CN106771173B - 抗h9亚型禽流感病毒的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

抗h9亚型禽流感病毒的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗H9亚型禽流感病毒的单克隆抗体，其结合H9亚型禽流感病毒的HA蛋白，并具有血凝抑制活性。本发明还公开了检测H9亚型禽流感病毒抗体的试剂盒及上述单克隆抗体在制备诊断禽流感的产品中的应用。本发明检测H9亚型禽流感病毒抗体的试剂盒，具有良好的特异性和敏感性，适用于大规模不同宿主血清的抗体检测和筛查，在H9亚型禽流感病毒病的诊断及抗体检测方面具有很好的应用前景。

Description

抗H9亚型禽流感病毒的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及免疫化学技术领域，尤其涉及一种抗H9亚型禽流感病毒的单克隆抗体、杂交瘤细胞株、以及应用该单克隆抗体检测H9亚型禽流感病毒特异性抗体的阻断ELISA试剂盒。
背景技术
禽流感(Avian influenza,AI)是由A型流感病毒引起的一种严重危害禽类健康的急性传染病。该病自1878年意大利鸡群首次爆发以来，世界各地都相继有各种亚型禽流感病毒引起AI爆发。其中H9亚型禽流感最早于1966年从美国威斯康辛州的一个火鸡养殖场中被分离到，自20世纪90年代开始其传播越来越广泛，并在亚洲、中东和北非许多国家形成地方流行，给养禽业带来沉重的打击，也造成无法估量的经济损失。在我国，H9N2亚型AIV从1992年开始在部分省区局部流行，1998年以来已在全国大部分地区形成地方流行。H9N2亚型AIV还可以直接感染人，同时还是H5N1/1997、H7N9/2013、H10N8/2013等可以感染并致死人的流感病毒的内部基因的供体。AI的潜伏期从几个小时到几天不等，潜伏期长短与病毒的致病性高低、感染强度、传播途径和感染禽种类有关。AI的临诊症状也因感染禽的种类、年龄、性别、并发感染情况有所感染毒株的毒力和其它环境因素等不同而表现很不一致，可涉及呼吸道、消化道、生殖道及神经***。因此，对鸡群免疫后的效果进行监测对禽流感的防控将有积极的意义，同时也要加强对家禽养殖运输销售相关从业人员的禽流感感染监测工作。
目前，针对病毒检测的分子诊断方法已经建立，本研究室在2013年也建立了病毒检测的荧光定量PCR法(胡涛,滕巧泱,申伟霞,张月娥,李国新,李雪松,闫丽萍,姜秀云,李泽君,H9N2亚型禽流感病毒荧光定量PCR方法的建立及初步应用.中国动物传染病学报,2013.21(2):p.7-13.)。ELISA诊断方法具备高敏感性和特异性、检测方便易行、自动化程度高，而且价格低廉等诸多优点，已成为一种常用的检测方法。针对H9亚型特异抗体的ELISA检测方法，有报道的是以杆状病毒表达的HA1分子蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法，该方法若用于不同宿主来源的血清抗体检测需要不同的二抗试剂才能进行，并且使得结果判定不能统一。阻断ELISA(blockinge ELISA,bELISA)以其特异性更高、不受宿主种类限制的优势在各种病毒疾病诊断和抗体检测领域得到应用。以A型流感病毒NP(nucleoprotein)单抗为基础建立的竞争ELISA方法可以检测不同宿主来源，包括鸭、鹅和野鸟中的流感病毒抗体。目前，还没有特异性检测H9亚型AIV特异性抗体的方法，为了更好地掌握H9亚型AIV在鸡群和人群中的抗体水平，建立一种可以大规模、准确、敏感、安全便捷的抗体检测方法很有必要。
发明内容
本发明要解决目前没有特异性针对H9亚型禽流感病毒的抗体检测方法的技术问题，提供一种抗H9亚型禽流感病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体可用于特异、灵敏地检测H9亚型禽流感病毒。
此外，还需要提供一种应用上述单克隆抗体检测H9亚型禽流感病毒抗体的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种一种抗H9亚型禽流感病毒的单克隆抗体，其结合H9亚型禽流感病毒的HA蛋白，并具有血凝抑制活性。
优选的，所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO.C2015211的杂交瘤细胞株产生。
在本发明的另一方面，还提供了一种产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。优选的，该杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO.C2015211。
在本发明的另一方面，还提供了一种检测H9亚型禽流感病毒抗体的试剂盒，包含上述单克隆抗体。
优选的，本发明试剂盒还包含ELISA酶标板、H9亚型禽流感病毒抗原、酶标二抗、显色液、阳性对照血清、阴性对照血清。
优选的，所述抗原的最佳包被浓度为10ng/孔；所述待测血清的最佳稀释倍数为1:10；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的抗鼠二抗，其最佳稀释倍数为1:5000。
所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
用纯化的H9亚型禽流感病毒抗原包被ELISA酶标板；
将待测血清与包被抗原作用后，依次加入上述单克隆抗体、酶标二抗和显色液；
利用酶标仪读取吸光度值OD450nm,并按公式：抑制率(％)＝(阴性对照的吸光度值-待测血清的吸光度值)/阴性对照的吸光度值×100％，计算待测血清的抑制率，得检测结果。
所述试剂盒检测结果的判定标准为：抑制率≥25.0％为阳性，17.6％≤抑制率<25.0％为可疑,抑制率＜17.6％为阴性。
在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述单克隆抗体的药物组合物。
在本发明的另一方面，还提供了上述单克隆抗体在制备诊断禽流感的产品中的应用。
本发明抗H9亚型禽流感病毒的单克隆抗体，以及应用该单克隆抗体检测H9亚型禽流感病毒抗体的阻断ELISA试剂盒，具有良好的特异性和敏感性，适用于大规模不同宿主血清的抗体检测筛查和监测，在H9亚型禽流感病毒病的诊断及抗体检测方面具有很好的应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1单克隆抗体的免疫荧光鉴定结果图；
图2是本发明实施例2的bELISA检测5份H9N2阳性血清以及H3、H4、H5、H7和H10亚型流感病毒血清、NDV阳性血清、DHV-1阳性血清、DPV阳性血清的结果图；
图3是本发明实施例2的H9N2亚型AIV感染试验鸡后不同时间血清的HI法和bELISA法检测结果比较图。
本发明的抗H9亚型禽流感病毒HA蛋白小鼠杂交瘤细胞株S1B1，已于2015年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址是湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏号为CCTCC NO.C2015211。
具体实施方式
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。
本发明采用纯化的H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)SH441株(A/chicken/Shanghai/441/2009)免疫BALB/c小鼠，利用单克隆抗体制备技术，筛选获得了1株稳定分泌抗SH441株单抗的杂交瘤细胞株，该株单抗经鉴定针对SH441株HA蛋白、且具有HI中和活性，命名为S1B1。用纯化的SH441株灭活病毒包被ELISA板，将待检血清与包被抗原作用后，然后分别加入了S1B1单抗、抗鼠IgG抗体和显色液来测定特异性单抗结合量，建立了检测H9亚型禽流感病毒抗体的阻断ELISA方法(blocking ELISA,bELISA)。经筛选确定，抗原最佳包被浓度为10ng/孔，待测血清最佳稀释倍数为1:10，单抗腹水最佳稀释倍数为1:1000，HRP抗鼠二抗为1:5000。特异性试验表明，该方法仅与H9N2 AIV抗体呈阳性，具有良好的特异性。适用性试验表明，该方法能够检测2003-2010年不同H9N2 AIV分离株的阳性血清，具有对H9N2AIV抗体检测的普遍适用性。与血清抗体检测的标准方法血凝抑制试验(Hemagglutinationinhibition,HI)相比,相关性达96.1％，且所建bELISA方法比HI更敏感，更安全，适用于对不同宿主血清的抗体检测，克服了异源红细胞对HI抗体检测的影响，在大规模不同宿主血清筛查监测中具有优势。
实施例1 H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)SH441株单克隆抗体的制备及鉴定
1.材料和方法
1.1病毒、细胞与试验动物
H9N2亚型禽流感病毒SH441株(A/chicken/Shanghai/441/2009)由本实验室分离并保存；MDCK细胞、293T细胞和SP2/0细胞为本实验室保存；SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验技术有限公司；清洁级BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；所用4-5周龄试验鸡由SPF鸡胚孵化饲养于负压隔离器中。pCAGGS-H9-HA重组真核质粒为本实验室构建并保存。
1.2主要材料和试验用血清
DMEM，Opti-MEM培养基购自GBICO公司；8-氮鸟嘌呤、PEG1450、HAT、HT、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、β-丙内酯(β-propiolactone，BPL)溶液购自Sigma公司；FITC标记羊抗鼠IgG和HRP标记羊抗鼠IgG购自Jackson ImmunoResearch公司；ISA70VG佐剂购自发国SEPPIC公司。H9N2 AIV阳性和阴性血清、其他H9病毒分离株，以及H3、H4、H5、H7和H10亚型流感病毒血清、新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)、I型鸭肝炎病毒(typeⅠduckhepatitis virus，DHV-1)、鸭瘟病毒(duck plague virus，DPV)阳性血清均为本实验室保存。
1.3 SH441株抗原的制备
将种毒SH441以104TCID50的剂量感染SPF鸡胚，72h收集含有病毒的尿囊液，0.05％BPL在4度灭活12h，经蔗糖密度梯度离心纯化病毒，测定蛋白浓度，分装于-70℃保存，用作免疫抗原和包被抗原。
1.4 SH441株单克隆抗体的制备及其鉴定
1.4.1小鼠免疫
用纯化的SH441株抗原加入等量弗氏完全佐剂乳化后，经腹部和背部皮下注射6-8周龄雌性BALB/c小鼠，每只50μg；用纯化的SH441株抗原加入等量弗氏不完全佐剂乳化后，每隔两周分别进行第二次和第三次免疫，剂量与首免相同；三免两周后进行加强免疫，静脉注射25μg纯化抗原后第三天开始细胞融合。
1.4.2阳性杂交瘤细胞株的建立
按常规方法制备小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养层细胞，脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)按10:1的比例在融合剂PEG1450作用下融合，按有限稀释法进行克隆，经间接ELISA和HI法筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞。
结果：利用淋巴细胞杂交瘤技术，通过间接ELISA和HI法检测杂交瘤细胞上清，共获得一株能够稳定分泌抗H9亚型禽流感病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并将该细胞株命名为抗H9亚型禽流感病毒HA蛋白小鼠杂交瘤细胞株S1B1，该杂交瘤细胞株已于2015年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址是湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏号为CCTCC NO.C2015211。
1.4.3单克隆抗体腹水的制备
将0.5mL灭菌的石蜡油注射小鼠腹腔，一周后再注入106个杂交瘤细胞，7-10天后，小鼠腹部的腹水极度膨胀时抽取腹水，分装备用。
1.4.4单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定(IFA)
将MDCK细胞培养于6孔培养板，待细胞长成单层后，用SH441株感染MDCK細胞，同时设阴性对照孔。感染24h后，弃上清，细胞用4％的多聚甲醛固定，经PBST洗涤三次，加入杂交瘤细胞培养上清，37℃孵育1小时，PBST洗涤三次，加入FITC-羊抗鼠IgG抗体，继续37℃孵育1小时，PBST洗涤三次，最后在荧光下显微镜下观察，凡有绿色荧光者判为阳性；无荧光者判为阴性。
结果：用SH441感染MDCK细胞，用S1B1单抗进行间接免疫荧光试验，设未感染MDCK细胞为空白对照。呈现特异绿色荧光信号的为阳性，无绿色荧光信号的为阴性。试验结果显示：S1B1单抗可产生特异性的绿色荧光(见图1)，图1中，A为S1B1单抗，B为空白对照。
1.4.5抗H9N2 AIV(SH441株)HA蛋白单克隆抗体的鉴定
将293T培养于6孔培养板，待细胞长成单层后，将重组真核表达质粒pCAGGS-H9-HA转染293T细胞，同时设阴性对照孔。转染24h后，弃上清，细胞用4％的多聚甲醛固定，经PBST洗涤一次，加入杂交瘤细胞培养上清，37℃孵育1小时，PBST洗涤三次，加入FITC-羊抗鼠IgG抗体，继续37℃孵育1小时，PBST洗涤三次，最后在荧光显微镜下观察，凡有特异的绿色荧光者判为阳性；无荧光者判为阴性。
结果：经pCAGGS-H9-HA真核质粒转染的293T细胞的IFA检测，对照转染空pCAGGs质粒的293T细胞没有特异的荧光，S1B1单抗出现特异的绿色荧光，结果见图1C&D，进而确认S1B1单抗为抗H9N2 AIV HA蛋白的单抗。图1中，C为pCAGGS-HA转染的293T细胞，D为pCAGGs转染的293T细胞。
实施例2 H9N2 AIV抗体阻断ELISA方法(blocking ELISA,bELISA)的建立
1.H9N2 AIV抗体阻断ELISA操作方法
⑴用PH9.6的碳酸盐缓冲液包被纯化的SH441株灭活病毒抗原，每孔100ng/孔,4℃过夜。次日取出后，用0.05％Tween-20PBS(PBST)洗涤三次，每次3min；
⑵用5％脱脂乳的PBS封闭酶标板，37℃2h，洗涤3次，方法同上；
⑶加入抗体稀释液稀释10倍的待测血清、阴性和阳性对照，每孔100μL 37℃孵育1小时，洗涤方法同上；
⑷每孔100μL S1B1单克隆抗体腹水(1000×)，37℃孵育1小时，洗涤3次；
⑸每孔加入抗体稀释液稀释到的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的羊抗鼠二抗(5000×)100微升，37℃1小时，洗涤3次；
⑹每孔加入TMB(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)底物显色液100微升，室温避光显色10分钟；
⑺每孔加入2M H2SO4 50uL终止反应，酶标仪读取吸光度值OD450nm,计算抑制率，抑制率(％)＝(阴性对照的吸光度值-待测样本的吸光度值)/阴性对照的吸光度值×100％。
2.临界值的确定
对58份鸭阴性血清和58份鸡阴性血清进行bELISA检测，对所得的检测结果进行统计学分析，计算阴性样本的平均抑制率和标准偏差(SD)。根据公式：临界值＝阴性样本的平均抑制率+2或3×标准偏差(SD)，分别计算其临界值。
结果：利用bELISA方法共检测116份阴性血清的平均抑制率为2.8％，标准偏差为7.4％。根据公式：阳性临界值＝阴性样本的平均抑制率+3×标准偏差，阳性样品临界值为25.0％，即当样品的抑制率(Percent inhibition value,PI value)≥25.0％时，该血清为阳性；阴性临界值＝阴性样本的平均抑制率+2×标准偏差，阴性样品临界值为17.6％，即当样品的抑制率PI＜17.6％时，该血清为阴性；当17.6≤PI＜25.0％时，该血清为可疑，需重复检测一次，若仍低于25.0％，则判定为阴性，否则判为阳性。
3.适用性和特异性试验
用建立的B-ELISA方法分别检测H9N2亚型AIV 2003-2010年的26个分离株免疫鸡血清，这些分离株的HA序列显示具有不同的进化分支，来确定该bELISA方法的适用性。用本发明试剂盒来检测H3、H4、H5、H7和H10亚型流感病毒血清、NDV阳性血清、DHV-1阳性血清、DPV阳性血清，验证本发明试剂盒对其它病毒的阳性血清的交叉反应性，来确定该bELISA方法的特异性。
结果显示：bELISA检测后，只有H9N2亚型AIV阳性血清呈阳性，PI在77.9％-85.3％，所有样品用HI法进行平行检测，结果见表1；其他病毒血清均为阴性(见图2)。说明该方法适用于不同进化分支的H9亚型禽流感病毒特异抗体的检测，且不与其他亚型流感病毒及禽常见的其他病毒性疾病具有交叉反应，特异性良好。
表1 26株H9亚型禽流感病毒血清的HI法和bELISA法检测结果
4.敏感性和相关性试验
用SH441株病毒静脉感染4周龄负压隔离饲养的SPF鸡后，不同时间(0h，12h，24h，48h，72h，96h)采集动物血清，分别用建立的bELISA方法和血清抗体检测的标准方法血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition,HI)进行检测，以比较两者的敏感性和相关性。
结果：见图3，0h-24h两种方法均显示血清抗体为阴性，48h后两种方法均显示抗体水平为阳性，两者的相关系数为96.1％。
5.重复性试验
⑴批内重复试验：用同一批次包被的酶标板检测不同的样本，一份阳性样本，一份阴性样本，每份样本重复6孔，进行bELISA检测，计算出同一样本PI值的变异系数，以检验批内检测样品的重复性；
⑵批间重复性试验：用不同批次包被的酶标板6块重复检测1份阳性样本和1份阴性样本，进行bELISA检测，计算同一份样本PI值的变异系数，以检验批间检测样本的重复性。
结果：对同一批次和不同批次的bELISA进行批内和批间重复试验，其PI值经统计学分析，变异系数均小于10％，说明本发明试剂盒重复性良好(见表2和表3)。
表2批内重复性试验
实施例3检测H9亚型禽流感病毒特异性抗体的阻断ELISA(B-ELISA)试剂盒的组成和应用
1、试剂盒的组成
按表4所列的试剂盒内容，装配成试剂盒，组装后置于相应条件保存。
表4 H9亚型禽流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒内容
编号 内容 数量 备注
1 待包被可拆卸酶标板 1块 8×12规格，4℃保存
2 包被抗原 一管 100μL/管，-20℃保存
3 包被缓冲液(1×) 一瓶 10mL/瓶，4℃保存
4 封闭液 一瓶 20mL/瓶，4℃保存
5 阳性对照血清 1管 50μL/管，-20℃保存
6 阴性对照血清 1管 50μL/管，-20℃保存
7 单克隆抗体 1管 100μL/管，-20℃保存
8 HRP-抗鼠IgG(5000×) 1管 5微升/管，-20℃保存
9 抗体稀释液(1×) 1瓶 10mL/管，4℃保存
10 TMB显色液 1瓶 10mL/瓶，4℃保存
11 终止液 1瓶 10mL/瓶，4℃保存
12 PBS-T洗涤液(10×) 1瓶 50mL/瓶，4℃保存
13 试剂盒说明书 1份
2、本发明试剂盒的使用方法：
1)使用步骤
A包被：于检测前一天用包被抗原包被待包被可拆卸酶标板，即将上述试剂的包被抗原置于包被液中混匀，每孔100微升，4℃过夜，次日取出后，用1×PBS-T洗涤液三次，每次3min；
B封闭：封闭液200微升/孔，37℃1h，1×洗涤液洗涤3次，每次3min；
C将待测血清、阴性及阳性对照血清用抗体稀释液稀释10倍备用，每孔100微升加入酶标板中，37℃孵育1小时。1×洗涤液洗涤3次，每次3min，方法同上；
D将单克隆抗体用抗体稀释液稀释20×，每孔100μL单抗，37℃孵育1h，洗涤3次；
E每孔加入用抗体稀释液稀释到1×的HRP-抗鼠IgG 100μL，37℃1h，洗涤3次；
F每孔加入TMB底物显色液100μL，室温避光显色10min；
G每孔加入终止液50uL，酶标仪读取吸光度值OD450nm,计算抑制率，抑制率(％)＝(阴性对照的吸光度值-待测血清的吸光度值)/阴性对照的吸光度值×100％。
2)检测结果的判定及分析
当阳性血清的抑制率大于50％，表明实验结果可信，根据以下标准判定：
当血清样本的抑制率值大于等于25.0％时，该样本判定为H9亚型禽流感病毒抗体阳性；
当血清样本的抑制率值小于17.6％时，该样本判定为H9亚型禽流感病毒抗体阴性；
当血清样本的抑制率值介于二者之间时，判定可疑，重新检测可疑样本，若抑制率仍低于25.0％，则判定为阴性，否则判为阳性。
3、本发明试剂盒的应用
用建立的bELISA方法测定鸭和鸡免疫H9N2灭活疫苗之后的免疫抗体产生情况，鸭和鸡各22只，检测了免疫后1w，2w，3w，5w，7w，9w，11w，13w，15w，17w，19w，21w，23w，25w和27w的共计660份血清样品，同时用HI试验平行检测上述样本。
结果显示，本发明bELISA检测试剂盒可以更快速便捷地检测大量不同宿主来源的血清样品，与HI试验相比，不需要使用活病毒，不受异源红细胞影响检测结果，且可以减少检测血清的用量。对于免疫后不同时间点的330份鸭血清和330份鸡血清进行检测，检测结果显示bELISA与HI实验的符合率达100％(见表5)。
表5 H9N2灭活疫苗免疫后鸭和鸡血清的抗体检测结果
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种抗H9亚型禽流感病毒的单克隆抗体，其结合H9亚型禽流感病毒的HA蛋白，并具有血凝抑制活性，所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO.C2015211的杂交瘤细胞株产生。
2.一种产生权利要求1所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO.C2015211。
3.一种检测H9亚型禽流感病毒抗体的试剂盒，包含权利要求1所述的单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包含ELISA酶标板、H9亚型禽流感病毒抗原、酶标二抗、显色液、阳性对照血清、阴性对照血清。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
用纯化的H9亚型禽流感病毒抗原包被ELISA酶标板；
将待测血清与包被抗原作用后，依次加入权利要求1所述的单克隆抗体、酶标二抗和显色液；
利用酶标仪读取吸光度值OD450nm,并按公式：抑制率(％)＝(阴性对照的吸光度值-待测血清的吸光度值)/阴性对照的吸光度值×100％，计算待测血清的抑制率，得检测结果。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测结果的判定标准为：抑制率≥25.0％为阳性，17.6％≤抑制率<25.0％为可疑，抑制率＜17.6％为阴性。
7.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的单克隆抗体。
8.权利要求1所述单克隆抗体在制备诊断禽流感的产品中的应用。
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