CN106755397A - 基因多态性位点的用途和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了ICOS基因多态性位点rs1559931的用途及其检测引物与试剂盒。实验证明,根据多态性位点rs1559931基因型能够分析晚期结直肠癌化疗疗效:基因型为GG时,预测晚期结直肠癌患者的化疗效果好,基因型为GA时化疗效果差,本发明提供了检测ICOS基因多态性位点rs1559931的引物组和试剂盒,以及检测方法,能够准确的测定多态性位点rs1559931,能对晚期结直肠癌化疗效果进行分析,分析结果与预期相符。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,涉及基因多态性位点的用途和试剂盒,尤其涉及ICOS基因多态性位点rs1559931的用途及其检测引物与试剂盒。
背景技术
结直肠癌(CRC)是最常见的恶性肿瘤之一。在世界范围内,CRC在男性和女性中的发病率分别处于恶性肿瘤发病率的第三位和第四位,死亡率分别位居第四位和第五位。近年来,我国CRC发病率呈明显上升趋势,在沿海发达地区及大中城市尤为明显。据统计,我国年均新发CRC病例达13万,约占全身肿瘤的12%~15%,并以年均4%增幅不断攀升。由于其发展迅速、恶性程度高、治疗困难,CRC越来越受到医学界特别是国内医学界的重视,使其成为基础研究和临床研究的重大课题。
由于CRC早期诊断率低,约60%的初发术后或复发转移患者需接受***化疗。目前临床用于治疗CRC的一线化疗药物有5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨、奥沙利铂等。然而,这些药物由于生物利用度个体差异很大,导致其疗效存在明显的个体差异,即使是联合使用其总体有效率也仅为30~40%
药物疗效的个体差异一直是临床常见的现象,也是临床医师关注的问题之一。癌症患者接受化疗时表现出的这种差异尤为明显,不同患者接受相同剂量强度的化疗药物后可能产生不同的反应,从有效到无效,甚至产生严重不良反应。药物发挥生物活性必须先进入靶细胞,而表达在靶细胞上的转运体对药物的转运直接关系到药物能否有效进入靶细胞,达到有效浓度。肠道作为口服药物最重要的吸收器官,分布着大量的药物转运体。这些转运体的诱导或抑制都将严重影响药物的疗效。
业已证实,作为人类最常见的一种基因变异,SNP在药物反应个体差异中起着极其重要的作用,是决定药物敏感性的主要因素之一,其与药物敏感性之间的关系及其功能意义也逐渐被人们所认识。随着研究的不断深入,越来越多的研究发现,位于基因3′非编码区(3′-UTR)内存在的基因多态性(SNP)能够通过影响蛋白表达调控的关键因子microRNA(miRNA)的调控,从而影响蛋白表达水平。
ICOS定位于人类染色体2q33,由199个氨基酸组成。ICOS基因多态性位点rs1559931是位于ICOS基因3’-UTR上的SNP位点,目前,尚无研究表明,ICOS基因的多态性位点rs1559931与化疗药物的疗效相关。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供ICOS基因多态性位点rs1559931的用途及其检测引物与试剂盒,本发明提供的引物具有良好的特异性,能够实现对ICOS基因多态性位点rs1559931的准确检测,从而实现对晚期结直肠癌化疗疗效的准确预测。
本发明涉及一种基因多态性位点的用途,其特征在于:
ICOS基因多态性位点rs1559931在制备分析晚期结直肠癌化疗疗效的产品中的应用。
本发明涉及一种基因多态性位点的用途,其特征在于:
ICOS基因多态性位点rs1559931在制备分析基因型为GG的晚期结直肠癌化疗疗效的产品中的应用。
ICOS基因多态性位点rs1559931在制备分析基因型为GA的晚期结直肠癌化疗疗效的产品中的应用。
本发明涉及一种基因多态性位点的用途,其特征在于:
所述化疗的药物为奥沙利铂。
本发明涉及一种基因多态性位点的用途,其特征在于,
扩增ICOS基因多态性位点rs1559931的引物组,包括SEQ ID NO:1~3所示核苷酸序列的引物。
本发明涉及一种基因多态性位点的用途,其特征在于:一种扩增ICOS基因多态性位点rs1559931的试剂盒,
包括:扩增ICOS基因多态性位点rs1559931的引物组,包括SEQ ID NO:1~3所示核苷酸序列的引物。
用于扩增rs1559931多态性位点的引物为SEQ ID No.1~2,
SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、
SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物;
用于单碱基延伸的引物为SEQ ID No.3,
SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的单碱基延伸引物,
SEQ ID No.1~3核苷酸序列分别为:
SEQ ID No.1:5'-ACGTTGGATGGATTTGGCTAGAAAGATTC-3';
SEQ ID No.2:5'-ACGTTGGATGCATGCAGACAGGAAGTAGAG-3';
SEQ ID No.3:5'-CTTGGCTAGAAAGATTCTTAAATAT-3'。
本发明涉及一种基因多态性位点的用途,其特征在于:
一种检测ICOS基因多态性位点rs1559931基因型的方法,包括以下步骤:
步骤1:以待测样品的基因组DNA为模板,以SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物进行PCR扩增,获得扩增产物;
步骤2:所述扩增产物经纯化后,以SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的单碱基延伸引物进行延伸,获得延伸产物;
步骤3:所述延伸产物经纯化后,以MALDI/TOF/MS测定ICOS基因多态性位点rs1559931的基因型。
本发明提供了ICOS基因多态性位点rs1559931在制备预测晚期结直肠癌化疗疗效的产品中的应用。
在本发明的实施例中,化疗的药物为奥沙利铂。
所述的疗效是指晚期结直肠癌患者经化疗后临床症状是否缓解,根据化疗后CT结果及肿瘤标志物联合评价化疗结果。化疗疗效评价根据RECIST疗效标准评价:
完全缓解(complete remission,CR):所有目标病灶消失,至少维持4周;
部分缓解(partial remission,PR):基线病灶最大径之和至少减少30%,至少维持4周;
病情稳定(steady disease,SD):基线病灶最大径之和减少不足30%或增大不足20%;
病情进展(progress disease,PD):基线病灶最大径之和至少增加20%或出现新病灶。
化疗有效包括CR和PR,化疗无效为SD和PD。
ICOS基因多态性位点rs1559931存在3种基因型,分别为GG、GA、AA,本发明对113例晚期结直肠癌病人进行调查,当完成4个月的治疗后,其中,44例患者疗效好,69例患者疗效差。对113例晚期结直肠癌患者的ICOS基因多态性位点rs1559931基因型分析显示其分布符合Hardy-Weinburg平衡。经回归分析发现,多态性位点rs1559931基因型均与晚期结直肠癌化疗疗效显著相关,根据多态性位点rs1559931基因型能够分析或预测晚期结直肠癌化疗疗效:基因型为GG时,预测晚期结直肠癌患者的化疗效果好,基因型为GA时化疗效果差。
通常,用于检测基因多态性位点的方法有单碱基延伸-MALDI/TOF/MS法、DNA测序法、限制性片段长度多态性分析法、等位基因特异性扩增法、四引物扩增法等。这些方法的灵敏性和准确性皆基于引物的特异性,本发明提供的引物能够具有良好的特异性,能够实现对ICOS基因多态性位点rs1559931的准确检测。其检测样品为全血的基因组DNA。
该试剂盒可通过单碱基延伸-MALDI/TOF/MS法对多态性位点rs1559931进行检测。
该试剂盒中还包括:PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP和Taq DNA聚合酶。
该试剂盒中还包括:SAP酶。
该试剂盒中还包括:IPLEX反应液。
本发明提供了一种检测ICOS基因多态性位点rs1559931基因型的方法,该方法通过单碱基延伸-MALDI/TOF/MS法对ICOS基因多态性位点rs1559931基因型进行检测,具体包括以下步骤:
步骤1:以待测样品的基因组DNA为模板,以SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物进行PCR扩增,获得扩增产物;
步骤2:扩增产物经纯化后,以SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的单碱基延伸引物进行延伸,获得延伸产物;
步骤3:延伸产物经纯化后,以MALDI/TOF/MS测定ICOS基因多态性位点rs1559931的基因型。
本发明通过实验证明,根据多态性位点rs1559931基因型能够分析或预测预测晚期结直肠癌化疗疗效:基因型为GG时,预测晚期结直肠癌患者的化疗效果好,基因型为GA时化疗效果差。故而,本发明提供了ICOS基因多态性位点rs1559931在制备预测晚期结直肠癌化疗疗效的产品中的应用,且提供了检测ICOS基因多态性位点rs1559931的引物组和试剂盒,以及检测方法。实验表明,采用本发明提供的试剂盒和方法能够准确的测定多态性位点rs1559931,并能对结直肠癌以奥沙利铂的化疗效果进行预测,预测结果与预期相符。
附图说明
图1:rs1559931-C164-A的质谱图
图2:rs1559931-C164-G的质谱图
图3:rs1559931-C75-AG的质谱图
具体实施方式
本发明提供了涉及rs1559931多态性位点的用途及其试剂盒,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明采用的仪器或试剂皆为普通市售品,皆可于市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1:
基于单碱基延伸-MALDI/TOF/MS法测定ICOS基因多态性位点rs1559931基因型的分析或预测晚期结直肠癌患者化疗疗效的试剂盒和方法。
一、试剂盒的组成成分:
1、检测ICOS基因多态性位点rs1559931基因型的引物;
扩增多态性位点的引物:
SEQ ID No.1:5'-ACGTTGGATGGATTTGGCTAGAAAGATTC-3'
SEQ ID No.2:5'-ACGTTGGATGCATGCAGACAGGAAGTAGAG-3'
单碱基延伸多态性位点的引物:
SEQ ID No.3:5'-CTTGGCTAGAAAGATTCTTAAATAT-3'
2、PCR扩增酶及相应缓冲液;
3、dNTP;
4、PCR产物纯化酶;
5、单碱基延伸反应酶及相应缓冲液;
6、单碱基延伸产物纯化酶。
二、基因型检测及疗效预测:
1、采集标本:
从患者外周静脉抽取全血1ml,放置于0.5M EDTA抗凝管中。
2、提取基因组DNA:
使用基因组DNA抽提试剂盒,按照说明书步骤提取DNA。
3、基因型检测:
(1)取1μl DNA样本,采用1%琼脂糖凝胶电泳对样本进行质量检查。
(2)取1μl检查合格的DNA样本,采用NanoDrop2000测定其浓度。
(3)根据DNA样本浓度,将其稀释至100~500ng/μl的工作浓度。
(4)PCR扩增反应:
扩增ICOS基因多态性位点rs1559931基因型的引物:
SEQ ID No.1:5'-ACGTTGGATGGATTTGGCTAGAAAGATTC-3'
SEQ ID No.2:5'-ACGTTGGATGCATGCAGACAGGAAGTAGAG-3'
PCR反应体系:
反应体系包含1μl DNA样本、1×PCR缓冲液、2.5mM MgCl2、引物SEQID No.1和SEQID No.2各0.4μM、0.2mM dNTPs和1U Taq DNA聚合酶。
PCR循环程序:
94℃预变性5min;然后以94℃变性10s,55℃退火30s,72℃延伸30s,循环35次;最后72℃延伸7min使反应完全;16℃保存。
(5)延伸产物纯化:
加0.5U SAP酶至2μl PCR延伸产物中,37℃温浴40min;85℃5min使酶灭活。
(6)单碱基延伸反应:
单碱基延伸多态性位点的引物:
SEQ ID No.3:5'-CTTGGCTAGAAAGATTCTTAAATAT-3'
延伸反应条件:
10μl延伸反应体系中包括2μl纯化后的PCR产物、0.5μl IPLEX反应液、1μl延伸引物和超纯水6.5μl。
延伸反应程序:
94℃预变性30s;然后以94℃变性5s,52℃退火5s,80℃延伸5s,循环40次;最后72℃延伸3min;12℃保存。
(7)延伸产物纯化
加1U SAP酶至10μl PCR延伸产物中,37℃温浴60min;75℃15min使酶灭活。
(8)MALDI/TOF/MS仪测定延伸产物的质谱图
MALDI/TOF/MS的参数,工艺的具体方法:
一、检测原理和方法
我们使用美国西昆诺姆公司(Sequenom,Inc.)的MassARRAY实验平台为乙方提供SNP分型检测服务,该平台主要是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)的核心技术。MALDI-TOF MS技术的主要特点是,先通过PCR扩增目标序列,然后加入SNP序列特异延伸引物,在SNP位点上,延伸1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶,将该晶体放入质谱仪的真空管,而后用瞬时纳秒(10-9s)强激光激发,由于基质分子经辐射所吸收的能量,导致能量蓄积并迅速产热,从而使基质晶体升华,核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子,产生的离子多为单电荷离子,这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能,进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离,在真空小管中飞行到达检测器。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight,TOF)检测器来检测,离子质量越小,就越快到达。理论上讲,只要飞行管的长度足够,TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的。MASSARRAY SNP检测的质谱范围为5000to 8500Dalton。
二、主要设备:
质谱检测仪(MassARRAY Analyzer Compact),点样仪(MassARRAY SamsungNanodispenser),384孔双头PCR仪(PCR System 9700 Dual 384-Well SampleBlock Module)。
三、主要试剂:
iPLEX反应试剂、384-well SpectroCHIP生物芯片、HOTSTART taq酶、SAP酶、纯化琼脂等。
四、实验步骤
1.实验设计及引物合成:
合成之后进行引物质量的检测及引物反应浓度调整。
2.实验流程:
1)PCR扩增:
PCR反应体系:5ul(4ul mix+1ul DNA)
*MgCl2终浓度为4.0mM,2.0mM来自PCR Buffer,2.0mM来自另加的MgCl2
**冻融不超过5次
***反应重数>27时,酶量增加到1U/反应
2)SAP酶处理,降解扩增用的dNTP,以确保延伸反应只延伸一个碱基。
配制SAP反应液,在PCR扩增后的384孔板中加入SAP反应液,降解dNTP。
SAP程序:37℃,40min
85℃,5min
12℃,forever
3)延伸引物单碱基延伸反应
配制iPlex反应体系,加入到SAP处理后的384孔板中,进行单碱基延伸反应。
*根据引物分子量调整引物浓度
4)树脂除盐纯化
a)取6mg树脂在384孔树脂刮板上,均匀覆盖,刮去多余的树脂,放置15min。
b)将反应结束的384孔板4000rpm离心30s,每孔加入16μL去离子水,倒置在树脂板上面,然后反置将树脂板扣在384孔板上,敲击使树脂落入384孔板,封膜。
c)以384孔板的长轴为轴心,翻转384孔板60min,3200rpm,5min离心后备用。
5)Nanodispenser SpectroCHIP芯片点样
将检测样品从384孔反应板转移到表面覆盖基质的MassARRAY SpectroCHIP芯片。
6)MassARRAY Analyzer Compac质谱检测
将样品转移到SpectroCHIP芯片后,即可放入质谱仪进行检测,每个检测点只需3-5秒,全自动分析。
7)TYPER4.0软件分析实验结果,获得分型数据
五、实验数据质量控制
为保证实验数据的可靠性及科学性,我们采用如下质控方案
1.阴性对照
实验时按样品数的1%加入阴性对照,即以水代替样品DNA模板,以监控实验中的扩增产物污染及交叉污染的情况。当阴性对照中该位点没有出现假阳性反应时,判定该位点通过该质控检测。
2.室内质控标准品对照
当所检测的SNP位点为人的SNP位点时我们会按照样品数的1%加入室内质控标准品对照。该室内指控标准品对照选用深圳华大基因研究院培育的“炎黄一号”细胞株DNA做为模板,该DNA样品的每个SNP位点的确切数据都可以在炎黄数据库中查询,因此可作为室内质控标准品质控,以检测每个SNP位点的引物设计的可靠度。当室内质控标准品对照中某位点数据与炎黄数据库该位点数据相同时,判定该位点通过该质控检测。
3.样本重复实验复核
实验时按样品数的5%随机选取乙方样品做为重复实验复核,以验证实验的重复性及稳定性。当某一位点的合格样品数据符合度达98%以上时,判定该位点通过该质控检测。
(9)基因型判断
根据质谱图中A峰和G峰判断ICOS基因多态性位点rs1559931的基因型。在质谱图中,如果横坐标7950出现A峰则为AA型(见图1),如果横坐标7968出现G峰则为GG型(见图2),如果两者均出现则为GA型(见图3)。
实施例2
采用实施例1提供的方法,对113例晚期结直肠癌病人的血液样品进行检测,获得病人ICOS基因多态性位点rs1559931的基因型。并对这些患者进行为期4个月的化疗,化疗药物分别为奥沙利铂。根据多态性位点rs1559931基因型能够预测晚期结直肠癌化疗疗效:基因型为GG的人数为89人,预测晚期结直肠癌患者的化疗效果好;基因型为GA的人数为23人,预测化疗效果差,结果见表1。
表1:非条件Logistic回归模型分析rs1559931基因型与晚期结直肠癌患者化疗疗效的相关性
结果显示,采用实施例1提供的方法对患者基因型的检测结果完全一致,根据化疗后CT结果及肿瘤标志物联合评价化疗结果。化疗疗效评价根据RECIST疗效标准评价:完全缓解(complete remission,CR):所有目标病灶消失,至少维持4周;部分缓解(partialremission,PR):基线病灶最大径之和至少减少30%,至少维持4周;病情稳定(steadydisease,SD):基线病灶最大径之和减少不足30%或增大不足20%;病情进展(progressdisease,PD):基线病灶最大径之和至少增加20%或出现新病灶。化疗有效包括CR和PR,化疗无效为SD和PD。
有效率=该基因型化疗有效人数/该基因型总人数×100%
结果显示,ICOS基因多态性位点rs1559931基因型分析显示其分布符合Hardy-Weinburg平衡,经回归分析发现,多态性位点rs1559931基因型均与结直肠癌化疗疗效显著相关,基因型为GA的患者疗效有效率较低,而基因型为GG的患者疗效有效率较高。该预期疗效与实际结果相符。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省肿瘤医院
<120> 基因多态性位点的用途和试剂盒
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgttggatg gatttggcta gaaagattc 29
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acgttggatg catgcagaca ggaagtagag 30
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cttggctaga aagattctta aatat 25
Claims (7)
1.一种基因多态性位点的用途,其特征在于:
ICOS基因多态性位点rs1559931在制备分析晚期结直肠癌化疗疗效的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的一种基因多态性位点的用途,其特征在于:
ICOS基因多态性位点rs1559931在制备分析基因型为GG的晚期结直肠癌化疗疗效的产品中的应用。
3.根据权利要求1所述的一种基因多态性位点的用途,其特征在于:
ICOS基因多态性位点rs1559931在制备分析基因型为GA的晚期结直肠癌化疗疗效的产品中的应用。
4.根据权利要求1所述的一种基因多态性位点的用途,其特征在于:
所述化疗的药物为奥沙利铂。
5.根据权利要求1所述的一种基因多态性位点的用途,其特征在于,
扩增ICOS基因多态性位点rs1559931的引物组,包括SEQ ID NO:1~3所示核苷酸序列的引物。
6.根据权利要求1所述的一种基因多态性位点的用途,其特征在于:
一种扩增ICOS基因多态性位点rs1559931的试剂盒,包括:
SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、
SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物和
SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的单碱基延伸引物。
7.根据权利要求1所述的一种基因多态性位点的用途,其特征在于:
一种检测ICOS基因多态性位点rs1559931基因型的方法,包括以下步骤:
步骤1:以待测样品的基因组DNA为模板,以SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物进行PCR扩增,获得扩增产物;
步骤2:所述扩增产物经纯化后,以SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的单碱基延伸引物进行延伸,获得延伸产物;
步骤3:所述延伸产物经纯化后,以MALDI/TOF/MS测定ICOS基因多态性位点rs1559931的基因型。
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104159917A (zh) * | 2012-02-22 | 2014-11-19 | 宾夕法尼亚大学董事会 | 使用icos基cars增强抗肿瘤活性和car持久性 |
WO2015066551A3 (en) * | 2013-10-31 | 2015-06-25 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Modified hematopoietic stem/progenitor and non-t effector cells, and uses thereof |
CN105255869A (zh) * | 2015-10-29 | 2016-01-20 | 苏州大学 | ABCC4基因多态性位点rs3742106的用途及其检测引物与试剂盒 |
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2016
- 2016-12-20 CN CN201611182281.2A patent/CN106755397A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN104159917A (zh) * | 2012-02-22 | 2014-11-19 | 宾夕法尼亚大学董事会 | 使用icos基cars增强抗肿瘤活性和car持久性 |
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Title |
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马军等主编: "《中国临床肿瘤学教育专辑》", 30 October 2009, 中国协和医科大学出版社 * |
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