CN106783496B - 一种电子显微镜断层成像方法及*** - Google Patents

一种电子显微镜断层成像方法及*** Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种电子显微镜断层成像方法及***，所述方法包括：步骤1，***复位；步骤2，采集投影及其参数；步骤3，根据步骤23采集到的投影及其参数，重建出待测样品的层析图像。本发明能够在成像范围内对投影参数进行选取，即精确控制待测样品处于不同的角度组合(alphai,phij)，并在选取的投影参数状态下自动采集待测样品的投影，因此可以同时实现对待测样品的单倾斜和锥倾斜成像的全自动数据采集过程，为快速获取待测样品的层析图像提供了有利条件。

Description

一种电子显微镜断层成像方法及***
技术领域
本发明涉及电子显微成像技术领域，特别是涉及一种电子显微镜断层成像方法及***。
背景技术
电子显微镜断层成像技术是使用电子显微镜拍摄与重建三维细胞或分子图像。电子显微断层成像通常包括两个步骤，第一步是采集样本的投影及该投影的技术参数，第二步是利用第一步采集到的投影及该投影的技术参数，重建出样本的层析图像。通常的显微镜断层成像技术主要包括三种拍摄方法：单倾斜、双倾斜和锥倾斜。使用锥倾斜方式能够获得的原空间信息交另外两种方法更多。
但是，目前使用的电子显微镜断层成像主要采用有专家参与评判的采集方式，即由操作人员操作无反馈的控制装置对样品进行移动，并进行投影采集操作。此种操作方式由于为有专家参与的闭环控制，不仅耗时多，且对投影参数的测量精度有限，采集到的投影参数较为粗略，从而也造成第二步重建过程耗时多。并且由于在人工评判是否对准的过程中，需要在同一角度对样品进行多次成像，会造成样品较为严重的变形。
因此，希望有一种技术方案来克服或至少减轻现有技术的上述缺陷中的至少一个。
发明内容
本发明的目的在于提供一种电子显微镜断层成像方法及***来克服或至少减轻现有技术的上述缺陷中的至少一个。
为实现上述目的，本发明提供一种电子显微镜断层成像方法，所述电子显微镜断层成像方法包括：步骤1，***复位，该步骤具体包括：步骤11，将样品台的中心调整至位于电子显微镜的主光轴上；步骤12，将置于样品台上的待测样品调整为零状态；步骤2，采集投影及其参数，该步骤具体包括：步骤21，采集待测样品在零状态下的透射图像，并在该透射图像上选取感兴趣区域的中心在三维坐标系中的坐标值(u,v,w)，该三维坐标系的原点是样品台上表面的中心点，(u，v)所在的平面平行样品台的上表面，u和v的方向相互垂直，w的方向为样品台的法线方向；步骤22，根据所有需要采集的投影参数中的角度组合(alphai,phij)，计算对应每一个角度组合(alphai,phij)下的感兴趣区域的中心(u,v,w)相对于电子显微镜的主光轴的偏移量(Δu,Δv,Δw)；步骤23，控制样品台按照步骤22中的每一个角度组合(alphai,phij)旋转以及按照与每一个角度组合(alphai,phij)相对应的偏移量(Δu,Δv,Δw)进行补偿运动，以使感兴趣区域的中心(u,v,w)始终位于电子显微镜的主光轴上，同时采集待测样品处于每一个状态(alphai,phij，u,v,w)下的投影；步骤3，根据步骤23采集到的投影及其参数，重建出待测样品的层析图像。
进一步地，步骤21用于较薄的待测样品的情形下，具体包括：步骤211，利用低分辨率采集待测样品在零状态下的图像，该图像经过预处理后，得到待测样品的大范围透射图像；步骤212，在待测样品的大范围透射图像上选取感兴趣区域的中心的坐标值中的u和v，并以待测样品的厚度中心对应的高度作为感兴趣区域的中心的坐标值中的w，以确定感兴趣区域的中心坐标值(u,v,w)；步骤21用于较厚的待测样品的情形下，具体包括：步骤211’，利用低分辨率采集待测样品在零状态下的图像；步骤212’，步骤211’采集到的图像经过预处理后，得到待测样品的大范围透射图像，在待测样品的大范围透射图像上选取感兴趣区域的中心的坐标值中的u和v，并以待测样品的厚度中心对应的高度作为感兴趣区域的中心的坐标值中的w，以初步确定感兴趣区域的中心坐标值(u,v,w)；步骤213’，利用步骤212’确定的中心坐标值(u,v,w)以及一个预设的角度组合(alphai,phij)，计算偏移量(Δu,Δv,Δw)；步骤214’，控制样品台按照步骤213’中的每一个角度组合(alphai,phij)旋转以及按照与每一个角度(alphai,phij)组合相对应的偏移量(Δu,Δv,Δw)进行补偿运动，以使感兴趣区域的中心始终位于电子显微镜的主光轴上；步骤215’，利用高分辨率采集待测样品在零状态下的图像，按照步骤212’相同的方法，以最终确定感兴趣区域的中心坐标值(u,v,w)。
进一步地，步骤22中的(Δu,Δv,Δw)的计算公式为：
式中，α为alphai，为phij，i，j为自然数。
进一步地，步骤23具体包括：步骤231，将alpha轴固定在指定范围内的一alpha角度值；步骤232，驱动phi轴旋转至指定范围内的一phi角度值；步骤233，控制样品台按照与步骤231和步骤232角度组合(alphai,phij)相对应的偏移量(Δu,Δv,Δw)进行补偿运动；步骤234，采集步骤233状态下的待测样品的投影；步骤235，返回步骤231至步骤234，直至所有的角度组合(alphai,phij)状态下的待测样品的投影采集完成。
进一步地，步骤11具体包括：步骤111，在样品台上放置校准用样品，校准用样品由电子透明材料制成，且与待测样品的尺寸相同，在校准用样品的厚度中心布置一层呈放射状分布的纳米级金属细丝，金属细丝交汇于校准用样品的中心；步骤112，调整样品台的alpha为0，通过校准用样品图像的中心与该校准用样品图像中的校准用样品的中心之间的偏差，校准样品台的中心的中心坐标(u,v)处于(0,0)；步骤113，调整样品台的alpha为最大，通过校准用样品图像的中心与该校准用样品图像中的校准用样品的中心之间的偏差，校准样品台的中心的中心坐标w处于0。
进一步地，步骤112和步骤113具体为：步骤114，采集校准用样品的图像，计算图像的中心与图像中的校准用样品的中心之间的偏差，若存在偏差，进入步骤115，若不存在偏差，则样品台校准完毕；步骤115，根据步骤114中的偏差，调整偏差，同时利用比步骤114中的分辨率更高的分辨率采集校准用样品的图像，并返回步骤114。
本发明还提供一种电子显微镜断层成像***，所述电子显微镜断层成像***包括：多维度载物样品台装置，其包括样品台、三轴平移构件、alpha旋转构件和phi旋转构件，其中：所述样品台用于放置待测样品，所述三轴平移构件、alpha旋转构件和phi旋转构件根据所述主控装置的控制指令驱动所述样品台运动，以使待测样品的感兴趣区域的中心始终位于电子显微镜的主光轴上；电子显微镜，其用于实时采集待测样品的图像数据；主控装置，其包括***复位模块、投影及其参数采集模块和重建模块，其中：所述***复位模块用于通过驱动三轴平移构件、alpha旋转构件和/或phi旋转构件将所述样品台的中心调整至位于所述电子显微镜的主光轴上以及将置于所述样品台上的待测样品调整为零状态；投影及其参数采集模块，其包括：感兴趣区域确定子模块，其用于采集待测样品在零状态下的透射图像，并在该透射图像上选取感兴趣区域的中心在三维坐标系中的坐标值(u,v,w)，该三维坐标系的原点是所述样品台上表面的中心点，(u，v)所在的平面平行所述样品台的上表面，u和v的方向相互垂直，w的方向为所述样品台的法线方向；偏移量计算子模块，其用于根据所有需要采集的投影参数中的角度组合(alphai,phij)，计算对应每一个角度组合(alphai,phij)下的感兴趣区域的中心(u,v,w)相对于电子显微镜的主光轴的偏移量(Δu,Δv,Δw)；投影采集子模块，其用于控制所述alpha旋转构件和phi旋转构件按照所述偏移量计算子模块给出的每一个角度组合(alphai,phij)旋转以及控制所述三轴平移构件按照与每一个角度组合(alphai,phij)相对应的偏移量(Δu,Δv,Δw)进行补偿运动，以使感兴趣区域的中心(u,v,w)始终位于所述电子显微镜的主光轴上，同时采集待测样品处于每一个状态(alphai,phij，u,v,w)下的投影；重建模块，其用于根据所述投影及其参数采集模块采集到的投影及其参数，重建出待测样品的层析图像。
进一步地，所述感兴趣区域确定子模块通过以下方式确定待测样品的感兴趣区域：
对于较薄的待测样品：首先，利用低分辨率采集待测样品在零状态下的图像，该图像经过预处理后得到待测样品的大范围透射图像；然后，在待测样品的大范围透射图像上选取感兴趣区域的中心的坐标值中的u和v，并以待测样品的厚度中心对应的高度作为感兴趣区域的中心的坐标值中的w，以确定感兴趣区域的中心坐标值(u,v,w)；
对于较厚的待测样品：利用低分辨率采集待测样品在零状态下的图像，该图像经过预处理后得到待测样品的大范围透射图像；然后，在待测样品的大范围透射图像上选取感兴趣区域的中心的坐标值中的u和v，并以待测样品的厚度中心对应的高度作为感兴趣区域的中心的坐标值中的w，以初步确定感兴趣区域的中心坐标值(u,v,w)；再利用初步确定的中心坐标(u,v,w)以及一个预设的角度组合(alphai,phij)，计算偏移量(Δu,Δv,Δw)；再者，控制所述alpha旋转构件和phi旋转构件按照每一个角度组合(alphai,phij)旋转以及控制所述三轴平移构件按照与每一个角度(alphai,phij)组合相对应的偏移量(Δu,Δv,Δw)进行补偿运动，以使感兴趣区域的中心始终位于电子显微镜的主光轴上；最后，利用高分辨率采集待测样品在零状态下的图像，在待测样品的大范围透射图像上选取感兴趣区域的中心的坐标值中的u和v，并以待测样品的厚度中心对应的高度作为感兴趣区域的中心的坐标值中的w，以最终确定为最终的感兴趣区域的中心坐标值(u,v,w)。
进一步地，所述投影采集子模块通过以下方式采集待测样品处于每一个状态(alphai,phij，u,v,w)下的投影：首先，将所述alpha旋转构件固定在指定范围内的一alpha角度值；再驱动所述phi旋转构件旋转至指定范围内的一phi角度值；然后，控制所述三轴平移构件按照角度组合(alphai,phij)相对应的偏移量(Δu,Δv,Δw)进行补偿运动，同步采集当前状态下的待测样品的投影，直至所有的角度组合(alphai,phij)状态下的待测样品的投影采集完成。
进一步地，所述电子显微镜断层成像***还包括：校准用样品，其由电子透明材料制成，且与待测样品的尺寸相同，所述校准用样品的厚度中心布置一层呈放射状分布的纳米级金属细丝，金属细丝交汇于所述校准用样品的中心；所述样品台和phi旋转构件都由电子透明材料制成。
本发明能够在成像范围内对投影参数进行选取，即精确控制待测样品处于不同的角度组合(alphai,phij)，并在选取的投影参数状态下自动采集待测样品的投影，因此可以同时实现对待测样品的单倾斜和锥倾斜成像的全自动数据采集过程，为快速获取待测样品的层析图像提供了有利条件。
附图说明
图1是本发明所提供的电子显微镜断层成像***的一优选实施例的原理的示意图。
图2是图1中的主控装置的一优选实施例的原理的示意图。
图3是图2中的投影及其参数采集模块的一优选实施例的原理的示意图。
图4是图1中的主控装置的一优选实施例的结构示意图。
图5是图1中的alpha旋转构件的工作原理示意图。
图6是图1中的phi旋转构件的工作原理示意图。
图7是本发明中的校准用样品的结构示意图。
具体实施方式
在附图中，使用相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。
在本发明的描述中，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。
如图1至图3所示，本实施例所提供的电子显微镜断层成像方法包括：
步骤1，***复位，该步骤具体包括：
步骤11，将样品台的中心调整至位于电子显微镜的主光轴上。
步骤12，将置于样品台上的待测样品调整为零状态。决定样品平面位置的参数包括u、v、w、alpha和phi，“零状态”指的是u、v、w、alpha和phi都为0。
u、v、w由参考三维坐标系确定，参考三维坐标系通常以放置待测样品的样品台作为参考对象，即定义样品台上表面的中心点为参考三维坐标系的原点，(u，v)所在的平面平行样品台的上表面，u轴和v轴的方向相互垂直，w轴的方向为样品台的法线方向，u为待测样品的中心相对于参考三维坐标系的原点沿u轴的距离值，v为待测样品的中心相对于参考三维坐标系的原点沿v轴的距离值，w为待测样品的中心相对于参考三维坐标系的原点沿w轴的距离值。u、v、w可通过图4中示出的三轴平移构件12进行调整。
定义图4中示意出来的样品台11的法线方向，即垂直纸面的方向为alpha为0的状态。通过如图5的旋转箭头转动alpha旋转构件13，可以改变样品台11的法线方向，即改变样品台11当前的法线方向与图4中示出样品台11的法线方向之间的夹角。
在样品台11选取一条半径，如图6中示意出来的R0作为参照点，通过phi旋转构件14将样品台11围绕样品台11的法线旋转，则可以将参照点旋转到R1，那么，半径R1与R0之间的夹角为phi，也就是说，若R0作为参照点，R0的位置phi为0的状态。
如图5示出地，alpha和phi都为0的状态下，参考三维坐标系(u,v,w)为三维坐标系(x,y,z)，也就是这两个三维坐标系重合，这时候的u为x，v为y，w为z。
步骤2，采集投影及其参数，该步骤具体包括：
步骤21，采集待测样品在零状态下的透射图像，并在该透射图像上选取感兴趣区域的中心在参考三维坐标系中的坐标值(u,v,w)。
步骤22，返回步骤1，根据所有需要采集的投影参数中的角度组合(alphai,phij)，计算对应每一个角度组合(alphai,phij)下的感兴趣区域的中心(u,v,w)相对于电子显微镜的主光轴的偏移量(Δu,Δv,Δw)；Δu为感兴趣区域的中心(u,v,w)相对于alpha轴和phi轴的交点在x方向上的偏移量，Δv为感兴趣区域的中心(u,v,w)相对于alpha轴和phi轴的交点在y方向上的偏移量，Δw为感兴趣区域的中心(u,v,w)相对于alpha轴和phi轴的交点在z方向上的偏移量。Δu、Δv和Δw的计算方法如下：
式中，α为alphai，为phij，i，j为自然数。
步骤23，控制样品台按照步骤22中的每一个角度组合(alphai,phij)旋转以及按照与每一个角度组合(alphai,phij)相对应的偏移量(Δu,Δv,Δw)进行补偿运动，以使感兴趣区域的中心(u,v,w)始终位于电子显微镜的主光轴上，同时采集待测样品处于每一个状态(alphai,phij，u,v,w)下的投影。
步骤3，根据步骤23采集到的投影及其参数，重建出待测样品的层析图像。步骤3提供的重建方法为现有技术，在此不再赘述。
本实施例能够在成像范围内对投影参数进行选取，即精确控制待测样品处于不同的角度组合(alphai,phij)，并在选取的投影参数状态下自动采集待测样品的投影，因此可以同时实现对待测样品的单倾斜和锥倾斜成像的全自动数据采集过程，为快速获取待测样品的层析图像提供了有利条件。
在一个实施例中，由于待测样品相比于可重建区域较大，且在进行拍摄之前，实验者无法知道具体的感兴趣区域，故需要进行一次较大范围拍摄以确定兴趣区域，所述步骤21提供如下两种模式。
第一种模式，单次确定法：用于较薄的待测样品，较薄的待测样品在本发明中可以理解为当对重建区域厚度方向位置精度要求不高时的待测样品。所述步骤21具体包括：
步骤211，利用低分辨率采集待测样品在零状态下的图像，该图像经过预处理后，得到待测样品的大范围透射图像。本步骤中，电子加速电压远远小于电子显微镜拍摄时所用加速电压称为“低分辨率”。“预处理”包括选择性进行降噪、染色和灰阶调节等处理。
步骤212，在待测样品的大范围透射图像上选取感兴趣区域的中心的坐标值中的u和v，并以待测样品的厚度中心对应的高度作为感兴趣区域的中心的坐标值中的w，以确定感兴趣区域的中心坐标值(u,v,w)。
本实施例所提供的方法对于较薄的样品，由于其厚度较小，进行一次定位即可精确地确定感兴趣区域的具体范围，因此操作简单。
第二种模式，两次确定法：用于较厚的待测样品，较厚的待测样品在本发明中可以理解为当对重建区域厚度方向位置精度要求高时的待测样品。所述步骤21具体包括：
步骤211’，利用低分辨率采集待测样品在零状态下的图像；本步骤中，电子加速电压远远小于电子显微镜拍摄时所用加速电压称为“低分辨率”。
步骤212’，步骤211’采集到的图像经过预处理后，得到待测样品的大范围透射图像，在待测样品的大范围透射图像上选取感兴趣区域的中心的坐标值中的u和v，并以待测样品的厚度中心对应的高度作为感兴趣区域的中心的坐标值中的w，以初步确定感兴趣区域的中心坐标(u,v,w)。“预处理”包括选择性进行降噪、染色和灰阶调节等处理。
步骤213’，利用步骤212’确定的中心坐标(u,v,w)以及一个预设的角度组合(alphai,phij)，计算偏移量(Δu,Δv,Δw)。
步骤214’，控制样品台的alpha轴和phi轴按照步骤213’中的每一个角度组合(alphai,phij)旋转以及按照与每一个角度(alphai,phij)组合相对应的偏移量(Δu,Δv,Δw)进行补偿运动，以使感兴趣区域的中心始终位于电子显微镜的主光轴上。
步骤215’，利用高分辨率采集待测样品在零状态下的图像，按照步骤212’相同的方法，以最终确定感兴趣区域的中心坐标(u,v,w)。本步骤中，电子加速电压与电子显微镜拍摄时所用加速电压相差不大时称为“高分辨率”。
本实施例所提供的方法针对厚度相对较大的样品，采取两次定位所对应的直线方程交点为感兴趣区域的中心点，因此，可以提高对感兴趣区域的定位的准确性。
在一个实施例中，步骤23具体包括：
步骤231，将alpha轴固定在指定范围内的一alpha角度值，alpha的取值范围为(-60°，60°)。
步骤232，驱动phi轴旋转至指定范围内的一phi角度值，phi的取值范围为(0°，360°)。
步骤233，控制样品台按照与步骤231和步骤232角度组合(alphai,phij)相对应的偏移量(Δu,Δv,Δw)进行补偿运动。
步骤234，采集步骤233状态下的待测样品的投影。
步骤235，返回步骤231至步骤234，比如：将alpha轴固定在指定范围内的另一alpha角度值，驱动phi轴旋转至指定范围内的一phi角度值，直至所有的角度组合(alphai,phij)状态下的待测样品的投影采集完成。
本实施例所提供的方法在每次对投影的拍摄之前，都会自动对待测样品进行移动，使感兴趣区域位于电子显微镜的主光轴上，从而实现了无需人工操作的自动拍摄过程，这样不仅大大减少了操作时间，并且由于每次的补偿量是由控制器直接给出，减少了对样品的曝光次数，从而大大减少样品形变造成的成像误差。
该实施例实现了投影参数状态的任意选取。
如图7所示，在一个实施例中，步骤11具体包括：
步骤111，在样品台上放置校准用样品，校准用样品由电子透明材料制成，且与待测样品的尺寸相同，在校准用样品的厚度中心布置一层呈放射状分布的纳米级金属细丝，金属细丝交汇于校准用样品的中心。
步骤112，调整样品台的alpha为0，通过校准用样品图像的中心与该校准用样品图像中的校准用样品的中心之间的偏差，校准样品台的中心的中心坐标(u,v)处于(0,0)；
步骤113，调整样品台的alpha为最大，通过校准用样品图像的中心与该校准用样品图像中的校准用样品的中心之间的偏差，校准样品台的中心的中心坐标w处于0。
通过步骤11，可以实现样品台的中心调整至位于电子显微镜的主光轴上。
本实施例提供了一种对样品台的校准方法，预先的校准有助于提高采集投影及其参数的准确性，进而为更加真实地重建出待测样品的层析图像提供了有利条件。
在一个实施例中，步骤112和步骤113具体为：
步骤114，采集校准用样品的图像，计算图像的中心与图像中的校准用样品的中心之间的偏差，若存在偏差，进入步骤115，若不存在偏差，则样品台校准完毕；
步骤115，根据步骤114中的偏差，调整偏差，该调整偏差的方法为现有技术，在此不再赘述。同时利用比步骤114中的分辨率更高的分辨率采集校准用样品的图像，并返回步骤114。
如图1所示，本发明还提供一种电子显微镜断层成像***，电子显微镜断层成像***包括：多维度载物样品台装置1、电子显微镜2和主控装置3，其中：
多维度载物样品台装置1包括样品台11、三轴平移构件12、alpha旋转构件13和phi旋转构件14，其中：
样品台11用于放置待测样品，三轴平移构件12、alpha旋转构件13和phi旋转构件14根据主控装置3的控制指令驱动样品台11运动，以使待测样品的感兴趣区域的中心始终位于电子显微镜1的主光轴上。
电子显微镜2用于实时采集待测样品的图像数据。
如图2所示，主控装置3包括***复位模块31、投影及其参数采集模块32和重建模块33，其中：
***复位模块31用于通过驱动三轴平移构件12、alpha旋转构件13和/或phi旋转构件14控制样品台11的中心位于电子显微镜2的主光轴上以及将置于样品台11上的待测样品调整为零状态。
决定样品平面位置的参数包括u、v、w、alpha和phi，“零状态”指的是u、v、w、alpha和phi都为0。
u、v、w由参考三维坐标系确定，参考三维坐标系通常以放置待测样品的样品台作为参考对象，即定义样品台上表面的中心点为参考三维坐标系的原点，(u，v)所在的平面平行样品台的上表面，u和v的方向相互垂直，w的方向为样品台的法线方向。u、v、w可通过图4中示出的三轴平移构件12进行调整。
定义图4中示意出来的样品台11的法线方向，即垂直纸面的方向为alpha为0的状态。通过如图5的旋转箭头转动alpha旋转构件13，可以改变样品台11的法线方向，即改变样品台11当前的法线方向与图4中示出样品台11的法线方向之间的夹角。
在样品台11选取一条半径，如图6中示意出来的R0作为参照点，通过phi旋转构件14将样品台11围绕样品台11的法线旋转，则可以将参照点旋转到R1，那么，半径R1与R0之间的夹角为phi，也就是说，当R1位于R0的位置phi为0的状态。
如图3所示，投影及其参数采集模块32包括感兴趣区域确定子模块321、偏移量计算子模块322和投影采集子模块323，其中：
感兴趣区域确定子模块321用于采集待测样品在零状态下的图像，并在该图像上选取感兴趣区域的中心坐标(u,v,w)。
偏移量计算子模块322用于根据所有需要采集的角度组合(alphai,phij)，计算其中每一个角度组合对应的(Δu,Δv,Δw)，Δu为感兴趣区域的中心(u,v,w)相对于alpha轴和phi轴的交点在x方向上的偏移量，Δv为感兴趣区域的中心(u,v,w)相对于alpha轴和phi轴的交点在y方向上的偏移量，Δw为感兴趣区域的中心(u,v,w)相对于alpha轴和phi轴的交点在z方向上的偏移量。Δu、Δv和Δw的计算方法如下：
式中，α为alphai，为phij，i，j为自然数。
投影采集子模块323用于控制样品台的alpha轴和phi轴按照偏移量计算子模块322给出的每一个角度组合(alphai,phij)旋转以及按照与每一个角度组合(alphai,phij)相对应的偏移量(Δu,Δv,Δw)进行补偿运动，以使感兴趣区域的中心始终位于电子显微镜的主光轴上，采集样品台处于每一个状态(alphai,phij，u,v,w)下待测样品的图像数据。
重建模块33用于根据投影及其参数采集模块32采集到的样品台处于每一个状态(alphai,phij，u,v,w)下待测样品的图像数据，重建出待测样品的层析图像。重建模块33提供的重建方法为现有技术，在此不再赘述。
本实施例能够在成像范围内对投影参数进行选取，即精确控制待测样品处于不同的角度组合(alphai,phij)，并在选取的投影参数状态下自动采集待测样品的投影，因此可以同时实现对待测样品的单倾斜和锥倾斜成像的全自动数据采集过程，为快速获取待测样品的层析图像提供了有利条件。
在一个实施例中，由于待测样品相比于可重建区域较大，且在进行拍摄之前，实验者无法知道具体的感兴趣区域，故需要进行一次较大范围拍摄以确定兴趣区域，感兴趣区域确定子模块321提供如下两种模式。
第一种模式，单次确定法：对于较薄的待测样品，较薄的待测样品在本发明中可以理解为当对重建区域厚度方向位置精度要求不高时的待测样品。单次确定法具体为：
首先，利用低分辨率采集待测样品在零状态下的图像，该图像经过预处理后得到待测样品的大范围透射图像；然后，在待测样品的大范围透射图像上选取感兴趣区域的中心的坐标值中的u和v，并以待测样品的厚度中心对应的高度作为感兴趣区域的中心的坐标值中的w。电子加速电压远远小于电子显微镜拍摄时所用加速电压称为“低分辨率”。“预处理”包括选择性进行降噪、染色和灰阶调节等处理。
第二种模式，两次确定法：对于较厚的待测样品较厚的待测样品在本发明中可以理解为当对重建区域厚度方向位置精度要求高时的待测样品。两次确定法具体为：
利用低分辨率采集待测样品在零状态下的图像，该图像经过预处理后得到待测样品的大范围透射图像；然后，在待测样品的大范围透射图像上选取感兴趣区域的中心的坐标值中的u和v，并以待测样品的厚度中心对应的高度作为感兴趣区域的中心的坐标值中的w，以初步确定感兴趣区域的中心坐标(u,v,w)；再利用初步确定的中心坐标(u,v,w)以及一个预设的角度组合(alphai,phij)，计算偏移量(Δu,Δv,Δw)；再者，控制样品台的alpha轴和phi轴按照每一个角度组合(alphai,phij)旋转以及按照与每一个角度(alphai,phij)组合相对应的偏移量(Δu,Δv,Δw)进行补偿运动，以使感兴趣区域的中心始终位于电子显微镜的主光轴上；最后，利用高分辨率采集待测样品在零状态下的图像，在待测样品的大范围透射图像上选取感兴趣区域的中心的坐标值中的u和v，并以待测样品的厚度中心对应的高度作为感兴趣区域的中心的坐标值中的w，以最终确定为最终的感兴趣区域的中心坐标(u,v,w)。
电子加速电压远远小于电子显微镜拍摄时所用加速电压称为“低分辨率”。电子加速电压与电子显微镜拍摄时所用加速电压相差不大时称为“高分辨率”。“预处理”包括选择性进行降噪、染色和灰阶调节等处理。
在一个实施例中，所述投影采集子模块323通过以下方式采集样品台处于每一个状态(alphai,phij，u,v,w)下待测样品的投影：
首先，将alpha轴固定在指定范围内的一alpha角度值，alpha的取值范围为(-60°，60°)。再驱动phi轴旋转至指定范围内的一phi角度值，phi的取值范围为(0°，360°)。然后，控制样品台按照角度组合(alphai,phij)相对应的偏移量(Δu,Δv,Δw)进行补偿运动，同步采集当前状态下的待测样品的图像数据；最后，将alpha轴调整为另一alpha角度值，直至所有的角度组合(alphai,phij)状态下的待测样品的投影采集完成。
如图7所示，所述电子显微镜断层成像***还包括校准用样品4，校准用样品4由电子透明材料制成，且与待测样品的尺寸相同，校准用样品4的厚度中心布置一层呈放射状分布的纳米级金属细丝，金属细丝交汇于校准用样品4的中心。样品台11和phi旋转构件14都由电子透明材料制成。样品台11的校准方法前文已经描述，在此不再展开描述。
最后需要指出的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。本领域的普通技术人员应当理解：可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种电子显微镜断层成像方法，其特征在于，包括：
步骤1，***复位，该步骤具体包括：
步骤11，将样品台的中心调整至位于电子显微镜的主光轴上；
步骤12，将置于样品台上的待测样品调整为零状态；
步骤2，采集投影及其参数，该步骤具体包括：
步骤21，采集待测样品在零状态下的透射图像，并在该透射图像上选取感兴趣区域的中心在三维坐标系中的坐标值(u,v,w)，该三维坐标系的原点是样品台上表面的中心点，(u，v)所在的平面平行样品台的上表面，u和v的方向相互垂直，w的方向为样品台的法线方向；
步骤22，根据所有需要采集的投影参数中的角度组合(alphai,phij)，计算对应每一个角度组合(alphai,phij)下的感兴趣区域的中心(u,v,w)相对于电子显微镜的主光轴的偏移量(Δu,Δv,Δw)；
步骤23，控制样品台按照步骤22中的每一个角度组合(alphai,phij)旋转以及按照与每一个角度组合(alphai,phij)相对应的偏移量(Δu,Δv,Δw)进行补偿运动，以使感兴趣区域的中心(u,v,w)始终位于电子显微镜的主光轴上，同时采集待测样品处于每一个状态(alphai,phij，u,v,w)下的投影；
步骤3，根据步骤23采集到的投影及其参数，重建出待测样品的层析图像。
2.如权利要求1所述的电子显微镜断层成像方法，其特征在于，步骤21用于较薄的待测样品的情形下，具体包括：
步骤211，利用低分辨率采集待测样品在零状态下的图像，该图像经过预处理后，得到待测样品的大范围透射图像；
步骤212，在待测样品的大范围透射图像上选取感兴趣区域的中心的坐标值中的u和v，并以待测样品的厚度中心对应的高度作为感兴趣区域的中心的坐标值中的w，以确定感兴趣区域的中心坐标值(u,v,w)；步骤21用于较厚的待测样品的情形下，具体包括：
步骤211’，利用低分辨率采集待测样品在零状态下的图像；
步骤212’，步骤211’采集到的图像经过预处理后，得到待测样品的大范围透射图像，在待测样品的大范围透射图像上选取感兴趣区域的中心的坐标值中的u和v，并以待测样品的厚度中心对应的高度作为感兴趣区域的中心的坐标值中的w，以初步确定感兴趣区域的中心坐标值(u,v,w)；
步骤213’，利用步骤212’确定的中心坐标值(u,v,w)以及一个预设的角度组合(alphai,phij)，计算偏移量(Δu,Δv,Δw)；
步骤214’，控制样品台按照步骤213’中的每一个角度组合(alphai,phij)旋转以及按照与每一个角度(alphai,phij)组合相对应的偏移量(Δu,Δv,Δw)进行补偿运动，以使感兴趣区域的中心始终位于电子显微镜的主光轴上；
步骤215’，利用高分辨率采集待测样品在零状态下的图像，按照步骤212’相同的方法，以最终确定感兴趣区域的中心坐标值(u,v,w)。
3.如权利要求1或2所述的电子显微镜断层成像方法，其特征在于，步骤22中的(Δu,Δv,Δw)的计算公式为：
式中，α为alphai，φ 为phij，i，j为自然数。
4.如权利要求3所述的电子显微镜断层成像方法，其特征在于，步骤23具体包括：
步骤231，将alpha轴固定在指定范围内的一alpha角度值；
步骤232，驱动phi轴旋转至指定范围内的一phi角度值；
步骤233，控制样品台按照与步骤231和步骤232角度组合(alphai,phij)相对应的偏移量(Δu,Δv,Δw)进行补偿运动；
步骤234，采集步骤233状态下的待测样品的投影；
步骤235，返回步骤231至步骤234，直至所有的角度组合(alphai,phij)状态下的待测样品的投影采集完成。
5.如权利要求4所述的电子显微镜断层成像方法，其特征在于，步骤11 具体包括：
步骤111，在样品台上放置校准用样品，校准用样品由电子透明材料制成，且与待测样品的尺寸相同，在校准用样品的厚度中心布置一层呈放射状分布的纳米级金属细丝，金属细丝交汇于校准用样品的中心；
步骤112，调整样品台的alpha为0，通过校准用样品图像的中心与该校准用样品图像中的校准用样品的中心之间的偏差，校准样品台的中心的中心坐标(u,v)处于(0,0)；
步骤113，调整样品台的alpha为最大，通过校准用样品图像的中心与该校准用样品图像中的校准用样品的中心之间的偏差，校准样品台的中心的中心坐标w处于0。
6.如权利要求5所述的电子显微镜断层成像方法，其特征在于，步骤112和步骤113具体为：
步骤114，采集校准用样品的图像，计算图像的中心与图像中的校准用样品的中心之间的偏差，若存在偏差，进入步骤115，若不存在偏差，则样品台校准完毕；
步骤115，根据步骤114中的偏差，调整偏差，同时利用比步骤114中的分辨率更高的分辨率采集校准用样品的图像，并返回步骤114。
7.一种电子显微镜断层成像***，其特征在于，包括：
多维度载物样品台装置(1)，其包括样品台(11)、三轴平移构件(12)、alpha旋转构件(13)和phi旋转构件(14)，其中：
所述样品台(11)用于放置待测样品，所述三轴平移构件(12)、alpha 旋转构件(13)和phi旋转构件(14)根据主控装置(3)的控制指令驱动所述样品台(11)运动，以使待测样品的感兴趣区域的中心始终位于电子显微镜(1)的主光轴上；
电子显微镜(2)，其用于实时采集待测样品的图像数据；
主控装置(3)，其包括***复位模块(31)、投影及其参数采集模块(32)和重建模块(33)，其中：
所述***复位模块(31)用于通过驱动三轴平移构件(12)、alpha 旋转构件(13)和/或phi旋转构件(14)将所述样品台(11)的中心调整至位于所述电子显微镜(2)的主光轴上以及将置于所述样品台(11)上的待测样品调整为零状态；
投影及其参数采集模块(32)，其包括：
感兴趣区域确定子模块(321)，其用于采集待测样品在零状态下的透射图像，并在该透射图像上选取感兴趣区域的中心在三维坐标系中的坐标值(u,v,w)，该三维坐标系的原点是所述样品台(11)上表面的中心点，(u，v)所在的平面平行所述样品台(11)的上表面，u和v的方向相互垂直，w的方向为所述样品台(11)的法线方向；
偏移量计算子模块(322)，其用于根据所有需要采集的投影参数中的角度组合(alphai,phij)，计算对应每一个角度组合(alphai,phij)下的感兴趣区域的中心(u,v,w)相对于电子显微镜的主光轴的偏移量(Δu,Δv,Δw)；
投影采集子模块(323)，其用于控制所述alpha旋转构件(13)和phi旋转构件(14)按照所述偏移量计算子模块(322)给出的每一个角度组合(alphai,phij)旋转以及控制所述三轴平移构件(12)按照与每一个角度组合(alphai,phij)相对应的偏移量(Δu,Δv,Δw)进行补偿运动，以使感兴趣区域的中心(u,v,w)始终位于所述电子显微镜(2)的主光轴上，同时采集待测样品处于每一个状态(alphai,phij，u,v,w)下的投影；
重建模块(33)，其用于根据所述投影及其参数采集模块(32)采集到的投影及其参数，重建出待测样品的层析图像。
8.如权利要求7所述的电子显微镜断层成像***，其特征在于，所述感兴趣区域确定子模块(321)通过以下方式确定待测样品的感兴趣区域：
对于较薄的待测样品：首先，利用低分辨率采集待测样品在零状态下的图像，该图像经过预处理后得到待测样品的大范围透射图像；然后，在待测样品的大范围透射图像上选取感兴趣区域的中心的坐标值中的u和v，并以待测样品的厚度中心对应的高度作为感兴趣区域的中心的坐标值中的w，以确定感兴趣区域的中心坐标值(u,v,w)；
对于较厚的待测样品：利用低分辨率采集待测样品在零状态下的图像，该图像经过预处理后得到待测样品的大范围透射图像；然后，在待测样品的大范围透射图像上选取感兴趣区域的中心的坐标值中的u和v，并以待测样品的厚度中心对应的高度作为感兴趣区域的中心的坐标值中的w，以初步确定感兴趣区域的中心坐标值(u,v,w)；再利用初步确定的中心坐标(u,v,w)以及一个预设的角度组合(alphai,phij)，计算偏移量(Δu,Δv,Δw)；再者，控制所述alpha旋转构件(13)和phi旋转构件(14)按照每一个角度组合(alphai,phij)旋转以及控制所述三轴平移构件(12)按照与每一个角度(alphai,phij)组合相对应的偏移量(Δu,Δv,Δw)进行补偿运动，以使感兴趣区域的中心始终位于电子显微镜的主光轴上；最后，利用高分辨率采集待测样品在零状态下的图像，在待测样品的大范围透射图像上选取感兴趣区域的中心的坐标值中的u和v，并以待测样品的厚度中心对应的高度作为感兴趣区域的中心的坐标值中的w，以最终确定为最终的感兴趣区域的中心坐标值(u,v,w)。
9.如权利要求8所述的电子显微镜断层成像***，其特征在于，所述投影采集子模块(323)通过以下方式采集待测样品处于每一个状态(alphai,phij，u,v,w)下的投影：
首先，将所述alpha旋转构件(13)固定在指定范围内的一alpha角度值；再驱动所述phi旋转构件(14)旋转至指定范围内的一phi角度值；然后，控制所述三轴平移构件(12)按照角度组合(alphai,phij)相对应的偏移量(Δu,Δv,Δw)进行补偿运动，同步采集当前状态下的待测样品的投影，直至所有的角度组合(alphai,phij)状态下的待测样品的投影采集完成。
10.如权利要求7至9中任一项所述的电子显微镜断层成像***，其特征在于，还包括：
校准用样品(4)，其由电子透明材料制成，且与待测样品的尺寸相同，所述校准用样品(4)的厚度中心布置一层呈放射状分布的纳米级金属细丝，金属细丝交汇于所述校准用样品(4)的中心；
所述样品台(11)和phi旋转构件(14)都由电子透明材料制成。
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