CN106795509A - 用于测量细胞机械应力的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了组合物和方法，其采用包封于水凝胶内并连接至水凝胶上的细胞以例如用于测量所述细胞的机械应变和/或应力，以及用于在细胞和分子水平上研究机械‑化学‑转导机制。

Description

用于测量细胞机械应力的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求提交于2014年3月6日的美国临时专利申请61/949,049的35 U.S.C.§119(e)下的权益，所述临时专利申请出于所有目的以引用的方式全文纳入本文。
技术领域
本申请提供了利用包封(encapsulated)在水凝胶中并连接至水凝胶上的细胞，以例如用于测量细胞的机械应变和/或应力以及在细胞和分子水平上研究机械-化学-转导机制的组合物和方法。
背景技术
感知机械应力并对其作出应答是生物细胞的根本需求。在心脏中，高外周阻力(高血压、压力超负荷)与增加心肌的收缩性(称为Anrep效应)相对；扩大的舒张期容积(容积超负荷)也与增加收缩性(称为Frank-Starling机制)相对。尽管心脏感知机械应力并调节收缩性以满足变化的血液动力学需求，但是过度的应变和应力(压力超负荷，容积超负荷)也导致心功能障碍和心脏病发生。心肌细胞的机械完整性是由包括肋状体(costamere)(黏着斑复合体的复杂版本)的结构蛋白网络保持，所述肋状体围绕z盘以提供结构支持(图1)。肋状体包括抗肌萎缩蛋白(dystrophin)-糖蛋白复合体(DGC)和粘着斑蛋白(vinculin)-踝蛋白(talin)-整联蛋白复合体(VTI)。这些机械应力承受和感知蛋白的重要性在多种肌营养不良症中被证明，在肌营养不良症中DGC或VTI中的突变导致心功能障碍和扩张型心肌病。尽管已经知道了这些现象超过一个多世纪，将机械应变和应力转导至细胞内生物化学反应的细胞和分子机制(所谓的机械-化学-转导(MCT)机制)迄今为止仍然了解的很少。因此，仍缺少用于治疗机械应力诱导的心脏病(例如，肌营养不良性心肌病，以及高血压诱导的心率失常和心力衰竭)的有效疗法。
发明内容
一方面，本申请提供了包括被包封在水凝胶中的细胞的组合物。在不同的实施方案中，所述水凝胶包含结合配偶体(binding partner)对的第一结合配偶体或缀合至生物相容性聚合物的结合配偶体对的第一结合配偶体，其中所述第一结合配偶体与Y-X-Y交联剂交联，其中X是线性亲水性聚合物，Y是所述结合配偶体对的第二结合配偶体，并且其中所述细胞直接或间接连接至所述第一结合配偶体。在一些实施方案中，所述水凝胶包含缀合至生物相容性聚合物的结合配偶体对的第一结合配偶体，其中所述生物相容性聚合物与硼酸酯-X-硼酸酯(boronate)交联剂交联，其中X是线性亲水性聚合物，并且其中所述细胞直接或间接连接至所述第一结合配偶体。在不同的实施方案中，所述结合配偶体对选自抗生物素蛋白/生物素、谷胱甘肽/谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)/麦芽糖、组氨酸标签(Histag)/咪唑+Zn2+，以及万古霉素/D-丙氨酸-D-丙氨酸(DADA)，其中所述结合配偶体对的任一成员可以为第一结合配偶体或第二结合配偶体。参见，例如，Rao,et al.,Science.(1998)280(5364):708-11。可使用的额外结合配偶体对记载于，例如，Lichty etal.,Protein Expression and Purification(2005)41:98-105。
一方面，本申请提供了包括被包封在水凝胶中的细胞的组合物。在不同的实施方案中，所述水凝胶包含与生物素-X-生物素交联剂交联的抗生物素蛋白或抗生物素蛋白-聚合物缀合物，其中X是线性亲水性聚合物，其中所述细胞直接或间接连接至抗生物素蛋白。在不同的实施方案中，所述水凝胶包含缀合至生物相容性聚合物的抗生物素蛋白，其中所述生物相容性聚合物与硼酸酯-X-硼酸酯交联剂交联，其中X是线性亲水性聚合物，其中所述细胞直接或间接连接至抗生物素蛋白。在一些实施方案中，所述细胞是通过生物素分子连接至抗生物素蛋白。在一些实施方案中，所述细胞是通过缀合至配体的生物素分子连接至抗生物素蛋白。
另一方面，本申请提供了包括被包封在水凝胶中的细胞的组合物。在不同的实施方案中，所述水凝胶包含生物素或缀合至生物相容性聚合物的生物素，其中所述生物素与抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交联剂交联，其中X是线性亲水性聚合物，其中所述细胞直接或间接连接至生物素。在一些实施方案中，所述水凝胶包含缀合至生物相容性聚合物的生物素，其中所述生物相容性聚合物与硼酸酯-X-硼酸酯交联剂交联，其中X是线性亲水性聚合物，其中所述细胞直接或间接连接至生物素。在一些实施方案中，所述细胞是通过抗生物素蛋白分子连接至生物素。在一些实施方案中，所述细胞通过缀合至配体的抗生物素蛋白分子连接至生物素。
在组合物的不同的实施方案中，所述硼酸酯-X-硼酸酯中的硼酸酯选自二硼酸酯、三硼酸酯、四硼酸酯及其混合物。在一些实施方案中，所述抗生物素蛋白选自抗生物素蛋白、抗生物素蛋白链菌素、中性抗生物素蛋白(neutravidin)和captavidin。在不同的实施方案中，所述万古霉素和D-丙氨酸-D-丙氨酸(DADA)是单价、二价或三价的。在不同的实施方案中，所述水凝胶包含缀合至生物相容性聚合物的配体，其中所述生物相通性聚合物与硼酸酯-X-硼酸酯交联剂交联，其中X是线性亲水性聚合物，其中所述细胞直接或间接连接至配体。在一些实施方案中，所述生物相容性聚合物包括范围为约50-150kDa，例如约80-100kDa，例如约50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、110kDa、120kDa、130kDa、140kDa或150kDa的平均分子量。在不同的实施方案中，所述生物相容性聚合物包括用于交联的功能部分，其选自羟基、二醇(例如，顺式二醇)、羧基、氨基、氨基-氧基(amino-oxy)、叠氮化物或炔烃。在不同的实施方案中，所述生物相容性聚合物包括用于交联的顺式二醇部分。在一些实施方案中，所述生物相容性聚合物选自聚乙烯醇(PVA)、琼脂糖和藻酸盐。在一些实施方案中，所述交联剂包括范围为约1-50kDa，例如约10-30kDa，例如约15-25kDa，例如约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa或50kDa的分子量。在一些实施方案中，X是线性亲水性聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖。在一些实施方案中，所述交联剂与所述聚合物的重量比(wt./wt.)的范围为约0.2至约5.0，例如0.2至约2.0，例如约0.5至约1.5。在一些实施方案中，所述水凝胶包括范围为约0.1kPa至约100kPa的刚度或杨氏模量值。在不同的实施方案中，所述水凝胶是光学透明的。在一些实施方案中，所述配体与细胞表面分子结合。在一些实施方案中，所述表面分子选自整联蛋白、糖蛋白、聚糖和细胞表面受体。在一些实施方案中，所述配体选自多肽、线性肽、环化肽、肽模拟物(peptidomimetic)、抗原结合分子、抗体和抗体片段。在一些实施方案中，所述配体为选自胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、玻璃体结合蛋白、VCAM-1和钙粘蛋白以及它们的子序列(subsequence)的多肽。在一些实施方案中，所述整联蛋白选自α3β1整联蛋白、α4β1整联蛋白和ανβ3整联蛋白。在一些实施方案中，所述细胞是肌细胞。在一些实施方案中，所述细胞是心肌细胞、骨骼肌细胞或平滑肌细胞。在一些实施方案中，所述肌细胞是心肌细胞。在一些实施方案中，所述包封的细胞未接触或不能接触固体表面或另一细胞。
另一方面，本申请提供了包括上述和本文所述组合物的装置。在不同的实施方案中，所述装置包括一个或多个灌注室。在不同的实施方案中，所述一个或多个灌注室包括改良的蒂罗德溶液(Tyrode solution)，其包括用于替代葡萄糖的丙酮酸。在不同的实施方案中，所述改良的蒂罗德溶液包括浓度足够低的Ca2+以允许肌细胞处于松弛态。在不同的实施方案中，所述改良的蒂罗德溶液包括低于约1mM的Ca2+浓度，例如，低于约100μΜ、75μΜ、50μΜ、40μΜ或30μΜ并且至少约10μΜ。在不同的实施方案中，所述包封的细胞未与所述装置的固体表面或水凝胶内的另一细胞接触。在不同的实施方案中，所述凝胶在至少两个维度上被拴系(tether)。在不同的实施方案中，所述装置包括拴系所述凝胶的夹具(grip)，其中所述夹具能够在所述凝胶上牵拉，从而在所述凝胶上和所述包封在凝胶中的细胞上引入机械应变和/或应力。在不同的实施方案中，所述凝胶与力传感器和张力操控器(tensionmanipulator)进行机械连通(mechanical communication)。在不同的实施方案中，所述凝胶处于由电刺激器控制的电场内，所述电刺激器将电信号施加于所述包封在凝胶中的细胞上。在不同的实施方案中，所述装置与成像***进行连通。在不同的实施方案中，所述装置与计算机连通。在不同的实施方案中，所述计算机记录施加在所述细胞和凝胶上的机械应变和/或应力。在不同的实施方案中，所述计算机记录细胞图像。
另一方面，本申请提供了一种***。在一些实施方案中，所述***包括：
i)一个或多个灌注室，每个灌注室均包括如上所述和本文所述的组合物；
ii)与凝胶接触的第一和第二夹具，其中所述第一和第二夹具能够在至少两个维度上在凝胶上引入张力；
iii)连接至第一夹具的力传感器和连接至第二夹具的张力操控器，其中所述力传感器感知施加在所述凝胶上的机械张力，其可用于计算所述细胞和凝胶中的应力；
iv)与所述力传感器连通的计算机，其中所述计算机能够存储由所述力传感器感知的机械张力读数。在不同的实施方案中，所述***还包括成像***，其能够捕捉被包封在凝胶中的细胞的图像，其中所述成像***与所述力传感器和计算机之一或两者进行连通。在不同的实施方案中，所述***还包括电刺激器，其将电信号施加于所述包封在凝胶中的细胞上。在不同的实施方案中，所述灌注室包括改良的蒂罗德溶液，其包括用于替代葡萄糖的丙酮酸。在不同的实施方案中，所述改良的蒂罗德溶液包括浓度足够低的Ca2+以允许肌细胞处于松弛态。在不同的实施方案中，所述改良的蒂罗德溶液包括低于约1mM的Ca2+浓度，例如，低于约100μΜ、75μΜ、50μΜ并且至少约10μΜ。在不同的实施方案中，所述计算机被编程以控制和/或管理给予所述灌注室的试验刺激。
另一方面，本申请提供了监测细胞上的机械应变和/或应力的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：
a)将细胞包封在上述和本文所述的组合物中；
b)获得细胞上的机械应变和/或应力的第一测量值；
c)将细胞暴露于试验刺激；
d)获得细胞上的机械应变和/或应力的第二测量值；和
e)比较第一和第二测量值。在不同的实施方案中，所述细胞是肌细胞。在不同的实施方案中，所述肌细胞是心肌细胞、骨骼肌细胞或平滑肌细胞。在不同的实施方案中，所述肌细胞是心肌细胞。在不同的实施方案中，测量心肌细胞收缩。在不同的实施方案中，所述方法还包括连续记录和测量细胞上的机械应变和/或应力。在不同的实施方案中，所述方法还包括在将细胞暴露于试验刺激之前在凝胶上引入机械应变和/或应力。在不同的实施方案中，所述方法还包括在将细胞暴露于试验刺激之前、期间和/或之后在凝胶上引入机械应变和/或应力。在不同的实施方案中，所述试验刺激是物理的、化学的或药理学的。在不同的实施方案中，所述细胞上机械应变和/或应力的第一和/或第二测量值记录在计算机可读介质上。
另一方面，本申请提供了产生上述或本文所述的凝胶包封细胞(Cell-in-Gel)组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：
a)用结合配偶体对-配体缀合物的第二结合配偶体孵育一个或多个细胞在，孵育条件为允许配体与一个或多个细胞上的一个或多个细胞表面分子结合；
b)使结合至第二结合配偶体-配体缀合物的细胞与结合配偶体对的第一结合配偶体或包括第一结合配偶体的生物相容性聚合物接触，接触条件为足以使第一结合配偶体结合至第二结合配偶体-配体缀合物的第二结合配偶体上；和
c)使来自步骤b)的细胞与Y-X-Y交联剂接触，接触条件为足以交联第一结合配偶体，其中X是线性亲水性聚合物，Y是结合配偶体对的第二结合配偶体，从而将细胞包封在水凝胶中。
在一些实施方案中，所述方法包括：
a)用结合配偶体对-配体缀合物的第二结合配偶体孵育一个或多个细胞，孵育条件为允许配体与一个或多个细胞上的一个或多个细胞表面分子结合；
b)使结合至结合配偶体对-配体缀合物的第二结合配偶体的细胞与缀合至结合配偶体对的第一结合配偶体的生物相容性聚合物接触，接触条件为足以使第一结合配偶体结合至第二结合配偶体-配体缀合物上；和
c)使来自步骤b)的细胞与硼酸酯-X-硼酸酯交联剂接触，接触条件为足以交联生物相容性聚合物，其中X是线性亲水性聚合物，从而将细胞包封在水凝胶中。
在产生方法的不同实施方案中，所述结合配偶体对选自抗生物素蛋白/生物素、谷胱甘肽/谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)/麦芽糖、组氨酸标签/咪唑+Zn2+，以及万古霉素/D-丙氨酸-D-丙氨酸(DADA)。
在一些实施方案中，所述方法包括：
a)用生物素-配体缀合物孵育一个或多个细胞，孵育条件为允许配体与一个或多个细胞上的一个或多个细胞表面分子结合；
b)使结合至生物素-配体缀合物的细胞与抗生物素蛋白或包括抗生物素蛋白的生物相容性聚合物或缀合至抗生物素蛋白的生物相容性聚合物接触，接触条件为足以使抗生物素蛋白与生物素-配体缀合物的生物素结合；和
c)使来自步骤b)的细胞和生物素-X-生物素交联剂接触，接触条件为足以交联抗生物素蛋白，其中X是线性亲水性聚合物，从而将细胞包封在水凝胶中。
在一些实施方案中，所述方法包括：
a)用生物素-配体缀合物孵育一个或多个细胞，孵育条件为允许配体与一个或多个细胞上的一个或多个细胞表面分子结合；
b)使结合至生物素-配体缀合物的细胞与缀合至抗生物素蛋白的生物相容性聚合物接触，接触条件为足以使抗生物素蛋白与生物素-配体缀合物结合；和
c)使来自步骤b)的细胞和硼酸酯-X-硼酸酯交联剂接触，接触条件为足以交联生物相容性聚合物，其中X是线性亲水性聚合物，从而将细胞包封在水凝胶中。
在一些实施方案中，所述方法包括：
a)用抗生物素蛋白-配体缀合物孵育一个或多个细胞，孵育条件为允许配体与一个或多个细胞上的一个或多个细胞表面分子结合；
b)使结合至抗生物素蛋白-配体缀合物的细胞与生物素或包含生物素的生物相容性聚合物接触，接触条件为足以使生物素与抗生物素蛋白-配体缀合物的抗生物素蛋白结合；和
c)使来自步骤b)的细胞和抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交联剂接触，接触条件为足以交联生物素，从而将细胞包封在水凝胶中。在不同的实施方案中，X是线性亲水性聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖。
在一些实施方案中，所述方法包括：
a)用抗生物素蛋白-配体缀合物孵育一个或多个细胞，孵育条件为允许配体与一个或多个细胞上的一个或多个细胞表面分子结合；
b)使结合至抗生物素蛋白-配体缀合物的细胞与缀合至生物素的生物相容性聚合物接触，接触条件为足以使生物素与抗生物素蛋白-配体缀合物结合；和
c)将来自步骤b)的细胞与硼酸酯-X-硼酸酯交联剂接触，接触条件为足以交联所述生物相容性聚合物，从而将细胞包封在水凝胶中。在不同的实施方案中，X是线性亲水性聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖。
在产生水凝胶的方法的不同的实施方案中，在进行或不进行机械混合的情况下包封所述一个或多个细胞。如以上和本文所述，X可以为任何亲水性线性聚合物。在不同的实施方案中，X是线性亲水性聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖。产生水凝胶的方法的其他实施方案如以上所述和本文所述。
另一方面，本申请提供了试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包括：i)包含结合配偶体对的第一结合配偶体或缀合至所述第一结合配偶体缀合的生物相容性聚合物的溶液；和ii)包含Y-X-Y交联剂的溶液；其中X是线性亲水性聚合物，Y是结合配偶体对的第二结合配偶体。在一些实施方案中，所述试剂盒包括：i)包含缀合至结合配偶体对的第一结合配偶体的生物相容性聚合物的溶液；和ii)包含硼酸酯-X-硼酸酯交联剂的溶液，其中X是线性亲水性聚合物。在不同的实施方案中，所述结合配偶体对选自抗生物素蛋白/生物素、谷胱甘肽/谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)/麦芽糖、组氨酸标签/咪唑+Zn2+，以及万古霉素/D-丙氨酸-D-丙氨酸(DADA)，所述结合配偶体对的任一成员可以为第一结合配偶体或第二结合配偶体。在一些实施方案中，所述试剂盒包括：i)包含抗生物素蛋白或缀合至抗生物素蛋白的生物相容性聚合物的溶液；和ii)包含生物素-X-生物素交联剂的溶液；其中X是线性亲水性聚合物。在一些实施方案中，所述试剂盒包括：i)包含缀合至抗生物素蛋白的生物相容性聚合物的溶液；和ii)包含硼酸酯-X-硼酸酯交联剂的溶液；其中X是线性亲水性聚合物。在一些实施方案中，所述试剂盒包括：i)包含生物素或缀合至生物素的生物相容性聚合物的溶液；和ii)包含抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交联剂的溶液；其中X是线性亲水性聚合物。在一些实施方案中，所述试剂盒包括：i)包含缀合至生物素的生物相容性聚合物的溶液；和ii)包含硼酸酯-X-硼酸酯交联剂的溶液；其中X是线性亲水性分子。在一些实施方案中，硼酸酯-X-硼酸酯交联剂中的硼酸酯选自二硼酸酯、三硼酸酯、四硼酸酯及其混合物。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括含有生物素-配体缀合物的溶液。在一些实施方案中，所述抗生物素蛋白选自抗生物素蛋白、抗生物素蛋白链菌素、中性抗生物素蛋白和captavidin。在一些实施方案中，所述生物相容性聚合物包括范围为约50-150kDa，例如约80-100kDa，例如约50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、110kDa、120kDa、130kDa、140kDa或150kDa的平均分子量。在一些实施方案中，所述生物相容性聚合物包括用于交联的顺式二醇部分。在一些实施方案中，所述生物相容性聚合物选自聚乙烯醇(PVA)、琼脂糖和藻酸盐。在一些实施方案中，所述交联剂包括范围为约1-50kDa，例如约10-30kDa，例如约15-25kDa，例如约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa或50kDa的分子量。在一些实施方案中，X是线性亲水性聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖。
定义
本文使用的术语“细胞粘附基质”指模拟胞外微环境的生理特征和分子特征的三维基质培养***。通过使用具有至少两个官能团的交联剂以与生物相容性聚合物链的两个相邻的官能团结合，使生物相容性聚合物链交联，从而形成本发明的细胞粘附基质。
本文使用的术语“接触”指使至少两个不同的物质接触，从而使它们能够反应的过程。但是应当理解，可直接从添加的试剂之间的反应，或从可在反应混合物中产生的一种或多种添加的试剂的中间产物直接产生所得的反应产物。
本文使用的术语“聚乙烯醇链”指聚乙烯醇的聚合物链。所述聚乙烯醇链可以具有任何分子量，并被更详细记载于下文中。
本文使用的术语“交联的”指通过硼酸交联剂使多个生物相容性聚合物链彼此相互连接以使它们形成单一结构的状态。连接交联的单个生物相容性聚合物链的化学官能度被称为“交联剂”。交联剂通常为多功能化合物，其与一条生物相容性聚合物链上至少一个官能团反应并且与另一条生物相容性聚合物链上的一个反应性官能团反应，从而将两条生物相容性聚合物链相互连接。本发明的交联剂可具有多于两个交联基团。
本文使用的术语“硼酸交联剂”指具有至少两个硼酸基团的化学部分，所述硼酸基团能够通过与生物相容性聚合物链上的两个相邻羟基基团结合而交联生物相容性聚合物链。所述硼酸交联剂也可包括具有生物相容性聚合物的接头(参见本文)。所述硼酸可以是任何硼酸物质，例如羧基苯硼酸。
本文使用的术语“接头”指将羧基苯硼酸基团连接在一起的化学部分。可用于本发明的接头具有生物相容性聚合物。术语“生物相容性聚合物”指在动物中无毒性的聚合物。生物相容性聚合物的实例包括但不限于，聚乙二醇、聚丙二醇等。可用作交联剂的聚醚聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖。可用分支部分修饰PEG和PPG。术语“分支部分”指通过一个官能团连接至所述聚醚聚合物并提供用于连接至硼酸基团的至少两个其他官能团的化学部分。分支部分的实例包括但不限于，赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。其他分支部分可以是赖氨酸衍生物，其具有羧酸基团以及α-胺和ω-胺。其他分支基团是本领域技术人员已知的。
附图说明
图1示出了肌肉细胞结构和环绕z线以提供结构支持的肋状体复合体(上图中的绿色束)。肋状体包括抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合体(DGC)和粘着斑蛋白-踝蛋白-整联蛋白复合体(VTI)。本发明人的研究示出了从DGC和VTI至一氧化氮合酶1(或nNOS)和一氧化氮合酶3(或eNOS)，以及至Ca2+处理蛋白的机械-化学-转导(MCT)途径。
图2示出了实验中使用的Cell-in-Gel***。连续灌注溶液以保持水凝胶中的生理条件(pH、温度、离子环境等)。使用电场以刺激肌细胞收缩。使用显微镜以在细胞和分子水平上获得肌细胞收缩和机械-化学-转导信号传导事件的图像。
图3示出了肋状体中的DGC和VTI复合体(从Guo et al.,(2011)Journal ofMolecular and Cellular Cardiology.50:606-12修改而得)。
图4示出了PVA-硼酸酯凝胶拴系细胞表面的聚糖和糖蛋白。
图5示出了PVA-抗生物素蛋白-硼酸酯凝胶能够拴系细胞表面的聚糖、糖蛋白、整联蛋白和任何目的分子。
图6示出了使用生物素-肽以将细胞表面分子拴系于PVA-抗生物素蛋白凝胶的示意图。
图7A-B示出了使用生物素-抗体以将细胞表面分子拴系于PVA-抗生物素蛋白凝胶的示意图。生物素缀合的一级抗体(生物素-一级抗体)能够直接结合至细胞表面分子。生物素缀合的二级抗体(生物素-二级抗体)能够结合至一级抗体，所述一级抗体直接结合至细胞表面分子。
图8A-C示出了使用多种凝胶组合物和生物素-配体以拴系肌细胞表面上的DGC和VTI的示意图。
图9A-F示出了从DGC到nNOS和从VTI到eNOS的机械-化学-转导(MCT)。上图(共聚焦图像的3D显示)示出了将机械应力施加到DGC上激活了机械-化学-转导以产生Ca2+火花(Ca2 +spark)(A)；抑制nNOS阻断了MCT，因此无火花(B)；抑制eNOS未阻断MCT，因此火花仍然存在(C)。下图(共聚焦图像的2D显示)示出了将机械应力施加到DGC和VTI上激活了机械-化学-转导以产生Ca2+火花(D)；仅抑制nNOS不足以阻断MCT，因此火花仍然存在(E)；同时抑制nNOS和eNOS阻断了MCT，因此无火花(F)。因此，DGC途径激活了nNOS，而VTI途径激活了eNOS。
图10A-C示出了Cell-in-Gel装置的示意图。
图11A-G示出了在心缩期和心舒期期间对Ca2+处理的机械应力作用。(A)包埋于包含红色荧光小珠的3D水凝胶基质中的肌细胞示意图。(B)肌细胞和小珠的共聚焦成像证明细胞收缩和凝胶变形，如在包埋于凝胶中的细胞边缘和红色荧光小珠的运动中所见。(C)在常规蒂罗德溶液中的细胞收缩提供了无负荷对照。(D)在机械负荷下凝胶中的细胞收缩。(E)与无负荷对照(n＝17)相比，凝胶中细胞收缩的缩短分数(fractional shortening)(n＝17细胞)。(F)与无负荷对照(n＝17)相比，凝胶中细胞的收缩期的Ca2+瞬时(CaT)峰(n＝17)。(G)在无负荷细胞(n＝18)中、由5％交联剂制成的软凝胶(凝胶5％，n＝9)中、具有7.5％交联剂的凝胶(凝胶7.5％，n＝18)中和blebbistatin处理(n＝5)之后，舒张期的Ca2+火花频率。单因素ANOVA以及Bonferroni事后检验用于配对比较：P<0.001***。
图12示出了单独的PVA或交联剂并未影响肌细胞收缩。与常规蒂罗德溶液中的无负荷对照(n＝6细胞)相比，在PVA(n＝27细胞)或交联剂(CL，n＝8细胞)中孵育后心肌细胞的缩短分数(FS)。单因素ANOVA检验表明无显著差异(p＝0.86)。因此单独的凝胶组分不改变肌细胞收缩，表明无毒性。
图13A-B示出了对收缩期的Ca2+瞬变和收缩的机械应变作用。使用Fluo-4共聚焦成像测量肌细胞收缩和收缩期的Ca2+瞬变(CaT)。示出了在无负荷的肌细胞收缩(n＝18细胞)中、在由5％交联剂制成的软凝胶(凝胶5％，n＝9)中、在具有7.5％交联剂的硬凝胶(凝胶7.5％，n＝18)中和blebbistatin处理之后(n＝5)，CaT峰(A)和缩短分数(FS＝肌原纤维节长度改变的百分数(％))。单因素ANOVA以及Bonferroni事后检验用于配对比较：P<0.05*，P<0.01**，P<0.001***视为显著，P>0.05视为不显著(NS)。
图14A-F示出了对凝胶中肌细胞收缩的收缩期Ca2+瞬变和SR负荷的机械-化学-转导作用。通过监测起搏之前、期间和之后肌细胞中的Ca2+信号传导来研究机械-化学-转导的瞬时反应。(A)在起搏之前凝胶中的肌细胞具有非常少的Ca2+火花；然后，在初始延迟之后(***a)，在起搏收缩期间发生大量Ca2+火花(***b)；当起搏停止时Ca2+火花立即消失(***c)。(B)在起搏方案过程中在凝胶中肌细胞收缩对比无负荷的肌细胞收缩中的Ca2+火花率。(C)使用Fura-2比值(Rfura)测量的无负荷vs.凝胶中收缩的细胞中Ca2+瞬变(CaT)的代表性记录。比例尺：R＝0.5,t＝2s。(D)在凝胶中(n＝29细胞)的收缩期Ca2+瞬变峰高于无负荷(n＝19)。(E)通过在起搏结束后以ΔT＝15s施用咖啡因(20mM)以从SR快速释放Ca2+，来测量SR容量(content)。对于凝胶中细胞(n＝9)和无负荷细胞(n＝17)而言，SR容量是类似的。(F)与无负荷细胞(n＝19)相比，凝胶中细胞(n＝29细胞)的Ca2+瞬变的τ(tau)并未改变。与无负荷(n＝17)相比，凝胶中(n＝9)咖啡因诱导的Ca2+瞬变下降的tau更长。非配对学生t检验：P<0.05*,P<0.001***。
图15A-J示出了在机械-化学-转导中nNOS与eNOS的差异作用。除非标记了无负荷，所有示出的数据来自在凝胶中的肌细胞收缩。(A)野生型(wt)肌细胞中的Ca2+活动。抑制(B)eNOS与(C)nNOS的作用。(D)nNOS-/-肌细胞无Ca2+火花。(E)eNOS-/-肌细胞具有频繁的Ca2+火花。(F)在eNOS-/-肌细胞中抑制nNOS遏制了火花。(G)在凝胶中的野生型(wt)肌细胞收缩中的Ca2+瞬变峰，以及抑制NOS亚型的作用。(H)无负荷(n＝18细胞)、凝胶中(n＝18)的野生型细胞中Ca2+火花率和抑制剂作用的平均值±SEM，以及L-NAME 10mM(n＝9)、L-NPA 5μΜ(n＝9)和L-Nio 10μΜ(n＝10)的分别作用。(I)nNOS-/-敲除中Ca2+火花率：从左至右的每组为n＝8、10、10、9细胞。(J)eNOS-/-敲除中Ca2+火花率：从左至右的每组为n＝10、13、6、6细胞。单因素ANOVA以及Bonferroni事后检验用于配对比较：P<0.001***。
图16A-C示出了抑制nNOS或eNOS对肌细胞的作用。使用Fura-2比值(Rfura)和肌原纤维节检测法同时测量Ca2+瞬变和肌细胞收缩。在无负荷的肌细胞收缩(n＝22)中、在凝胶中的肌细胞收缩(n＝18)中，以及使用L-NPA抑制nNOS之后的肌细胞收缩(n＝7)中或使用L-Nio抑制eNOS之后的肌细胞收缩(n＝12)中，(A)收缩期Ca2+瞬变(CaT)峰，(B)Ca2+瞬变降低的Tau，以及(C)缩短分数(FS＝肌原纤维节长度缩短的百分数)。单因素ANOVA检验表明CaT(p<0.05)、Tau(p<0.01)和FS(p<0.001)中的显著差异；Bonferroni事后检验用于凝胶中组与其他组之间的配对比较：P<0.05*，P<0.01**，P<0.001***视为显著差异，置信水平为95％。
图17A-D示出了野生型肌细胞中RyR、nNOS、eNOS的表达和分布。(A)示出了使用60X水浸物镜、NA＝1.2、变焦＝10获得的样品共聚焦图像。(B)为nNOS(绿)和RyR(红)的超分辨率结构光照显微镜(SIM)成像，(C)为eNOS(青)和RyR(红)的超分辨率结构光照显微镜(SIM)成像，每组n＝5。(D)nNOS-RyR和eNOS-RyR对的共定位被描绘为重叠的体元体积(voxelvolume)(bars)。nNOS-RyR和eNOS-RyR之间的分子间距离示出了最接近的邻近距离的直方图(概率密度函数，PDF)(曲线图)。Mann-Whitney检验用于比较nNOS-RyR距离与eNOS-RyR距离直方图，发现差异显著，p<0.0001。
图18示出了NO依赖性CaMKII激活。使用Camui传感器的FRET测量表明Ca2+/CaM对野生型、非自磷酸化(T286A)和非氧化(CM280/281VV)突变CaMKII的直接激活(左侧两组柱)。当Ca2+被+EGTA缓冲时，CaMKII的激活降低(柱被标记为No SNAP)。[SNAP]升高到500μΜ时观察到自主CaMKII激活，但升高到50μΜ未观察到激活。值得注意的是，与磷酸化(T286A)或氧化(CM/VV)相比，SNAP/NO依赖性自主激活并不是次要的，这与直接NO作用一致。每个柱中n＝6个样品。单因素ANOVA以及Bonferroni事后检验用于配对比较；p值示出在不同的条件下每对(相同颜色)之间的差异的显著性。
图19A-C示出了在健康的心脏中和心肌病中的机械-化学-转导。(A)在体温下1Hz起搏过程中，R92Q肌细胞中Ca2+信号的样品图像，以及抑制nNOS、eNOS、NOX2或CaMKII的作用。(B)比较WT肌细胞与R92Q肌细胞中Ca2+火花率。WT：无负荷(n＝18细胞)，Cell-in-Gel(n＝47)，以及药物对Cell-in-Gel的作用：L-NPA 5μΜ(n＝9)、L-Nio 10μΜ(n＝9)、Gp91ds 1μΜ(n＝31)、K 93 1μΜ(n＝10)。R92Q：无负荷(n＝12)，Cell-in-Gel(n＝20)，以及药物对Cell-in-Gel的作用：L-NPA 5μΜ(n＝32)、L-Nio 10μΜ(n＝12)、Gp91ds 1μΜ(n＝16)、KN93 1μΜ(n＝23)。双因素ANOVA检验表明R92Q与WT细胞株之间自发Ca2+火花率的显著差异(p<0.0001)，显著的药物作用(p<0.0001)，以及显著的相互作用(p<0.0001)。Bonferroni事后检验示出了与无药物的Cell-in-Gel相比，对每种细胞株的药物作用的显著差异(p<0.001***)；也示出了对于Cell-in-Gel的条件，R92Q中比WT中显著更高的火花率(p<0.05#)，以及对于Gp91ds作用，R92Q中比WT中显著更高的火花率(p<0.001###)。(C)机械-化学-转导途径的示意图。
图20A-E示出了用于将单个肌细胞包埋于3D弹性基质中的PVA-交联剂***。包埋于3D PVA水凝胶基质中的肌细胞的示意图(Cell-in-Gel)。首先，将细胞(A)与PVA溶液(B)混合；然后加入4-硼酸酯-PEG交联剂(C)。所述硼酸酯使细胞表面聚糖的顺式二醇与PVA凝胶交联，从而将细胞包埋于PVA凝胶中，且细胞表面拴系于凝胶(D)。(E)该Cell-in-Gel***允许通过灌注进行溶液交换以研究药物作用，允许电场刺激以研究肌细胞的刺激-收缩偶联，以及允许显微镜成像以研究包埋的肌细胞的结构和功能。通过包埋的亚微米荧光小珠可追踪凝胶中的移位。
图21A-C示出了破坏DGC中的指挥链(chain-of-command)改变了Ca2+信号。(A)当DGC被拴系时机械应力诱导Ca2+火花；(B)掩蔽DG使Ca2+火花消失；(C)抗肌萎缩蛋白无效突变也使Ca2+火花消失。
图22A-D示出了DGC和VTI共同形成肋状体以赋予机械-化学-转导。有缺陷的DGC使M-C转导失衡。
具体实施方式
1.引言
本文所述的组合物、装置、***、方法和试剂盒增强了对机械-化学-转导(MCT)机制的理解。它们实现了至少两种重要的能力：一种是在模拟心肌的3-D环境中在单细胞水平上控制机械应力；另一种是在肌细胞收缩过程中在特定的细胞表面机械传感器上牵引(tug)。这些技术能力可用于在细胞和分子水平上研究MCT机制。与本发明的组合物、装置、***、方法和试剂盒相比，目前可用的技术并未同时具备这两种能力。
本文提供了“Cell-in-Gel”***以将单个活细胞(包括肌细胞)包埋于模拟体内机械环境的3D弹性凝胶。该***以两种重要的方式区别于目前所用的技术。首先，细胞(例如肌细胞)相对于弹性凝胶收缩，这不仅在细胞上施加了纵向的张力和横向的压缩，还在细胞表面施加了剪切应力和法向应力。其次，Cell-in-Gel***使细胞表面上的特定机械传感器(例如，整联蛋白，糖蛋白)能够拴系于凝胶基质，以研究MCT复合体如何转导机械应力以影响胞内Ca2+动力学。
合成化学、肌肉力学，以及细胞和分子生物学的多学科知识已被结合起来以开发Cell-in-Gel***并利用一组通用且易用的工具以在单细胞和分子水平上控制机械应力。还提供了硬件和软件，以在单细胞和分子水平上施加机械应力并且研究机械-化学-转导机制。
本发明人已改造了本发明的Cell-in-Gel***，其允许将活的肌细胞包埋于模拟体内环境的3D弹性水凝胶中。该***使得能够在收缩过程中控制单个肌细胞上的机械应力并且监测响应于多种应力水平的细胞和分子变化。对于适用性和通用性，所述Cell-in-Gel***具有至少以下合乎需要的性质(参见图20)。
(a)可使用已知的合成组分(而非含有不纯组分的天然产品如基质胶或ECM提取物)来制备所述Cell-in-Gel***，从而提供明确的化学性质以研究机械-化学-转导的细胞和分子机制。
(b)所述凝胶的化学组成对活细胞无毒性且不会损伤活细胞。分离的心肌细胞(以及其他肌细胞)特别脆弱。用于装配凝胶的化学组分在生理pH和温度下无毒性。这使得能够使用所述Cell-in-Gel***来研究活细胞功能。
(c)可容易且快速地(在几分钟内)将细胞包埋于凝胶中，使在合理的时间范围(几小时和几天之内)从脆弱的细胞获取数据是可行的。
(d)通过调节凝胶组分和交联剂的比值，可容易地调节凝胶的刚度(杨氏模量)。这使得能够精细调节施加到细胞上的机械应力的水平。
(e)所述凝胶基质是多孔的以允许用于实验研究的快速溶液交换和药物施用。
(f)所述凝胶是光学透明的以允许在显微镜上成像。
(g)所述凝胶包含允许拴系特定细胞表面分子的通用的“钩”，其使得能够控制不同细胞表面分子(机械传感器等)上的机械应力。
研究MCT机制的主要障碍是缺少实现两种重要能力的技术：一是在模拟心肌的3-D环境中在单细胞水平上控制机械应力；另一个是在肌细胞收缩过程中在特定细胞表面机械传感器上牵引以研究其在MCT中的作用。但是，所有目前可用的技术都无法同时具备这两种能力。
所述Cell-in-Gel***相对于已存在的技术(使用碳纤维或玻璃杆拉伸细胞)具有至少两个主要优势。(1)将活的心肌细胞包埋于3-D水凝胶(包含交联的聚合物的弹性基质)中，从而它们在收缩过程中经受3-D机械应力(纵向张力、横向压缩、剪切应力)，模拟体内环境。(2)凝胶的化学性质允许将特定细胞表面机械传感器(例如，抗肌萎缩蛋白聚糖、整联蛋白)拴系于凝胶基质以在细胞收缩过程中在所述机械传感器上施加机械应力。所述Cell-in-Gel***使得能够研究机械-化学-转导复合体、其下游信号传导，以及在活的心肌细胞和其他细胞类型中的功能结果。
本发明人使用Cell-in-Gel***来评估，心肌细胞中的两种大分子复合体——DGC和VTI——转导机械应力以调节每次心跳的Ca2+信号传导***，这增强了响应于机械负荷的Ca2+瞬变和收缩性，但是该相同的机制也能在过度负荷下导致Ca2+失调。解析该机制对于理解心脏如何应答于机械负荷以自动调节收缩性，过度的负荷如何导致心脏病，以及肌营养不良症中的DGC突变如何导致Ca2+失调和心功能障碍是重要的。所述Cell-in-Gel***为研究和开发用于治疗机械应力诱导的心脏病的有效药物疗法提供了有力的新工具。
2.组合物
a.通常
包封或包埋细胞的水凝胶通常是生物相容性的，对细胞无毒性，不损伤细胞，不影响细胞功能并且允许细胞行使其天然生理学功能。所述水凝胶还具有允许水凝胶直接或间接地(例如，通过交联剂)结合至或拴系于细胞上一个或多个表面分子的化学部分。在不同的实施方案中，用结合配偶体对分子的第一或第二结合配偶体将所述水凝胶功能化。所述结合配偶体对的第一或第二结合配偶体可直接或间接地(例如，通过所述结合配偶体对的互补配偶体(例如，第一结合配偶体与第二结合配偶体互补，并且第二结合配偶体与第一结合配偶体互补)或与互补结合配偶体的配体缀合物，其中所述配体结合至细胞表面分子)结合或连接至包封的细胞。当使用结合配偶体对的第一或第二结合配偶体来功能化时，所述结合配偶体分子也可在水凝胶中彼此相连，例如，通过Y-X-Y交联剂，其中X是亲水性线性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PG)、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖)，Y是结合配偶体对的第一或第二结合配偶体。所述3D水凝胶具有刚度，所述刚度模拟体内机械环境并且允许测量施加在拴系于或连接于水凝胶上的细胞上的应变和应力。
b.结合配偶体对
本领域中已知的任何结合配偶体对可用于本文所述的组合物。在不同的实施方案中，所述结合配偶体对选自抗生物素蛋白/生物素、谷胱甘肽/谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)/麦芽糖、组氨酸标签/咪唑+Zn2+，以及万古霉素/D-丙氨酸-D-丙氨酸(DADA)，其中所述结合配偶体对的任一成员可以是第一结合配偶体或第二结合配偶体。在一些实施方案中，所述抗生物素蛋白选自抗生物素蛋白、抗生物素蛋白链菌素、中性抗生物素蛋白、captavidin，及其混合物。在不同的实施方案中，所述万古霉素和D-丙氨酸-D-丙氨酸(DADA)是单价、二价或三价的。
c.聚合物
在不同的实施方案中，所述水凝胶具有由生物相容性聚合物构建的基质。通常，可使用的生物相容性聚合物是对动物(特别是哺乳动物，特别是对包封或包埋在凝胶中的一个或多个细胞)无毒性的那些。示例性生物相容性聚合物包括琼脂糖、藻酸盐、聚乙烯醇(PVA)、聚醚如聚乙二醇和聚丙二醇，以及纤维素、多糖和聚酯。
在不同的实施方案中，所述聚合物具有化学部分，其允许拴系于或连接至被包埋的细胞和/或组成所述凝胶的聚合物分子的内部交联。可使用具有任何用于共价键合或化学交联的功能性部分的生物相容性聚合物。在不同的实施方案中，所述功能性部分是羟基、二醇(例如，顺式二醇)、羧基、氨基、氨基-氧基、叠氮化物或炔烃。在不同的实施方案中，所述生物相容性聚合物分子具有范围为约50-150kDa的平均分子量，例如约80-100kDa，例如约50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、110kDa、120kDa、130kDa、140kDa或150kDa。所使用的示例性聚合物和细胞粘附基质包括聚乙烯醇(PVA)，国际公开号WO 2010/148346中记载的聚合物，琼脂糖和藻酸盐。国际公开号WO 2010/148346出于所有目的在此以引用的方式全文纳入本文。
对于使用聚乙烯醇(PVA)的实施方案，用于水凝胶的聚乙烯醇链可以为任何适合的大小。例如，在不同的实施方案中，所述聚乙烯醇链具有约500至约150,000、或约50,000至约150,000、或约75,000至约125,000、或约85,000至约105,000的平均分子量。
d.交联剂
所述水凝胶通常包含交联剂分子。可使用任何生物相容***联剂分子。在不同的实施方案中，所述交联剂是二价、三价或四价的。
在不同的实施方案中，所述交联剂将聚合物分子连接至聚合物分子和/或将聚合物分子连接至或拴系于包埋或包封的细胞。聚合物分子可通过所连接的结合配偶体对的第一或第二结合配偶体或通过其他可用的化学官能团连接。在不同的聚合物中，连接至聚合物的所述结合配偶体对的第一或第二结合配偶体是通过Y-X-Y交联剂连接，其中X是线性亲水性聚合物，Y是结合配偶体对的互补结合配偶体。在不同的实施方案中，聚合物上的抗生物素蛋白分子是通过生物素-X-生物素交联剂连接，其中X是线性亲水性聚合物。在不同的实施方案中，聚合物上的生物素分子是通过抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交联剂连接，其中X是线性亲水性聚合物。具有羟基或二醇官能团的聚合物可与硼酸酯-X-硼酸酯交联剂交联，其中X是线性亲水性聚合物。在一些实施方案中，硼酸酯-X-硼酸酯交联剂中的硼酸酯选自二硼酸酯、三硼酸酯、四硼酸酯，以及其混合物。
在不同的实施方案中，X指线性亲水性聚合物，其选自聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖。讨论了所使用的交联聚合物，例如在Song,etal.,Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 14(2004)161-165中，其出于所有目的以引用的方式全文纳入本文。在不同的实施方案中，所述交联剂包括范围为约1-50kDa的分子量，例如约10-30kDa，例如约15-25kDa，例如约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa或50kDa。可使用的聚乙二醇聚合物可以是任何适合的大小。例如，聚乙二醇聚合物可具有约500至约50,000、或约500至约5,000、或约1,500至约2,500的分子量。其他聚乙二醇聚合物是可使用的，包括WO 2010/148346中记载的那些。
在不同的实施方案中，所述结合配偶体对的第一或第二结合配偶体的配体缀合物可用于将与细胞表面上配体特异性结合的细胞表面分子拴系于缀合至聚合物的互补结合配偶体。在不同的实施方案中，生物素-配体缀合物可用于将与细胞表面上配体特异性结合的细胞表面分子拴系于缀合至聚合物的抗生物素蛋白分子。在不同的实施方案中，抗生物素蛋白-配体缀合物可用于将与细胞表面上配体特异性结合的细胞表面分子拴系于缀合至聚合物的生物素分子。
凝胶的刚度可通过调节交联剂与PVA的混合比例来调节。在不同的实施方案中，聚合物:交联剂的重量比(wt./wt.)的范围为约0.1至约10。在不同的实施方案中，例如，当所述细胞是肌细胞时，聚合物:交联剂的重量比(wt./wt.)的范围为约0.5至约5。具有相对更高的交联剂比例或浓度的水凝胶具有相对更高的刚度或杨氏模量值。在不同的实施方案中，所述水凝胶具有范围为约0.5kPa至约100kPa的刚度或杨氏模量值。在病理条件(例如纤维化或梗塞形成)下，心脏组织的刚度可增加至100kPa或更多。
e.配体
与所述结合配偶体对的第一或第二结合配偶体的配体缀合物的配体通常是与细胞表面分子结合的配体，以允许将所选择的细胞表面分子栓系于水凝胶。在不同的实施方案中，所述配体选自多肽、线性肽、环化肽、肽模拟物、抗原结合分子(例如，纳米抗体、Adnectin、Avimer、Anticalin、抗体模拟物等)、抗体、抗体片段(例如，Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、双体抗体(diabody)、单链Fv(scFv)分子、仅包含一个轻链可变区的单链多肽、包含轻链可变区的3个CDR的单链多肽、仅包含一个重链可变区的单链多肽和包含重链可变区的3个CDR的单链多肽)、碳水化合物或结合于细胞表面的任何其他分子。在不同的实施方案中，所述配体结合于整联蛋白、糖蛋白或聚糖。例如，所述配体可结合于选自α3β1整联蛋白、α4β1整联蛋白和ανβ3整联蛋白的整联蛋白。在一些实施方案中，所述配体是选自胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、纤维蛋白原、玻连蛋白、VCAM-1和钙粘着蛋白及其子序列的多肽。
在不同的实施方案中，所述配体是结合于细胞表面分子的抗体。在不同的实施方案中，与所述结合配偶体对的第一或第二结合配偶体的缀合物中的配体是结合于一级抗体的二级抗体，所述一级抗体结合于或被结合于细胞上的细胞表面分子。
在不同的实施方案中，所述配体是结合于整联蛋白的肽。在一些实施方案中，所述配体可以是细胞粘附配体，例如肽、蛋白质、肽模拟物或抗体，或报告底物如荧光底物。适用的细胞粘附配体的实例包括但不限于RGD配体、LXY3、MSE、HYD1和LLP-2A。这些配体和其他适用于本发明的配体结合于不同的整联蛋白类型，包括α6β1、α3β1、α4β1、α3β1、ανβ3、α1、α2及其他。可使用的其他示例性肽记载于，例如Xiao et al.,Molecular Cancer Therapeutics.(2010)9:2714-23；Yao,et al.,Journal of Medicinal Chemistry.(2009)52:126-33；Peng,et al.,Nat Chem Biol.(2006)2:381-9；Pennington,et al.,Molecular Diversity(1996)2:19-28；DeRoock,et al.,Cancer Research,(2001)61:3308-3313；Park,et al.,Letters in Peptide Science,(2002)8:171-178；Aina,et al.,Molecular CancerTherapeutics,(2005)4:806-813；Aina,et al.,Molecular Imaging,(2005)4:439-447；Liu,Biopolymers(Peptide Science)(2006)84:595-604；Carpenter,et al.,Journal ofCombinatorial Chemistry,(2006)8:907-914；Aina,et al.,Molecular Pharm.(2007)4:631-651,2007；Carpenter,et al.,J Medicinal Chemistry.(2007)50:5863-5867；Peng,et al.,Molecular Cancer Therapeutics.(2008)7:432-437；Luo,et al.,Journal ofCombinatorial Chemistry,(2008)10:599-604；Xiao,et al.,European Journal ofNuclear Medicine and Molecular Imaging,(2008)36:94-103；Yao,et al.,J Med Chem(2009)52:126-133；Yao,et al.,J Med Chem.52:6744-6751；Carpenter,et al.,CancerResearch.(2010)70:5448-556；Zhang,et al.,Urol Oncol.(2012)30(5):635-45；Aina,etal.,Vet Immunol Immunopathol.(2011)143:11-19；Zwingenberger,et al.,Vet ImmunolImmunopathol.(2012)145:298-304；Zwingenberger,et al.,PLos One,(2012)7(4):e34404和Lin,et al.,Int J Nanomedicine.(2012)7:2793-804中。所有以上列出的出版物出于所有目的以引用的方式全文纳入本文。
3.产生Cell-in-Gel组合物的方法
本申请还提供了将细胞包封并拴系于水凝胶，从而使细胞保持活力和功能性(例如，通过细胞表面受体的信号传导，收缩性)的方法。
在一个实施方案中，细胞表面蛋白(例如，整联蛋白)拴系于水凝胶，而不拴系聚糖。在不同的实施方案中，所述方法使：(1)与所述结合配偶体对的第一或第二结合配偶体的配体缀合物和细胞结合，其中所述配体缀合物结合于所述配体的结合配偶体；(2)第一结合配偶体或第二结合配偶体的配体缀合物与所述结合配偶体对的互补结合配偶体结合；以及(3)所述第一或第二结合配偶体与Y-X-Y交联剂交联，其中X是亲水性线性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖)，Y是互补结合配偶体。在不同的实施方案中，所述方法使：(1)生物素-配体缀合物与细胞结合，其中所述生物素-配体缀合物结合于所述配体的配体结合配偶体；(2)抗生物素蛋白分子与生物素-配体缀合物结合；以及(3)抗生物素蛋白分子与生物素-X-生物素交联剂交联，其中X是亲水性线性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖)。在不同的实施方案中，所述方法使：(1)抗生物素蛋白-配体缀合物与细胞结合，其中所述抗生物素蛋白-配体缀合物结合于与所述配体的配体结合配偶体；(2)生物素分子与抗生物素蛋白-配体缀合物结合；以及(3)生物素分子与抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交联剂交联，其中X是亲水性线性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖)。
在不同的实施方案中，产生具有以上构型的Cell-in-Gel需要进行以下步骤：
(a)使细胞(例如，肌细胞)与结合配偶体对的第一或第二结合配偶体的配体缀合物接触，接触条件为足以使第一结合配偶体结合于细胞表面上所述配体的配体结合配偶体；
(b)使结合于第一或第二结合配偶体的配体缀合物的细胞与互补结合配偶体接触，接触条件为使互补结合配偶体与第一或第二结合配偶体的配体缀合物的生物素结合；
(c)使包含第一结合配偶体/第二结合配偶体-配体缀合物/细胞的复合体与Y-X-Y交联剂接触，接触条件为足以使Y-X-Y交联剂交联第一结合配偶体并形成水凝胶——其中单个细胞(例如肌细胞)被包埋于凝胶基质中，并且细胞表面受体结合配偶体拴系于第一结合配偶体的凝胶，，其中X是亲水性线性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖)，Y是第二结合配偶体。
在不同的实施方案中，具有产生以上构型的Cell-in-Gel需要进行以下步骤：
(a)使细胞(例如肌细胞)与生物素-配体缀合物接触，接触条件为足以使生物素-配体结合于细胞表面上所述配体的配体结合配偶体；
(b)使结合于生物素-配体缀合物细胞与抗生物素蛋白接触，接触条件为使抗生物素蛋白与生物素-配体缀合物的生物素结合；
(c)使包含抗生物素蛋白/生物素-配体缀合物/细胞的复合体与生物素-X-生物素交联剂接触，接触条件为足以使生物素-X-生物素交联剂交联抗生物素蛋白并形成水凝胶——其中单个细胞(例如肌细胞)被包埋于凝胶基质中并且细胞表面配体结合配偶体拴系于抗生物素蛋白凝胶，其中X是亲水性线性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖)。
在不同的实施方案中，产生具有以上构型的Cell-in-Gel需要进行以下步骤：
(a)使细胞(例如肌细胞)与生物素-配体缀合物接触，接触条件为足以使生物素-配体结合于细胞表面上配体的配体结合配偶体；
(b)使结合于生物素-配体缀合物的细胞与抗生物素蛋白接触，接触条件为使抗生物素蛋白结合于生物素-配体缀合物的生物素；
(c)使包含抗生物素蛋白/生物素-配体缀合物/细胞的复合体与生物素-X-生物素交联剂接触，接触条件为足以使生物素-X-生物素交联剂交联抗生物素蛋白并形成水凝胶——其中单个细胞(例如肌细胞)被包埋于凝胶基质中并且细胞表面配体结合配偶体拴系于抗生物素蛋白凝胶，其中X是亲水性线性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖)。
在不同的实施方案中，产生具有以上构型的Cell-in-Gel需要进行以下步骤：
(a)使细胞(例如肌细胞)与抗生物素蛋白-配体缀合物接触，接触条件为足以使抗生物素蛋白-配体结合于细胞表面上配体的配体结合配偶体；
(b)使结合于抗生物素蛋白-配体缀合物的细胞与生物素接触，接触条件为使生物素结合于抗生物素蛋白-配体缀合物的生物素；
(c)使包含生物素/抗生物素蛋白-配体缀合物/细胞的复合体与抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交联剂接触，接触条件为足以使抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交联剂交联生物素并形成水凝胶——其中单个细胞(例如肌细胞)被包埋于凝胶基质中并且细胞表面配体结合配偶体拴系于生物素凝胶，其中X是亲水性线性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖)。
通常，包含结合配偶体对的交联的结合配偶体的水凝胶不拴系细胞表面聚糖，因此可用于选择性地拴系合乎需要的细胞表面分子(例如，不是聚糖的那些)，这取决于所使用的第一或第二结合配偶体的配体缀合物所结合的配体结合配偶体。在以上实施方案中，抗生物素蛋白-生物素水凝胶不拴系细胞表面聚糖，因此可用于选择性地拴系合乎需要的细胞表面分子(例如，不是聚糖的那些)，这取决于所使用的生物素-配体缀合物或抗生物素蛋白-配体缀合物所结合的配体结合配偶体。抗生物素蛋白具有4个生物素结合位点。因此，当将抗生物素蛋白与生物素-X-生物素交联剂混合时或当将生物素与抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交联剂混合时，形成凝胶基质。当将生物素-配体缀合物或抗生物素蛋白-配体缀合物添加到预制成的凝胶中时，所述配体缀合物将分别连接抗生物素蛋白或生物素分子以将配体展示在凝胶基质上。或者，可同时将抗生物素蛋白、生物素-X-生物素交联剂和生物素-配体缀合物全部混合在一起以形成装饰有配体的凝胶。类似地，可同时将生物素、抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交联剂和抗生物素蛋白-配体缀合物全部混合在一起以形成装饰有配体的凝胶。在下文概述的另一个实施方案中，抗生物素蛋白或生物素也可共价连接至生物相容性聚合物(例如，聚乙烯醇)。在这种情况下，所述生物相容性聚合物与生物素-X-生物素或抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交联剂一起作为三维凝胶基质骨架。可通过混合不同比例的生物相容性聚合物(如果包括的话)、交联剂和抗生物素蛋白(或生物素)，容易地调节和调整水凝胶的性质。
在一个相关的实施方案中，细胞表面蛋白(例如整联蛋白)和细胞表面聚糖同时拴系于聚合物-第一或第二结合配偶体-硼酸酯水凝胶。所述聚合物-第一或第二结合配偶体-硼酸酯水凝胶包括：(1)与第一结合配偶体缀合的生物相容性聚合物；(2)硼酸酯交联剂；和(3)第二结合配偶体-配体缀合物。
在不同的实施方案中，产生具有以上构型的Cell-in-Gel需要进行以下步骤：
(a)使细胞(例如肌细胞)与第一或第二结合配偶体的配体缀合物接触，接触条件为足以使结合配偶体-配体结合于细胞表面上所述配体的结合配偶体；
(b)使结合至第二结合配偶体-配体缀合物的细胞与聚合物-第一结合配偶体缀合物接触，接触条件为足以使第一结合配偶体结合至第二结合配偶体-配体缀合物的第二结合配偶体；
(c)使包含聚合物-第一结合配偶体/第二结合配偶体-配体缀合物/细胞的复合体与硼酸酯-X-硼酸酯交联剂接触，接触条件为足以使硼酸酯-X-硼酸酯交联剂交联聚合物和细胞并形成水凝胶——其中单个细胞(例如肌细胞)被包埋于凝胶基质中并且细胞表面配体结合配偶体拴系于聚合物-第一结合配偶体，其中X是亲水性线性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖)。
在不同的实施方案中，产生具有以上构型的Cell-in-Gel需要进行以下步骤：
(a)使细胞(例如肌细胞)与生物素-配体缀合物接触，接触条件为足以使生物素-配体结合于细胞表面上所述配体的配体结合配偶体；
(b)使结合于生物素-配体缀合物的细胞和聚合物-抗生物素蛋白缀合物接触，接触条件为足以允许抗生物素蛋白结合于生物素-配体缀合物的生物素；
(c)使包含聚合物-抗生物素蛋白/生物素-配体缀合物/细胞的复合体与硼酸酯-X-硼酸酯交联剂接触，接触条件为足以使硼酸酯-X-硼酸酯交联剂交联聚合物和细胞并形成水凝胶——其中单个细胞(例如肌细胞)被包埋于凝胶基质中并且细胞表面配体结合配偶体拴系于聚合物-抗生物素蛋白，其中X是亲水性线性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖)。
在不同的实施方案中，产生具有以上构型的Cell-in-Gel需要进行以下步骤：
(a)使细胞(例如肌细胞)与抗生物素蛋白-配体缀合物接触，接触条件为足以使生物素-配体结合于细胞表面上所述配体的配体结合配偶体；
(b)使结合于抗生物素蛋白-配体缀合物的细胞与聚合物-生物素缀合物接触，接触条件为足以允许生物素结合于抗生物素蛋白-配体缀合物的抗生物素蛋白；
(c)使包含聚合物-生物素/抗生物素蛋白-配体缀合物/细胞的复合体与硼酸酯-X-硼酸酯交联剂接触，接触条件为足以使硼酸酯-X-硼酸酯交联剂交联聚合物和细胞并形成水凝胶——其中单个细胞(例如肌细胞)被包埋于凝胶基质中并且细胞表面配体结合配偶体拴系于聚合物-生物素，其中X是亲水性线性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖)。
在不同的实施方案中，所述细胞被悬浮于pH的范围为7.2<pH<7.4的生理盐水(例如，标准磷酸盐缓冲盐水或蒂罗德溶液)中，并且在4-37℃(例如，在20-25℃的室温或36-37℃的体温)的温度范围中与生物素-配体一起被孵育约20-30分钟。
硼酸酯(例如，二价、三价和/或四价的)自发结合于聚合物-抗生物素蛋白或聚合物-生物素中的官能团(例如，二醇)以形成水凝胶，其中单个细胞(例如，肌细胞)被包埋于凝胶基质中。通过硼酸酯结合至聚糖和聚合物中的顺式二醇，细胞表面聚糖也被拴系于凝胶。通过生物素-配体或抗生物素蛋白-配体分别结合至凝胶中的抗生物素蛋白或生物素“钩”，细胞表面蛋白(例如，整联蛋白)或任何其他分子也可被拴系于凝胶。因此具有抗生物素蛋白钩的聚合物-抗生物素蛋白-硼酸酯水凝胶或具有生物素钩的聚合物-生物素-硼酸酯水凝胶提供了用于单独地或共同地栓系任何细胞表面分子的通用***。
可选择生物素-配体或抗生物素蛋白-配体缀合物的配体以结合于任何目的细胞表面分子。在不同的实施方案中，细胞表面配体结合配偶体是整联蛋白。不同的整联蛋白结合至胞外基质中不同的粘附配偶体。因此，生物素-配体缀合物和抗生物素蛋白-配体缀合物可作为胞外基质中粘附分子的替代物而发挥作用。
4.装置、***和试剂盒
a.装置
本申请还提供了包括上述和本文所述的组合物的装置。在不同的实施方案中，所述装置包括一个或多个灌注室中的一个或多个Cell-in-Gel胶囊(capsule)。所述一个或多个灌注室被灌注了适合于被包封或包埋的细胞的生物相容性、等渗溶液，并且相互流体连通。在不同的实施方案中，例如当被包封或包埋的细胞是肌细胞时，使用改良的蒂罗德溶液——其包括用于替代葡萄糖的丙酮酸——来灌注在灌注室中的Cell-in-Gel胶囊。在不同的实施方案中，所述改良的蒂罗德溶液包括低于50μΜ的Ca2+浓度，这允许了松弛态的肌细胞。通常，细胞的整个表面被包封或包埋在水凝胶中，以使细胞外表面不与装置的固体表面(例如，灌注室的内表面)或水凝胶内部的另一细胞接触。
在不同的实施方案中，固定夹具用于将Cell-in-Gel胶囊固定在所述装置上，例如，如图10所示。所述固定夹具可以是包埋于凝胶中的梳状夹具，或凝胶胶囊周围的弹性膜。当用于牵拉凝胶时，凝胶中的梳状夹具允许在整个凝胶中实现几乎均一的应变场。在不同的实施方案中，所述Cell-in-Gel胶囊在至少两个方向上(例如，在2、4或6个方向上，例如沿着x、y和/或z轴)被栓系。可通过固定夹具恰当地抓住Cell-in-Gel胶囊，然后将其固定在微操控器和力传感器之间。通过微操控器控制Cell-in-Gel胶囊上的机械负荷，并通过力传感器进行监测。因此，在不同的实施方案中，所述装置包括能够牵拉凝胶的固定夹具，从而在凝胶和被包封在凝胶中的细胞上引入机械应变和/或应力。
在不同的实施方案中，所述凝胶在由电刺激器控制的电场内，所述电刺激器将电信号施加到包封于凝胶中的一个或多个细胞。在不同的实施方案中，在不同的实施方案中，所述装置可还包括成像***(例如，用于捕获细胞图像)和/或计算机(例如，用于记录施加在细胞和凝胶上的机械应变和应力和/或用于记录细胞图像)。
b.***
在不同的实施方案中，可将相互间流体连通的多个装置放大以构建高通量筛选***(例如，试验化合物(例如药物)的***)，以寻找影响肌细胞机械-化学-转导的新药。在不同的实施方案中，所述高通量Cell-in-Gel***包含以下组分。
(a)处于流体连通的两个或多个(例如，6、8、24、48、96、192、384个)Cell-in-Gel胶囊的阵列。在不同的实施方案中，所述阵列可以是一维(例如，线性的)或二维排列。
(b)通过每个Cell-in-Gel胶囊的一个或多个灌注通道；
(c)任选地，电刺激器(例如，以起搏凝胶包封的肌细胞来经历刺激-Ca2+信号传导-收缩)；
(d)任选地，装备有激发光源、滤光器和发射光检测器的成像***；
(e)任选地，模拟-数字转换器和计算机以记录成像数据；和/或
(f)任选地，可用于控制Cell-in-Gel胶囊的试验化合物灌注、数据采集、图像存储和数据分析的计算机。
因此，本申请还提供了包括本文所述的组合物和/或装置的***。在不同的实施方案中，所述***包括：
i)一个或多个灌注室，每个灌注室包括组合物，其包括本文所述的Cell-in-Gel胶囊。在不同的实施方案中，所述一个或多个灌注室处于流体连通。在不同的实施方案中，灌注溶液包括本文所述的改良的蒂罗德溶液。
ii)与凝胶接触的第一和第二固定夹具，其中所述第一和第二夹具能在至少两个维度上在凝胶上引入张力。在不同的实施方案中，所述第一和第二夹具在完全相反的方向上引入张力。
iii)与力传感器连通的计算机，其中所述计算机能够存储由力传感器感知的机械张力读数。在不同的实施方案中，对所述计算机进行编程以控制和/或管理施加到灌注室的试验刺激。
iv)任选地，能够捕获被包封在凝胶中的细胞的图像的成像***，其中所述成像***与所述力传感器和计算机之一或二者同时连通。
v)任选地，电刺激器，其将电信号施加到包封于凝胶中的细胞。
c.试剂盒
本申请还提供了试剂盒。在不同的实施方案中，可从试剂盒提供的组分来包装用于组装Cell-in-Gel组合物的组分。在一个考虑到的实施方案中，所述试剂盒包括：i)包含生物相容性聚合物的溶液，所述生物相容性聚合物与结合配偶体对的第一结合配偶体缀合；和ii)包含Y-X-Y交联剂的溶液；其中X是线性亲水性聚合物，Y是结合配偶体对的第二结合配偶体。在一个考虑到的实施方案中，所述试剂盒包括：i)包含生物相容性聚合物的溶液，所述生物相容性聚合物与抗生物素蛋白缀合；和ii)包含生物素-X-生物素交联剂的溶液；其中X是线性亲水性聚合物。在一个考虑到的实施方案中，所述试剂盒包括：i)包含生物相容性聚合物的溶液，所述生物相容性聚合物与生物素缀合；和ii)包含抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交联剂的溶液；其中X是线性亲水性聚合物。在不同的实施方案中，所述试剂盒还包括含有生物素-配体缀合物或抗生物素蛋白-配体缀合物的溶液。聚合物、抗生物素蛋白、生物素、交联剂、生物素-配体缀合物和抗生物素蛋白-配体缀合物的其他实施方案如上文和本文所述。该试剂盒的组分适用于包封或包埋和拴系细胞表面聚糖以及任何其他细胞表面分子。
在一个考虑到的实施方案中，所述试剂盒包括：i)包含生物相容性聚合物的溶液，所述生物相容性聚合物与抗生物素蛋白缀合；和ii)包含硼酸酯-X-硼酸酯交联剂的溶液；其中X是线性亲水性聚合物。在一个考虑到的实施方案中，所述试剂盒包括：i)包含生物相容性聚合物的溶液，所述生物相容性聚合物与生物素缀合；和ii)包含硼酸酯-X-硼酸酯交联剂的溶液；其中X是线性亲水性聚合物。在不同的实施方案中，所述试剂盒还包括含有生物素-配体缀合物或抗生物素蛋白-配体缀合物的溶液。聚合物、抗生物素蛋白、生物素、交联剂、生物素-配体缀合物和抗生物素蛋白-配体缀合物的其他实施方案如上文和本文所述。该试剂盒的组分适用于拴系任何细胞表面分子而不拴系聚糖。
所述试剂盒可还包含用于组装和使用所述Cell-in-Gel组合物的说明书。
测量细胞机械应变和应力的方法
本申请还提供了监测和测量细胞上的机械应变和/或应力的方法，包括：
a)将细胞包封在组合物中，如上文和本文所述；
b)获得细胞上的机械应变和/或应力的第一测量值；
c)将细胞暴露于试验刺激；
d)获得细胞上的机械应变和/或应力的第二测量值；和
e)比较第一次和第二次测量值。
在不同的实施方案中，可在将细胞暴露于试验刺激之前和/或之后在凝胶上施加机械应变和/或应力。一种在凝胶上引入机械应变和/或应力的技术是牵拉凝胶，例如，使用本文所述的固定夹具。凝胶中的梳状夹具将材料向内拉并稍微平移，这是获得在整个凝胶中的近乎均一的应变场的方法。视情况或所需，可同时或连续地在1、2、3、4、5或6个方向上牵拉凝胶。可通过梳状夹具抓住Cell-in-Gel胶囊，然后将其固定在微操控器和力传感器之间。通过微操控器控制Cell-in-Gel胶囊上的机械负荷，并通过力传感器进行监测。可通过使用微操控器在细胞上施加机械预负荷以拉伸Cell-in-Gel胶囊；通过拉伸或牵引凝胶的程度来控制预负荷水平。通过使用电场在细胞上施加机械后负荷以刺激Cell-in-Gel胶囊中的肌细胞收缩；通过凝胶的刚度来控制后负荷水平。将牵拉与收缩相结合，同时在细胞上施加预负荷和后负荷。因此，该***允许控制单个细胞上的机械预负荷和后负荷。
在不同的实施方案中，测量肌细胞(例如，心肌细胞、骨骼肌细胞或平滑肌细胞)上的机械应变和/或应力。在不同的实施方案中，测量肌细胞收缩。在不同的实施方案中，所述试验刺激是物理的、化学的或药理学的刺激。在不同的实施方案中，细胞上机械应变和/或应力的第一和/或第二测量值记录于计算机可读介质中。
使用本领域已知的方法可测量和定量细胞上的机械应变和/或应力。一种这样的方法包括使用3D Cell-in-Gel***的数学建模，并且记载于Shaw,et al.,PLoS One.(2013)8(10):e75492)。
实施例
下列实施例用于举例说明，而不是限定所要求保护的发明。
实施例1用于将细胞包埋在3D弹性基质中和拴系细胞表面分子的Cell-in-Gel***
1.1设计凝胶组合物以拴系不同类型的细胞表面分子
在体内，将细胞表面粘附至胞外基质(ECM)上。细胞表面上的机械传感器通常连接于胞外基质中其粘附配偶体上。在心肌细胞中，例如，环绕z盘以提供结构支撑的肋状体包含抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合体(DGC)和粘着斑蛋白-踝蛋白-整联蛋白复合体(VTI)。如图3所示，DGC中的细胞表面分子为抗肌萎缩蛋白聚糖和肌聚糖(sarcoglycan)(其连接至胞外基质中的层粘连蛋白和胶原上)；VTI中的细胞表面分子为整联蛋白(其连接至胞外基质中的纤连蛋白、纤维蛋白原、玻连蛋白等)(Guo,et al.,Journal of Molecular andCellular Cardiology.(2011)50:606-12；Campbell,Cell.(1995)80:675-9；和Anastasi,Int J Mol Med.(2009)23:149-59)。这些细胞表面分子用作胞外基质和胞内细胞骨架(以及在肌细胞的情况下的肌丝)之间的结构连接。这些细胞表面分子还用作机械传感器以便通过其大分子复合体和下游信号传导途径激活机械-化学转导。
本发明人已设计了凝胶组合物以拴系不同类型的细胞表面分子，其能够施加机械应力于特定的分子上以研究它们对机械应力的应答和下游机械-化学-转导机制。本文中，本发明人记载了三种不同的用于拴系多种细胞表面分子(其包括聚糖、整联蛋白和任何其他普通的分子)的凝胶组合物。
1.2用于拴系细胞表面聚糖的PVA-硼酸酯凝胶组合物
用于拴系细胞表面聚糖的基础PVA-硼酸酯凝胶组合物记载于国际公开WO 2010/148346中。尽管该凝胶原本设计为维持3D支架中癌细胞生长，但其化学性质还可用于将聚糖结合至PVA凝胶中。因此本发明人应用它将细胞(包括心肌细胞)包埋在凝胶中并拴系细胞表面聚糖(例如DGC的抗肌萎缩蛋白聚糖、肌聚糖)。
PVA-硼酸酯凝胶(图4)包括两部分：未衍生化的聚乙烯醇(PVA)和四价4-硼酸酯-PEG交联剂。在混合两种组分时，在室温下1-3分钟内硼酸酯自发地结合在PVA的羟基基团上以形成PVA水凝胶。该***可用于通过下列步骤产生Cell-in-Gel的胶囊：首先将新鲜分离的细胞(例如心肌细胞)悬浮在PVA溶液中，然后加入交联剂以形成具有包埋在凝胶基质中的单个肌细胞的PVA水凝胶。凝胶的刚度可通过调节交联剂和PVA的混合比来调整。因此，本发明人可设计具有所需可变刚度(例如约0.5kPa至约50kPa)的弹性凝胶以模拟用于细胞的多种病理-生理环境。所述凝胶还可通过添加山梨糖醇(或其他糖)可逆地溶于浴溶液(bathsolution)中以竞争掉并洗去交联剂。
1.3用于拴系细胞表面整联蛋白的抗生物素蛋白-生物素凝胶组合物
为了拴系细胞表面整联蛋白而不拴系聚糖，本发明人设计了包括三部分的抗生物素蛋白-生物素凝胶：抗生物素蛋白、生物素-PEG-生物素交联剂和生物素-配体(整联蛋白结合配体)。该实施方案可通过下列步骤产生Cell-in-Gel构型：
(a)用生物素-配体(其结合于所选的整联蛋白亚型上)孵育细胞(例如肌细胞)；
(b)将细胞(例如肌细胞)悬浮在抗生物素蛋白溶液中；
(c)添加生物素-PEG-生物素交联剂；生物素和抗生物素蛋白自发地结合以形成水凝胶，其具有包埋在凝胶基质中的单个细胞(例如肌细胞)和拴系在抗生物素蛋白凝胶上的细胞表面整联蛋白。
抗生物素蛋白-生物素凝胶不会拴系细胞表面聚糖，因此可只用于选择性拴系细胞表面整联蛋白。不同亚型的整联蛋白可通过使用不同的抗生物素蛋白-配体来拴系。例如，表1列举了数种结合于不同亚型的整联蛋白上的肽(Xiao et al.,Molecular CancerTherapeutics.(2010)9:2714-23；Yao et al.,Journal of Medicinal Chemistry.(2008)52:126-33；Peng et al.,Nat Chem Biol.(2006)2:381-9)。
表1
肽 整联蛋白亚型 ECM结合配偶体
LXY3 α3β1 层粘连蛋白
LLP2A α4β1 纤连蛋白(Fn)、VCAM-1
LXW7 αvβ3 纤连蛋白、纤维蛋白原、玻连蛋白
LXW7为：cGRGDdvc
LXY3为：cdG-Tyr(3-NO2)-G-BNc；
其中B＝羟基脯氨酸；
小写字母表示D-氨基酸；以及
Tyr(3-NO2)为L-3-硝基-酪氨酸。
不同的整联蛋白结合在在胞外基质中不同的粘附配偶体上。因此，生物素-肽配体可用作胞外基质中粘附分子的替代物。当所述细胞(例如肌细胞)相对于凝胶被拉伸或收缩时，生物素-肽配体将牵引整联蛋白以激活它们的机械-化学-转导途径，若该细胞在体内被连接至胞外基质上则其也可被激活。本文中，本发明人利用本发明人的合成凝胶***(而非基质胶或ECM提取物)的优势单独地牵引每个整联蛋白的亚型以剖析其作用，并还可牵引整联蛋白的组合以研究它们的共同效果。
1.4用于拴系细胞表面分子的杂合的PVA-抗生物素蛋白-硼酸酯凝胶组合物
本发明人还研制了杂合(hybrid)的PVA-抗生物素蛋白-硼酸酯凝胶，其被设计为拴系聚糖和整联蛋白以及任何细胞表面分子。该PVA-抗生物素蛋白-硼酸酯凝胶包含三部分：PVA-抗生物素蛋白、4-硼酸酯-PEG交联剂以及生物素-配体。合成PVA-抗生物素蛋白以在PVA中加入抗生物素蛋白“钩”，用于拴系生物素缀合的分子。可选择生物素-配体以结合任何目的细胞表面分子。例如，配体可为结合整联蛋白上肽或可为结合特定的细胞表面分子的抗体或抗体片段。
该杂合***用于通过下列步骤产生Cell-in-Gel构型(参见图5)：
(a)用生物素-配体(其结合于所选的细胞表面分子上)孵育细胞(例如肌细胞)；
(b)将细胞(例如肌细胞)悬浮在PVA-抗生物素蛋白溶液(参见下文中PVA抗生物素蛋白合成步骤)中；
(c)添加4-硼酸酯-PEG交联剂。
硼酸酯自发地结合于PVA抗生物素蛋白中的羟基基团上以形成具有包埋在凝胶基质中的单个细胞(例如肌细胞)的水凝胶。通过硼酸酯结合至聚糖和PVA中的顺式-二醇上，将细胞表面聚糖拴系在凝胶中。通过生物素-配体结合至凝胶中的抗生物素蛋白“钩”上，可将细胞表面整合蛋白或任何其他分子拴系至凝胶中。因此，具有抗生物素蛋白钩的PVA-抗生物素蛋白-硼酸酯凝胶提供了用于单独地或共同地拴系任何细胞表面分子的通用***。
1.5用于将细胞表面分子拴系至凝胶中的生物素-配体
Cell-in-Gel***提供了一种实验工具以在单个细胞上施加机械应力以及牵引细胞表面分子。将细胞表面分子直接地或通过生物素-配体拴系至凝胶中。直接拴系的实例为细胞表面聚糖结合至基于硼酸酯的交联剂上，从而被拴系在PVA凝胶中。利用生物素-配体作为中间键的实例为所述生物素缀合至结合细胞表面整联蛋白的整联蛋白结合配体上；在另一端，所述生物素结合PVA-抗生物素蛋白凝胶中的抗生物素蛋白，从而将整联蛋白拴系至凝胶中。
具有生物素-配体***的PVA-抗生物素蛋白凝胶提供了用于拴系任何细胞表面分子的一般方法。本发明人已设计了单独地或共同地靶向细胞表面分子的下列生物素-配体：
(a)生物素缀合的肽(生物素-肽)提供了另一种通用方法以将细胞表面分子拴系至凝胶中(图6)。所述肽可以是结合不同整联蛋白亚型的整联蛋白结合肽。所述肽还可模拟胞外基质中细胞粘附蛋白质的结合域，从而用作其替代物以结合其在细胞表面上的粘附配偶体。
(b)生物素缀合的抗体(生物素-抗体)提供了一种通用方法以将细胞表面分子拴系至凝胶中。一种简单方法为使用生物素缀合的抗IgG的二级抗体(生物素-二抗)；生物素-二抗可结合靶向所选择的细胞表面分子的一级抗体(一抗)上，从而将所述分子拴系到凝胶中(图7A)。一种替代方法为使用生物素缀合的一级抗体(生物素-一抗)以结合至所选择的细胞表面分子上(图7B)。与使用生物素-一抗相比，使用生物素-二抗提供了更通用的方法。本发明人使用一系列生物素缀合的二级抗体以结合不同种类(小鼠、大鼠、兔子、山羊和绵羊)的IgG上，所述种类通常用于产生一级抗体。这允许使用任何一级抗体来拴系任何细胞表面的目的分子。
1.6用于拴系心肌细胞中的细胞表面分子的凝胶组合物和生物素-配体
作为上述设计的原理证明，本发明人已进行实验以使用生物素-配体来拴系心肌细胞中的细胞表面分子。对肌细胞功能和疾病来说，特别值得注意的是将机械应力转导至生化反应中的DGC和VTI分子复合体，如图8所示。DGC的细胞表面机械传感器为抗肌萎缩蛋白聚糖和肌聚糖；VTI的为整联蛋白。本发明人使用PVA-硼酸酯凝胶来拴系所述聚糖(图8A)；使用抗生物素蛋白-生物素凝胶来拴系整联蛋白(图8B)；以及使用PVA-抗生物素蛋白-硼酸酯凝胶来拴系DGC和VTI(图8C)。使用PVA-硼酸酯凝胶来激活DGC的实验结果记载在下文的实施例7中。图9(上图)中的数据示出使用PVA-硼酸酯凝胶来牵引DGC在肌细胞中产生Ca2+火花(参见在图9A中的3D图像中的亮荧光斑点)。Ca2+火花可通过抑制nNOS来清除(图9B)。因此牵引聚糖激活的DGC及其缔合的nNOS，这反过来增强了兰尼碱受体活性以产生Ca2+火花。抑制eNOS(图9C)不会影响Ca2+火花，这表明eNOS不会被DGC激活，因此其不参与Ca2+火花的产生。
使用PVA-抗生物素蛋白-硼酸酯凝胶和生物素-配体来拴系DGC和VTI的结果示于图9(下图)中。在该实验中，本发明人使用表1中列出的肽来拴系三种亚型的整联蛋白。图9的数据示出了在凝胶中肌细胞收缩期间牵引DGC和VTI导致肌细胞产生Ca2+火花(图9E，2D图像)。Ca2+火花并不能仅通过抑制nNOS清除(图9F)，但是可通过抑制nNOS和eNOS来去除(图9G)。因此，牵引DGC和VTI会激活nNOS和eNOS(还参见图8C)。
将细胞表面分子拴系至凝胶中的有用替代方法为保护特定的分子不被拴系在凝胶中。这可通过使用非缀合的抗体来结合特定的分子，从而掩蔽它不被拴系在凝胶中来实现。例如，本发明人用抗α-抗肌萎缩蛋白聚糖的抗体预孵育肌细胞，然后将所述细胞包埋在上文和本文所述的PVA-硼酸酯凝胶中。除了α-抗肌萎缩蛋白聚糖之外，所述凝胶拴系细胞表面上的所有其他聚糖(例如肌聚糖、β-抗肌萎缩蛋白聚糖等)。该方法可用于从命令的机械-化学-转导链上除去α-抗肌萎缩蛋白聚糖。本发明人的实验数据示出当α-抗肌萎缩蛋白聚糖未被拴系时，Ca2+火花率减小，这显示了在转导机械应力以产生Ca2+火花的过程中α-抗肌萎缩蛋白聚糖的作用。
这些实验结果证明了使用多种凝胶组合物和生物素-配体来拴系所选的细胞表面分子的可行性。
1.7 Cell-in-Gel试剂盒：用于拴系细胞表面分子的凝胶组分和生物素-配体
用于装配Cell-in-Gel胶囊的组分可被包装在试剂盒中。考虑到至少两种构型：(1)包含PVA-抗生物素蛋白凝胶的试剂盒可用于拴系细胞表面聚糖和任何其他分子；(2)包含抗生物素蛋白-生物素凝胶的试剂盒可用于拴系任何细胞表面分子而不拴系聚糖。可任选地包括生物素-配体；用户还可使用其他来源的其他生物素缀合的配体或抗体。
实施例2用于合成和纯化凝胶组分的方法
合成和纯化Cell-in-Gel组分的方法记载于本实施例中。
2.1 PVA-抗生物素蛋白
PVA抗生物素蛋白是通过利用PVA(98kDa)作为起始材料合成。通过缀合将抗生物素蛋白添加到PVA中。然后通过过滤移出过量的抗生物素蛋白。下面详细说明用于合成和纯化PVA-抗生物素蛋白的示例性逐步方法。
(a)在室温下N2气氛中用NaH(0.05当量，0.23mmol，溶于纯度60％的矿物油中的9.1mg NaH)处理10mL无水DMSO中的2％聚乙烯醇溶液(PVA，98kDa)，磁力搅拌2小时。
(b)然后将过量的环氧氯丙烷(epichlorophydrin)(0.5当量)加入到所述反应中并搅拌过夜。将5倍体积的乙醇加入到DMSO溶液中以沉淀环氧-PVA。
(c)再将聚合物用乙醇洗涤3次并真空干燥。
(d)然后将聚合物溶于20ml PBS中，随后添加(0.05当量)ml的抗生物素蛋白。
(e)在4℃下再将反应混合物搅拌24小时。
(f)然后用100kDa离心过滤装置将反应混合物离心过滤以除去过量的未缀合的抗生物素蛋白。
(g)在每次离心过滤步骤后，通过加入PBS使滞留溶液(retentate solution)的最终体积回到起始体积。
2.2生物素-PEG-生物素
生物素-PEG-生物素是通过使用NH2-PEG-NH2(20kDa)作为起始材料合成。在DMF中经一整夜使用1,3-二异丙基碳二亚胺(DIC)(6当量)和6-氯-1羟基苯并***(Cl-HOBt)(6当量)作为偶联剂将D-生物素(6当量)偶联至PEG的氨基基团上。通过Kaiser试验检测偶联的完成情况：黄色表示未剩余氨基基团，蓝色表示存在氨基基团。通过加入冷***沉淀PEG化的分子，并用***洗涤3次。随后将该生物素-PEG-生物素透析并冻干以得到白色粉末。下面详细说明用于合成生物素-PEG-生物素的示例性逐步方法。
(a)分别称出NH2-PEG-NH2(20K)和6当量的Cl-HOBt、D-生物素和DIC。
(b)将D-生物素添加至10-15ml的偶联DMF中并用微波加热约30s直至所有粉末完全溶于DMF中，然后将NH2-PEG-NH2和Cl-HOBt添加至溶液中并进行涡旋直至所有试剂溶解，最后添加DIC。
(c)将全部反应溶液转移至100ml的塑料瓶中并在200rpm下震荡所述瓶过夜。
(d)第二天，取出约200μl反应溶液，用冷***沉淀溶液，并对产物进行Kaiser试验。
(e)对于阴性Kaiser试验，继续使所有反应溶液沉淀，用冷***洗涤产物三次。
(f)将反应产物放置在真空下直至粉末完全干燥。
(g)将最终的生物素-PEG-生物素溶于偶联DMF中并用孔径在6-8k之间的膜透析溶液。
(h)最后，冻干所述溶液并且将粉末备使用。
实施例3用于在Cell-in-Gel***中使用活细胞的工作de溶液和方案
使用活细胞的工作的溶液是基于标准蒂罗德溶液或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。每种凝胶组分溶于蒂罗德(例如119mM NaCl、5mM KCl、25mM HEPES缓冲液、2mM CaCl2、2mMMgCl2、6g/升葡萄糖，pH用NaOH调节至7.4)或具有生理性pH(7.2-7.4)值的PBS中。本发明人改良该蒂罗德溶液以除去葡萄糖(其通常是存在的)，并用丙酮酸(用于能量供应的葡萄糖的下游代谢物)替代它。这是由于葡萄糖与硼酸酯交联剂竞争而在延长的培养时间内缓慢地软化凝胶。用丙酮酸替代葡萄糖解决了该问题。
以下是示例性逐步方案以将细胞快速地包埋在凝胶中、将特定的细胞表面分子拴系到凝胶中，同时避免细胞损伤以保持活细胞的功能。
(a)将新鲜分离的细胞(心室肌细胞)悬浮至改良的蒂罗德溶液(参见下文的制法)中并在室温下储存。将20μM生物素-配体溶液添加至细胞悬浮液中，缓慢地混合，并孵育15-20分钟。
(b)用蒂罗德洗去未结合的生物素-配体，并通过使细胞在1.5ml Eppendorf管形瓶中沉降来浓缩细胞浓度，并除去上清液以剩下0.5ml溶液。缓缓地混合以悬浮细胞。注意：为了防止在机械扰动下肌细胞收缩，将蒂罗德溶液中Ca2+浓度从1mM降低至20μM以使细胞松弛，因此细胞将在松弛状态下被包埋。
(c)缓缓地将15μl细胞悬浮液混合至35μl PVA-抗生物素蛋白溶液中。
(d)将15μl悬浮在PVA-抗生物素蛋白中的细胞移液至1号玻璃盖玻片上的室中。如下文图6所述，该室被制成含有约100μm厚度的Cell-in-Gel胶囊。该室底部的1号玻璃盖玻片(厚度约0.15mm)允许在使用具有较短工作距离的物镜的显微镜上成像(高放大率下的荧光成像需要使用大数值口径NA的物镜，因此缩短工作距离)。
(e)使细胞在PVA抗生物素蛋白溶液中沉淀2-3分钟。然后在顶部加入15μl交联剂，快速但轻轻地混合。在3-5分钟内水凝胶自发地形成以将单个细胞包埋在3D凝胶基质中。注意：仅需要较小体积来用于包埋单个细胞(心肌细胞尺寸～120x40x30μm；癌细胞直径尺寸～15-20μm)，因此本发明人建议制作一个小的Cell-in-Gel胶囊，以促进交联剂的扩散和避免机械混合。这对于肌细胞来说是非常重要的，因为机械扰动可导致肌细胞收缩。
(f)将Cell-in-Gel胶囊在室温下于增湿室(用湿滤纸包封培养皿)中孵育5分钟用于形成凝胶。
(g)将具有Cell-in-Gel胶囊的玻璃盖玻片固定在灌注室中，并迅速用蒂罗德溶液覆盖凝胶。此时Cell-in-Gel***被组装并准备好用于实验。
表2基于蒂罗德溶液的配方
实施例4 Cell-in-Gel胶囊和用于控制细胞上机械预负荷和后负荷的装置
本发明人设计了一个梳状固定夹具以便将Cell-in-Gel胶囊固定到实验设备上，如图10所示。凝胶中的梳状夹具可将材料向内牵拉并稍微平移，这是一种在整个凝胶中获得接近均一应变场的方法。Cell-in-Gel胶囊可被梳状夹具夹住，然后固定在微操控器和力传感器之间。Cell-in-Gel胶囊上的机械载荷是通过微操控器来控制并通过力传感器来监测。
利用微操控器在细胞上施加机械预负荷以拉伸Cell-in-Gel胶囊；预负荷水平是通过拉伸的程度来控制。利用电场在细胞上施加机械后负荷以刺激Cell-in-Gel胶囊中的肌细胞收缩；后负荷水平是通过凝胶的刚度来控制。将拉伸与收缩结合可同时在细胞上施加预负荷和后负荷。因此，该***允许在单个细胞上控制机械预负荷和后负荷。
用于Cell-in-Gel胶囊的梳状夹具还可定制成适合任何装置，例如，IonOptixMyoStretcher(原本设计成用一对玻璃杆夹住单个肌细胞(Iribe,Circ Res.(2009)104:787-95),IonOptix LLC,USA)。
实施例5用于高通量药物筛选的Cell-in-Gel阵列
可放大Cell-in-Gel***以建立大通量药物筛选***来寻找影响肌细胞机械-化学-转导的新药。高通量的Cell-in-Gel***包含下列组件。
(a)Cell-in-Gel胶囊的阵列；
(b)穿过每个Cell-in-Gel胶囊的灌注通道；
(c)电刺激器来起搏(pace)凝胶内肌细胞以经历刺激-Ca2+信号传导-收缩；
(d)装配有激光激发光源、滤光器和发射光检测器的成像***；
(e)模拟数字转换器和用于记录成像数据的计算机；
(f)用于计算机控制Cell-in-Gel胶囊的药物灌注、数据采集和数据分析的软件。
实施例6 Cell-in-Gel***的试验
6.1凝胶组分及其组合对活细胞是无毒的
本发明人设计凝胶以包含抗生物素蛋白“钩”，所述抗生物素蛋白“钩”允许经由自发的抗生物素蛋白-生物素结合将任何生物素-配体拴系在凝胶中。凝胶的基础组分包括：PVA、PVA-抗生物素蛋白、4-硼酸酯-PEG交联剂，以及所有组分均溶于生理盐水(磷酸盐缓冲盐水PBS，或溶于蒂罗德溶液，其中pH为7.3)。本发明人通过在每种凝胶组分中预孵育新鲜分离的肌细胞，然后测定肌细胞收缩作为灵敏功能性输出量来检验每种组分的细胞毒性。本发明人的数据表明肌细胞收缩不会被任何这些组分改变。然后本发明人将这些组分混合以形成具有包埋在3D弹性凝胶基质中的肌细胞的水凝胶。肌细胞能够在凝胶中经历刺激-收缩偶联。因此，在通常预期新鲜分离的肌细胞在生理盐水(无凝胶)中正常发挥作用的时间间隔中，肌细胞能够在凝胶中以及在每种凝胶组分中实施它们天然生理学功能，而没有表现出任何明显的损伤。
6.2 Cell-in-Gel***的机械分析
在后负荷下收缩期间为了定量肌细胞中的机械应变和应力，本发明人进行3DCell-in-Gel***的数学建模(Shaw et al.,,PLoS One.(2013)8(10):e75492)。结果表明(B)在凝胶内收缩期间，所述细胞在其表面上经历正常和剪切牵引(力/单位面积)的高度非均一分布。(C)纵向应力的3D应力图表明细胞内部的压力状态基本上是均一的，然而外部(凝胶)应力场非常不均一，其表面上肌细胞的中部(waist)和顶点处具有“热点”。其他应力组分的应力图(例如横向应力)是相似的(但是细胞内是收缩的)，这表明细胞经历着多个轴向负荷。因此，在细胞表面上不同几何位置处的机械-化学-转导(MCT)复合体应当经历不同水平的正应力和剪切应力。这再次确保了顶点处的最高应力水平与Intercalated Disc(一种已知的应力支承结构)相符。这是第一次定量分析肌细胞结构的这种3D应力图。目前，本发明人的分析方案以无量纲(标准化)术语表示，这些术语容易用于参数研究。
实施例7心脏收缩期间的机械-化学-转导是通过使局部一氧化氮信号传导介导
每次心跳期间心肌细胞应机械负荷发生收缩，以及过度的机械应力导致心脏疾病。利用在肌细胞收缩期间施加后负荷的新的Cell-in-Gel***，本发明人确定一氧化氮合酶(NOS)为参与转导机械负荷以改变Ca2+动态的关键分子。在小鼠的心室肌细胞中，细胞收缩期间的后负荷提高了收缩期的Ca2+瞬变和舒张期的自发性Ca2+火花，这是由于SR负荷保持不变而增强了兰尼碱受体(RyR)的敏感性。后负荷诱发的Ca2+火花是通过nNOS的药理学抑制作用或遗传缺失来阻止，但是eNOS并不能如此。这种差异作用可能源于与eNOS到RyR的物理接近度相比，nNOS到RyR的物理接近度更近，这可通过超分辨率成像来解析。除了NOS，Ca2 +-钙调蛋白依赖性蛋白质激酶II(CaMKII)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(NOX2)也参与机械-化学-转导。在具有增加的肌丝Ca2+敏感性的心肌病的小鼠模型中，机械转导被进一步加强以引起频繁的Ca2+火花以及Ca2+波。自发的Ca2+活性可通过抑制nNOS和CaMKII而不是NOX2来消除，这证明通过机械转导复合体对NOS和NOX的独立激活。总之，本发明人的数据显示在心脏收缩期间的机械-化学-转导中nNOS和CaMKII为新的关键介质，其提供了用于治疗机械应力诱导的Ca2+调节异常、心律失常和心肌病的新的机械学见解和治疗目标。
引言
心脏必须应机械负荷而泵血液，所述机械负荷随身体活动、姿势、情感和病理生理状态而不断变化。Anrep效应(1-4)描述了由增加的后负荷引起的心脏收缩性的增强，其是对描述由增加的预负荷而增强的收缩性的Frank-Starling机制(5)的补充。Petroff etal.,的开创性研究(6)发现拉伸心肌细胞以增加预负荷可通过激活一氧化氮合酶3(eNOS)而诱导自发性Ca2+火花。Prosser et al.,最近的研究(7,8)显示拉伸肌细胞可激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(NOX2)以引发Ca2+火花。预负荷诱导的Ca2+处理的改变促成Frank-Starling机制。但是，后负荷是否也可引起Ca2+处理的改变以及类似的机械--化学-转导机制是否可在应机械负荷而收缩的肌细胞中被激活仍然是未知的。已知在病理学病症(例如高血压、异步收缩和梗死)下过度后负荷可导致心脏重塑、肥大、心律失常和心力衰竭(9-11)。本文中，本发明人确定nNOS、eNOS、NOX2和Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白质激酶II(CaMKII)为将机械后负荷与Ca2+处理联系起来的机械-化学-转导途径的关键介质。这丰富了Anrep效应的机械理解，并有助于鉴别用于治疗机械应力诱导的心脏疾病的可能分子靶标。
材料和方法
所有实验室方案均符合US国家卫生研究院出版的“实验动物护理和使用指南”(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)。动物使用由当地机构动物保护和使用委员会批准。
细胞分离从Jackson Laboratories(USA)购得野生型及转基因小鼠(8周龄的雄性)：C57BL/6J(野生型)、B6.129S4-Nos1tm1Plh/J(NOS1-/-)、B6.129P2-Nos3tm1Unc/J(NOS3-/-)。在Tardiff实验室中在制备心肌钙蛋白T中具有R92Q突变的转基因小鼠(22)，并在Chen-Izu实验室中繁殖。利用标准酶学技术(40)使用Worthington胶原酶II型和Sigma蛋白酶XIV型分离心室肌细胞。所有实验在21-22℃下进行。
Cell-in-Gel***弹性凝胶基质是由包含未衍生化PVA(98KD)和四价硼酸酯-PEG交联剂的聚乙烯醇(PVA)水凝胶***制成(12)。首先将新鲜分离的肌细胞悬浮在7％PVA溶液中；然后加入相同体积的7.5％交联剂溶液(凝胶7.5％)。一旦混合，硼酸酯基团就交联PVA水凝胶，将细胞包埋在3D凝胶基质中。硼酸酯基团还将细胞表面聚糖的顺式-二醇交联至PVA上，从而将细胞表面拴系在凝胶中。本发明人在该研究的所有实验中使用Gel7.5％，除了图11G中的一组(其使用凝胶5％)。
本Cell-in-Gel***具有数个有利的性质。(1)在电场刺激下，肌细胞在弹性凝胶中经历刺激-收缩，并且凝胶基质抵抗收缩期间得到细胞的缩短和变宽，从而对细胞施加多轴向机械应力。(2)凝胶的刚度可通过交联剂和PVA的混合比来调节[41]。在绝大多数实验中，混合相同体积的7.5％交联剂和7％PVA以形成7.5％凝胶。在少数实验中，将5％交联剂和7％PVA混合以形成较软的5％凝胶。(3)凝胶基质是多孔的以允许快速的浴溶液交换用于研究药物作用。(4)凝胶基质是光学透明的，用于细胞收缩的实时成像以及Ca2+信号的荧光成像。
本发明人通过以下步骤进行对照实验以检验PVA或交联剂单独对肌细胞的效应：在PVA或CL中预孵育所述细胞10分钟，然后用正常蒂罗德溶液灌注细胞并测量细胞收缩。图12表明单独用PVA或CL的预孵育不能改变兔肌细胞的收缩。本发明人还进一步检验了凝胶内肌细胞收缩诱发的自发性Ca2+活性(参见下文)。数据表明在电起搏前位于凝胶中的细胞没有Ca2+火花；然后凝胶内细胞收缩产生舒张期的自发性Ca2+火花和波；然后停止起搏去除细胞收缩并消除自发性Ca2+活性。这些证据清楚地排除了单独的凝胶会改变Ca2+信号传导和细胞收缩的可能性。
在单个细胞水平上控制机械应力的现代技术可分类如下。通过使用一对微悬臂支架(碳纤维[42]，玻璃棒[43])拉伸细胞的1D(单轴)技术已产生有价值的数据，但其与体内3D环境不同。在可变形膜或微柱(micropost)上培养细胞的2D技术用于拉伸新生儿肌细胞[44]等，但是新鲜分离的成体肌细胞不容易连接到膜上。3D技术，通过将细胞包裹在纤维蛋白原-凝血酶凝胶[45]和然后在琼脂中[6]，但细胞表面不粘附于琼脂。而且，去皮(“死”细胞)的肌肉或肌原纤维制品通常用于研究被动肌肉力学，但机械-化学-转导需要在活的完整肌细胞中研究。因此，本发明人的Cell-in-Gel***通过将细胞表面拴系在凝胶上并对单个活的成体心肌细胞施加3D机械应力来更接近地模拟生理环境。
本发明人的数据与以下结论一致：细胞表面粘附到3D凝胶基质(模拟对体内胞外基质的粘附)在机械-化学-转导中发挥重要作用。本发明人工作假说为：在Cell-in-Gel***，将细胞表面聚糖通过硼酸酯结合连接至PVA凝胶基质。由于在肌细胞收缩期间细胞表面遭受正应力和剪切应力[13]，凝胶牵引细胞表面糖蛋白(包括抗肌萎缩蛋白聚糖和肌聚糖)以在抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合体中的这些机械感应分子上施加机械应变和应力似乎是合理的。抗肌萎缩蛋白连接至nNOS上是已知的。该观点与本发明人的发现是一致的，即nNOS在凝胶内收缩的肌细胞中被激活。
此外，当心肌在舒张末期被拉伸并随后应机械负荷而收缩时，体内的心肌细胞最可能在一个心脏周期内经受预负荷和后负荷。Cell-in-Gel***提供了用于研究后负荷作用的实验工具[6][42][43]。该***还可被进一步开发以通过拉伸凝胶来施加预负荷。本研究是本发明人的第一个关于后负荷诱导的机械-化学-转导的成就，其补充预负荷作用的在先研究。本文中本发明人的研究为下一阶段施加预负荷和后负荷以研究它们的组合作用的研究调查奠定了基础。
在3D弹性基质中的肌细胞收缩的机械分析。PVA凝胶的刚度是使用TA-XT2质构分析仪(Stable Micro Systems,England)来测定。50mm直径和1.5mm厚度的PVA凝胶样品经受单向应变。所施加的10％的应变足够小以保持在应力-应变响应的线性区域中，并且根据应力与应变曲线的斜率计算杨氏模量。凝胶的刚度是由交联剂和PVA的混合比来控制[41]。除非另有说明，本研究中的实验是使用杨氏模量为1KPa的7.5％的凝胶进行。本发明人已在弹性凝胶中进行了用于肌细胞收缩的3D机械分析[13]。主要发现包括(1)应力状态在细胞内是均一的；沿着纵向轴线的轴向应力是沿着横向轴线的横向应力的约15倍。(2)表面牵引力(剪切应力)高度不均一；它在细胞的中部最小，沿着长度方向逐渐增大，并且在顶点附近达到最大。(3)凝胶内肌细胞的缩短分数(fractional shortening)小于无负荷收缩的缩短分数。击倒因子(knock-down factor)是由细胞的几何尺寸和细胞对凝胶的相对刚度决定；更细或更软的细胞具有较少的缩短分数。来自严格的3D机械分析的上述结果可使用Cell-in-Gel***确认以在模拟的体内机械环境中对单个肌细胞施加纵向张力、横向压缩和表面牵引。
Ca2+信号的共聚焦成像。将肌细胞负载Ca2+指示剂Fluo-4，然后包埋在凝胶中。使用标准方法进行共聚焦成像(41)。
为了Ca2+信号的共聚焦成像，在pH7.4下将负载有Ca2+指示剂Fluo-4的新鲜分离的肌细胞在包含(以mM计):150NaCl、5.4KCl、1.2MgCl2、1CaCl2的蒂罗德溶液中连续灌注，然后包埋在PVA凝胶中。使用具有双极转换(在连续刺激脉冲中转换正极和负极)的短(4ms)去极化脉冲通过电场刺激以0.5Hz频率对细胞进行起搏。铂电极与新鲜蒂罗德溶液的持续灌注结合使用以保持恒定浴条件(pH、葡萄糖、离子组成、温度等)。
使用具有水浸式荧光物镜UPlanSApo 60X，NA1.2的Olympus FluoView 1000共聚焦显微镜(倒置配置)获得共聚焦图像，就灌注室底部使用的1号玻璃盖玻片的厚度进行修正。用488nm激光束(激光功率设置为5％)激发Fluo-4，并使发射的荧光通过带通滤波器BA505-605并用PMT收集。设置PMT电压、增益和偏移以避免任何饱和并获得高保真度图像。使用2μs/像素的最高扫描速度获得线扫描图像。
Ca2+火花是使用基于本发明人的火花识别算法的自制程序自动检测并适用于x-t线扫描[47]。如在本发明人的2-D程序中，火花是在两个阶段中鉴定。在第一阶段中，基于Cheng et al.,的说明书[48]检测假定的火花，并且使用本发明人先前的出版物[49]中记载的“活或死”算法消除可见但空间上小的事件。在第二阶段中，基于统计筛将假定的火花被归类为火花或噪音，如在本发明人先前的出版物[47]中所述。该分析软件提供了对Ca2+信号传导事件的自动化和客观(通过统计学筛选的不可预知性(agnostic))检测和分类。Flou-4信号的共聚焦成像主要用于检测Ca2+火花和波，因为Fluo-4是可用于检测具有局部Ca2+信号传导的较小变化的最佳指示剂之一，这是由于Fluo-4的高量子产率。
对肌细胞收缩和收缩期的Ca2+瞬变的机械负荷的作用。为了确定舒张期的自发性Ca2+火花确实是由机械负荷引起的，本发明人检测了在不同机械负荷下收缩的肌细胞中的Ca2+火花率，如图11G所示。本发明人还检测了在这些不同的负荷条件下收缩期的Ca2+瞬变和肌细胞收缩。图13A表明：与无负荷收缩相比，在中度机械负荷下软凝胶(凝胶5％，由5％的交联剂制得)中的肌细胞收缩不会显著地改变Ca2+瞬变；然而，由于机械-化学-转导，在高度机械负荷下刚性凝胶(凝胶7.5％，由7.5％的交联剂制得)中的肌细胞收缩显著地增强了Ca2+瞬变，尽管收缩幅度由于更大的负荷而减小(图13B)。Blebbistatin(10μM)处理(其将细胞收缩从Ca2+信号传导中去耦合(图13B))消除机械-化学-转导和恢复Ca2+瞬变至无负荷条件(图13A)；Ca2+瞬变的正常化还与消除机械负荷后的Ca2+火花率的正常化一致(图11G)。
使用Fura-2比率法的全细胞Ca2+瞬变的测定。为了更准确地测定全细胞Ca2+浓度，本发明人使用Fura-2比率法(40)而不是Fura-4单波长测量法。通过用2.5μM Fura-2/AM和0.75μM Pluronic-127(在20％DMSO中)在室温下将细胞孵育30分钟进行Fura-2负载。洗去Fura-2/AM后，再将该细胞孵育45分钟，然后在2小时内用于实验。具有Hyperswitch并安装在具有水浸式荧光物镜UPlanSPao 40X，1.15NA的Olympus X71倒置显微镜上的IonOptix***(IonOptix Inc.，USA)，针对1号玻璃盖玻片的厚度进行修正。使用高强度弧光灯(Cairn)产生激发光。Hyperswitch(基于使用340/370d/380滤波器立方体在500Hz的频率下在340mm和380nm之间转换的电流计)用于释放340nm和380nm的双激发光束，在两个波长之间转换。Fura-2荧光发射光穿过带通滤波器D510/40m，然后在光电倍增管(PMT)中收集。设置PMT的增益以避免任何饱并获得高保真光子计数。
记录来自细胞的在340nm和380nm处的激发的Fura-2荧光发射(F)。在溶液和没有细胞的凝胶中获得340nm和380nm波长处的背景荧光(BG)。发现凝胶中的BG信号稍微高于溶液中的，但是两者都显著地低于来自细胞的Fura-2荧光发射。Fura-2荧光比RFura是在扣除背景后计算。
为了测定收缩期的Ca2+瞬变，首先将细胞起搏以达到稳定状态(>2分钟)，然后在稳态期间记录至少10次搏动的Fura-2荧光。为了测定SR容量，细胞达到稳定状态后停止场刺激以使细胞保持休眠状态15秒；然后应用高浓度(20mM)的咖啡因以快速放空SR负荷(图14A、B)。通过咖啡因诱导的Ca2+瞬变的速度增加来获得SR Ca2+释放的快速性，并且Ca2+峰值用作测量SR负荷的指数。值得注意的是，使用fura-2(图14D)或其它指示剂的SR Ca2+含量在Cell-in-Gel和无负荷收缩之间没有显示出任何可辨别的差异。由于RyR对内SR[Ca 2+]的敏感性是急剧的，本发明人还证实，本发明人不能检测到的SR Ca2+的较小变化可能具有功能性影响。
肌细胞收缩测定。通过由明亮的Fluo-4信号以及来自PVA凝胶或浴溶液的调光信号划分的左边界和右边界的位置的差异，从共聚焦x-t线扫描来确定使用Fluo-4共聚焦成像的收缩测定。肌细胞的长度是通过将沿着每个x方向的荧光信号转换成二元向量来计算。高于背景的荧光值加上阈值被认为是1，否则为0。然后将“1”像素的数量乘以比例因子(通过使用具有2.5间距的Ronchi刻线法确定)以获得以微米为单位的细胞缩短。阈值设置为钙荧光最大值的一半。
使用具有肌原纤维节检测的IonOptix***(IonOptix Co.，USA)的收缩测量是通过使用高速照相机(Myocam-S，240至最高达1000帧/s)记录收缩期间的肌原纤维节运动来进行。然后使用快速傅立叶变换算法(FFT)将肌细胞中的肌原纤维节模式用于计算肌原纤维节长度变化。
本发明人决定在本发明人的实验中使用IonOptix肌原纤维节检测和FFT方法来测量肌细胞收缩，而不是Flou-4共聚焦成像边缘检测法，这是因为如果在肌细胞收缩期间细胞端移出焦点，则Flou-4共聚焦成像边缘检测法可包括一些不精确性。就平均肌原纤维节长度缩短而言，肌原纤维节FFT法通常提供对肌细胞收缩的更稳定(避免边缘运动)和精确的测量。
抑制nNOS与eNOS对Ca2+瞬变和凝胶内肌细胞收缩的影响。通过抑制nNOS而不是eNOS来抑制机械负荷诱发的自发性Ca2+火花(图15)；该差异作用促使本发明人来探索是否收缩期的Ca2+瞬变也是通过抑制nNOS而不是eNOS来抑制的。图16表明，使用L-NPA(5μM)抑制nNOS确实减少Ca2+瞬变(图A)；使用L-Nio(10μM)抑制eNOS不仅减少Ca2+瞬变(A)，而且减慢Ca2+瞬变下降的速度(在B中延长tau)。综合来看，nNOS抑制会显著地抑制舒张期的Ca2+火花并轻微地减少了收缩期的Ca2+瞬变；而eNOS抑制没有抑制Ca2+火花并显著地减少了Ca2+瞬变，还减缓了Ca2+从细胞溶质中的移出。这些数据与以下结论是相符的：nNOS与eNOS在调节不同的Ca2+处理途径上的差异作用。本发明人的工作假说为：由于nNOS更接近于SR则nNOS可显著地调节RyR和SERCA，而eNOS可显著地影响肌纤维膜附近的Ca2+处理蛋白，包括Na+/Ca2+交换、肌纤维膜Ca2+泵和L-型Ca2+通道。该诱人的假说需要通过关于nNOS与eNOS对所有这些Ca2+处理分子的作用的全面研究进行测试。
根据nNOS和eNOS的减小Ca2+瞬变的作用，nNOS和eNOS的抑制作用还减弱了肌细胞收缩(作为缩短分数测定，图16C中的FS)。对收缩数据的解释需要考虑以下复杂性。当肌细胞在牵拉机械负荷时，收缩幅度预计会降低。然而，如果没有Ca2+瞬变的机械-化学-转导介导的增加，收缩的降低将更严重。换句话说，如果肌细胞仅仅是弹性的，则收缩将小于在活的肌细胞(其具有活性的机械-化学-转导调节以增加Ca2+瞬变)中测量的收缩。为了解决此问题，本发明人已对假设没有机械-化学-转导的弹性模型进行了机械分析[13]，这提供了容易参与参数计算的分析方案。例如，击倒因子(KF＝凝胶内肌细胞缩短与无负荷状态下肌细胞缩短的比率)是机械负荷的函数。对于本发明人的实验条件下的标准凝胶内肌细胞，弹性模型预测KF为0.2。然而，实验测定的KF为约0.4(图16C)，因为机械-化学-转导导致的Ca2+瞬变的增加提高了收缩性。抑制nNOS或eNOS会中断机械-化学-转导信号传导，因此将KF降低至基础水平(图16C)。
Cell-in-Gel***提供了一种强大的技术使能够进行这种研究。在本文中，本发明人致力于建立Cell-in-Gel技术以及研究nNOS和eNOS对RyR的作用。
新鲜分离的心室肌细胞的抗体标记。新鲜分离的心室肌细胞的抗体标记是基于稍作修改的本发明人先前描述的方案[49]进行。简言之，将细胞在室温下在正常磷酸盐缓冲溶液(PBS)中洗涤，然后在1％多聚甲醛PBS溶液中固定10分钟。在冷PBS(在冰上或在4℃的冰箱中)中洗涤两次后，然后将细胞在冷的0.1％Triton X-100PBS溶液中透化10分钟。在室温下将细胞用一级抗体(1：100稀释)溶液(包含溶于PBS中的5％牛血清白蛋白、3％山羊血清和0.01％Triton X-100)孵育2小时；在冷PBS中洗涤两次，然后在室温下用二级抗体(1：100稀释，Molecular Probe，USA)溶液孵育2小时或在4℃孵育过夜。对于RyR、nNOS和eNOS的抗体标记，本发明人分别使用了抗RyR单克隆抗体(克隆C3-33，Affinity BioReagentsInc.USA)、抗nNOS多克隆抗体(Thermo Scientific)和抗eNOS多克隆抗体(ThermoScientific)。
对于共定位研究，本发明人使用来自不同物种的两种一级抗体来双标记所述细胞，以在同一个细胞中同时标记分子A和B(A/B对)；然后同时使用靶向每个一级抗体的荧光团-缀合的二级抗体来将A和B显影。在具有足够光谱分离的两个单独的发射通道中选择荧光团检测A和B。例如，用Alexa555缀合的抗兔IgG抗体标记nNOS，而用Alexa488缀合的抗小鼠IgG抗体标记RyR。共聚焦显微镜上的“顺序模式”能够分别激发两个荧光团，以便使串扰最小化。本发明人使用上述方法标记nNOS/RyR对和eNOS/RyR对，然后使用共聚焦显微镜和结构化照明显微镜对其成像。分子的伪彩色编码如下：RyR为红色、nNOS为绿色以及eNOS为青色。
通过细胞形态(即棒状、清晰纹理)、标记的亮度和标记的均一性的保持来评价抗体标记的质量。例如，在保存良好和标记良好的细胞中，外周RyR标记显示出干净和平滑的轮廓，并且***的RyR单元清晰可见；标记是明亮的并均匀分布在整个细胞中[49]。细胞图像的实例示出在图17中。
抗体标记细胞的共聚焦成像。共聚焦成像是使用具有水浸式荧光物镜UPlanSApo60X,NA1.2的Olympus FlowView 1000共聚焦显微镜(倒置配置)来获得，针对在灌注室底部使用的1号玻璃盖玻片的厚度进行修正。水浸式物镜用于核对溶液的折射率，其中将细胞保存在容纳室底部的1号玻璃盖片上，以使球面像差最小化。共聚焦图像是通过2D扫描得到。设置共聚焦口径(CA)为1Airy unit以获得用于最高空间分辨率的最薄的光学切片。
为了双标记细胞的成像，使用“顺序模式”在两种激发光束之间转换(例如逐行扫描的488nm和543nm之间)以便使两个不同荧光团的光谱之间的串扰最小化。所发射的荧光被二向色镜分成两个通道，并穿过相应的带通滤波器(用于绿色的BA505-525和用于红色的BA560-660)，然后在每个通道中用PMT收集。设置PMT电压、增益和偏移以避免任何饱和以及获得高保真度图像。图像的空间分辨率由最高共聚焦分辨率定义，通常具有～0.3μm的x,y分辨率和0.8-1.0μm的z分辨率。
使用结构化照明显微镜(SIM)的超分辨率成像。使用SIM来实现具有x,y～100nm和z～250nm的空间分辨率的超分辨率成像。使用Pearson共定位分析测量nNOS-RYR和eNOS-RyR的共定位(42)；由各个分子簇的质心的最小成对距离计算最近相邻距离(43)。本发明人使用DeltaVision OMX V3.0 Blaze***(Applied Precision Inc，GE HealthcareCompany，Issaquah，WA)获得抗体标记的肌细胞的荧光图像。详细的SIM成像方法此前已有记载[40]。简言之，该***使用488和532nm激光作为照明的光源。光路中的光栅用于产生三个相干光束，其在样品中产生三维结构化照明模式。将抗体标记的细胞浸入具有1.47RI的抗衰退试剂ProLong Gold中，并置于样品台上。用浸入在具有1.514RI的油中的60X，1.42NA物镜收集荧光发射。不同颜色的荧光是通过二向色镜分离，并通过带通发射滤波器过滤，然后通过两个快速sCMOS照相机(PCO-TECH Inc.，Romulus，MI)收集。为了获得3D图像，将样品沿着z方向以125nm的步长移动。对于每个切片，照明模式旋转三次并移位五次，导致每个通道总共有15次曝光。用专有软件包(SoftWoRx v5.0，Applied Precision Inc.)处理所获得的原始图像以重建超分辨率3D图像。然后使用定制的软件记录不同颜色的重建图像以校正色差和图像失真。在实验之前，已使用0.1微米的多色聚合小珠(四谱珠，Molecular Probe，Eugene，OR)校正***和彩色记录软件。发现所述***的空间分辨率对于x轴、y轴为～110nm，对于z轴为～250nm。发现彩色记录误差小于一个像素，即40nm。使用Volocity plusVisualization软件包进行SIM图像的3D渲染。
使用具有Quantitation的软件包Volocity(Perkin-Elmer，Waltham，MA)分析nNOS-RYR对和eNOS-RyR对的共定位，执行标准Pearson共定位分析[39]。按照先前描述的方法[40]，仔细设置用户自定义的阈值以从背景中分离信号，并且计算Manders重叠系数(M1和M2)。M1和M2被用作共定位程度的指标，如图17D所示(左边的条)。该条表示nNOS(绿色)-RyR(红色)对和eNOS(青色)-RyR(红色)对的体元体积，每个均被标准化为RyR体元体积。M1和M2值是由条中的重叠区域(混合色)来描述。例如，对于nNOS(绿色)-RyR(红色)对，M1＝0.349和M2＝0.524。这被看作在图17D中最左侧条柱中绿色和红色混合区域占nNOS条(绿色)的34.9％和RyR条(红色)的52.4％。注意，上述指标给出了共定位程度的稍微一般性的评价。它们不能定量不同分子之间的距离。
NOS同种型簇和RyR簇之间的最近相邻距离被定义为各个簇的质心之间的最小成对距离。在成对距离计算中排除具有低于0.00189的体积的对象(斑点)(其可能源自光子噪声)。使用具有Quantitation软件包的Volocity确定质心和最近相邻距离。nNOS-RYR对之间和eNOS-RyR对之间的最近相邻距离的概率密度函数(PDF)如图17D所示(右侧曲线)。nNOS-RYR和eNOS-RyR之间的峰最近相邻距离分别为0.19μm和0.37μm。
以前，已发现nNOS与不同亚细胞区域的各种分子相关，包括SR膜中的SERCA[50]，细胞膜穴样内陷中的PMCA[19]以及靠近肌纤维膜和t小管的抗肌萎缩蛋白[46]。本发明人的SIM成像数据(图15G)还显示一个以上的nNOS-RyR距离群(由直方图中的扭结表示)；第一个峰出现在0.19μm处，这使得一个nNOS的亚群与RyR紧密接近。
使用Camui传感器的体外CaMKII活性测量。之前描述了野生型、抗磷酸化和抗氧化的Camui构建体的设计和合成[51]。将HEK293细胞在加有5％胎牛血清和青霉素/链霉素的Eagle培养基中培养24小时，然后使用哺乳动物转染试剂盒(Stratagene)利用编码Camui(或突变同种型)的质粒转染。再经过24小时后，通过荧光显微镜检查Camui表达。将表达Camui的HEK细胞在包含50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、5mM MgCl2和蛋白酶抑制剂的不含Ca2+的缓冲液中裂解。使用MS SpectraMax板读分光光度计(Molecular Devices)进行荧光测量，其中激发和发射狭缝设置为4nm，激发波长设置为440nm，发射波长分别设置为477nm(FCFP)和527nm(FYFP)。将转染的HEK细胞的细胞溶质级分被稀释，在存在10μM CaM和200μMCa2+的情况下测量Camui荧光。将EGTA 1mM用于螯合Ca2+并在存在1mM EGTA和50μM或500μMSNAP的情况下测量自主CaMKII活性。
已知CaMKII活性可通过自磷酸化[52]和通过氧化作用[53]来提高。本文中，本发明人使用基于FRET的生物传感器Camui(其在激活期间检测CaMKII的构象变化)来测量一氧化氮(NO)对CaMKII活性的作用。为了确定NO能否激活CaMKII，本发明人在HEK细胞中表达CaMKII活性传感器Camui[51]并测量由NO供体SNAP诱发的自主激活。Camui包含在激酶的任一端具有CFP/YFP对的全长CaMKII，其在闭合(自身抑制)状态下产生大量FRET。如果通过Ca2+/CaM结合直接地或通过激酶的翻译后修饰自发地破坏自身抑制，则FRET减少，导致FCFP/FYFP增加。如图18所示，本发明人发现在用EGTA和50μM SNAP处理的HEK细胞溶解产物中对FCFP/FYFP没有影响(与仅用EGTA处理的溶解产物相比)，但是施用500μM SNAP导致CaMKII激活的显著增加(至约50％的Ca2+/CaM依赖性活性)。已知CaMKII可通过T286磷酸化[52]和CM280/281氧化[53]来自主激活。为了测试这些机制中的一个或两个是否负责SNAP诱导的CaMKII激活，本发明人使用缺乏磷酸化(T286)或氧化(CM280/281)靶位点的Camui的突变体重复HEK细胞实验。在两种情况下，CaMKII的SNAP依赖性激活得到保持。总之，本发明人的数据表明CaMKII经受NO诱导的激活，并且该激活是通过独立于先前描述的磷酸化和氧化途径的机制进行。
统计。计算平均值、标准偏差(SD)和平均值的标准误差(SEM)的数值。平均值±SEM值显示在条形图中。平均值±SD值记录在文本中。每组中的细胞数在图标中记录，每组中的细胞来自3-6只个体动物。考虑到细胞之间的生物差异性，每个细胞均在统计学测试中被视为独立的，尽管多个细胞可能来自一个动物。在每组中合并来自至少3只个体动物的细胞。
对于具有正态分布的数据，使用学生t检验或方差分析(ANOVA)来评价数据组之间的统计学差异。条形图中所示的数据是每组的在相同条件下由细胞数(N＝图标中给出的细胞的#)计算的平均值±SEM值。每组中的细胞间差异性(生物差异性)要求遵循正态分布。例如，由在共聚焦线扫描图像中的每秒每100μm的火花数目(图像中以100μm*s作为单位面积，参见图11G)计算每个细胞的火花率；然后计算无负荷组中18个细胞的这种数值火花率数据的平均值、SD、SEM值。使用学生t检验(使用不等方差的非配对检验)来评估两个不同组的平均值的差异。如果p<0.05，该差异被认为是显著的，并且通过本领域的惯例表示为*p<0.05、p<0.01**、p<0.001***。单因素ANOVA用于比较两个以上的组，然后使用Bonferroni后检验进行配对比较。双因素ANOVA检验用于比较具有两个不同的因素的多个组。例如，在图19A和19B中，在两种不同的小鼠品系(R92Q和WT)之间以及同一品系中药物处理组与未处理组之间比较Ca2+火花率。因此，使用双因素ANOVA检验，其显示R92Q与WT品系之间的Ca2+火花率中的显著差异(p<0.0001)，每个品系内的显著的药物作用(p<0.0001)以及显著的相互作用(p<0.0001)。Bonferroni后检验用于配对比较，并且示出了与不含药物的Cell-in-Gel相比，对每个品系的药物作用的显著差异(p<0.001***)，以及对于Cell-in-Gel条件(p<0.05#)和对于Gp91ds作用(p<0.001###)，在R92Q中比WT中显著更高的火花率。
对于具有非正态分布的数据，用Mann-Whitney检验来比较两个组。例如，在图15C中，分子间距离直方图具有非正态分布。因此，用Mann-Whitney检验来比较nNOS-RyR距离与eNOS-RyR距离的直方图，发现具有p<0.0001的显著差异。使用GraphPad PRISM软件进行所有统计学检验(http://www.graphpad.com/,USA)。
结果
在单个肌细胞收缩期间Cell-in-Gel***施加机械负荷
以前，机械-化学-转导机制的研究因难以在单细胞水平上控制对肌细胞收缩的机械负荷而受到限制。本发明人通过将新鲜分离的肌细胞包埋在由聚乙烯醇水凝胶和硼酸交联剂制成的3D弹性基质中来开发一种新的“Cell-in-Gel”***；硼酸酯基团还交联细胞表面聚糖，从而将细胞表面拴系在凝胶上(图11A，图20)(12)。当凝胶内肌细胞相对于凝胶基质收缩时，在收缩期间弹性基质抵抗细胞的缩短和增宽，并在松弛期间相反(图11B)。对照实验表明，凝胶成分是无毒的并且不影响细胞功能(图12)。这种Cell-in-Gel***在两个重要方面模拟体内机械环境：一是在收缩期间施加多轴向3D机械应力；另一方面是将细胞表面拴系至凝胶上以对细胞表面施加正应力和剪切应力。(13)
在收缩和舒张期间后负荷诱导的Ca2+处理的变化
本发明人使用Cell-in-Gel***研究了在机械后负荷下的肌细胞收缩期间的机械应力作用。将肌细胞以0.5Hz起搏以达到稳态收缩，同时用蒂罗德溶液连续灌注。与无负荷收缩(图11C)相比，凝胶内肌肉收缩(图11D)示出更小的缩短分数(图11E)；还示出收缩中增强了的Ca2+瞬变(图11F)以及舒张期间的自发性Ca2+火花(图11G)。Ca2+火花率(每个单位面积的火花)在无负荷条件下较低，在软凝胶(凝胶5％)中稍微增加，在硬凝胶(凝胶7.5％)中显著增加；用Blebbistatin去耦收缩以恢复Ca2+瞬变和火花率至无负荷条件(图11G)，这表明机械负荷和自发性Ca2+火花产生之间的正相关性。因此，收缩期间对肌细胞的后负荷提高了收缩期的Ca2+瞬变，其增强了收缩性以抵抗机械负荷；而且在舒张期间引起自发性Ca2+火花，其可导致致心律不齐活动。在下面的所有实验中，本发明人用具有凝胶7.5％的Cell-in-Gel***在肌细胞收缩期间施加机械后负荷。
瞬态响应(图14A、14B)示出了在最初数次收缩搏动期间，舒张期的Ca2+火花很少，但接着在随后搏动中明显上升。一旦起搏停止，火花几乎立即消失。最初的延迟表明机械-化学-转导的积聚过程以激活导致RyR调节并增加Ca2+火花的信号传导途径。这种延迟与Anrep效应的缓慢起动一致，其需要几分钟才在组织水平上完全发生(3)。Ca2+火花在起搏停止后立即消失的事实也与可逆的NO信号传导作用相符(14、15)。
为了检测Ca2+瞬变和Ca2+火花的增加是否是由于肌质网(SR)Ca2+含量升高，本发明人使用Fura-2比率法测量细胞溶质的Ca2+浓度和SR含量。如图14C所示，将肌细胞以0.5Hz起搏；达到稳态后，停止起搏，15秒后迅速应用咖啡因以释放SR Ca2+含量。虽然与无负荷的情况相比，在凝胶内肌细胞收缩中收缩期的Ca2+瞬变增加(图14D)，但是SR Ca2+含量没有示出可检测的变化(图14E)。因此，对于凝胶内肌细胞收缩，分级的SR Ca2+释放更高(Ca2+瞬变峰值与SR含量的比率：凝胶内85±6％对比无负荷的77±7％)，表明RyR敏感性增加。增加的RyR敏感性也可解释舒张期的Ca2+火花的增加。高RyR敏感性和舒张期SR Ca2+释放将减少SRCa2+含量(16)，除非通过以下方式对其补偿：通过SERCA增强SR Ca2+摄取或通过Na+/Ca2+交换减少Ca2+移出。实际上，收缩期的Ca2+瞬变下降没有改变(图14F、图16B)，这表明尽管有更大的释放，SR Ca2+摄取仍然能够减少(Ca2+)。此外，凝胶内肌细胞表现出咖啡因诱导的Ca2+瞬变更慢的降低(图14G)，这表明通过Na+/Ca2+交换和肌纤维膜Ca2+泵减少Ca2+移出通量。尽管SR Ca2+释放增加，上述伴随的变化允许肌细胞维持正常的SR Ca2+含量。
机械-化学-转导中的局部的nNOS和eNOS信号传导
为了破译介导后负荷诱导的Ca2+处理的变化的机械-化学-转导机制，本发明人检验了一氧化氮信号传导的参与性。将肌细胞以0.5Hz起搏直至收缩达到稳态。凝胶内肌细胞表现出高度自发性的Ca2+火花率(图15A)。抑制所有NOS同种型的L-NAME有效抑制了Ca2+火花(图15B)，表明NOS信号传导是机械-化学-转导所必需的。接下来，本发明人区分在心室肌细胞中组成性表达的NOS的神经同种型(nNOS或NOS1)和内皮同种型(eNOS或NOS3)(17)。令本发明人惊讶的是，用L-Nio-二盐酸盐(L-Nio)选择性抑制eNOS不能抑制Ca2+火花(图15A、15B)。然而，使用Nω-丙基-L-精氨酸盐酸盐(L-NPA)选择性抑制nNOS有效抑制了Ca2+火花(图15A、15B)。这些数据与nNOS(而不是eNOS)介导后负荷诱导的自发性Ca2+火花的结论相符。为了排除药理学抑制剂的可能的非特异性作用，本发明人还用遗传敲除nNOS-/-和eNOS-/-小鼠进行实验。nNOS-/-肌细胞表现出非常少的后负荷诱导的Ca2+火花(图15A、15C)。相比之下，eNOS-/-肌细胞在凝胶内收缩期间表现出高的Ca2+火花频率(图15A、15D)；抑制eNOS-/-肌细胞中的nNOS有效抑制了Ca2+火花(图15A、15D)。因此，nNOS而不是eNOS介导后负荷诱导的自发性SR Ca2+释放。
nNOS与eNOS对Ca2+火花的选择性作用的看似合理的解释是nNOS与RyR的接近度，因为NO被认为是短寿命的局部信号传导分子。在心肌细胞中，eNOS据报道在细胞膜穴样内陷中(18)，而nNOS定位于SR(19)和肌纤维膜中(20)。然而，RyR与nNOS以及RyR与eNOS的分子间距离尚未呗测量。由于共聚焦分辨率不足以辨别这些距离(图17A)，本发明人使用超分辨率的结构化照明显微镜(SIM)来定量nNOS-RyR与eNOS-RyR的共定位。SIM图像显示出nNOS与RyR紧密共定位(图17B)，而eNOS定位距RyR的更远处(图15F)。共定位分析产生nNOS-RyR的0.438和eNOS-RyR的0.125的重叠系数(图17C)。最近相邻距离直方图(图17D)也显示出显著不同的模式，其中nNOS-RyR距离峰值在0.19μm处，eNOS-RyR距离在0.37μm处，其为两倍的差距。有效的NO信号传导范围应该受扩散距离、NOS产生的NO量、降解/去除和缓冲能力以及靶向修饰动力学的影响。信号传导距离的2倍变化将转换为靶位点的慢4倍的扩散时间和8倍的NO浓度降低。上述与功能数据结合的结构数据与下列结论一致：nNOS与eNOS信号传导的有效范围高度定位在心肌细胞亚微米结构域中。
健康心脏中和心肌病中的机械-化学-转导
为了进一步探讨机械应力和Ca2+动力学之间的关系，本发明人还研究了在肌钙蛋白T中具有R92Q突变的家族性肥厚性心肌病模型。人或小鼠心脏中的R92Q突变导致肌丝Ca2+敏感性增加，并表现出心律失常和心脏性猝死(21)(22)(23)(24)(25)。一个主要的未解决的问题是收缩蛋白中的突变如何导致心律失常(26)(27)。因此，本发明人研究了R92Q肌细胞中的机械-化学-转导。后负荷诱导的自发性Ca2+火花率在R92肌细胞中(图19A、19B)显著高于野生型肌细胞(图19B)。一致地，通过抑制nNOS而不是eNOS可抑制火花(图19A，19B)。本发明人的数据与下列结论一致：机械-化学-转导敏感性增加导致自发性Ca2+活性增加；从而提供对R92Q FHC心脏中的Ca2+诱导的心律失常的机械性解释(28-31)。
为了扩展信号传导分析，本发明人测试了由预负荷激活的(8)NOX2-ROS信号是否也可由后负荷进行。图19B示出用gp91ds-tat抑制NOX2减少了野生型而不是R92Q肌细胞中的后负荷诱导的Ca2+火花；这显示了NOX2的复杂参与性。由于NOX2被发现可被nNOS信号传导激活(32)，预期这两者之间存在复杂的相互作用。CaMKII被ROS(53)激活，本发明人证明了它还可被NO信号传导激活(图18)；然后CaMKII可将RyR磷酸化以刺激Ca2+火花(33)。实际上，本发明人发现CaMKII抑制在WT和R92Q小鼠中均防止了后负荷诱导的Ca2+火花增加(图19B)。
讨论
总之，使用本Cell-in-Gel***，本发明人已确定了参与机械-化学-转导的关键分子，其在肌细胞收缩期间响应于机械负荷而引发Ca2+处理的变化。收缩期的Ca2+瞬变可通过后负荷来增加，这可较好地以机械方式促进Anrep效应(3,4,34,35)。后负荷诱导的自发性Ca2+火花可通过抑制nNOS而不是eNOS来抑制，尽管这两种NOS同种型都参与增加Ca2+瞬变。nNOS与eNOS对调节RyR的趋异作用可通过高度定位的NO信号传导来解释；来自超分辨率成像的数据与以下结论相符：胞分泌NO信号传导在肌细胞中的亚微米范围内。除了NOS之外，还发现在肌细胞收缩期间NOX2和CaMKII参与由机械后负荷触发的SR Ca2+释放增强。关于后负荷作用的本研究补充了关于预负荷作用的先前研究，所述预负荷中并不涉及nNOS并且未研究CaMKII(6,8)。此外，本发明人发现，在已知的具有高的心律失常发生率的家族性肥大性心肌病模型中选择性抑制nNOS和CaMKII可有效地抑制后负荷诱导的自发性Ca2+活性(25)(36)(37)。因此，除了包括NOX(8)、血管紧张素II(38)、瞬时受体电位典型通道(39)以及更多(由(4)述及)的其他已知的途径之外，本发明人在本文中描述的机械NOS-CaMKII途径还提供了基本的机械工作模型(图19C)，用于了解Anrep效应。通过NOS和CaMKII信号传导途径进行的机械-化学-转导提供了关于治疗机械应力诱导的Ca2+调节异常、心律失常和心肌病的治疗性见解。
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实施例8由Cell-in-Gel实验证明的心脏病模型中缺陷性机械-化学-转导
在本实施例中，本发明人通过破坏抗肌萎缩蛋白聚糖(通过将其从凝胶基质中解离出来)和抗肌萎缩蛋白(使用mdx小鼠模型)位点上的机械-转导，***性地研究了DGC中的命令链。结论说明了心肌细胞中DGC如何连接机械应力以调节Ca2+处理途径。本发明人使用本发明人的‘Cell-in-Gel’技术研究在单个细胞和分子水平上Duchenne型肌营养不良(DMD)突变是如何引起心脏调节异常。本发明人发现心肌收缩时，细胞上的机械应力被转导成细胞内的生物化学信号。这种机械-化学转导过程是由抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合体进行。重要的是，DMD患者在该大分子复合体上具有突变，这破坏了机械-化学-转导而导致Ca2+调节异常和心脏功能异常。在本实施例中，本发明人使用本发明人的Cell-in-Gel***来进一步研究各种DMD突变种如何破坏机械-化学-转导过程、参与引发心脏功能异常的关键分子有哪些，以及测试新的药物靶点。
缺陷性DGC破坏M-C转导。为了研究DGC作为M-C转导复合体的作用，本发明人破坏DGC大分子复合体中的各个位点上的机械连接(图21)。本发明人的凝胶化学将细胞表面聚糖拴系到凝胶基质中(通过硼酸酯结合至顺式-二醇上)。因此，将抗肌萎缩蛋白聚糖(DG)拴系在凝胶上并在肌细胞收缩期间经受机械应力。为了防止α-DG栓系，在将细胞包埋至凝胶中之前，本发明人用α-DG抗体对细胞进行预处理。这种α-DG的“掩蔽”抑制了舒张期Ca2+火花(图21B对比图21A)。这也证明α-DG是细胞表面机械传感器。然后，本发明人使用mdx小鼠模型研究了缺陷性DGC如何影响Ca2+信号传导。(5C)表明与野生型(wt)细胞不同，凝胶内mdx心肌细胞收缩不产生舒张期Ca2+火花。这些数据与本发明人和同事的先前的发现相符：(1)在mdx中，抗肌萎缩蛋白缺失，并且nNOS在骨骼肌细胞和心肌细胞中错位(dislocalize)(Lai,et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences(2013)110:525-530；Li,etal.,Journal of Cell Science(2010)123:2008-2013；Bia,et al.,Journal ofMolecular and Cellular Cardiology(1999)31:1857-1862；Wehling-Henricks,et al.,Human Molecular Genetics(2005)14:1921-1933)；和(2)nNOS产生的NO可提高RyR活性以引发Ca2+火花(Jian,et al.,Sci Signal.(2014)Mar 18；7(317):ra27)。因此，本发明人的数据与下列结论相符：在α-DG或在抗肌萎缩蛋白点上破坏命令链可切断从DGC到NOS信号传导和到Ca2+处理***的机械-化学-转导。
通过选择性拴系细胞表面机械传感器研究特定的MCT复合体。在本发明人的Cell-in-Gel***的一个特征中，将抗生物素蛋白改造到凝胶聚合物中以“钩”在生物素缀合的分子上。这能使特定的细胞表面分子被拴系在凝胶基质中。在Jian et al.,中(参见上文)，发现抗肌萎缩蛋白聚糖通过硼酸酯-PEG交联剂结合至凝胶上，其在野生型心肌细胞中通过DGC转导机械应力以产生Ca2+火花(图22A)。然而，在不存在抗肌萎缩蛋白的mdx小鼠心肌细胞中，缺失抗肌萎缩蛋白和nNOS破坏了机械-化学-转导中的命令链；因此它使机械应力与产生Ca2+火花之间去耦和(图22B)。
然后，本发明人通过使用具有抗β1整联蛋白亚基的一级抗体和生物素缀合的二级抗体的PVA-抗生物素蛋白凝胶将抗肌萎缩蛋白聚糖和整联蛋白拴系在凝胶上。将DGC和VTI两者拴系到凝胶中，产生了明显不同于单独拴系DGC的作用。在wt心肌细胞中，机械应力诱导的Ca2+火花增加(图22C)。然而，当DGC被拴系时，mdx心肌细胞缺乏Ca2+火花(图22D)，但当DGC和VTI都被拴系时(因为两者都被拴系至体内的胞外基质中)，则表现出高频率的自发性Ca2+火花和波。这与mdx对机械负荷(压力过载)的脆弱性相符。可使用这种“拴系”技术以及“掩蔽”来研究各种机械-化学-转导复合体(整联蛋白同种型、其他机械传感器)。
成为机械-化学-转导物的DGC的生理和病理生理学影响。本发明人的数据与下列结论相符：的DGC在收缩自身调节反馈回路中作为机械-化学-转导复合体发挥作用。这可以解释为什么杜氏肌营养不良(DMD)中缺陷性DGC可破坏反馈回路导致收缩自身调节受损。在全心脏水平上，受损的自身调节表现为对响应于变化的后负荷的心输出量的调节更差。事实上，许多DMD患者表现出与该预测相符的症状。例如，在年轻的DMD患者中，超声心动图测量值显示出缩短分数减小(Ramaciotti,et al.,J.Child Neurol.(2002)17:191-194)，以及无抗肌萎缩蛋白的mdx小鼠极易受到压力过载的损伤(Kamogawa,et al.,Cardiovascular Research(2001)50:509-515)。相反，降低心脏的负荷(ACE抑制剂和β-阻断剂处理)对心脏有所帮助(Jefferies,et al.,Circulation(2005)112:2799-2804)。先前研究还表明，mdx心肌细胞具有错位的nNOS、不变的eNOS和上调的iNOS(Bia,et al.,Journal of Molecular and Cellular Cardiology(1999)3:1857-1862)。在mdx小鼠中表达nNOS可减少ECG的异常(Wehling-Henricks,et al.,Human Molecular Genetics(2005)14:1921-1933)。这些数据支持了本发明人关于DGC在M-C转导中起到重要作用的新发现。
肌营养不良领域的先前的研究主要集中在DGC作为膜完整性的支撑结构的作用，而DGC在M-C转导中的作用还没有得到全面的研究并且尚不明确。Cell-in-Gel***提供了一个在分子和细胞水平上研究通过DGC进行的M-C转导的有用的工具。本文中，本发明人的数据表明DGC转导机械应力来影响心肌细胞中的调节Ca2+动力学的NOS信号传导。识别参与的关键分子将为开发用于治疗肌营养不良相关的心肌病的新疗法提供新的药物靶标。
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于举例说明目的，本领域技术人员会想到对其的各种修改或改变并且这些修改和改变包括在本申请的精神和权属内以及随附的权利要求的范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引证的方式全文纳入本说明书中。

Claims (71)

1.一种包含包封在水凝胶中的细胞的组合物，其中所述水凝胶包含结合配偶体对的第一结合配偶体或缀合至生物相容性聚合物的结合配偶体对的第一结合配偶体，其中所述第一结合配偶体与Y-X-Y交联剂交联，其中X为线性亲水性聚合物以及Y为所述结合配偶体对的第二结合配偶体，并且其中所述细胞直接或间接地连接至所述第一结合配偶体上。
2.一种包含包封在水凝胶中的细胞的组合物，其中所述凝胶包含缀合至生物相容性聚合物的结合配偶体对的第一结合配偶体，其中所述生物相容性聚合物与硼酸酯-X-硼酸酯交联剂交联，其中X为线性亲水性聚合物，以及其中所述细胞直接或间接地连接至所述第一结合配偶体上。
3.权利要求2的组合物，其中所述硼酸酯-X-硼酸酯交联剂中的硼酸酯选自二硼酸酯、三硼酸酯、四硼酸酯及其混合物。
4.权利要求1至3中任一项的组合物，其中所述结合配偶体对选自抗生物素蛋白/生物素、谷胱甘肽/谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)/麦芽糖、组氨酸标签/咪唑+Zn2+以及万古霉素/D-丙氨酸-D-丙氨酸(DADA)。
5.权利要求4的组合物，其中所述抗生物素蛋白选自抗生物素蛋白、抗生物素蛋白链菌素、中性抗生物素蛋白和captavidin。
6.权利要求4的组合物，其中所述万古霉素和D-丙氨酸-D-丙氨酸(DADA)为单价的、二价的或三价的。
7.一种包含包封在水凝胶中的细胞的组合物，其中所述水凝胶包含缀合至生物相容性聚合物的配体，其中所述生物相容性聚合物与硼酸酯-X-硼酸酯交联剂交联，其中X为线性亲水性聚合物，其中所述细胞直接或间接地连接至所述配体上。
8.权利要求1至7中任一项的组合物，其中所述生物相容性聚合物包含范围为约50-150kDa的平均分子量。
9.权利要求1至8中任一项的组合物，其中所述生物相容性聚合物包含用于交联的顺式-二醇部分。
10.权利要求1至9中任一项的组合物，其中所述生物相容性聚合物选自聚乙烯醇(PVA)、琼脂糖和藻酸酯。
11.权利要求1至10中任一项的组合物，其中所述交联剂包含范围为约1-50kDa的分子量。
12.权利要求1至11中任一项的组合物，其中X为线性亲水性聚合物，其选自聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、藻酸酯、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖。
13.权利要求1至12中任一项的组合物，其中所述交联剂与所述聚合物的wt./wt.比的范围为约0.2至约5.0.
14.权利要求1至13中任一项的组合物，其中所述水凝胶包含范围为约0.1kPa至约100kPa的刚度或杨氏模量值。
15.权利要求1至14中任一项的组合物，其中所述水凝胶为光学透明的。
16.权利要求1至15中任一项的组合物，其中所述细胞是经由所述第二结合配偶体连接至所述第一结合配偶体上。
17.权利要求1至15中任一项的组合物，其中所述细胞是经由缀合至配体的所述第二结合配偶体连接至所述第一结合配偶体上。
18.权利要求17的组合物，其中所述配体结合至细胞表面分子上。
19.权利要求18的组合物，其中所述表面分子选自整联蛋白、聚糖、糖蛋白、细胞表面受体以及任何细胞表面分子。
20.权利要求17至19中任一项的组合物，其中所述配体选自多肽、线性肽、环化肽、肽模拟物、抗原结合分子、抗体和抗体片段。
21.权利要求17至20中任一项的组合物，其中所述配体为多肽，所述多肽选自胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、玻连蛋白、VCAM-1、钙粘蛋白，以及其子序列。
22.权利要求19的组合物，其中所述整联蛋白选自α3β1整联蛋白、α4β1整联蛋白和αvβ3整联蛋白。
23.权利要求1至22中任一项的组合物，其中所述细胞为肌细胞。
24.权利要求23的组合物，其中所述细胞为心肌细胞、骨骼肌肌细胞或平滑肌肌细胞。
25.权利要求23的组合物，其中所述肌细胞为心肌细胞。
26.权利要求1至25中任一项的组合物，其中所述包封的细胞不接触固体表面或另一细胞。
27.一种包含权利要求1至26中任一项的组合物的装置。
28.权利要求27的装置，其中所述装置包括一个或多个灌注室。
29.权利要求28的装置，其中所述灌注室包括改良的蒂罗德溶液，该溶液包含替代葡萄糖的丙酮酸。
30.权利要求29的装置，其中所述改良的蒂罗德溶液包含低于50μM的Ca2+浓度。
31.权利要求27至30中任一项的装置，其中所述包封的细胞不与所述装置的固体表面或所述水凝胶中的另一细胞接触。
32.权利要求27至31中任一项的装置，其中所述凝胶在至少两个维度上被拴系。
33.权利要求32的装置，其中所述装置包括拴系所述凝胶的夹具，其中所述夹具可在所述凝胶上牵拉，从而在所述凝胶和包封在所述凝胶中的细胞上引入机械应变和/或应力。
34.权利要求27至33中任一项的装置，其中所述凝胶与力传感器和张力操控器机械连通。
35.权利要求27至34中任一项的装置，其中所述凝胶处于由电刺激器控制的电场内，所述电刺激器将电信号应用至所述包封在凝胶中的细胞上。
36.权利要求27至35中任一项的装置，其中所述装置与成像***连通。
37.权利要求27至36中任一项的装置，其中所述装置与计算机连通。
38.权利要求37的装置，其中所述计算机记录施加在所述细胞和所述凝胶上的机械应变和/或应力。
39.权利要求37至38中任一项的装置，其中所述计算机记录细胞图像。
40.一种***，其包括：
i)一个或多个的灌注室，每个灌注室包括权利要求1至26中任一项的包含包封在凝胶中的细胞的组合物；
ii)与凝胶接触的第一和第二固定夹具，其中第一和第二夹具可在至少两个维度上在所述凝胶上引入张力；
iii)连接至所述第一夹具上的力传感器和连接至所述第二夹具上的张力操控器，其中所述力传感器感应施加在所述凝胶上的机械张力，其用于计算所述细胞和所述凝胶中的应力；
iv)与所述力传感器连通的计算机，其中所述计算机能够储存所述力传感器所感应的机械张力读数。
41.权利要求40的***，还包括能捕获所述包封在凝胶中的细胞的图像的成像***，其中所述成像***与所述力传感器和所述电脑之一或两者连通。
42.权利要求40至41中任一项的***，还包括电刺激器，其将电信号应用在所述包封在凝胶中的细胞上。
43.权利要求40至42中任一项的***，其中所述灌注室包含改良的蒂罗德溶液，所述溶液包含用于替代葡萄糖的丙酮酸。
44.权利要求43的***，其中所述改良的蒂罗德溶液包含低于50μM的Ca2+浓度。
45.权利要求40至44中任一项的***，其中所述计算机还被编程以控制和/或管理给予所述灌注室的试验刺激。
46.一种用于监测细胞上的机械应变和/或应力的方法，其包括
a)将细胞包封在权利要求1至26中任一项的组合物中；
b)获得所述细胞上的机械应变和/或应力的第一测量值；
c)将所述细胞暴露于试验刺激下；
d)获得所述细胞上的机械应变和/或应力的第二测量值；以及
e)比较所述第一测量值和第二测量值。
47.权利要求46的方法，其中所述细胞为肌细胞。
48.权利要求47的方法，其中所述肌细胞为心肌细胞、骨骼肌肌细胞或平滑肌肌细胞。
49.权利要求47至48中任一项的方法，其中所述肌细胞为心肌细胞。
50.权利要求47至49中任一项的方法，其中测量肌细胞收缩。
51.权利要求46至50中任一项的方法，还包括连续记录和测量所述细胞上的机械应变和/或应力。
52.权利要求46至51中任一项的方法，还包括在将所述细胞暴露于所述试验刺激下之前在所述凝胶上引入机械应变和/或应力。
53.权利要求46至52中任一项的方法，还包括在将所述细胞暴露于所述试验刺激下之前、期间和/或之后，在所述凝胶上引入机械应变和/或应力。
54.权利要求46至53中任一项的方法，其中所述试验刺激为物理的、化学的或药理学的。
55.权利要求46至54中任一项的方法，其中所述细胞上的机械应变和/或应力的第一测量值和/或第二测量值被记录在计算机可读介质上。
56.一种产生权利要求1的组合物的方法，其包括：
a)用结合配偶体对-配体缀合物的第二结合配偶体孵育一个或多个细胞，孵育条件为允许所述配体结合至所述一个或多个细胞上的一个或多个细胞表面分子上；
b)使结合至所述第二结合配偶体-配体缀合物上的细胞与结合配偶体对的第一结合配偶体或包含所述第一结合配偶体的生物相容性聚合物接触，接触条件为足以使所述第一结合配偶体结合至所述第二结合配偶体-配体缀合物的第二结合配偶体上；以及
c)使来自步骤b)的所述细胞与Y-X-Y交联剂接触，接触条件为足以交联所述第一结合配偶体，其中X为线性亲水性聚合物且Y为所述结合配偶体对的第二结合配偶体，从而将所述细胞包封在水凝胶中。
57.一种产生权利要求2的组合物的方法，其包括：
a)用结合配偶体对-配体缀合物的第二结合配偶体孵育一个或多个细胞，孵育条件为允许所述配体结合至所述一个或多个细胞上的一个或多个细胞表面分子上；
b)使结合至结合配偶体对-配体缀合物的所述第二结合配偶体上的所述细胞与缀合至结合配偶体对的第一结合配偶体上的生物相容性聚合物接触，接触条件为足以使所述第一结合配偶体结合至所述第二结合配偶体-配体缀合物上；以及
c)使来自步骤b)的所述细胞与硼酸酯-X-硼酸酯交联剂接触，接触条件为足以交联所述生物相容性聚合物，其中X为线性亲水性聚合物，从而将所述细胞包封在水凝胶中。
58.权利要求56至57中任一项的方法，其中所述结合配偶体对选自抗生物素蛋白/生物素、谷胱甘肽/谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)/麦芽糖、组氨酸标签/咪唑+Zn2+，以及万古霉素/D-丙氨酸-D-丙氨酸(DADA)。
59.一种产生权利要求7的组合物的方法，其包括：
a)用生物相容性聚合物-配体缀合物孵育一个或多个细胞，孵育条件为允许所述配体结合至所述一个或多个细胞上的一个或多个细胞表面分子上；
b)使所述细胞与硼酸酯-X-硼酸酯交联剂接触，接触条件为足以交联所述生物相容性聚合物，其中X为线性亲水性聚合物，从而将所述细胞包封在水凝胶中。
60.权利要求56至59中任一项的方法，其中所述一个或多个细胞是在或不在机械混合下被包封。
61.一种试剂盒，其包括：
i)包含结合配偶体对的第一结合配偶体或缀合至所述第一结合配偶体上的生物相容性聚合物的溶液；以及
ii)包含Y-X-Y交联剂的溶液，其中X为线性亲水性聚合物以及Y为所述结合配偶体对的第二结合配偶体。
62.一种试剂盒，其包含：
i)包含缀合至结合配偶体对的第一结合配偶体上的生物相容性聚合物的溶液；以及
ii)包含硼酸酯-X-硼酸酯交联剂的溶液，其中X为线性亲水性聚合物。
63.权利要求62的试剂盒，其中所述硼酸酯-X-硼酸酯交联剂中的硼酸酯选自二硼酸酯、三硼酸酯、四硼酸酯及其混合物。
64.权利要求61至63中任一项的试剂盒，其中所述结合配偶体对选自抗生物素蛋白/生物素、谷胱甘肽/谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)/麦芽糖、组氨酸标签/咪唑+Zn2+，以及万古霉素/D-丙氨酸-D-丙氨酸(DADA)。
65.权利要求64的试剂盒，其中所述抗生物素蛋白选自抗生物素蛋白、抗生物素蛋白链菌素、中性抗生物素蛋白和captavidin。
66.权利要求61至65中任一项的试剂盒，还包括包含缀合至配体上的第一结合配偶体或第二结合配偶体的缀合物的溶液。
67.权利要求61至66中任一项的试剂盒，其中所述生物相容性聚合物包含范围为约50-150kDa的平均分子量。
68.权利要求61至67中任一项的试剂盒，其中所述生物相容性聚合物包含用于交联的顺式-二醇部分。
69.权利要求61至68中任一项的试剂盒，其中所述生物相容性聚合物选自聚乙烯醇(PVA)、琼脂糖和藻酸酯。
70.权利要求61至69中任一项的试剂盒，其中X为线性亲水性聚合物，其选自聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、藻酸酯、琼脂糖、壳聚糖和线性低聚糖。
71.权利要求61至70中任一项的试剂盒，其中所述交联剂具有范围为约1-50kDa的分子量。
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