CN106794210A - 包含山竹提取物或α、γ倒捻子素作为有效成分的牙周病预防或改善用组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种包含山竹提取物的牙周病预防、改善或治疗用组合物。本发明的组合物通过包含山竹提取物或由其分离而得的α‑倒捻子素或γ‑倒捻子素，从而表现出针对牙周病致病菌的优异的抗菌及抗炎效果，因此能够广泛应用于牙周病预防、改善或治疗用途的药物、食品。

Description

包含山竹提取物或α、γ倒捻子素作为有效成分的牙周病预防 或改善用组合物

技术领域

本发明涉及包含表现优异的抗炎效果的山竹提取物或其有效成分的牙周病改善或预防用组合物。

背景技术

牙周病也时常被称为风齿，是指由细菌的复合感染(mixed infection)引发的伴有牙周组织的破坏的炎症疾病，表现出牙龈出血和肿胀、牙周袋的形成、附着牙龈的丧失、牙槽骨的破坏以及口臭等多种临床症状，这成为牙齿脱落和植牙失败的主要原因。

可以说这样的牙周病与一般称为蛀牙的龋齿(dental caries)相比，在口腔内发病组织、致病菌以及发病机理方面是非常不同的疾病。具体而言，龋齿发生在牙齿上的疾病，牙周病是发生在牙周组织(白垩质、牙龈、牙周韧带、牙槽骨)上的疾病，龋齿的致病菌是包括变形(mutans)菌群链球菌在内的利用糖质发酵代谢而产生有机酸(主要为乳酸)的菌种，与此不同，牙周病主要因革兰氏阴性厌氧性细菌而发病。即，龋齿是在酸性状态下发生疾病，然而牙周病在厌氧状态下发生的疾病，这是因为，与糖质代谢相比，革兰氏阴性厌氧性细菌的氮代谢更加活跃。因而，发生牙周病的部分会产生大量牙石。

已知这样的牙周病通常因多种局部性以及全身性的因素而发病，局部性因素中最重要的便是牙菌斑，已知该牙菌斑内目前为止存在约500余种细菌且形成一种生物膜(biofilm)。在上述菌种中，作为主要的牙周病的致病菌，已知包括以具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)为首的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、中间型普里沃氏菌(Prevotella intermedia)、微小微单胞菌(Parvimonas micra；也称为Peptostreptococcus micros)、和伴放线放线杆菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans；也称为Actinobacillus actinomycetemcomitans)等。

这样的牙周病病原菌所引发的固有免疫应答和牙槽骨破坏机理如下。

人的牙龈上皮细胞(gingival epithelial cells)主要起到阻止细菌侵入的物理屏障的作用，且会分泌抗菌肽(人β防御素(human beta defensins)和LL-37等)，因此进行了对于人的牙龈上皮所分泌的作为抗菌肽的防御素类(defensins)和LL-37的易感性调查，据该结果报告，病原性强的菌种(牙龈卟啉单胞菌和中间型普里沃氏菌)对于上述抗菌肽的易感性高，然而作为病原性弱的菌种(变形链球菌等)的代表的具核梭杆菌在低浓度下被杀灭。

此外，人的牙龈上皮细胞会因牙周病致病菌而分泌白介素-8(Interleukin-8，IL-8)和IL-1α等细胞因子和趋化因子来诱导固有免疫应答从而将这些细菌去除，但如果作为初始防御膜的牙龈上皮细胞被牙菌斑内口腔微生物破坏，则会激活固有免疫应答以及适应性免疫应答，当无法去除病原体时，就会促进牙周组织的破坏。

此外，细菌感染后，会通过中性粒细胞(neutrophils)和抗体来保护牙龈上皮的连续性，具体而言，如果通过抗体而细菌的毒素被中和，且通过补体活性而细菌被调理(opsonization)，则细菌会被巨噬细胞去除。但是，如果牙龈上皮细胞的连续性受到破坏，则细菌或细菌的产物[LPS、磷酰胆碱(phosphoryl choline)、蛋白酶、白细胞毒素、细胞膨胀致死毒素(cytolethal distendingtoxin，CDT)等]会向牙周组织内入侵，从而诱导免疫应答，通过淋巴球、巨噬细胞等分泌白介素(IL)-1、IL-6、***素E2(prostaglandinE2，PGE2)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor(TNF)-α)等免疫介导分子，在牙龈上皮细胞、牙周韧带上皮细胞、前成骨细胞等中分泌核因子κB受体活化子配体(receptoractivator of nuclearfactorκB ligand，RANKL)骨保护素(osteoprotegerin，OPG)，从而调节破骨细胞的分化。此时，人的牙周韧带纤维母细胞应答IL-1而使RANKL表达增加，且使OPG的表达减少而促进破骨母细胞分化，从而参与牙槽骨破坏。

另一方面，牙龈纤维母细胞应答IL-1而促进OPG表达，从而抑制破骨母细胞分化。

另外，伴放线放线杆菌的LPS与牙周韧带细胞的TLR-4结合而使p38MAPK通路活化，使RANKL表达增加，使破骨母细胞分化增加，并且牙龈卟啉单胞菌利用赖氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶(Lys-gingipain)使牙周韧带细胞的RANKL表达增加。

但实际情况是，虽然牙周病是因多种菌种导致的混合感染而发生的疾病，但大部分研究仅进行了针对单一菌种的固有免疫。

目前，牙周病的治疗中，利用患者的口腔卫生改善、非外科治疗以及外科治疗(牙石去除术、牙根平整术、牙龈刮除术、应用新附着的牙周组织再生术)。作为最有效的治疗的外科治疗方法由于存在为了治疗而不得不到牙科门诊的不便以及相比疾病的预防而言仅在疾病发展到某种程度时才会进行的局限性，因此针对牙周病的治疗并没有有效治愈，从而大部分牙周病发展成慢性病。过去一直通过服用全身性的抗生素和使用局部释放性制剂来进行辅助治疗，但是由于报道了因不需要的部位也会吸收大量的药物从而引发副作用和分离出对于近年来所使用的抗生素表现出耐受性的牙周病菌的例子，因此存在严重的问题。

尤其就韩国而言，根据健康保险审查评价院的“2013年诊疗费统计指标”，因牙周病而到牙科门诊就诊的人数超过1000万人，与2004年相比，增加了约2倍，除了急性上呼吸道炎症(感冒)以外，是韩国国民最常患的疾病，而且据报道目前作为代表性牙周病治疗剂而熟知的和等药物实际上对于牙周病并不具有直接疗效，仅达到健康食品或辅助剂水平。

为了克服这样的外科治疗的局限性和抗生素使用的问题且开发用于提高牙周病预防和治疗效果的替代物质，进行了利用天然植物提取物来找出抗菌活性的研究。

例如，通过在作为天然提取物的红姜根(Park等人,Phytother.Res.22,1446-1449,2008)、南非药用植物、荷叶(Li和Xu,Arch.Pharm.Res.Vol 31,No.5,640-644,2008)等中测定针对牙周病致病菌的抗菌活性开发了具有高抗菌能力的物质，此外，近年来，确认了将从甘草提取物中分离的物质和作为炎症物质的iNOS和COX-2注入存在于伴放线放线杆菌和牙龈卟啉单胞菌的细胞壁上的作为耐毒素物质的脂多糖(LPS)中，用GCSB-5对其进行处理，则引发炎症的过程中细胞内信号传递物质(Akt和NF-kB)的活化减少，疼痛和浮肿得到缓解(Bodet等人,J.Periodontal.Vol.9,No.9,2008)，但目前为止对牙周病有效的来自天然植物的治疗剂或保健食品仍未正式售卖。

另一方面，山竹(Garcinia mangostana)是原产于马来西亚的属于无患子树目、省沽油科的双子叶植物的果实，会结出扁平球状的且大小比乒乓球稍大的果实。已知山竹果实含有作为多酚之一的所谓氧杂蒽酮(xanthone)的代表性抗氧化剂成分，因而具有优异的抗氧化能力，并且已知以泰国为代表的东南亚等国在很久以前就将其作为民间药物来用于炎症或创伤等伤口的治疗等中。

进一步，作为山竹的其他用法，关于山竹果皮，日本特开平6-98738号公报及日本特开平7-147951号公报中公开了食品用保存材、日本特开平5-17365号公报中公开了5α-还原酶抑制剂、日本特开平7-250658号公报中公开了抗菌剂、日本特开平8-208501号公报中公开了抗幽门螺杆菌药、日本特开平9-87155号公报中公开了紫外线吸收剂、日本特开平10-120586号公报中公开了丝氨酸蛋白酶抑制剂。

此外，关于山竹果皮的水溶性提取物，日本特开平4-244004号公报中公开了来自肥大细胞的组胺的分离抑制作用所带来的美白、抗炎症作用，关于山竹果皮的极性溶剂提取物以及α-倒捻子素、γ-倒捻子素，日本特开平10-72357号公报中公开了针对组胺和血清素的拮抗作用所带来的抗过敏作用，但没有公开任何山竹提取物及由其分离的物质与牙周病有关的效果。

在这样的背景下，本发明人为了开发基于天然物质的对牙周病预防、改善及治疗表现出优异效果的药物及食品组合物进行了深入研究，结果确认到，山竹提取物及由其分离的α-倒捻子素、γ-倒捻子素对于牙周病病原菌的抗菌效果及抗炎效果非常优异，从而完成了本发明。

发明内容

技术课题

本发明的一个目的在于，提供抗菌及抗炎效果同时优异的牙周病预防或治疗用药物组合物。

本发明的另一目的在于，提供抗菌及抗炎效果同时优异的牙周病预防或改善用食品组合物。

技术解决方法

作为用于达成上述目的的一个方式，本发明提供包含山竹提取物的牙周病预防或治疗用药物组合物。

作为又一方式，本发明提供包含选自由α-倒捻子素和γ-倒捻子素组成的组中的一种以上的牙周病预防或治疗用药物组合物。

作为又一方式，本发明提供包含山竹提取物的牙周病预防或改善用食品组合物。

作为又一方式，本发明提供包含选自由α-倒捻子素和γ-倒捻子素组成的组中的一种以上的牙周病预防或改善用食品组合物。

有益效果

本发明的组合物通过包含山竹提取物或由山竹提取物分离而得的α-倒捻子素或γ-倒捻子素，从而能够表现对于牙周病原菌的优异的抗菌及抗炎效果，广泛用于牙周病预防、改善或治疗用途用药物、食品。

附图说明

图1图示了将包含本发明的山竹提取物的组合物以纳米胶囊形态剂型化时的结构。

图2是表示本发明的组合物中所包含的山竹提取物针对中间型普里沃氏菌KCOM1107的MBC试验结果的照片。

图3是表示本发明的组合物中所包含的山竹提取物针对具核梭杆菌多形亚种KCOM1232的MBC试验结果的照片。

图4是表示本发明的组合物中所包含的山竹提取物针对伴放线放线杆菌KCOM1306的MBC试验结果的照片。

图5是表示本发明的组合物中所包含的山竹提取物针对牙龈卟啉单胞菌ATCC33277T的MBC试验结果的照片。

具体实施方式

以下，更详细说明本发明。

本发明提供包含山竹提取物的牙周病预防或治疗用药物组合物。

此外，本发明提供包含山竹提取物的牙周病预防或改善用食品或食品添加用组合物、口腔组合物。

本发明的组合物中所包含的山竹提取物马来西亚、泰国、越南用于本研究的原料由分布于马来西亚、泰国、越南、印度尼西亚等的作为热带果实的山竹(GarciniaMangostana)制造而得，已知上述山竹含有约40余种氧杂蒽酮成分，作为单一果实类，含有相当多的氧杂蒽酮成分。

上述山竹提取物可以采购市售品，或者可以无限制地适当选择药物或食品企业通常已知的提取方法及提取溶剂来制造。通常的提取方法可以包括超声波提取法、过滤法及回流提取法等，但并不限于此。优选地，可以使用选自由水和碳原子数1至6的低级醇组成的组中的一种以上提取溶剂来提取山竹。更优选地，由于上述山竹提取物中作为针对牙周病的有效成分的α-倒捻子素和γ-倒捻子素为脂溶性物质，因此可以使用例如50至小于100％的乙醇水溶液之类的水和乙醇的含水有机溶剂或乙醇溶剂。作为具体的一个方式，本发明中所使用的山竹提取物可以如下获得：将50至小于100％的乙醇水溶液3至5重量份与山竹1重量份混合，在60至80℃的温度区间进行回流的同时提取8至10小时，然后利用过滤器并通过减压过滤之类的合适的过滤方法将所提取的液体过滤，之后将该滤液在40至60℃温度区间、真空度0.2至0.5气压的条件下去除提取溶剂，从而获得山竹提取物。

进一步，由于上述α-倒捻子素和γ-倒捻子素具有脂溶性，因此为了有效地制剂化及体内吸收，可以通过提高对于水的溶解度的水溶化工序而制成作为包合物(inclusioncompound)形态的水溶性山竹分子胶囊(molecular encapsulation)形态。

作为具体的一个方式，为了制造用于提高如上脂溶性山竹提取物的水溶性、稳定性及体内吸收率的水溶性山竹分子胶囊，可以将山竹提取物根据需要与以下说明的追加有效物质(例如，蜂胶、大豆不皂化物、溶菌酶、维生素C)一同通过环糊精、优选γ-环糊精之类的包合物进行包合而进行分子胶囊化。优选地，可以将γ-环糊精0.2至0.5重量份与脂溶性山竹提取物1重量份混合，并在60至80℃的温度区间、在0.3气压至0.5气压范围使山竹提取物包合。必要时，为了将包合山竹提取物更加稳定化，可以追加精氨酸0.1重量份并在4度以下保管4小时至8小时而稳定化，也可以通过冷冻干燥而颗粒化。

如此水溶化的水溶性山竹分子胶囊可以表示为具有下述图1所示的结构的分子胶囊形态，且可以具有约50至150nm的粒径。

作为优选的一个方式，上述山竹提取物作为针对牙周病预防、改善及治疗的有效成分，可以包含选自由作为分别具有下述化学式1和2的结构的氧杂蒽酮成分的α-倒捻子素和γ-倒捻子素组成的组中的一种以上成分。更优选地，本发明的组合物可以同时包含上述α-倒捻子素和γ-倒捻子素，优选α-倒捻子素:γ-倒捻子素以1:1至5:1，更优选以2:1至4:1、最优选以8.75:2.54的含量比包含。上述范围内，本发明的组合物表现出极佳水平的牙周病预防、改善及治疗效果。

[化学式1]

[化学式2]

作为具体的一个方式，本发明的组合物中，以组合物总重量为基准，上述山竹提取物的含量可以为30至50重量％。

作为具体的一个方式，为了获得针对牙周病的增效效果，本发明的组合物可以进一步包含选自由蜂胶、氯化溶菌酶、大豆不皂化物、维生素C、木糖醇和维生素E组成的组中的一种以上的针对牙周病的有效成分。

上述“蜂胶”是蜜蜂为了自身生存和繁殖，将自身的唾液和酶等与从多种植物中吸出的如树脂那样的物质混合而制成的物质，其包含黄酮(例如，柯因、柚木柯因、高良姜精)或黄烷酮(例如，栎精、乔松酮)等黄酮类物质、苯甲酸苄酯香豆素等芳香族酸、肉桂酸、短叶松素、松属素等多种多样的成分而表现出抗菌、抗真菌、胃炎及胃溃疡治疗效果、镇痛效果、降低血压及维持血糖效果、心血管保护效果、牙齿保护效果等。优选地，相对于本发明的组合物总重量，上述蜂胶的含量可以为15至25重量％。

上述“大豆不皂化物”是存在于豆油中的成分且具有疏水性，其是指与氢氧化钾之类的强碱成分反应不会制得可溶性肥皂的纯化合物，包含植物甾醇(phytosterol)。具体而言，上述大豆不皂化物包含β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、白藜芦醇、木质素、染料木黄酮、异黄酮、卵磷脂、磷脂酰胆碱、鞘脂、磷脂酰丝氨酸等成分。优选地，相对于本发明的组合物总重量，上述大豆不皂化物的含量可以为7至13重量％。这样的大豆不皂化物为细腻而白色的粉末，存在特有的味道，不溶于水或醇，且体积大，在以高容量填充于一般胶囊的情况下，存在如下缺点：不仅不易填充，而且填充时会因摩擦热而熔化，从而全部组合物的原料无法良好结合，难以制剂化。因此，作为优选的方式，本发明中所包含的大豆不皂化物可以与其他组合物的构成成分分开颗粒化后加入组合物中。进一步，作为另一优选的方式，为了这样的颗粒化，优选在各种添加剂中尤其添加酒精而进行颗粒化以便容易进行制剂化。对于酒精而言，可以根据需要使用各种浓度的酒精，但优选可以使用99.9％(v/v)的酒精，以与大豆不皂化物的重量比计，可以以大豆不皂化物:酒精＝5:1至1:1使用。更优选地，大豆不皂化物:酒精的重量比可以为17:4.4。

上述“氯化溶菌酶”作为切割细菌细胞壁的酶，主要从蛋清中提取而制造，其通过将成为牙龈病原因的细菌及病毒细胞壁的不溶性多糖类变成可溶性多糖类而发挥抗菌作用，且在炎症部位表现消炎作用而抑制发红、肿胀、疼痛等并将脓汁分解、排出，从而不仅促进炎症部位的组织修复而治愈炎症，还通过抗肝素作用而发挥防止牙龈出血的作用。优选地，相对于本发明的组合物总重量，上述氯化溶菌酶的含量可以为10至20重量％。

上述“维生素C”作为抗氧化剂发挥如下作用：将体内自由基去除而防止细胞损伤，促进胶原合成而使受伤部位的组织快速再生，强化血管壁且激活凝血酶的作用而预防牙龈出血。优选地，相对于本发明的组合物总重量，上述维生素C的含量可以为3至10重量％。

上述“维生素E”是通过利用细胞膜稳定化的抗氧化作用、微循环改善作用等来防止组织损伤的物质，相对于本发明的组合物总重量，其含量可以为0.5至2重量％。

上述“木糖醇”作为从桦树或橡树提取的糖醇系天然甜味剂，是由于五碳糖结构而能够防止蛀牙菌增殖的物质，相对于本发明的组合物总重量，其含量可以为1至7重量％。

更优选地，本发明的组合物除了上述追加成分以外可以进一步包含选自由海藻粉、干酵母和铬酵母组成的组中的一种以上成分。

另一方面，上述山竹提取物中表现针对牙周病的预防、改善或治疗效果的有效物质是上述α-倒捻子素和/或γ-倒捻子素，因此本发明的组合物可以包含选自由上述α-倒捻子素和γ-倒捻子素组成的组中的一种以上作为药理成分来代替山竹提取物本身。因此，包含α-倒捻子素和/或γ-倒捻子素的情况也与将上述山竹提取物用作药理成分的情况相同，可以包含追加成分。

本发明的组合物除了上述记载的有效成分以外会进一步包含一种以上可药用的载体以用于给药。本发明中，“可药用的载体”是指，在将给药用药学活性化合物剂型化时有用且在使用条件下为非毒性和非敏感性的公知的药物赋形剂。这样的赋形剂的精确的比率不仅要依据活性化合物的溶解度和化学特性、所选择的给药途径，还要依据标准药学惯例进行决定。

本发明的药物组合物可以使用合适且生理学上允许的赋形剂、崩解剂、甜味剂、结合剂、被覆剂、膨胀剂、润滑剂、助滑剂、芳香剂等助剂并利用期望的给药方法以合适的形态进行制剂化。

上述药物组合物可以以片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、粉剂、注射剂或液剂的形态进行制剂化，但不限于此。

药物组合物的剂型及可药用的载体可以根据本领域公知的技术来适当选择，例如，可以参照下述文献：“Urquhart等人,Lancet,16:367,1980”；“Lieberman等人,药物剂型-分散体系(PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS-DISPERSE SYSTEMS),第2版,vol.3,1998”；“Ansel等人,药物剂型和给药体系(PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS&DRUG DELIVERYSYSTEMS),第7版,2000”；“Martindale,大药典(THE EXTRA PHARMACOPEIA),第31版”；“雷明顿药物科学(Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES),第16-20版”；“治疗学的药理学基础(THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS),Goodman和Gilman编,第9版,1996”；“Wilson和Gisvolds的有机药物和药物化学课本(Wilson and Gisvolds'TEXTBOOK OFORGANIC MEDICINAL AND PHARMACEUTICAL CHEMISTRY),Delgado和Remers编,第10版,1998”。

本发明的组合物可以根据目标方法来进行经口给药或非经口给药(例如，应用于静脉内、皮下、腹腔内或局部)，给药量根据个体的体重、年龄、性别、健康状态、饮食、给药时间、给药方法、***率及疾病的严重程度等不同其范围也会不同。上述山竹提取物的日给药量为约60至90mg，α-倒捻子素的日给药量以成人为基准为约5至9.0mg，γ-倒捻子素为0.9至1.2mg，优选每天分成一次至多次而给药。

本发明的组合物在用于食品的情况下，上述食品用组合物可以将其本身直接剂型化而用作保健食品，或作为保健食品的添加物而添加于其他保健食品中。所谓保健食品是指，具有疾病的预防或改善、生物体防御、免疫、病后的恢复、老化抑制等生物体调节功能的食品，长期服用时，应当对人体无害。有效成分的混合量可以根据使用目的(预防、健康或治疗性处理)来适当决定。

上述食品的种类没有特别限制。作为可以添加上述物质的食品的例子，有肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、点心类、饼干类、比萨、方便面、其他面类、口香糖类、包括冰淇淋类在内的乳酪制品、各种汤、饮料、茶、口服液、酒精饮料及维生素复合剂等，包括通常意义上的全部保健食品。

本发明的食品用组合物可以包含食品或食品添加物的制造中所使用的通常的成分，具体可以包含：芳香剂；作为天然碳水化合物的葡萄糖、果糖等单糖、麦芽糖、蔗糖等二糖、和糊精、环糊精等天然甜味剂，或糖精、阿斯巴甜等合成甜味剂；营养剂；维生素；电解质；着色剂；有机酸；保护性胶体增稠剂；pH调节剂；稳定剂；防腐剂；甘油；酒精；碳酸饮料中所使用的碳酸化剂等。

本发明的组合物也可以用作用于口腔卫生的口腔用组合物。该情况下，可以具有牙膏、口气清新剂、漱口液、口腔按摩霜等剂型。此外，关于本发明中提供的口腔用组合物的配合成分，除了以上说明的成分以外，可以根据组合物的用途和种类进行各种各样的配合而使用。

以下，通过实施例来详细说明本发明。但，下述实施例仅是例示本发明，本发明不受下述实施例的限定。

以下，为了帮助本发明的理解，例举实施例来进行详细说明。但，下述实施例仅是例示本发明的内容，本发明的范围不受下述实施例的限定。本发明的实施例是为了向本领域普通技术人员更完全地说明本发明而提供的。

<制造例1>山竹果皮(Pericarp)粉碎物的制造

将山竹果皮(Pericarp)1kg在25℃通风干燥烘箱中进行干燥，制成水分含量为10％以下的干燥物250g，然后利用破碎机将该干燥物粉碎，获得粒子大小400目至500目的山竹果皮粉碎物230g。

有效成分的含量在下述条件下利用HPLC进行分析。

HPLC分析条件

柱(Column)：菲罗门(Phenomenex)Luna C18，250×4.6nm(5um)

-溶剂(Solvent)：MeOH:H₂O:甲酸(formic acid)＝90％:10％:0.1％

-检测器(Detector)：UV/VIS，254nm

-流速(Flow rate)：1.0ml/min

-柱温(Column temp.)：加热烘箱(Heating Oven，35℃)

分析结果确认到，山竹果皮400目至500目的粉碎物中，α-倒捻子素的含量为3.0±1.0％，γ-倒捻子素的含量为0.2±0.05％。

<制造例2>含有α-倒捻子素和γ-倒捻子素的山竹提取物的制造

在20L反应槽中，使用10L的乙醇，在60℃的条件下，对上述制造例1的山竹果皮粉碎物制造工序中获得的山竹果皮粉碎物1kg进行提取4小时，然后利用1.0μm过滤纸进行过滤，将滤液在40℃下减压浓缩而获得150g的浓缩物。

如果将99％乙醇300g加入该浓缩物150g中，加热至70℃而使其完全溶解后，以0.05度/min的冷却速度缓慢进行结晶化直至4℃，则会析出结晶体，将此时析出的结晶体过滤。

将该结晶体进行真空干燥(真空条件：50℃，0.3气压，8小时)及均匀化，获得最终山竹果皮提取物105g。在与制造例1相同的条件下对其进行HPLC分析，结果α-倒捻子素和γ-倒捻子素含量与下述表1中所记载的相同。

[表1]

山竹提取物	α-倒捻子素	γ-倒捻子素
			有效成分含量	40.0含量同	5.00含量同。

<制造例3>水溶性山竹分子胶囊的制造

按照下述表2中记载的配合比率制造山竹提取物被可溶化的水溶性山竹分子胶囊。具体而言，将γ-环糊精45g与通过<制造例2>的方法获得的脂溶性山竹提取物150g混合，在70℃的温度、0.4气压的真空下，以搅拌速度1000rpm搅拌2小时而使山竹提取物包合。为了将所包合的山竹提取物更加稳定化，添加精氨酸22g，在4℃以下保管6小时而使胶囊相稳定化。之后，将该溶液通过冷冻干燥(从-40℃升温至40℃，升温条件：1℃/hr)而粉末化。

利用与制造例1的测定方法相同的方法测定作为如上制造的水溶性山竹分子胶囊的指标物质的α-倒捻子素、γ-倒捻子素的含量，结果确认到包含与表3所示的含量的α-倒捻子素、γ-倒捻子素。

[表2]

原材料名或成分名	配合比率(％)
		山竹提取物粉末	7.00
γ-环糊精	2.00
		精氨酸	1.00
精制水	90.00
		合计	100.00

[表3]

α-倒捻子素	γ-倒捻子素
		28.945mg	3.605mg

<制造例4>水溶性山竹组合物的制造

在制造例3中所制造的水溶性山竹粉末430g中加入蜂胶提取物210g(液态)、大豆不皂化物120g、氯化溶菌酶150g、维生素C 50g、维生素E 10g、木糖醇30g，且放入粉末混合机进行均匀混合，然后在真空干燥机(60℃，0.4气压，8小时)中充分干燥后，粉碎而制成粉末。

[表4]

利用这样制造的组合物，可以用于片剂(tablet)、软质及硬质胶囊、液包(l iquidpouch)、液瓶(liquid vial)、颗粒剂棒等所有食品剂型。

<实施例1>山竹提取物对于变形链球菌ATCC 25175(Streptococcus mutans ATCC25175)的抗菌性测定

一般而言，当开发出新型抗菌剂时，关于作为判定该抗菌剂的有效性的基准试验方法，有最低抑菌浓度(minimum Inhibitory concentration：以下称为MIC)试验和时间杀菌能力(time-kill assay)试验。

MIC TEST是决定细菌不易滋长的最低抑菌浓度、即用于获得目标抗菌功效的抗菌剂的最低使用量的试验方法，Time-Kill assay试验是决定一定的时间范围内可以维持目标功效的抗菌剂的使用的试验方法，为了验证山竹提取物针对变形链球菌ATCC 15175(Streptocccus Mutans ATCC 15175)具有何种程度的增殖抑制功效，进行如下各试验。

(1)针对变形链球菌的MIC试验

针对变形链球菌ATCC 25175(Streptococcus mutans ATCC 25175)的MIC试验，按照美国临床试验标准方法即NCCLS(美国临床实验室标准化委员会)来进行。为了对山竹提取物针对变形链球菌的抗菌性进行比较试验，对于各分析试样而言，如以下表5那样将各分析试样的浓度设为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10ul，将所使用的变形链球菌的浓度比率设为50重量％以便最终为1×10⁵，且使用作分析试样溶解剂的DMSO(二甲亚砜)的浓度最终为1重量％，对于剩余的40重量％而言加入脑心浸液培养基(Brain heart infusion，BHI：动物组织胃蛋白酶消化物(Peptic Digest of Animal tissue)、氯化钠(Sodium Chloride)、葡萄糖(Dextrose)、明胶胰酶消化物(Pancreatic Digest of Gelation)、磷酸二钠(Disodium Phosphate)、最终PH7.4+-0.2；Difco公司)，如此制造后用于试验。

作为分析试样，使用在利用制造例2的方法制造的山竹提取物和制造例1中制造的山竹果皮粉碎物中加入99％以上的乙醇并溶解后，将其冷却而获得的α-倒捻子素和γ-倒捻子素。

[表5]

将上述试样添加于微米管(一式两份(duplicate))在37℃培养24小时后，测定550nm处的吸光度而观察生长抑制程度，该结果与下述表6相同。

[表6]

分析试样	MIC
		α-倒捻子素	1.0(ug/ml)
γ-倒捻子素	4.0(ug/ml)
		山竹提取物	10.0(ug/ml)

上述表6中可以确认到，山竹提取物和由山竹提取物分离而得的α-倒捻子素和γ-倒捻子素在非常低的浓度下也会显示出针对作为牙周病相关病原菌的变形链球菌的抗菌活性。特别是在α-倒捻子素的情况下，仅为1.0ug/ml时也显示出抗菌活性，从而判断对于牙周病的预防、改善及治疗表现出显著的效果。

(2)针对变形链球菌的时间杀菌能力试验

关于针对变形链球菌ATCC 25175(Streptococcus mutans ATCC 25175)的分析试样的时间杀菌能力实验，按照基于NCCLS(美国临床实验室标准化委员会)的方法中依据麦氏比浊标准(McFarland Standard)来换算相对于最初O.D550nm值的菌数的方法来实施。

使用作分析试样溶解剂的DMSO(二甲亚砜)的浓度最终为1重量％，对于剩余的40重量％而言加入BHI培养基，如此制造后用于试验。

具体而言，添加制造例2中所制造的山竹提取物10mg而制成10,000ug/ml。此时，使用作分析试样溶解剂的DMSO(二甲亚砜)的浓度最终为10重量％，对于剩余的40重量％而言加入BHI培养基，如此制造后用于试验。将如此制造的10,000ug/ml的山竹提取物根据下述表7中的组成比以山竹提取物的最终浓度分别为10、100、1000ug/ml的方式稀释而制造试验液。将作为所使用的菌株的变形链球菌的比率设为50重量％以便调整为最终1x10⁵CFU/ml。

[表7]

之后，将如上述表7那样以不同浓度比率制得的试验液100μl一边在与MIC实验相同的条件下进行培养一边分别以立即(Direct)、10分钟、30分钟间隔取试验液中的一定量的液体。涂抹于固体BHI培养基上且在37℃培养48小时后，数出形成菌落的细菌数，将该结果示于下述表8中。

[表8]

如上可以确认到，在使用本发明的山竹提取物的情况下，即使在极低浓度10ug/ml下，与牙周病相关的变形链球菌在刚刚处理后也被杀灭10％以上，特别是在使用1000ug/ml的情况下，不仅刚刚处理后就表现出约40％左右的杀灭率，而且在10分钟之后杀灭90％以上，30分钟之后杀灭大部分的细菌。

<实施例2>山竹提取物针对牙龈卟啉单胞菌CCARM 0145(Porphyromonasgingivalis CCARM 0145)的抗菌性测定

针对牙龈卟啉单胞菌CCARM 0145(Porphyromonas gingivalis CCARM0145)的MIC实验通过NCCLS(美国临床实验室标准化委员会，1997)的固体培养基稀释法(Agardilution method(琼脂稀释法))来实施。

具体而言，试验菌液如下准备：将在胰酶大豆琼脂(Trypticase soy agar，TSA)中添加了绵羊血液5％、血红素(hemin)5μg/ml和维生素K3(menadione)0.5μg/ml的培养基中培养至对数期的菌株依据麦氏比浊标准(MacFarland standard)以吸光度(O.D550nm)0.5进行混悬。

培养基如下准备：在布氏琼脂(Brucella agar)中添加了溶血绵羊血液5％、血红素5μg/ml和维生素K1 1μg/ml的培养基中将各试样进行倍数稀释而进行混合，以使培养基内的最终浓度为0.25μg/ml至128μg/ml。

在上述培养基中接种约5xl0⁵CFU/滴(spot)的试验菌液，在利用GasPak EZ厌氧容器***(Anaerobic container System)(Becton，Dickinson and Company，Sparks，MD，USA)的厌氧条件下于35℃培养48小时。

其结果确认到，本发明的山竹提取物针对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis CCARM 0145)显示出120μg/ml的MIC。

<实施例3>针对多种牙周病菌种的山竹提取物的抗菌性测定

为了更详细地测定本发明的山竹提取物的抗菌性，通过以作为韩国人的口腔中分离鉴定的牙周病病原菌的中间型普里沃氏菌KCOM 1107(Prevotella intermedia KCOM1107)、具核梭杆菌多形亚种KCOM 1232(Fusbacterium nucleatum subsp.polymorphumKCOM 1232)、伴放线放线杆菌KCOM 1306(Aggregatibacter actinomycetemcomitans KCOM1306)和牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277T(Porphyromonas gingivalis ATCC 33277T)为对象测定最低杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration，MBC)而测定山竹果皮提取物的抗菌性。

所使用的上述菌株全部购自韩国口腔微生物保藏中心(Korean Collection forOral Microbiology，Gwangju，Korea)或美国菌种保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC，Manassas，VA，USA)。

将上述菌株接种于在胰酶大豆培养基(Tryptic Soy broth)中添加了0.5％酵母提取物(yeast extract)、0.05％半胱氨酸(cysteine)HCl-H2O、0.5mg/ml血红素和2ug/ml维生素K1的培养基中，并在37℃厌氧腔室(anaerobic chamber)(Bactron I，SheldonManufacturing Inc.，Cornelius，OR，USA)和厌氧条件(10％H₂，5％CO₂，85％N₂)下进行培养。

MBC测定中将临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute，CLSI)[1]中提供的微稀释(micro-dilution)法变形后使用。将细菌接种于上述培养基中，于37℃在细菌培养器中培养器中培养24小时后，稀释成1x10⁶CFU/ml并分装于96孔板(96-well plate)中。

作为分析物质，将制造例2中制造的山竹提取物设为上述表7的实验组中记载的组成(MBL-Wmg01)，并且将按上述表2制造的水溶性山竹提取物分子胶囊设为上述表7的实验组中记载的组成(MBL-Wmg 02)，分别从2000ug/ml以每一阶段2倍的方式分8阶段进行稀释，并添加于细菌培养液。

此时，阴性对照组仅使用细菌培养液，阳性对照组使用市售的漱口液(Johnson&Johnson)。将它们以各200ul分装于96孔板后，于37℃培养48小时，然后从细菌培养液中取10ul并涂抹于琼脂培养基，于37℃培养48小时后，确认所形成的菌落，将100％不生长细菌定为最低浓度。各反应反复进行3次。将该结果示于下述表9及图2至图5中。

[表9]

*ND：未测定

从上述表9的结果中也可以知道，水溶性山竹提取物分子胶囊(MBL-Wmg02)与山竹提取物(MBL-Wmg 01)相比，针对属于牙周病的主要致病菌的中间型普里沃氏菌KCOM 1107、具核梭杆菌多形亚种1232和牙龈卟啉单胞菌ATCC33277T分别显示出16倍、4倍和2倍的更强的抗菌效果。但是，两种物质针对伴放线放线杆菌KCOM 1306在本实验中所使用的最高浓度(2mg/ml)以下均没有表现出抗菌能力。

当考虑到伴放线放线杆菌菌种是***前牙周炎之类的特殊牙周病的主要病原性菌种，在属于大部分牙周病的成人牙周炎中，中间型普里沃氏菌、具核梭杆菌多形亚种和牙龈卟啉单胞菌是主要病原性菌种时，本发明的山竹果皮提取物MBL-Wmg 01和MBL-Wmg 02可以分别以2.0mg/ml和250g/ml浓度以上在用于牙周病预防的食品添加剂、口腔卫生用品(牙膏、漱口液等)以及保健食品中非常有效地使用。

以上，详细描述了本发明的特定部分，但这样的具体技术仅是优选的实施例，本发明的范围不受其限制，这对于本领域的一般技术人员来讲是显而易见的。因此，本发明的实际范围应当根据随附的权利要求及其等同内容来定义。

Claims (27)

1.一种牙周病预防或治疗用药物组合物，其包含山竹提取物作为有效成分。

2.根据权利要求1所述的牙周病预防或治疗用药物组合物，其特征在于，所述山竹提取物是利用如下溶剂对山竹果皮进行提取而得到的，所述溶剂为选自由水、碳原子数1至6的醇、以及水与碳原子数1至6的醇的混合溶剂组成的组中的一种以上。

3.根据权利要求2所述的牙周病预防或治疗用药物组合物，其特征在于，所述碳原子数1至6的醇是乙醇。

4.根据权利要求1所述的牙周病预防或治疗用药物组合物，其特征在于，所述山竹提取物是进一步包含作为分子胶囊包衣剂的γ-环糊精的水溶性山竹提取物。

5.根据权利要求1所述的牙周病预防或治疗用药物组合物，其特征在于，所述山竹提取物包含选自由α-倒捻子素和γ-倒捻子素组成的组中的一种以上物质。

6.根据权利要求1所述的牙周病预防或治疗用药物组合物，其特征在于，相对于组合物总重量，包含30至50重量％所述山竹提取物。

7.根据权利要求1所述的牙周病预防或治疗用药物组合物，其特征在于，进一步包含选自由蜂胶、氯化溶菌酶、大豆不皂化物、维生素C、木糖醇和维生素E组成的组中的一种以上的针对牙周病的有效成分。

8.根据权利要求7所述的牙周病预防或治疗用药物组合物，其特征在于，相对于组合物总重量，包含15至25重量％蜂胶、10至20重量％氯化溶菌酶、7至13重量％大豆不皂化物、3至10重量％维生素C、1至7重量％木糖醇和0.5至2重量％维生素E。

9.根据权利要求7所述的牙周病预防或治疗用药物组合物，其特征在于，进一步包含选自由海藻粉、干酵母和铬酵母组成的组中的一种以上成分。

10.根据权利要求1所述的牙周病预防或治疗用药物组合物，其特征在于，进一步包含可药用的载体。

11.一种牙周病预防或治疗用药物组合物，其特征在于，包含选自由α-倒捻子素和γ-倒捻子素组成的组中的一种以上化合物。

12.一种牙周病预防或改善用食品组合物，其包含山竹提取物作为有效成分。

13.根据权利要求12所述的牙周病预防或改善用食品组合物，其特征在于，所述山竹提取物是利用如下溶剂对山竹果皮进行提取而得到的，所述溶剂为选自由水、碳原子数1至6的醇、以及水与碳原子数1至6的醇的混合溶剂组成的组中的一种以上。

14.根据权利要求13所述的牙周病预防或改善用食品组合物，其特征在于，所述碳原子数1至6的醇是乙醇。

15.根据权利要求12所述的牙周病预防或改善用食品组合物，其特征在于，所述山竹提取物是进一步包含作为分子胶囊包衣剂的γ-环糊精的水溶性山竹提取物。

16.根据权利要求12所述的牙周病预防或改善用食品组合物，其特征在于，所述山竹提取物包含选自由α-倒捻子素和γ-倒捻子素组成的组中的一种以上物质。

17.根据权利要求12所述的牙周病预防或改善用食品组合物，其特征在于，相对于组合物总重量，包含30至50重量％所述山竹提取物。

18.根据权利要求12所述的牙周病预防或改善用食品组合物，其特征在于，进一步包含选自由蜂胶、氯化溶菌酶、大豆不皂化物、维生素C、木糖醇和维生素E组成的组中的一种以上的针对牙周病的有效成分。

19.根据权利要求18所述的牙周病预防或改善用食品组合物，其特征在于，相对于组合物总重量，包含15至25重量％蜂胶、10至20重量％氯化溶菌酶、7至13重量％大豆不皂化物、3至10重量％维生素C、1至7重量％木糖醇和0.5至2重量％维生素E。

20.根据权利要求18所述的牙周病预防或改善用食品组合物，其特征在于，进一步包含选自由海藻粉、干酵母和铬酵母组成的组中的一种以上成分。

21.一种牙周病预防或改善用食品组合物，其特征在于，包含选自由α-倒捻子素和γ-倒捻子素组成的组中的一种以上化合物。

22.一种牙周病预防或改善用口腔卫生组合物，其特征在于，包含山竹提取物作为有效成分。

23.一种牙周病预防或改善用口腔卫生组合物，其特征在于，包含选自由α-倒捻子素和γ-倒捻子素组成的组中的一种以上化合物。

24.根据权利要求23所述的牙周病预防或改善用口腔卫生组合物，所述组合物的剂型是牙膏、口气清新剂、漱口液或牙龈按摩霜。

25.山竹提取物用于牙周病预防、治疗或改善的用途。

26.选自由α-倒捻子素和γ-倒捻子素组成的组中的一种以上化合物用于牙周病预防、治疗或改善的用途。

27.一种牙周病预防、治疗或改善方法，其包括给药选自由山竹提取物、α-倒捻子素和γ-倒捻子素组成的组中的一种以上。