寡糖重复单元和B的寡糖重复单元的不同仅在于在所述重复的还原末端含有不同的单糖。
在杂合寡糖或多糖的一个实施方案中，A的寡糖重复单元是***荚膜糖的荚膜糖的重复单元，所述***荚膜糖例如组A链球菌荚膜糖、组B链球菌荚膜糖、肺炎链球菌荚膜糖、肠球菌荚膜糖或金黄色葡萄球菌荚膜糖；例如肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、12A、12B、12F、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、26、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35D、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F或48；合适地血清型8、12F、14、15A、16F、22F、23A、24F、31、33F、35B或38的荚膜糖的重复单元；或肺炎链球菌血清型2、3、6A、6B、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、26、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35D、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F或48的荚膜糖的重复单元。
在杂合寡糖或多糖的一个实施方案中，A的寡糖重复单元是选自血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII或VIII的组B链球菌荚膜糖的荚膜糖的重复单元。
在杂合寡糖或多糖的一个实施方案中，A的寡糖重复单元是血清型5或血清型8的金黄色葡萄球菌荚膜糖或粪肠球菌血清型A、B、C或D的荚膜糖的重复单元。
本发明的一个进一步方面是包含与上述杂合寡糖或多糖连接的如本文所述的载体蛋白的生物缀合物。
本发明的一个进一步方面是包含与杂合寡糖或多糖N-连接的载体蛋白的生物缀合物，其中所述杂合寡糖或多糖与供体寡糖或多糖相同，除了以下事实：所述杂合寡糖或多糖，除了包含所述供体寡糖或多糖的所有单糖之外，在第一重复单元的还原末端还包含己糖单糖衍生物。换言之，包含含有Asn-X-Ser/Thr共有序列的载体蛋白的生物缀合物(其天冬酰胺残基与杂合寡糖或多糖连接，其中所述杂合寡糖或多糖含有供体寡糖或多糖的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50个糖重复单元)和与载体蛋白N-连接的进一步重复单元(其中己糖单糖衍生物在所述进一步重复单元的还原末端处)。
在一个实施方案中，所述己糖单糖衍生物是其中C-2位被乙酰氨基修饰的任何单糖。合适的己糖单糖衍生物包括N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、HexNAc、脱氧HexNAc、2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧己糖(DATDH)、N-乙酰岩藻糖胺(FucNAc)或N-乙酰异鼠李糖胺(QuiNAc)。合适的己糖单糖衍生物为N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。
在一个实施方案中，所述杂合寡糖或多糖与***荚膜糖相同，除了以下事实：所述杂合寡糖或多糖在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖衍生物，代替通常存在于所述***荚膜糖的第一重复的还原末端的己糖单糖。
在一个实施方案中，所述***荚膜糖是组A链球菌荚膜糖、组B链球菌荚膜糖、肺炎链球菌荚膜糖、肠球菌荚膜糖或金黄色葡萄球菌荚膜糖。术语糖包括寡糖和多糖。
在一个实施方案中，所述***荚膜糖是肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、12A、12B、12F、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、26、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35D、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F或48荚膜糖；或肺炎链球菌血清型2、3、6A、6B、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、26、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35D、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F或48的荚膜糖；或合适地肺炎链球菌血清型8、12F、14、15A、16F、22F、23A、24F、31、33F、35B或38荚膜糖的重复单元。
在一个实施方案中，所述***荚膜糖是金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜糖。
在一个实施方案中，所述***荚膜糖是无乳链球菌(组B链球菌)血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII或VIII荚膜糖。
在一个实施方案中，所述***荚膜糖是粪肠球菌血清型A、B、C或D荚膜糖。
在一个实施方案中，所述载体蛋白是脱毒的绿脓假单胞菌外毒素A(EPA)、CRM197、麦芽糖结合蛋白(MBP)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌的溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚基(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌Sat蛋白、大肠杆菌Sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素和其脱毒变体、肺炎链球菌PhtD蛋白、空肠弯曲杆菌AcrA、空肠弯曲杆菌天然糖蛋白、PcrV(又名LcrV、EspA、SseB)、PopB (YopB、YopD、FliC)或OprF、OprI。在一个实施方案中，每种载体蛋白含有至少1、2、3、4、5或6个糖基化共有序列(例如Asn-X-Ser/Thr，更具体地Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro以外的任何天然氨基酸。
5.5 组合物
包含宿主细胞的组合物
在一个方面，本文提供包含本文描述的宿主细胞的组合物。此类组合物可用于生成本文描述的生物缀合物的方法中，例如，可在适于产生蛋白的条件下培养组合物。随后，可使用本领域已知的方法从所述组合物分离生物缀合物。
包含本文提供的宿主细胞的组合物可包含其他适于本文描述的宿主细胞的维持和存活的组分，且可另外包含通过宿主细胞产生蛋白所需或对其有益的额外组分，例如用于诱导型启动子的诱导剂，诸如***糖、IPTG。
包含生物缀合物的组合物
在另一个方面，本文提供包含一种或多种本文所述的生物缀合物的组合物(例如，药物组合物)。在一个具体实施方案中，本文提供的组合物包含一种或多种本文所述的生物缀合物。本文描述的组合物可用于治疗和预防已知具有抗原寡糖和/或多糖的细菌对个体(例如，人个体)的细菌感染。
在一个具体实施方案中，本文提供包含生物缀合物的组合物，其中所述生物缀合物包含杂合肺炎链球菌荚膜多糖。在另一个具体实施方案中，本文提供包含两种生物缀合物的组合物，其中所述生物缀合物各自包含不同的杂合肺炎链球菌荚膜多糖(即二价组合物)。在另一个具体实施方案中，本文提供包含三种生物缀合物的组合物，其中所述生物缀合物各自包含不同的杂合肺炎链球菌荚膜多糖(即三价组合物)。在一个具体实施方案中，所述肺炎链球菌荚膜多糖是CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A、B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15 (A、B、C、F)、CP16 (A、F)、CP17 (A、F)、CP18 (A、B、C、F)、CP19 (A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22 (A、F)、CP23(A、B、F)、CP24 (A、B、F)、CP25 (A、F)、CP 26、CP27、CP28 (A、F)、CP29、CP31、CP32 (A、F)、CP33 (A、B、C、D、F)、CP34、CP35 (A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41 (A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47 (A、F)或CP48。在一个具体实施方案中，所述三价组合物包含(i)包含杂合肺炎链球菌CP1荚膜多糖的生物缀合物；(ii)(i)包含杂合肺炎链球菌CP4荚膜多糖的生物缀合物；和(iii)(i)包含杂合肺炎链球菌CP14荚膜多糖的生物缀合物。
在一个具体实施方案中，本文提供包含生物缀合物的组合物，其中所述生物缀合物包含杂合金黄色葡萄球菌荚膜多糖，例如金黄色葡萄球菌荚膜多糖是CP5或CP8。
在一个具体实施方案中，本文提供包含生物缀合物的组合物，其中所述生物缀合物包含杂合无乳链球菌(GBS)荚膜多糖，例如无乳链球菌(组B，GBS) CPIa、CPIb、CPII、CPIII、CPIV、CPV、CPVI、CPVII或CPVIII。
在一个具体实施方案中，本文提供包含生物缀合物的组合物，其中所述生物缀合物包含杂合粪肠球菌荚膜多糖，例如粪肠球菌荚膜多糖CPA、CPB、CPC或CPD。
在某些实施方案中，除包含本文描述的生物缀合物外，本文描述的组合物(例如药物组合物)还包含药学上可接受的载体。如本文所使用，术语"药学上可接受的"意指已获得联邦或州政府管理机构批准或列于美国药典或其他公认药典中可用于动物(且更具体而言用于人)中。在药学上可接受的载体的背景中，如本文所使用的术语"载体"是指与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。也可采用盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液作为液体载体，具体而言用于可注射溶液。合适赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。合适药物载体的实例由E. W. Martin描述于"Remington'sPharmaceutical Sciences"中。
包含本文描述的生物缀合物的组合物可包含适用于药物施用的任何额外组分。在具体实施方案中，本文描述的组合物是单价制剂。在其他实施方案中，本文描述的组合物是多价制剂，例如二价、三价和四价制剂。例如，多价制剂包含多于一种本文所述的生物缀合物。
在某些实施方案中，本文描述的组合物额外包含防腐剂，例如汞衍生物硫柳汞。在一个具体实施方案中，本文描述的药物组合物包含0.001%至0.01%硫柳汞。在其他实施方案中，本文描述的药物组合物不包含防腐剂。
在某些实施方案中，本文描述的组合物(例如免疫原性组合物)包含佐剂，或与佐剂组合施用。与本文描述的组合物组合施用的佐剂可在施用所述组合物之前、同时或之后施用。在一些实施方案中，术语"佐剂"是指如下化合物：其当与本文描述的组合物结合或作为其一部分施用时增加、增强和/或加强对生物缀合物的免疫应答，但当单独施用化合物时不生成对生物缀合物的免疫应答。在一些实施方案中，佐剂生成对聚生物缀合物肽的免疫应答且不产生过敏或其他不良反应。佐剂可通过几种机制增强免疫应答，包括，例如，淋巴细胞募集、刺激B和/或T细胞和刺激巨噬细胞。
佐剂的具体实例包括但不限于铝盐(alum)(例如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝)、3去-O-酰化单磷酰基脂质A(MPL)(参见英国专利GB2220211)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、聚山梨醇酯80(Tween 80；ICL Americas,Inc.)、咪唑并吡啶化合物(参见国际申请号PCT/US2007/064857，公开为国际公开号WO2007/109812)、咪唑并喹喔啉化合物(参见国际申请号PCT/US2007/064858，公开为国际公开号WO2007/109813)和皂苷诸如QS21(参见Kensil等人，Vaccine Design：The Subunitand Adjuvant Approach (Powell和Newman编辑，Plenum Press, NY, 1995)；美国专利号5,057,540)。在一些实施方案中，佐剂是弗氏佐剂(完全或不完全)。其他佐剂是任选地与免疫刺激剂(诸如单磷酰基脂质A)组合的水包油型乳液(诸如角鲨烯或花生油)(参见Stoute等人，N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997))。另一佐剂是CpG(Bioworld Today, Nov.15, 1998)。
在某些实施方案中，本文描述的组合物被配制以适用于施用于个体的预期途径。例如，本文描述的组合物可被配制以适用于皮下、肠胃外、经口、皮内、经皮、结肠直肠、腹膜内和直肠施用。在一个具体实施方案中，药物组合物可被配制以用于静脉内、经口、腹膜内、鼻内、气管内、皮下、肌内、局部、皮内、经皮或肺部施用。
在某些实施方案中，本文描述的组合物额外包含一种或多种缓冲剂，例如磷酸盐缓冲剂和蔗糖磷酸盐谷氨酸盐缓冲剂。在其他实施方案中，本文描述的组合物不包含缓冲剂。
在某些实施方案中，本文描述的组合物额外包含一种或多种盐，例如氯化钠、氯化钙、磷酸钠、谷氨酸单钠和铝盐(例如氢氧化铝、磷酸铝、明矾(硫酸钾铝)或此类铝盐的混合物)。在其他实施方案中，本文描述的组合物不包含盐。
本文描述的组合物可与施用说明一起包括于容器、包装或分配器中。
可在使用之前储存本文描述的组合物，例如，组合物可冷冻(例如在约-20℃下或在约-70℃下)储存；储存于冷藏条件下(例如在约4℃下)；或储存在室温下。
5.6 预防和治疗用途
本文提供治疗和/或预防个体的细菌感染的方法，其包括向个体施用本文所述的生物缀合物或本文所述的组合物。在一个具体实施方案中，本文所述的组合物用于预防细菌感染个体(例如人个体)。可以使用本文提供的生物缀合物和/或组合物治疗和/或预防的细菌感染包括由以下引起的那些：埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。在一个具体实施方案中，本文所述的生物缀合物或本文所述的组合物用于治疗或预防链球菌属的感染。
本文还提供在个体中诱导针对细菌的免疫应答的方法，其包括向个体施用本文所述的生物缀合物或本文所述的组合物。在一个实施方案中，所述个体在施用时具有细菌感染。在另一个实施方案中，所述个体在施用时不具有细菌感染。本文提供的生物缀合物和/或组合物可用于诱导针对以下的免疫应答：埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。在一个具体实施方案中，本文所述的生物缀合物或本文所述的组合物用于诱导针对链球菌属的免疫应答。
本文还提供在个体中诱导产生针对细菌的调理吞噬抗体的方法，其包括向个体施用本文所述的生物缀合物或本文所述的组合物。在一个实施方案中，所述个体在施用时具有细菌感染。在另一个实施方案中，所述个体在施用时不具有细菌感染。本文提供的生物缀合物和/或组合物可用于诱导产生针对以下的调理吞噬抗体：埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。在一个具体实施方案中，本文所述的生物缀合物或本文所述的组合物用于诱导产生针对链球菌属的调理吞噬抗体。
组合治疗
在某些实施方案中，向个体施用本文描述的生物缀合物或本文描述的组合物与一种或多种其他治疗(例如抗细菌剂或免疫调节治疗)的组合。所述一种或多种其他治疗可有益于治疗或预防细菌感染或可改善与细菌感染相关的症状或病况。在一些实施方案中，所述一种或多种其他治疗是疼痛缓解剂或抗发烧药剂。在某些实施方案中，以下列方式施用各治疗：间隔小于5分钟、间隔小于30分钟、间隔1小时、间隔约1小时、间隔约1小时至约2小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时至约5小时、间隔约5小时至约6小时、间隔约6小时至约7小时、间隔约7小时至约8小时、间隔约8小时至约9小时、间隔约9小时至约10小时、间隔约10小时至约11小时、间隔约11小时至约12小时、间隔约12小时至18小时、间隔18小时至24小时、间隔24小时至36小时、间隔36小时至48小时、间隔48小时至52小时、间隔52小时至60小时、间隔60小时至72小时、间隔72小时至84小时、间隔84小时至96小时或间隔96小时至120小时。
本领域技术人员已知的任何抗细菌剂可与本文描述的生物缀合物或本文描述的组合物组合使用。抗细菌剂的非限制性实例包括阿米卡星、阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、两性霉素-B、氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、安普霉素、阿奇霉素、氨曲南、杆菌肽、苄基青霉素、卡泊芬净、头孢克洛、头孢羟胺苄、头孢胺苄、头孢噻吩、头孢唑林、头孢地尼、头孢吡肟、头孢克肟、头孢甲肟、头孢哌酮、头孢哌酮-舒巴坦、头孢噻肟、头孢西丁、头孢匹罗、头孢泊肟、头孢泊肟-克拉维酸、头孢泊肟-舒巴坦、头孢丙烯、头孢喹肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢噻呋、头孢托罗、头孢曲松、头孢呋辛、氯霉素(Chloramphenicole)、氟苯尼考(Florfenicole)、环丙沙星、克拉霉素、克林沙星、克林霉素、氯唑西林、粘菌素、Cotrimoxazol(Trimthoprim/磺胺甲噁唑)、达巴万星、达福普汀/Quinopristin、达托霉素、地贝卡星、双氯西林、多利培南、多西环素、恩氟沙星、厄他培南、红霉素、氟氯西林、氟康唑、氟胞嘧啶、磷霉素、夫西地酸、加雷沙星、加替沙星、吉米沙星、庆大霉素、亚胺培南、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、左氧氟沙星、林可霉素、利奈唑胺、氯碳头孢、Mecillnam(甲亚胺青毒素(amdinocillin))、美罗培南、甲硝唑、美洛西林、美洛西林-舒巴坦、米诺环素、莫西沙星、莫匹罗星、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥因、诺氟沙星、氧氟沙星、苯唑西林、培氟沙星、青霉素V、哌拉西林、哌拉西林-舒巴坦、哌拉西林-***巴坦、利福平、罗红霉素、司帕沙星、壮观霉素、螺旋霉素、链霉素、舒巴坦、磺胺甲噁唑、替考拉宁、特拉万星、泰利霉素、替莫西林、四环素、替卡西林、替卡西林-克拉维酸、替吉环素、妥布霉素、甲氧苄啶、曲伐沙星、泰洛星、万古霉素、维吉霉素和伏立康唑。
在某些实施方案中，组合治疗包括施用两种或更多种本文描述的生物缀合物(参见章节5.4)和/或本文描述的组合物。
施用的剂量和频率
将有效治疗和/或预防细菌感染的本文描述的生物缀合物或本文描述的组合物的量将取决于疾病性质，且可通过标准临床技术确定。可经由临床医师已知的各种途径来施用生物缀合物和/或组合物，例如皮下、肠胃外、静脉内、肌内、局部、经口、皮内、经皮、鼻内等。在一个实施方案中，经由肌内注射施用。
制剂中待采用的确切剂量还将取决于施用途径和感染的严重程度，且应根据从业医师的判断和各个体的情况来决定。例如，有效剂量还可根据以下因素而变化：施用方式、目标位点、患者的生理学状态(包括年龄、体重、健康)、患者是人还是动物、所施用的其他药剂和治疗是预防性还是治疗性的。最佳地，滴定治疗剂量以优化安全性和效力。
在某些实施方案中，采用体外测定以帮助鉴定最佳剂量范围。参见章节5.7。可从源自体外或动物模型测试***的剂量反应曲线外推有效剂量。
在某些实施方案中，用于基于生物缀合物的疫苗(例如包含生物缀合物的组合物)的示例性剂量范围为约0.1μg至400μg碳水化合物/剂量。在其他实施方案中，用于基于糖缀合物的疫苗(例如包含生物缀合物的组合物)的示例性剂量范围为约0.1μg至4000μg蛋白/剂量。在某些实施方案中，用于基于糖缀合物的疫苗(例如包含生物缀合物的组合物)的示例性剂量包含0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50μg碳水化合物/剂量。在某些实施方案中，用于基于糖缀合物的疫苗(例如包含生物缀合物的组合物)的示例性剂量包含50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μg蛋白/剂量。在某些示例性实施方案中，对于所包括的每种糖缀合物，用于施用于人的剂量对应于含有约1-10μg(例如约2-6μg，例如约4μg)多糖的0.5ml。
在某些实施方案中，将本文描述的生物缀合物或本文描述的组合物作为单一剂量施用于个体一次。在某些实施方案中，将本文描述的生物缀合物或本文描述的组合物作为单一剂量施用于个体，随后在3至6周后施用第二剂量。根据这些实施方案，可在第二次接种后以6至12个月间隔向个体施用加强接种。在某些实施方案中，加强接种可利用不同的生物缀合物或组合物。在一些实施方案中，可重复施用相同的生物缀合物或组合物且施用可间隔至少1天、2天、3天、5天、7天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。在某些实施方案中，将本文描述的生物缀合物或本文描述的组合物作为单一剂量每年一次施用于个体。
在某些实施方案中，将本文描述的生物缀合物或本文描述的组合物作为2、3、4、5或更多个剂量间隔2周、3周、4周、5周或6周施用于个体。在一些实施方案中，以0.1μg至0.5mg、0.1μg至0.4mg、0.1μg至0.3mg、0.1μg至0.2mg或0.1μg至0.1mg碳水化合物内容物的剂量将2、3、4、5或更多个剂量的本文描述的生物缀合物或本文描述的组合物间隔2、3、4、5或6周施用于个体。在某些实施方案中，所施用的生物缀合物或组合物每次是相同的。在某些实施方案中，所施用的生物缀合物或组合物每次是不同的。
5.7 测定
评价生物缀合物诱导免疫应答的能力的测定
可使用本领域技术人员已知或本文描述的任何方法来评价本文描述的生物缀合物/组合物在个体中生成免疫应答的能力。在一些实施方案中，可通过以下方式来评价生物缀合物在个体中生成免疫应答的能力：用本文描述的生物缀合物免疫个体(例如小鼠)或个体组和用对照(PBS)免疫额外个体(例如小鼠)或个体组。随后可用目标细菌攻击个体或个体组并可测定目标细菌在个体或个体组中引起疾病的能力。本领域技术人员将认识到，如果用对照免疫的个体或个体组患有随后用目标细菌攻击的疾病，但用本文描述的生物缀合物或其组合物免疫的个体或个体组更少患有疾病或不患有疾病，则生物缀合物能够在个体中生成免疫应答。可通过，例如，免疫测定(诸如ELISA)测试本文描述的生物缀合物或其组合物诱导与来自目标细菌的O抗原交叉反应的抗血清的能力。
体外杀细菌测定
可使用血清杀细菌测定(SBA)或调理吞噬杀灭测定(OPK)评价本文描述的生物缀合物在个体中生成免疫应答的能力，所述测定代表已用于获得基于糖缀合物的疫苗的批准的确立且被接受的方法。此类测定是本领域众所周知的且简而言之包括以下步骤：通过向个体(例如小鼠)施用引发针对靶标的抗体的化合物来生成和分离此类抗体。随后，可通过，例如，以下方式来评价抗体的杀细菌能力：在所述抗体和补体和(根据测定)嗜中性粒细胞存在的情况下培养所讨论的细菌并例如使用标准微生物方法测定抗体杀灭和/或中和细菌的能力。
6-实施例
实施例1：在大肠杆菌中合成CP14生物缀合物
本实施例描述了产生包含与衍生自供体多糖肺炎链球菌CP14的杂合多糖连接的载体蛋白的生物缀合物。所述杂合多糖在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖衍生物，代替存在于野生型肺炎链球菌CP14中的己糖单糖。申请人已经鉴定，翻转酶和聚合酶包含松弛的特异性，因此允许杂合多糖在异源宿主细胞中的工程改造。代替己糖单糖的己糖单糖衍生物的存在允许通过寡糖基转移酶(PglB)将杂合多糖转移至载体蛋白以在宿主细胞(大肠杆菌)中产生生物缀合物。本实施例中描述的方法可以容易地适应于在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖的任何寡糖或多糖，因此允许此类寡糖或多糖在宿主细胞中与载体蛋白连接(以形成生物缀合物)。
肺炎链球菌CP14的重复单位结构显示于图1中，且CP14基因簇显示于图2中。CP14的重复单元由b-D-Gal-1,4-b-D-GlcNAc-1,3-b-D-Gal-1,4-b-D-Glc-构成。图3说明本实施例中使用的糖工程改造方法的原理，其产生仅在其还原末端单糖中不同于野生型CP14的杂合CP14。
遵循国际专利申请号WO2014/072405(其以其整体通过引用并入本文)中描述的方法，将含有wchA至wciY的延伸的CP14基因簇的部分(参见图2)克隆至pDOC-C质粒(Lee DJ,Bingle LE, Heurlier K, Pallen MJ, Penn CW, Busby SJ, Hobman JL: Genedoctoring: a method for recombineering in laboratory and pathogenicEscherichia coli strains.BMC Microbiol 2009, 9:252)中，随后整合入大肠杆菌菌株W3310(包含waaL基因的缺失)代替可拉酸簇。如下所述，在某些实验中使用所得菌株大肠杆菌W3110可拉酸::CP14 ∆waaL。
为了产生糖工程改造的CP14亚基(在还原末端包含己糖单糖衍生物的重复单元)，使用来自鲍氏志贺氏菌(Shigella boyedii)的半乳糖基转移酶(WfeD)。已报道，WfeD将Gal从UDP-Gal转移至- GlcNAc-P-P-十一异戊烯基。首先，通过WecA(其存在于合成ECA的所有革兰氏阴性细菌和制备磷壁酸的***中)在UndP上从UDP-GlcNAc组装GlcNAc(Annu Rev Microbiol.2013;67:313-36; Glycobiology.2011 Feb;21(2):138-51.)，以制备β(1,4)键(J Bacteriol.2011 Jan;193(2):449-59)。该反应的产物是二糖Gal-GlcNAc-P-P-十一异戊烯基。此后，分别将GlcNAc和Gal添加至β-D-Gal-1,4- β -D-GlcNAc-PP-Und的来自肺炎链球菌CP14簇的WchL和WchM用于产生CP14工程改造的亚基，β -D-Gal-1,4- β-D-GlcNAc-1,3- β -D-Gal-1,4- β -D-GlcNAc-PP-Und(图4D)。基于上述基因的组合产生的合成质粒(pGVX1190)的示意图显示于图4A。
在大肠杆菌宿主细胞的胞浆中产生上述CP14工程改造的亚基。然而，对于多糖形成，亚基需要被转运至周质中，在周质中野生型多糖(CP14)可以在其上组装。为了测试CP14生物合成途径的翻转酶是否能够转位工程改造的亚基，将CP14 wzx基因(翻转酶)添加至质粒pGVX1190以产生pGVX1366(图4B)。将两种质粒转化至缺乏O抗原翻转酶的大肠杆菌Sф874细胞中。只有当CP14的翻转酶(Wzx)存在时，蛋白酶K消化的来自用质粒转化的大肠杆菌Sф874的样品的银染色显示对应于在脂质A核心上组装的CP14工程改造的亚基的条带(图4C)。该结果表明可以产生CP14工程改造的亚基，并且CP14的翻转酶(Wzx)能够将其转位至周质中，在周质中大肠杆菌的O抗原连接酶WaaL将其转移至脂质A核心。
为了证实CP14工程改造的亚基的结构，将pGVX1366或其相应的空载体转化至大肠杆菌Sф874 ∆waaL中，使细胞生长，诱导后收获，并将LLO纯化并用2AB标记并进行HPLC(图5)。收集在57分钟洗脱的独特峰，并进行质谱分析(图5A)。已经证明，寡糖的单糖组成与提出的CP14工程改造的亚基相匹配(图5B)。
为了证实CP14工程改造的亚基可以被空肠弯曲杆菌PglB转移，用(i)pGVX970(其包含空肠弯曲杆菌PglB)、(ii)编码AcrA(载体蛋白)的pGVX1和(iii)pGVX1366(参见上文)或其相应的空载体(pGVX81)转化大肠杆菌Sф874 ∆waaL细胞。诱导后，从周质中提取蛋白并通过IMAC富集，并进行Western印迹分析(图6A)。仅在用质粒pGVX1366转化的细胞中观察到对应于糖基化的AcrA的条带(图6A，泳道2)，但在用空载体转化的细胞中没有观察到(图6A，泳道1)。通过质谱分析相同的纯化蛋白，并证实CP14工程改造的亚基与AcrA连接(图6Bii)。因此，证实了工程改造的(杂合)CP14是PglB的底物。
为了增加野生型CP14的生产率并增强工程改造的CP14质粒pGVX1366的聚合，将其用CP14 wchJ -wchk(将Gal添加至UndPP-Glc)和CP14 wzy进一步延伸。图7显示合成质粒pGVX1433的基因组织。
为了证明杂合CP14多糖可以在大肠杆菌W3110可拉酸::CP14 ∆waaL细胞中产生(参见国际专利申请号WO2014/072405)，将宿主细胞用表达RcsA的质粒(野生型CP14的活化和产生所需)和工程改造的pGVX1433或其相应的空载体转化(图8)。诱导细胞后，用蛋白酶K消化全细胞提取物，并在SDS-PAGE上分离出糖脂，并使用血清分型CP14抗体进行Western印迹分析。用CP14工程改造的质粒或其相应的空载体转化的两种大肠杆菌菌株都可以产生由抗CP14抗体识别的LLO。这表明两种细胞都可以产生正确的CP14多糖结构(图8A)。诱导后收获细胞，并纯化LLO，用2AB标记并进行HPLC(图8B)。显示携带CP14工程改造的质粒的细胞产生与CP14野生型相同的多糖，除了其连接至GlcNAc-2AB，而在空载体存在的情况下，多糖连接至Glc-2AB(如CP14野生型中)。这令人惊讶地证明，CP14聚合酶不仅聚合CP14重复单元，而且在工程改造的CP14亚基上组装野生型聚合物，其随后终止聚合反应(因为在CP14多糖中间没有检测到工程改造的亚基)。
为了证明仅通过PglB可以有效地转移工程改造的CP14聚合物，用RcsA质粒(CP14合成的活化物)、pGVX970(表达PglB)、pGVX1(表达蛋白载体AcrA)和CP14 eng.质粒(pGVX1433)转化大肠杆菌W3110 (可拉酸::CP14, ∆waaL, ∆wecA-wzzE)和大肠杆菌W3110 (CA:CP14 ΔwaaL)(图9)。诱导后，收获大肠杆菌细胞，并将全细胞蛋白酶K消化的提取物(图9A)或从周质中提取并通过IMAC富集的蛋白使用分型CP14抗体作为一抗进行Western印迹分析(图9B)。如小图A中所示，所有菌株都产生由抗CP14抗体识别的LLO(图9A泳道1和2)；然而，仅在大肠杆菌W3110 (可拉酸::CP14, ∆waaL)中表达CP14工程改造亚基的菌株中检测到糖蛋白(CP14-AcrA)(图9A，泳道1)，但在大肠杆菌W3110 (可拉酸::CP14,∆waaL, ∆wecA-wzzE)中没有检测到(图9A，泳道2)。该菌株缺乏WecA(将GlcNAc添加至UndPP的引发转移酶)，因此不能产生工程改造的CP14。这清楚地表明，在工程改造的CP14亚基上组装的CP14可以被PglB转移至蛋白载体(AcrA)，而不能有效地转移野生型CP14多糖。
为了证明工程改造的CP14聚合物可以被PglB转移至不同的蛋白载体，用CP14eng.质粒(pGVX1433)和用于表达RcsA的质粒pGVX970以及pGVX538 (表达载体蛋白EPA)转化大肠杆菌W3110可拉酸::CP14, ∆waaL细胞。诱导后收获所有样品，并从周质提取蛋白，并通过IMAC富集。通过SDS-PAGE(4-12％凝胶)分离富集的蛋白样品，并将其电印迹至硝酸纤维素膜上，然后与抗His抗体(图10，小图A)或分型CP14抗体(图10，小图B)一起孵育。当使用抗His或抗CP14抗体时，观察到反应性阶梯状条带，表明工程改造的CP14可以与EPA缀合。此外，使相同的细胞在生物反应器中生长并进行纯化(图11)。使用传统的离子交换色谱和凝集素(蓖麻(Ricinus communis)凝集素)亲和色谱，获得纯化的缀合物(图11C)。
实施例2：在大肠杆菌中合成CP33F生物缀合物
实施例1表明，可以通过用己糖单糖衍生物替代己糖单糖来修饰在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖的寡糖或多糖，因此允许此类杂合寡糖或多糖在宿主细胞中与载体蛋白连接(以形成生物缀合物)。如实施例1中所述，异源宿主细胞中糖基化机制(翻转酶，聚合酶)的松弛特异性是宿主细胞中杂合寡糖或多糖的产生的基础。本实施例描述了宿主细胞中另一种杂合多糖肺炎链球菌CP33F的工程改造，并证实杂合多糖是宿主细胞中PglB的底物。
CP33F基因簇描绘于图12中，且肺炎链球菌CP33F的重复单元结构显示于图1中。CP33F的重复单元由β -D-Galf-1,3- β -D-Gal-1,3- α -D-Gal(α1,2-D-Gal)-1,3- β -D-Galf-1,3-D-Glc-构成。
将含有wchA至glF的延伸的CP33F基因簇的部分(参见图12)克隆至pDOC-C质粒中(PLoS Genet.2006 Mar;2(3):e31.)并整合至大肠杆菌W3110可拉酸簇中，如国际专利申请公开号WO2014/072405中所述。产生在RcsA的控制下产生CP33F的大肠杆菌W3110可拉酸::CP33F，并用于以下实验(图13A)。此外，为了改进用于下一步骤的生物缀合物的产生，将大肠杆菌WW3110可拉酸::CP33F的连接酶(waaL)替换为空肠弯曲杆菌pglB，以产生菌株大肠杆菌W3110可拉酸::CP33FwaaL::pglB。如图13B中所示，大肠杆菌W3110可拉酸::CP33FwaaL::pglB产生与大肠杆菌W3110可拉酸::CP33F相当的量的LLO。
为了合成糖工程改造的CP33F亚基(在还原末端包含己糖单糖衍生物的重复单元)，使用两种半乳糖呋喃糖基转移酶，来自大肠杆菌O28的WbeY和来自大肠杆菌O167的WfdK。从大肠杆菌O28和大肠杆菌O167 LPS的结构预测，两种结构由经由β(1,3)键连接至还原GlcNAc的Galf构成(Carbohydr Res.(1996) 127-39, Eur. J. Biochem. 246 (1997)565-573 )。因此，预计WbeY和WfdK可以将Galf转移至- GlcNAc-P-P-十一异戊烯基。通过WecA(其存在于所有合成ECA的革兰氏阴性细菌和制备磷壁酸的***中)在UndP上从UDP-GlcNAc组装GlcNAc(Annu Rev Microbiol.2013;67:313-36; Glycobiology.2011Feb;21(2):138-51.)，以制备β(1,3)键(J Bacteriol.2011 Jan;193(2):449-59)。此后，使用来自肺炎链球菌CP33F基因簇的糖基转移酶WciC、WciD、WciE和WciF，完成CP33F工程改造的亚基(β -D-Galf-1,3- β -D-Gal-1,3- α -D-Gal(α1,2-D-Gal)-1,3- β -D-Galf-1,3-D-GlcNAc-PP-Undd)的合成(图14B)。用于产生工程改造的CP33F亚基的合成质粒的示意图基因组织说明于图14A中(pGVX2342)。该质粒在胞浆中产生CP33F工程改造的亚基，其通过CP33F的翻转酶从胞浆转位入周质中，可以在周质中通过CP33F聚合酶(wzy)的作用将野生型多糖组装在其上。质粒pGVX2342还含有CP33F聚合酶(wzy)和大肠杆菌O16 galE和glf，以增强野生型聚合酶以及工程改造的亚基的生产率(图14A)。
为了表明CP33F的聚合酶(wzx)具有松弛的聚糖特异性并且可以将工程改造的CP33F重复单元从胞浆转移至周质中，大肠杆菌W3110用质粒pGVX2342(图14)或含有所有CP33F的产生必需的基因(除了CP33F翻转酶(wzx))的相应质粒(pGVX2098)转化。诱导后，收获细胞并进行蛋白酶K消化。消化的细胞在SDS-PAGE 4-12%上进行，并进行银染或电印迹在硝酸纤维素上，并使用分型CP33F抗体进行Western印迹分析。如图15A中所示，仅在用质粒pGVX2342转化的大肠杆菌细胞中检测到脂质A核心上的额外条带(图15A，泳道2)，但在用缺乏CP33F翻转酶的pGVX2098转化的大肠杆菌细胞中没有检测到(图15A，泳道1)。通过使用抗CP33F抗体的Western印迹也检测到该条带(图15B，泳道2)，表明CP33F工程改造的重复单元被产生并转位至大肠杆菌的周质中，在周质中O抗原连接酶(WaaL)将其转移至脂质A核心。有趣的是，该实验表明CP33F工程改造的亚基可以被针对野生型CP33F产生的抗体识别，并且它们共享类似的免疫原性表位。
为了验证CP33F工程改造的亚基的结构，将pGVX2342或其相应的空载体转化至大肠杆菌Sф874 ∆waaL细胞中。诱导后，收获细胞，并纯化LLO并用2AB标记并进行HPLC(图16)。HPLC色谱(图16，小图A)显示在72分钟洗脱的独特峰。收集该峰并进行质谱分析，并表明寡糖的单糖组成与提出的CP33F工程改造的亚基相匹配(图16，小图B)。
为了表明CP33F工程改造的亚基可以被空肠弯曲杆菌PglB转移，用pGVX970(编码空肠弯曲杆菌PglB)、pGVX1(编码AcrA蛋白载体)和pGVX2305(编码工程改造的CP33F亚基)或其对应的空载体(pGVX1387)转化大肠杆菌Sф874 ∆waaL细胞。诱导后，从周质中提取蛋白并通过IMAC富集，并进行Western印迹分析(图17)。仅当存在质粒pGVX1366时才观察到对应于糖基化AcrA的条带(图17A，泳道2)，但对于空载体没有观察到(图17A，泳道1)。此外，使用分型抗CP33F抗体的相同纯化的蛋白的Western印迹分析显现来自从携带CP33F工程改造的质粒的大肠杆菌细胞提取的蛋白样品的条带(图17B，泳道2)，而对于相应的空载体则没有显现(图17B，泳道1)。这表明仅CP33F工程改造的亚基可以被PglB有效地转移至蛋白载体。
为了表明工程改造的CP33F聚合物可以被PglB转移并且野生型CP33F多糖不是PglB底物，将大肠杆菌W3110 (可拉酸::CP33FwaaL::pglB ∆wecA-wzzE)细胞用RcsA质粒(CP33F合成的活化物)、pGVX970(表达PglB)、表达EPA(蛋白载体)的pGVX2310和CP33F工程改造的质粒(pGVX2342)或其相应的空载体转化(图18)。诱导后，收获大肠杆菌细胞，并对于全细胞蛋白酶K消化的提取物(图18A)或从周质提取并通过IMAC富集的蛋白(图18B和C)进行Western印迹分析。使用分型CP33F抗体作为分析蛋白酶K消化的提取物的一抗的Western印迹分析显示所有菌株都产生LLO(梯样模式)(图18A)。然而，仅在携带CP33F工程改造的质粒的菌株中检测到糖蛋白(CP33F-EPA)(图18B和C；泳道3和4)，而对于空载体则没有检测到(图18B和C；泳道1和2)。这清楚地表明，当蛋白载体在工程改造的CP33F亚基上组装时(即，当被工程改造为在第一重复单位的还原末端包含己糖单糖衍生物代替己糖单糖的杂合多糖时)，CP33F被PglB转移至蛋白载体。
实施例3：使用不同的修饰方法在大肠杆菌中合成CP14缀合物
实施例1和2描述了如何修饰宿主细胞背景，以使得宿主细胞能够产生在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖衍生物代替己糖单糖的杂合寡糖或多糖。实施例1和2还表明，令人惊讶的是，某些糖基化机制(翻转酶、聚合酶)的松弛特异性允许在异源宿主细胞中产生此类杂合寡糖或多糖。本实施例表明制备杂合寡糖或多糖的替代方法，所述杂合寡糖或多糖也是宿主细胞中PglB的底物。具体而言，本实施例表明，通过将己糖单糖衍生物添加至在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖的供体寡糖或多糖，可以产生作为PglB的底物的杂合寡糖或多糖。此外，本实施例证明，令人惊讶的是，根据本实施例产生的杂合寡糖或多糖是PglB的极其有效的底物。最后，本实施例表明，根据本实施例产生的包含杂合寡糖或多糖的生物缀合物在体内是功能性和免疫原性的。
将来自肺炎链球菌CP14的野生型基因簇的基因(参见图19A)克隆并整合至大肠杆菌染色体中，代替大肠杆菌W3110可拉酸簇，如国际专利申请号WO 2014/072405中所述。所得遗传修饰的大肠杆菌产生野生型CP14(野生型CP14的一个重复单元(RU)的结构呈现于图19B中)。
接下来，产生能够产生与野生型(即CP14)重复单元相似的修饰的寡糖的合成基因簇(除了其在还原末端含有额外单糖，其中所述额外单糖是己糖单糖衍生物)(参见图20)。通常，通过组合具有已知功能的几种糖基转移酶来实现该寡糖的产生。具体步骤为：首先，在大肠杆菌宿主细胞中通过WecA在UndP上从UDP-GlcNAc组装GlcNAc(参见上文)。然后，来自大肠杆菌O157的Z3206差向异构酶将GlcNAcUndPP转化为GalNAcUndPP。接下来，来自大肠杆菌O21的wciQ将葡萄糖(Glc)经由b(1,3)键添加至GlcNAcUndPP以形成Glc b(1,3)GlcNAc。接下来，大肠杆菌O21 wciP将Gal经由b(1,4)键添加至二糖以形成三糖Gal b(1,4)Glc b(1,3) GalNAcUndPP。最后，来自肺炎链球菌CP14的wchL(GlcNAc转移酶)和wchM(半乳糖基转移酶)完成重复单元的组装(参见图20)。所得杂合重复单元包含以下：(i)在还原末端的己糖单糖衍生物和(ii)来自肺炎链球菌CP14的第一重复单元。
通过来自空肠弯曲杆菌的翻转酶(PglK)(使用标准重组技术将该翻转酶引入大肠杆菌宿主细胞)，工程改造的(杂合)亚基能够从宿主细胞的胞浆转位至宿主细胞的周质。一旦被翻转酶转位，通过大肠杆菌宿主细胞中存在的肺炎链球菌聚合酶在工程改造的(杂合)亚基的顶部聚合野生型CP14多糖，再次令人惊讶地表明对产生杂合CP14多糖必不可少的聚合酶的松散特异性。参见图21。
接下来，确定PglB能够将工程改造的CP14聚合物转移至载体蛋白EPA(参见图22)，导致产生可纯化的杂合CP-14-EPA生物缀合物(参见图23)。令人惊讶的是，确定本实施例中描述的修饰的宿主细胞能够产生非常高产量的杂合CP-14-EPA生物缀合物。事实上，使用本实施例的方法产生的杂合CP-14-EPA生物缀合物的产量是实施例1中产生的CP-14-EPA生物缀合物的产量的70倍。
接下来，评价杂合CP-14-EPA生物缀合物的功能性和免疫原性。用纯化的杂合CP-14-EPA生物缀合物或作为对照的Prevnar 13免疫新西兰白雌兔。参见图24。如图25中所示，根据本实施例产生的杂合CP-14-EPA生物缀合物保持功能性并且是高度免疫原性的。
实施例4：在大肠杆菌中合成CP15A生物缀合物
实施例1表明，可以通过用己糖单糖衍生物替代己糖单糖来修饰在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖的寡糖或多糖，因此允许此类杂合寡糖或多糖在宿主细胞中与载体蛋白连接(以形成生物缀合物)。如实施例1中所述，异源宿主细胞中糖基化机制(聚合酶)的松弛特异性是宿主细胞中杂合寡糖或多糖的产生的基础。本实施例描述了宿主细胞中另一种杂合多糖肺炎链球菌CP15A的工程改造，并证实杂合多糖是宿主细胞中PglB的底物。
CP15A基因簇描绘于图27中，且肺炎链球菌CP15A的重复单元结构显示于图28中。CP15A的重复单元由以下构成：
α-D-Gal-1,2-β-D-Gal-1,4-[Gro-2-P-3]-β-D-GlcNAc-1,3-β-D-Gal-1,4-D-Glc-。
将大肠杆菌W3110的连接酶(waaL)替换为空肠弯曲杆菌pglB，以产生菌株大肠杆菌W3110 waaL::pglB (StGVXN8011)。作为下一步，将含有wchA至gtp3的延伸的CP15A基因簇的部分(参见图27)克隆至pDOC质粒(PLoS Genet.2006 Mar;2(3):e31.)中并整合至如国际专利申请公开号WO2014/072405中所述的大肠杆菌W3110 waaL::pglB (StGVXN8011)可拉酸簇中，以产生StGVXN9510。产生在RcsA的控制下产生CP15A的大肠杆菌W3110可拉酸::CP15A waaL::pglB，并用于以下实验(图30)。
为了合成糖工程改造的CP15A亚基(在还原末端包含己糖单糖衍生物的重复单元)，使用来自大肠杆菌O21的葡糖基转移酶WclQ和半乳糖基转移酶WclP，来自肺炎链球菌CP14的N-乙酰葡糖胺转移酶WchL和半乳糖基转移酶WchM，来自大肠杆菌O157的差向异构酶Z3206，来自肺炎链球菌CP15A的半乳糖基转移酶WchN和来自空肠弯曲杆菌的翻转酶PglK(图29A)。通过WecA(其存在于所有合成ECA的革兰氏阴性细菌和制备磷壁酸的***中)在UndP上从UDP-GlcNAc组装GlcNAc(Annu Rev Microbiol.2013;67:313-36;Glycobiology.2011 Feb;21(2):138-51.)，以制备β(1,3)键(J Bacteriol.2011 Jan;193(2):449-59)，并通过差向异构酶Z3206转化为Und-PP-GalNAc。此后，使用糖基转移酶WclQ和WclP (Journal of Microbiological Methods.2008; 75(2):329-334)，分别添加葡萄糖和半乳糖作为第2和第3糖部分。在下文中，来自肺炎链球菌CP14的WchL和WchM分别添加N-葡糖胺部分和半乳糖部分，并且来自肺炎链球菌CP15A的WchN添加半乳糖作为末端部分以完成工程改造的亚基α -D-Gal-1,2- β -D-Gal-1,4- β -D-GlcNAc-1,3- β -D-Gal-1,4-β -D-Glc-1,3-D-GalNAc-(图29B)。用于产生工程改造的CP15A亚基的合成质粒的示意图基因组织说明于图29A中(pGVX3058)。该质粒在胞浆中产生CP15A工程改造的亚基，其通过来自空肠弯曲杆菌的翻转酶PglK从胞浆转位入周质中，可以在周质中通过CP15A聚合酶(wzy)的作用将野生型多糖组装在其上。
为了表明工程改造的CP15A亚基可以是CP15A聚合酶(wzy)的底物并且被并入野生型CP15A聚合物中并被PglB转移至载体蛋白上，将大肠杆菌W3110 (可拉酸::CP15A waaL::pglB)细胞用RcsA质粒(CP15A合成的活化物)、表达载体蛋白AcrA的pGVX2703、表达CP15A的工程改造的质粒pGVX3058或其相应的空载体转化(图30)。诱导后，收获大肠杆菌细胞，并对于全细胞蛋白酶K消化的提取物(图30A)或从周质提取并通过IMAC富集的蛋白(图30 B和30C)进行Western印迹分析。使用分型CP15A抗体作为分析蛋白酶K消化的提取物的一抗的Western印迹分析显示所有菌株都产生LLO(梯样模式)(图30A，线条1和2)。然而，仅在携带CP15A工程改造的质粒的菌株中检测到糖蛋白(CP15A-AcrA)(图30B和30C；泳道2)，而对于空载体则没有检测到(图30B和30C；泳道1)。这清楚地表明，当蛋白载体在工程改造的CP15A亚基上组装时(即，当被工程改造为在第一重复单位的还原末端包含己糖单糖衍生物代替己糖单糖的杂合多糖时)，CP15A被PglB转移至蛋白载体。
等效方案：
本文公开的方法、宿主细胞和组合物不应通过本文所述的具体实施方案限制范围。事实上，除了所述的方法、宿主细胞和组合物以外，对所述方法、宿主细胞和组合物的各种改变，对于本领域技术人员而言，从前面的描述和附图将变得显而易见。此类改变意图落入所附权利要求的范围之内。
本文引用各种出版物、专利和专利申请，其公开内容以其整体通过引用并入。

Claims (97)

1.具有以下结构的杂合寡糖或多糖
(B)n—A→
其中A是含有至少2、3、4、5、6、7或8个单糖的寡糖重复单元，其在还原末端具有己糖单糖衍生物(通过箭头表示)；
其中B是含有至少2、3、4、5、6、7或8个单糖的寡糖重复单元；
其中A和B是不同的寡糖重复单元；且
其中n为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或至少20。
2.权利要求1的杂合寡糖或多糖，其中所述B寡糖重复在所述重复的还原末端含有己糖单糖。
3.权利要求2的杂合寡糖或多糖，其中在所述重复的还原末端的己糖单糖选自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、***糖醇、岩藻糖和甘露糖。
4.权利要求1-3中任一项的杂合寡糖或多糖，其中A的寡糖重复单元和B的寡糖重复单元的不同仅在于在所述重复的还原末端含有不同的单糖。
5.权利要求1-4中任一项的杂合寡糖或多糖，其中A的寡糖重复单元是***荚膜糖的荚膜糖的重复单元，所述***荚膜糖例如组A链球菌荚膜糖、组B链球菌荚膜糖、肺炎链球菌荚膜糖、肠球菌荚膜糖或金黄色葡萄球菌荚膜糖。
6.权利要求1-5中任一项的杂合寡糖或多糖，其中A的寡糖重复单元是肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、12A、12B、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、26、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35D、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F或48的荚膜糖的重复单元。
7.生物缀合物，其包含与权利要求1-6中任一项的杂合寡糖或多糖连接的载体蛋白。
8.包含与杂合寡糖或多糖N-连接的载体蛋白的生物缀合物，其中所述杂合寡糖或多糖与供体寡糖或多糖相同，除了以下事实：所述杂合寡糖或多糖，除了包含所述供体寡糖或多糖的所有单糖之外，在第一重复单元的还原末端还包含己糖单糖衍生物。
9.权利要求7或8的生物缀合物，其中所述己糖单糖衍生物是其中C-2位被乙酰氨基修饰的任何单糖，诸如N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧己糖(DATDH)、N-乙酰岩藻糖胺(FucNAc)或N-乙酰异鼠李糖胺(QuiNAc)。
10.权利要求9的生物缀合物，其中所述己糖单糖衍生物为N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。
11.权利要求7-10中任一项的生物缀合物，其中所述杂合寡糖或多糖与***荚膜糖相同，除了以下事实：所述杂合寡糖或多糖在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖衍生物，代替通常存在于所述***荚膜糖的第一重复的还原末端的己糖单糖。
12.权利要求11的生物缀合物，其中所述***荚膜糖是组A链球菌荚膜糖、组B链球菌荚膜糖、肺炎链球菌荚膜糖、肠球菌荚膜糖或金黄色葡萄球菌荚膜糖。
13.权利要求12的生物缀合物，其中所述***荚膜糖是肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、12A、12B、12F、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、26、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、35D、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F或48荚膜糖。
14.权利要求13的生物缀合物，其中所述***荚膜糖是肺炎链球菌血清型8、12F、14、15A、16F、22F、23A、24F、31、33F、35B或38荚膜糖。
15.权利要求12的生物缀合物，其中所述***荚膜糖是金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜糖。
16.权利要求12的生物缀合物，其中所述***荚膜糖是无乳链球菌(组B链球菌)血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII或VIII荚膜糖。
17.权利要求12的生物缀合物，其中所述***荚膜糖是粪肠球菌血清型A、B、C或D荚膜糖。
18.权利要求7-17中任一项的生物缀合物，其中所述载体蛋白是脱毒的绿脓假单胞菌外毒素A(EPA)、CRM197、麦芽糖结合蛋白(MBP)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌的溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚基(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌Sat蛋白、大肠杆菌Sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素和其脱毒变体、空肠弯曲杆菌AcrA、空肠弯曲杆菌天然糖蛋白、PcrV(又名LcrV、EspA、SseB)、PopB (YopB、YopD、FliC)或OprF、OprI。
19.合成以下结构的寡糖或多糖的方法
(B)n—A→
其中A是(任选地含有至少2、3、4、5、6、7或8个单糖的)寡糖重复单元，其在还原末端具有己糖单糖衍生物(通过箭头表示)；
其中B是(任选地含有至少2、3、4、5、6、7或8个单糖的)寡糖重复单元；
其中A和B是不同的寡糖重复单元；且
其中n为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或至少20；
所述方法包括：将A和B与多糖聚合酶孵育。
20.权利要求19的方法，其中所述接触步骤在体外进行。
21.权利要求19的方法，其中所述接触步骤在原核细胞中，任选地在原核细胞的周质中进行。
22.权利要求19的方法，其中所述多糖聚合酶是wzy多糖聚合酶。
23.权利要求19的方法，其中A在还原末端具有己糖单糖衍生物(通过箭头表示)，且B在还原末端具有己糖，且其中A和B在其他方面相同。
24.权利要求19的方法，其中A与B具有相同的结构，其中一个差别是A在还原末端具有额外单糖。
25.权利要求24的方法，其中所述额外单糖是己糖单糖衍生物。
26.权利要求19至25中任一项的方法，其中所述己糖单糖衍生物或额外单糖是其C-2位被乙酰氨基修饰的任何单糖，诸如N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧己糖(DATDH)、N-乙酰岩藻糖胺(FucNAc)、N-乙酰异鼠李糖胺(QuiNAc)，或其中所述己糖单糖衍生物是GlcNAc、HexNAC、脱氧HexNAc或2,4-二乙酰氨基-2, 4, 6-三脱氧己糖。
27.权利要求19至26中任一项的方法，其中所述聚合酶来自埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。
28.权利要求19至27中任一项的方法，其中所述供体寡糖或多糖重复单元是肺炎链球菌荚膜多糖CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A、B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10(A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15 (A、B、C、F)、CP16 (A、F)、CP17 (A、F)、CP18 (A、B、C、F)、CP19 (A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22 (A、F)、CP23 (A、B、F)、CP24 (A、B、F)、CP25 (A、F)、CP 26、CP27、CP28 (A、F)、CP29、CP31、CP32 (A、F)、CP33 (A、B、C、D、F)、CP34、CP35 (A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41 (A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47 (A、F)或CP48的重复单元。
29.原核宿主细胞，其包含：
a) 编码产生寡糖或多糖重复单元的糖基转移酶的核酸，其中所述重复单元在还原末端不包含己糖，且其中所述寡糖或多糖重复单元衍生自在还原末端包含己糖的供体寡糖或多糖重复单元；和
b) 编码包含N-糖基化共有序列的载体蛋白的核酸；和
c) 编码寡糖基转移酶的核酸；和任选地
d) 编码聚合酶(wzy)的核酸，其中所述聚合酶催化杂合寡糖或多糖的产生，其中所述杂合寡糖或多糖(i)在所述第一重复单元的还原末端包含己糖单糖衍生物，且(ii)在所有其他重复单元的还原末端包含己糖单糖。
30.权利要求29的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含足以合成所述供体寡糖或多糖重复单元的糖基转移酶。
31.权利要求30的宿主细胞，其中所述足以合成所述供体寡糖或多糖重复单元的糖基转移酶作为操纵子或基因簇或其部分存在于所述宿主细胞中。
32.权利要求29-31中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够产生杂合寡糖或多糖，其中所述杂合寡糖或多糖与所述供体寡糖或多糖相同，除了所述杂合寡糖或多糖在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖衍生物，代替通常存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖。
33.权利要求29-32中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够产生杂合寡糖或多糖，其中所述杂合寡糖或多糖与所述供体寡糖或多糖相同，除了以下事实：所述杂合寡糖或多糖，除了包含所述供体寡糖或多糖的所有单糖之外，在第一重复单元的还原末端还包含己糖单糖衍生物。
34.权利要求29-32中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含(i)将己糖单糖衍生物组装至焦磷酸十一异戊烯基酯(UND-PP)上的糖基转移酶和(ii)能够将单糖添加至组装在UND-PP上的己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶。
35.权利要求34的宿主细胞，其中所述己糖单糖衍生物是其中C-2位被乙酰氨基修饰的任何单糖，例如N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧己糖(DATDH)、N-乙酰岩藻糖胺(FucNAc)、N-乙酰异鼠李糖胺(QuiNAc)。
36.权利要求34或35的宿主细胞，其中所述将己糖单糖衍生物组装至UND-PP上的糖基转移酶与宿主细胞异源和/或与催化所述供体寡糖重复单元的基因异源。
37.权利要求34-36中任一项的宿主细胞，其中所述将己糖单糖衍生物组装至UND-PP上的糖基转移酶来自埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。
38.权利要求34-37中任一项的宿主细胞，其中所述将己糖单糖衍生物组装至UND-PP上的糖基转移酶是wecA，任选地来自大肠杆菌。
39.权利要求34-38中任一项的宿主细胞，其中所述己糖单糖是半乳糖(Gal)。
40.权利要求34-39中任一项的宿主细胞，其中所述能够将单糖添加至所述己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶是来自鲍氏志贺氏菌的半乳糖基转移酶(wfeD)或来自大肠杆菌O28的半乳糖呋喃糖基转移酶(wbeY)或来自大肠杆菌O167的半乳糖呋喃糖基转移酶(wfdK)或者是来自大肠杆菌O28的半乳糖呋喃糖基转移酶(wbeY)和来自大肠杆菌O167的半乳糖呋喃糖基转移酶(wfdK)。
41.权利要求30、31或33-40中任一项的宿主细胞，其中所述足以合成所述供体寡糖或多糖的重复单元的糖基转移酶包含来自肺炎链球菌CP14的wchL和/或wchM。
42.权利要求41的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够产生杂合寡糖或多糖，其中所述杂合寡糖或多糖与肺炎链球菌CP14相同，除了以下事实：所述杂合寡糖或多糖在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖衍生物，代替通常存在于肺炎链球菌CP14的第一重复单元的还原末端的己糖单糖。
43.权利要求30、31或33-42中任一项的宿主细胞，其中所述足以合成所述供体寡糖或多糖的重复单元的糖基转移酶包含来自肺炎链球菌CP33F的wciC、wciD、wciE和/或wciF。
44.权利要求43的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够产生杂合寡糖或多糖，其中所述杂合寡糖或多糖与肺炎链球菌CP33F相同，除了以下事实：所述杂合寡糖或多糖在第一重复单元的还原末端包含己糖单糖衍生物，代替通常存在于肺炎链球菌CP33F的第一重复单元的还原末端的己糖单糖。
45.权利要求29-34中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含(i)将己糖单糖衍生物组装至焦磷酸十一异戊烯基酯(UND-PP)上的糖基转移酶和(ii)将供体寡糖或多糖重复单元组装至己糖单糖衍生物上的糖基转移酶。
46.权利要求45的宿主细胞，其中所述己糖单糖衍生物是其C-2位被乙酰氨基修饰的任何单糖，诸如N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧己糖(DATDH)、N-乙酰岩藻糖胺(FucNAc)、N-乙酰异鼠李糖胺(QuiNAc)。
47.权利要求45或46的宿主细胞，其中所述将己糖单糖衍生物组装至UND-PP上的糖基转移酶与所述宿主细胞异源。
48.权利要求45-47中任一项的宿主细胞，其中所述将己糖单糖衍生物组装至UND-PP上的糖基转移酶来自埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。
49.权利要求45-48中任一项的宿主细胞，其中所述将己糖单糖衍生物组装至UND-PP上的糖基转移酶是任选地来自大肠杆菌的wecA。
50.权利要求45-49中任一项的宿主细胞，其中所述将供体寡糖或多糖重复单元组装至己糖单糖衍生物上的糖基转移酶包含能够将存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖添加至己糖单糖衍生物的糖基转移酶。
51.权利要求50的宿主细胞，其中所述能够将存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的所述己糖单糖添加至己糖单糖衍生物的糖基转移酶是半乳糖基转移酶(wciP)，任选地来自大肠杆菌O21。
52.权利要求50-51中任一项的宿主细胞，其中所述将供体寡糖或多糖重复单元组装至己糖单糖衍生物上的糖基转移酶包含能够将邻近于存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖的单糖添加至存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖的糖基转移酶。
53.权利要求52的宿主细胞，其中所述能够将邻近于存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖的单糖添加至存在于所述供体寡糖或多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖的糖基转移酶是葡糖基转移酶(wciQ)，任选地来自大肠杆菌O21。
54.权利要求53的宿主细胞，其中所述宿主细胞进一步包含能够修饰单糖的酶，任选地差向异构酶或消旋酶。
55.权利要求54的宿主细胞，其中所述差向异构酶来自埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。
56.权利要求55的宿主细胞，其中所述差向异构酶来自大肠杆菌。
57.权利要求55的宿主细胞，其中所述差向异构酶是来自大肠杆菌O157的Z3206。
58.权利要求45-57中任一项的宿主细胞，其中所述足以合成所述供体寡糖或多糖的重复单元的糖基转移酶包含来自肺炎链球菌CP14的wchL和wchM。
59.权利要求58的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够产生杂合寡糖或多糖，其中所述杂合寡糖或多糖与肺炎链球菌CP14相同，除了以下事实：所述杂合寡糖或多糖，除了包含肺炎链球菌CP14的所有单糖残基之外，在第一重复单元的还原末端还包含己糖单糖衍生物。
60.权利要求29-59中任一项的宿主细胞，其中所述非己糖单糖或所述己糖单糖衍生物是在位置2包含乙酰氨基的单糖。
61.权利要求60的宿主细胞，其中所述己糖单糖衍生物是其C-2位被乙酰氨基修饰的任何单糖，诸如N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧己糖(DATDH)、 N-乙酰岩藻糖胺(FucNAc)或N-乙酰异鼠李糖胺(QuiNAc)。
62.权利要求29-61中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码荚膜多糖聚合酶(wzy)或O抗原聚合酶(wzy)的核酸。
63.权利要求62的宿主细胞，其中所述聚合酶与所述宿主细胞异源，和/或所述聚合酶与编码用于合成供体寡糖或多糖重复单元的酶的基因簇异源。
64.权利要求62-63的宿主细胞，其中所述聚合酶来自埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。
65.权利要求64的宿主细胞，其中所述聚合酶来自肺炎链球菌，任选地来自肺炎链球菌CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A和B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15(A、B、C、F)、CP16(A、F)、CP17(A、F)、CP18(A、B、C、F)、CP19(A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22(A、F)、CP23(A、B、F)、CP24(A、B、F)、CP25(A、F)、CP26、CP27、CP28(A、F)、CP29、CP31、CP32(A、F)、CP33(A、B、C、D、F)、CP34、CP35(A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41(A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47(A、F)或CP48。
66.权利要求29-65中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码翻转酶(wzx)的核酸。
67.权利要求66的宿主细胞，其中所述翻转酶与所述宿主细胞异源，和/或所述翻转酶与编码用于合成供体寡糖或多糖重复单元的酶的基因簇异源。
68.权利要求66-67的宿主细胞，其中所述翻转酶来自埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。
69.权利要求68的宿主细胞，其中所述翻转酶来自肺炎链球菌，任选地来自肺炎链球菌CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A和B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15(A、B、C、F)、CP16(A、F)、CP17(A、F)、CP18(A、B、C、F)、CP19(A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22(A、F)、CP23(A、B、F)、CP24(A、B、F)、CP25(A、F)、CP26、CP27、CP28(A、F)、CP29、CP31、CP32(A、F)、CP33(A、B、C、D、F)、CP34、CP35(A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41(A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47(A、F)或CP48。
70.权利要求29-69中任一项的宿主细胞，其中所述寡糖或多糖来自埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属、螺杆菌(Helicobacter)属、变形杆菌(Proteus)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属、李斯特菌(Listeria)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属。
71.权利要求29-70中任一项的宿主细胞，其中所述多糖是荚膜多糖(CP)，任选地来自肺炎链球菌，任选地其中所述肺炎链球菌荚膜多糖是CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6 (A、B)、CP7 (A、B、C)、CP8、CP9 (A、L、N、V)、CP10 (A、B、C、F)、CP11 (A、B、C、D、F)、CP12(A、B、F)、CP13、CP14、CP15 (A、B、C、F)、CP16 (A、F)、CP17 (A、F)、CP18 (A、B、C、F)、CP19 (A、B、C、F)、CP20、CP21、CP22 (A、F)、CP23 (A、B、F)、CP24 (A、B、F)、CP25 (A、F)、CP 26、CP27、CP28 (A、F)、CP29、CP31、CP32 (A、F)、CP33 (A、B、C、D、F)、CP34、CP35 (A、B、C、D、F)、CP36、CP37、CP38、CP39、CP40、CP41 (A、F)、CP42、CP43、CP44、CP45、CP46、CP47 (A、F)或CP48。
72.权利要求71的宿主细胞，其中所述肺炎链球菌荚膜多糖是CP8、CP12F、CP15A、CP16F、CP22F、CP23A、CP24F、CP31、CP33F、CP35B或CP38。
73.权利要求71的宿主细胞，其中所述荚膜多糖来自金黄色葡萄球菌，任选地其中所述金黄色葡萄球菌荚膜多糖是CP5或CP8。
74.权利要求71的宿主细胞，其中所述荚膜多糖来自无乳链球菌(GBS)，任选地其中所述无乳链球菌荚膜多糖是无乳链球菌(组B，GBS) CPIa、CPIb、CPII、CPIII、CPIV、CPV、CPVI、CPVII或CPVIII。
75.权利要求71的宿主细胞，其中所述荚膜多糖来自粪肠球菌，任选地其中所述粪肠球菌荚膜多糖是CPA、CPB、CPC或CPD。
76.权利要求29-75的宿主细胞，其中所述产生在第一重复单元的还原末端不包含己糖的寡糖或多糖的糖基转移酶中的至少一种与所述宿主细胞异源。
77.权利要求29-76的宿主细胞，其中所述载体蛋白与所述宿主细胞异源。
78.权利要求29-77中任一项的宿主细胞，其中所述寡糖基转移酶与所述宿主细胞异源。
79.权利要求29-78的宿主细胞，其中所述产生在第一重复单元的还原末端不包含己糖的寡糖或多糖的糖基转移酶、所述寡糖基转移酶和所述载体蛋白中的至少一种与所述宿主细胞异源。
80.权利要求29-79中任一项的宿主细胞，其中所述寡糖基转移酶来自空肠弯曲杆菌，任选地其中所述寡糖基转移酶是空肠弯曲杆菌的pglB基因，任选地其中所述空肠弯曲杆菌的pglB基因被整合至宿主细胞基因组中。
81.权利要求29-80中任一项的宿主细胞，其中所述寡糖基转移酶衍生自真核生物或古细菌生物。
82.权利要求29-81中任一项的宿主细胞，其中所述足以合成所述供体寡糖或多糖的重复单元的糖基转移酶被整合至宿主细胞基因组中。
83.权利要求29-82中任一项的宿主细胞，其中所述载体蛋白是脱毒的绿脓假单胞菌外毒素A(EPA)、CRM197、麦芽糖结合蛋白(MBP)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌的溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚基(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌Sat蛋白、大肠杆菌Sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素和其脱毒变体、空肠弯曲杆菌AcrA、空肠弯曲杆菌天然糖蛋白、PcrV(又名LcrV、EspA、SseB)、PopB (YopB、YopD、FliC)或OprF、OprI。
84.权利要求29-83中任一项的宿主细胞，其中宿主细胞的至少一种基因已被功能失活或缺失，任选地其中宿主细胞的waaL基因已被功能失活或缺失，任选地其中宿主细胞的waaL基因已被编码寡糖基转移酶的核酸替代，任选地其中宿主细胞的waaL基因已被空肠弯曲杆菌pglB替代。
85.权利要求29-84中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
86.权利要求29-85中任一项的宿主细胞，其中作为包含产生在第一重复单元的还原末端不包含己糖的寡糖或多糖的糖基转移酶的结果，与表型相同、但包含供体寡糖或多糖的宿主细胞相比，所述宿主细胞能够产生更高产量的生物缀合物，所述生物缀合物包含与寡糖或多糖N-连接的载体蛋白。
87.权利要求86的宿主细胞，其中与表型相同、但包含供体寡糖或多糖的宿主细胞相比，所述宿主细胞产生至少或约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%或500%更多的生物缀合物，其中所述生物缀合物包含与寡糖或多糖N-连接的载体蛋白。
88.权利要求86的宿主细胞，其中与表型相同、但包含供体寡糖或多糖的宿主细胞相比，所述宿主细胞产生至少或约5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的生物缀合物，其中所述生物缀合物包含与寡糖或多糖N-连接的载体蛋白。
89.产生生物缀合物的方法，所述生物缀合物包含与在第一重复单元的还原末端不包含己糖的寡糖或多糖N-连接的载体蛋白，所述方法包括(i)在适合于产生蛋白的条件下培养权利要求29-88中任一项的宿主细胞和(ii)分离所述生物缀合物。
90.根据权利要求7-18中任一项所述的生物缀合物，其通过权利要求89的方法产生。
91.包含权利要求7-18或90中任一项的生物缀合物的组合物。
92.药物组合物，其包含通过权利要求19至28中任一项的方法合成的寡糖或多糖。
93.权利要求91或92的组合物，其用于治疗或预防个体中的细菌感染。
94.权利要求91或92的组合物，其用于诱导个体中针对细菌菌株的免疫应答。
95.治疗或预防个体中的细菌感染的方法，其包括向个体施用权利要求91或92的组合物。
96.诱导个体中针对细菌菌株的免疫应答的方法，其包括向个体施用权利要求91或92的组合物。
97.权利要求93或94或95或96的用途组合物或方法，其中所述个体是人。
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