CN106795491B - 一种用于淋巴细胞培养的血清替代物及制备方法 - Google Patents

Abstract

提供了一种用于淋巴细胞培养的血清替代物及制备方法，该血清替代物包括如下质量比的组分：血小板聚集释放物30‑100份，人血清白蛋白50‑200份，重组人转铁蛋白或柠檬酸铁1‑10份，植物血凝素1‑5份。

Description

一种用于淋巴细胞培养的血清替代物及制备方法

技术领域

本发明涉及动物免疫细胞培养技术领域，更具体的说，涉及到一种用于淋巴细胞培养的血清替代物及制备方法。

背景技术

在常规的细胞培养、扩增过程中，动物源性血清如胎牛血清、新牛血清、小牛血清等，是细胞培养过程中必不可少的营养物质。如今，大部分实验室仍然还在用动物源性血清来培养细胞，但是随着血源的减少以及血清价格的不断上涨，以及来自动物保护组织的压力，动物源性血清的使用日益受到限制，另外，动物源性血清中的复杂成分会对所培养细胞照成较多的不确定性影响，不能准确放映出需要的生物学特性。

很多实验室，尤其是干细胞实验室开始尝试使用血清替代物来进行细胞培养，例如，ZL20091009607.9号专利公开了一种非动物源性细胞培养血清替代物及其应用，该血清替代物由如下方法制备得到：取3～5体积单位O型的血沉棕黄层和1体积单位AB型的血浆混合，300～400G离心，取上清液作为一个体积单位的富含血小板血浆；将富含血小板血浆过滤除去白细胞，-10℃以下冷冻保存备用，使用前30～37℃解冻、3000～5000G离心去除血小板膜碎片，既得所述非动物源性细胞培养血清替代物。该血清替代物可以替代胎牛血清用于细胞培养，能够免除细胞培养中的动物源性成分，加速细胞倍增，从而满足临床安全和缩短手术周期需求，不仅适用于间质干细胞，亦适用于其他人源细胞的扩增培养。该专利中直接使用血小板作为胎牛血清替代物用于细胞培养，营养成分较为单一，对于间质干细胞的培养可能影响不大，但是不适用于淋巴细胞的培养。

ZL20051002311.8号专利公开了一种无血清配方的动物细胞培养用胎牛血清替代剂，由重组人***-1：0.1g～0.5g/L(浓度)，重组人血小板源性生长因子-B：0.1g～0.6g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子：0.05～0.4g/L，牛转铁蛋白：1g～5g/L，牛血清白蛋白(V组分)：2g～15g/L，巯基乙醇0.3～0.5mol/L组成；通过添加重组的细胞因子等主要成分，可以与基础培养基以不同比例配制成的培养基，成功的培养了使CHO细胞、BHK细胞、L929细胞等不同细胞系，达到了替代血清的目的；同时，将添加剂做成独立于基础培养基的独立配方，可与多种基础培养基进行搭配，以适合培养不同的细胞，具有高度的灵活性；并且可以与国产廉价的基础培养基配合，用于哺乳动物细胞无血清培养，大大降低培养基在生产或科研中的成本。该专利采用已知分子结构和构型的组分替代胎牛血清，但是缺少对维持细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或量很少的营养物、以及主要的低分子营养物，特别是将其用于淋巴细胞的培养时，细胞增殖慢、细胞杀伤作用较弱。

技术问题

本发明所要解决的技术问题在于：提供一种用于淋巴细胞培养的血清替代物及制备方法，解决现有技术中的血清替代剂不适用于淋巴细胞的培养、营养不均衡等问题。

问题的解决方案

技术解决方案

本发明解决上述问题的技术方案为：提供一种用于淋巴细胞培养的血清替代物，所述血清替代物包括如下质量比的组分：

在本发明提供的用于淋巴细胞培养的血清替代物中，所述血小板聚集释放物的制备方法包括：

分离获得血小板并用磷酸盐缓冲液重悬，获得重悬血小板；向所述重悬血小板中加入80～150μmol/L的二磷酸腺苷，培养箱孵育培养2～4小时，1800～2000g离心20～25min，收获上清成分，直接作为含有血小板聚集释放物的溶液使用，或者冻干处理即得所述血小板聚集释放物。

在本发明提供的用于淋巴细胞培养的血清替代物中，所述磷酸盐缓冲液为含Ca²⁺、Mg²⁺的磷酸盐缓冲液。

在本发明提供的用于淋巴细胞培养的血清替代物中，所述血小板聚集释放物中血小板衍生生长因子、转化生长因子、类胰岛素生长因子、表皮生长因子的含量均大于150ng/g。

在本发明提供的用于淋巴细胞培养的血清替代物中，所述“分离获得血小板”的方法包括：

取抗凝(抗凝剂可为枸橼酸、EDTA、肝素等)全血或者富血小板血浆，将其小心铺层到血小板分离液的上层；800～1200g离心20～25min，吸取淋巴细胞分离液和血浆之间的血小板层。

在本发明提供的用于淋巴细胞培养的血清替代物中，所述血小板分离液由聚蔗糖、泛影酸、去离子水配制而成，密度为1.060g/L，渗透压为280mosm/L，0.22μm滤器过滤除菌后即得。

本发明还提供一种用于淋巴细胞培养的血清替代物的制备方法，包括如下步骤：

S101、血小板聚集释放物的制备：分离获得血小板并用磷酸盐缓冲液重悬，获得重悬血小板；向所述重悬血小板中加入80～150μmol/L的二磷酸腺苷，培养箱孵育培养2～4小时，1800～2000g离心20～25min，收获上清成分，冻干处理即得所述血小板聚集释放物；

S102、血清替代物的制备：包括如下质量比的组分，

本发明提供的另一种用于淋巴细胞培养的血清替代物的制备方法，包括如下步骤：

S201、血小板聚集释放物的制备：分离获得血小板并用磷酸盐缓冲液重悬，获得重悬血小板；向所述重悬血小板中加入80～150μmol/L的二磷酸腺苷，培养箱孵育培养2～4小时，1800～2000g离心20～25min，收获上清成分，所述上清成分中包含所述血小板聚集释放物；

S202、血清替代物的制备：包括如下质量比的组分，

发明的有益效果

有益效果

实施本发明，具有如下有益效果：使用血小板聚集释放物和已知成分的蛋白替代动物源性血清，避免了异种添加物的不确定性和危险性，另外，将本发明的血清替代物添加进入完全培养基用于淋巴细胞的培养，收获的淋巴细胞从细胞增殖、表型、体外杀伤等方面都明显优于胎牛血清培养基和无血清培养基。

发明实施例

本发明的实施方式

下面将结合本发明实施例，对现有技术和本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在常规的细胞培养、扩增过程中，仍然大量的使用动物源性血清，如胎牛血清、新牛血清、小牛血清等，但是血源的减少、复杂成分带来的不确定性影响，越来越限制动物源性血清的使用，更特别的是，动物源性血清中复杂的抗原活性物质对于淋巴细胞培养容易照成很多不确定性干扰，有可能无法反应出特异性刺激物的作用、引起其他未知的免疫反应，对实验研究或者实际应用中要想排查出此种干扰或者影响需要付出较大的工作量，阻碍工作进度甚至照成工作无法继续开展。

本发明的主要创新点在于，将血小板聚集释放物和数种适宜淋巴细胞生长的营养物质配合使用添加进入基础培养基，用于淋巴细胞的培养，血小板聚集释放物中含有促进淋巴细胞生长的微量低分子营养物质和各种生长因子，不仅利于大量收获淋巴细胞，而且避免了异种添加物的不确定性和危险性，培养的淋巴细胞从细胞增殖、表型、体外杀伤等方面都明显优于胎牛血清培养基和无血清培养基。

在本发明的第一较佳实施例中，淋巴细胞培养的血清替代物包括如下质量比的组分：

血小板聚集释放物富含维持淋巴细胞指数生长的生长因子、基础培养基中没有或量很少的营养物、以及主要的低分子营养物，配合易于被淋巴细胞利用的人血清白蛋白、重组人转铁蛋白或柠檬酸铁，可以完全替代动物源性血清作为淋巴细胞培养的营养物质，另外，植物血凝素(PHA)能促使淋巴细胞转化为淋巴母细胞，继而***增殖，释放淋巴因子，并能大幅提高淋巴细胞的杀伤作用。优选的，本实施例中使用的血小板聚集释放物中血小板衍生生长因子、转化生长因子、类胰岛素生长因子、表皮生长因子的含量均大于150ng/g。

在本发明的另一较佳实施例中，血小板聚集释放物的制备方法包括有分离血小板之后的孵育培养，具体包括：

分离获得血小板并用磷酸盐缓冲液重悬，获得重悬血小板，磷酸盐缓冲液有2种，一种没有钙、镁离子，另一种含有钙、镁离子，本发明优选的使用含Ca²⁺、Mg²⁺的磷酸盐缓冲液可以更好的促进血小板孵育培养，促进释放血小板中的细胞因子。向重悬血小板中加入80～150μmol/L的二磷酸腺苷，培养箱孵育培养2～4小时，培养温度37℃。孵育培养过程中血小板聚集并释放血小板中的细胞因子，提高血小板聚集释放物对于淋巴细胞的促生长能力。孵育培养完成后在1800～2000g离心20～25min，去除血小板膜、纤维蛋白、细胞碎片等，收获上清成分。特别需要说明的是，该上清成分可以直接作为含有血小板聚集释放物的溶液使用，也可以经过冻干处理后得到血小板聚集释放物。

在本发明的另一较佳实施例中，分离并获得血小板的方法为密度离心分离，具体包括：

取枸橼酸抗凝全血或者富血小板血浆，将其小心铺层到血小板分离液的上层；800～1200g离心20～25min，吸取淋巴细胞分离液和血浆之间的血小板层。血小板分离液主要由聚蔗糖、泛影酸、去离子水配制而成，密度为1.060g/L，渗透压为280mosm/L，0.22μm滤器过滤除菌后即得。通过密度离心分离可去除血浆中航的红细胞、白细胞及绝大部分血浆成分，获得纯度很高的血小板。当然，上述分离并获得血小板的方法只是示例性而非限制性，现有技术中分离并获得血小板的方法也可用于本发明中，只要能够获得的血小板纯度足够、血小板保持完整不破裂。

实施例1

分离获得血小板：将聚蔗糖和泛影酸融入去离子水中，调整密度为1.060g/L，渗透压为280mosm/L，0.22μm滤器过滤除菌，备用。取枸橼酸抗凝全血或者富血小板血浆，将其小心铺层到血小板分离液的上层；800g离心25min，吸取淋巴细胞分离液和血浆之间的血小板层。

血小板聚集释放物的制备：分离获得血小板并用含Ca²⁺、Mg²⁺的磷酸盐缓冲液重悬，获得重悬血小板；向所述重悬血小板中加入80μmol/L的二磷酸腺苷，培养箱孵育培养4小时，1800g离心25min，收获上清成分，直接作为含有血小板聚集释放物的溶液使用。

血清替代物的制备：包括如下质量比的组分，

其中，血小板聚集释放物使用含有血小板聚集释放物的溶液，具体用量参照冻干后干粉质量。

实施例2

分离获得血小板：将聚蔗糖和泛影酸融入去离子水中，调整密度为1.060g/L，渗透压为280mosm/L，0.22μm滤器过滤除菌，备用。取枸橼酸抗凝全血或者富血小板血浆，将其小心铺层到血小板分离液的上层；1200g离心20min，吸取淋巴细胞分离液和血浆之间的血小板层。

血小板聚集释放物的制备：分离获得血小板并用含Ca²⁺、Mg²⁺的磷酸盐缓冲液重悬，获得重悬血小板；向所述重悬血小板中加入150μmol/L的二磷酸腺苷，培养箱孵育培养2小时，2000g离心20min，收获上清成分，冻干处理即得血小板聚集释放物；

血清替代物的制备：包括如下质量比的组分，

实施例3

分离获得血小板：将聚蔗糖和泛影酸融入去离子水中，调整密度为1.060g/L，渗透压为280mosm/L，0.22μm滤器过滤除菌，备用。取枸橼酸抗凝全血或者富血小板血浆，将其小心铺层到血小板分离液的上层；1000g离心22min，吸取淋巴细胞分离液和血浆之间的血小板层。

血小板聚集释放物的制备：分离获得血小板并用含Ca²⁺、Mg²⁺的磷酸盐缓冲液重悬，获得重悬血小板；向所述重悬血小板中加入100μmol/L的二磷酸腺苷，培养箱孵育培养3小时，1900g离心22min，收获上清成分，冻干处理即得所述血小板聚集释放物；

血清替代物的制备：包括如下质量比的组分，

效果验证

在基础培养基1640中加入1.5％上述实施例1～3中的血清替代物，即可配置成完全培养基用于CIK细胞的培养。

对比实施例1中采用含10％胎牛血清1640、对比实施例2中采用AIM-V无血清培养基用于CIK细胞的培养。

1细胞增殖情况

在培养条件完全相同的情况下，经过14天的培养，使用台盼蓝染色检测或细胞计数仪：标准为活细胞在80％以上。

实验结果包括总细胞数、细胞存活率。

实施例1、实施例2、实施例3、对比实施例1、对比实施例2中总细胞数分别为1.27×10¹⁰、1.34×10¹⁰、1.51×10¹⁰、0.87×10¹⁰、0.69×10¹⁰；

实施例1、实施例2、实施例3、对比实施例1、对比实施例2中细胞存活率分别为97.5％、99.1％、98.2％、92.4％、91.5％。

对比可知，使用本发明血清替代物配置的完全培养基培养出的CIK细胞，在总细胞数、细胞存活率上都明显优于对比实施例。

2流式细胞仪检测细胞表面，CD3+，CD3+CD56+，CD3+CD8+，CD8+IFN-γ+等分子的表达。

检测对象包括CD3+、CD3+CD56+、CD3+CD8+、CD8+IFN-γ+、CD107a。

实施例1、实施例2、实施例3、对比实施例1、对比实施例2中CD3+分别为92.4％、89.7％、93.6％、82.4％、76.5％；

实施例1、实施例2、实施例3、对比实施例1、对比实施例2中CD3+CD56+分别为44.2％、35.8％、38.6％、15.2％、20.4％；

实施例1、实施例2、实施例3、对比实施例1、对比实施例2中CD3+CD8+分别为85.2％、80.5％、82.8％、60.2％、65.1％；

实施例1、实施例2、实施例3、对比实施例1、对比实施例2中CD8+IFN-γ+分别为40.4％、45.5％、40.8％、20.2％、19.2％；

实施例1、实施例2、实施例3、对比实施例1、对比实施例2中107a分别为17.6％、14.2％、15.8％、3.2％、5.4％；

对比可知，使用本发明血清替代物配置的完全培养基培养出的CIK细胞，在细胞表面分子的表达上都明显优于对比实施例。

3细胞杀伤实验：以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10∶1、20∶1、40∶1(E∶T为两者数目比)的比例加入96孔U型板中，每孔含靶细胞1×10⁴个，终体积为200ml，设3个复孔。培养4h后，离心吸取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率，同时设置空白对照，靶细胞对照，效应细胞对照。每孔数值减去空白孔对照，求出复孔的平均值。按照下面公式计算效应细胞的细胞毒活性，以杀伤率(％)表示：

杀伤率＝靶细胞对照值-(实验孔值-效应细胞对照值)/靶细胞对照值×100％。

按照此方法分别检测实施例1～3配置的完全培养基、对比实施例1～2中的培养基获得的自体肿瘤特异性细胞对肝癌细胞系HEPG2以及B细胞白血病K562的杀伤率。实验重复6次，取平均值。

实验结果包括E∶T＝10∶1、E∶T＝20∶1、E∶T＝40∶1三种情形下肝癌HEPG2与白血病K562为靶细胞的细胞杀伤实验结果。

当E∶T＝10∶1时，实施例1、实施例2、实施例3、对比实施例1、对比实施例2中肝癌HEPG2的杀伤结果分别为44.2％、42.1％、45.2％、30.2％、25.8％；实施例1、实施例2、实施例3、对比实施例中白血病K562的杀伤结果分别为26.5％、30.2％、35.2％、20.5％、23.2％；

当E∶T＝20∶1时，实施例1、实施例2、实施例3、对比实施例1、对比实施例2中肝癌HEPG2的杀伤结果分别为58.9％、57.2％、62.1％、41.2％、36.7％；实施例1、实施例2、实施例3、对比实施例中白血病K562的杀伤结果分别为50.3％、53.2％、45.9％、36.0％、38.1％；

当E∶T＝40∶1时，实施例1、实施例2、实施例3、对比实施例1、对比实施例2中肝癌HEPG2的杀伤结果分别为80.4％、77.5％、85.9％、55.1％、49.7％，实施例1、实施例2、实施例3、对比实施例中白血病K562的杀伤结果分别为65.2％、72.5％、68.5％、50.5％、55.2％。

4收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素＜5Eu)。

检测得知本发明实施例1～3和对比实施例中各项指标都不超标。

Claims (7)

1.一种用于淋巴细胞培养的血清替代物，其特征在于，所述血清替代物包括如下质量比的组分：

血小板聚集释放物 30～100 份

人血清白蛋白 50～200 份

重组人转铁蛋白或柠檬酸铁 1～10份

植物血凝素 1～5份；

其中，所述血小板聚集释放物的制备方法包括：

分离获得血小板并用磷酸盐缓冲液重悬，获得重悬血小板；向所述重悬血小板中加入80～150 μmol/L的二磷酸腺苷，培养箱孵育培养2～4小时，1800～2000g离心20～25 min，收获上清成分，直接作为含有血小板聚集释放物的溶液使用，或者冻干处理即得所述血小板聚集释放物。

2.根据权利要求1所述的血清替代物，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液为含Ca²⁺、Mg²⁺的磷酸盐缓冲液。

3. 根据权利要求1所述的血清替代物，其特征在于，所述血小板聚集释放物中血小板衍生生长因子、转化生长因子、类胰岛素生长因子、表皮生长因子的含量均大于150 ng/g。

4.根据权利要求1所述的血清替代物，其特征在于，所述“分离获得血小板”的方法包括：

取抗凝全血或者富血小板血浆，将其小心铺层到血小板分离液的上层；800～1200g 离心20～25 min，吸取淋巴细胞分离液和血浆之间的血小板层。

5. 根据权利要求4所述的血清替代物，其特征在于，所述血小板分离液由聚蔗糖、泛影酸、去离子水配制而成，密度为1.060 g/L，渗透压为280 mosm/L，0.22μm滤器过滤除菌后即得。

6.一种用于淋巴细胞培养的血清替代物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S101、血小板聚集释放物的制备：分离获得血小板并用磷酸盐缓冲液重悬，获得重悬血小板；向所述重悬血小板中加入80～150 μmol/L的二磷酸腺苷，培养箱孵育培养2～4小时，1800～2000g离心20～25 min，收获上清成分，冻干处理即得所述血小板聚集释放物；

S102、血清替代物的制备：包括如下质量比的组分，

血小板聚集释放物 30～100 份

人血清白蛋白 50～200 份

重组人转铁蛋白或柠檬酸铁 1～10份

植物血凝素 1～5份。

7.一种用于淋巴细胞培养的血清替代物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S201、血小板聚集释放物的制备：分离获得血小板并用磷酸盐缓冲液重悬，获得重悬血小板；向所述重悬血小板中加入80～150 μmol/L的二磷酸腺苷，培养箱孵育培养2～4小时，1800～2000g离心20～25 min，收获上清成分，所述上清成分中包含所述血小板聚集释放物；

S202、血清替代物的制备：包括如下质量比的组分，

血小板聚集释放物 30～100 份

人血清白蛋白 50～200 份

重组人转铁蛋白或柠檬酸铁 1～10份

植物血凝素 1～5份。