CN106754655B - 一种动物胚胎培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种高效的动物胚胎培养基，其组成如下：氯化钠，氯化钾，氯化钙，磷酸二氢钾，硫酸镁，碳酸氢钠，β‑巯基乙醇，转铁蛋白，葡萄糖，乳酸钠，乳酸钙，丙酮酸钠，乙二胺四乙酸钠，谷氨酰胺，牛血清白蛋白，胎牛血清，HEPES，NEAA(100×)，小分子物质。本发明动物胚胎培养基用于注射后培养较现有技术的培养基，大幅提高了100％ES来源小鼠的产率，使得用囊胚前胚胎ES注射法完全取代传统的囊胚ES注射法成为可能。

Description

一种动物胚胎培养基
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及生物基因技术领域，具体涉及一种一种动物胚胎培养基。
背景技术
ES基因打靶是通过同源重组将外源基因定点整合入ES细胞基因组上某一确定的位点，从而实现定点修饰改造染色体上某一基因的技术。将基因打靶后的ES细胞用显微注射的办法导入胚胎中就可以生产出基因修饰小鼠。
ES基因打靶技术制备基因修饰小鼠可以分为ES基因打靶和ES胚胎显微注射获取基因修饰小鼠(以下简称ES显微注射)两个阶段。在这过程中，需要进行胚胎体外培养，在ES细胞注射入胚胎后还会有一段时间的ES和胚胎共培养，直到外源ES细胞完全融入或取代内细胞团。但现有的胚胎培养基均是单纯针对胚胎培养设计的，不利于共培养阶段ES细胞的发育，进而导致传统ES细胞胚胎显微注射很难获得100％ES来源的小鼠。。
因此，亟需一种可以同时满足胚胎和ES细胞发育条件的新型胚胎培养基。
发明内容
本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种高效的动物胚胎培养基。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种动物胚胎培养基，其组成如下：
Figure BDA0001196485850000011
Figure BDA0001196485850000021
；其中NEAA(100×)的成分为：
成分 浓度(g/100mL)
脯氨酸 0.01-0.1
丙氨酸 0.01-0.1
丝氨酸 0.01-0.1
甘氨酸 0.01-0.1
天冬酰胺 0.05-0.5
天冬氨酸 0.05-0.5
谷氨酸 0.05-0.5
；其中，所述小分子物质为C、H、F、N、O、S类化学成分组成的氨基芳香烃类，其范围在C(11-25)H(9-30)F(2-8)N(1-10)O(2-8)S(1-5)。
优选地，所述动物胚胎培养基组成如下：
Figure BDA0001196485850000022
Figure BDA0001196485850000031
；其中NEAA(100×)的成分为：
成分 浓度(g/100mL)
脯氨酸 0.05-0.1
丙氨酸 0.05-0.1
丝氨酸 0.05-0.1
甘氨酸 0.05-0.1
天冬酰胺 0.05-0.4
天冬氨酸 0.05-0.4
谷氨酸 0.05-0.4
；其中，所述小分子物质为C、H、F、N、O、S类化学成分组成的氨基芳香烃类，其范围在C(11-25)H(9-30)F(2-8)N(1-10)O(2-8)S(1-5)。
优选地，所述小分子物质选自XAV939、PD184352、A0-6301、PD184352、AZD6244、CT99021、GSK1120212、PS-341类抑制剂中的两种或两种以上。
优选地，所述动物胚胎培养基组成如下：
Figure BDA0001196485850000032
Figure BDA0001196485850000041
；其中NEAA(100×)的成分为：
成分 浓度(mg/L)
脯氨酸 1150
丙氨酸 890
丝氨酸 1050
甘氨酸 750
天冬酰胺 1320
天冬氨酸 1330
谷氨酸 1470
；其中，所述小分子物质选自XAV939、PD184352、A0-6301、PD184352、AZD6244、CT99021、GSK1120212、PS-341类抑制剂中的两种或两种以上。
优选地，所述培养体系pH：7.0-7.4；渗透压：260-320mOsm/kg；细菌、真菌检测：阴性；衣原体、支原体检测：阴性；内毒素：<0.5EU/mL。
本发明的第二方面提供上述培养基的用途。
本发明所述的动物胚胎培养基用于体外培养哺乳动物早期胚胎。
优选地，所述的早期胚胎阶段包括但不限于2细胞期、4细胞期、8细胞期、桑椹期和囊胚期。
优选地，所述的哺乳动物选自小鼠、大鼠、兔、猴、人。
优选地，所述的培养基用于ES胚胎显微注射时的注射液。
优选地，所述的ES胚胎显微注射包括但不限于ES 2细胞期胚胎显微注射、ES 4细胞期胚胎显微注射、ES 8细胞期胚胎显微注射、ES桑椹期胚胎显微注射和ES囊胚期胚胎显微注射。
优选地，所述的培养基用于ES胚胎显微注射后的胚胎培养。
优选地，所述的ES胚胎显微注射包括但不限于ES 2细胞期胚胎显微注射、ES 4细胞期胚胎显微注射、ES 8细胞期胚胎显微注射、ES桑椹期胚胎显微注射和ES囊胚期胚胎显微注射。所述的胚胎选自小鼠、大鼠、兔、猴、人的胚胎。
本发明中的胚胎培养基和注射液的组分中，NEAA(100×)，表示为NEAA为100×的母液，即其应用时最大稀释倍数为100倍；其在配方中的最大添加量为0.1-10×，即在总体积为100mL培养试剂中，添加NEAA为0.1-10mL。
目前使用最多的基因修饰动物模型制备技术是囊胚ES显微注射技术，该技术由于其获得的是嵌合体，不是真正意义上的基因修饰小鼠，需要再繁殖一代才能从后代中挑选出真正可稳定遗传的基因修饰小鼠(且最多只占后代总数的50％)，这个传代过程至少耗时3个月，而且成功率较低。显微注射技术无论在小鼠出生率还是ES来源的小鼠比率上与传统方法的效率不相上下，另外还可以直接大量产生100％ES来源小鼠；节省了至少3个月的时间；由于减少了一个中间环节而简化了操作流程、增加了成功率。因此该技术具有省时、低成本、高效率的三大优势，是对现有技术的突破性改进。改进后的ES基因打靶技术在基因修饰小鼠制备效率上已经接近CRISPR/Cas9等最新的核酸酶基因修饰技术，可在基因修饰领域大大缓解CRISPR/Cas9基因修饰技术专利生效后对我国生物医药产业可能产生的冲击。
相比现有技术，本发明的优点在于：
本发明的动物胚胎培养基可用做胚胎培养基和显微注射时的注射液较现有技术的培养基和注射液，大幅提高了100％ES来源小鼠的比例，使得使用斜口针进行囊胚前胚胎注射获取高比例的100％ES来源小鼠成为可能。
本发明动物胚胎细胞培养基用于注射后培养较现有技术的培养基，大幅提高了100％ES来源小鼠的产率，使得用囊胚前胚胎ES注射法完全取代传统的囊胚ES注射法成为可能。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
本发明的动物胚胎细胞培养基可以应用在ES细胞基因打靶技术制备基因修饰小鼠方法，该方法包括如下步骤：
(1)制备提供小鼠的2-细胞胚胎：
A.在显微注射前用孕马血清(PMSG)和人绒毛膜***(HCG)处理Albino B6小鼠用于***的超排；挑选6-10周龄、发育正常、体质健康、毛质顺滑、无任何异常症状的小鼠作为供精公鼠；选用6-8周的发情ICR母鼠与结扎的公鼠进行交配，获得***母鼠；
B.胚胎获取：
i)将超排的母鼠与供精公鼠合笼，并于次日检查超排雌鼠的***栓，将见栓后第2天的小鼠从动物房取出，用CO2窒息法处死，并用75％的酒精消毒；
ii)剖开小鼠腹壁，取出输卵管，将其放入预先准备好的盛有一滴M2培养液的培养皿中；
iii)使用无菌的小号针头，在解剖镜下用M2培养液冲洗输卵管,得到2-细胞胚胎；
(2)将冲出的2-cell胚胎进行筛选并在50μL的新鲜M2培养液滴中清洗多遍，然后将胚胎转移到微滴培养皿中，用平衡好的M16培养液清洗胚胎多遍后将胚胎放置于一个培养皿中的一个干净液滴内，将培养皿放入37℃、5％CO2的培养箱中培养12-24小时；
(3)显微注射:将步骤(2)培养好的胚胎和准备好的ES细胞转移到同一注射皿中的液滴内，液滴内为注射液，将所述注射皿放置在显微镜下进行显微注射:
S1.注射皿放置在倒置显微镜下，将注射用针转移入注射用滴中，在高倍镜下仔细选择单个ES细胞，连续吸多个细胞到注射针里，
S2.挑选形态较好的胚胎，用固定针吹吸胚胎，旋转胚胎直至将一个较大间隙调节在3点方向，用固定针负压固定胚胎，调节显微镜确定胚胎的边缘，同时要确保胚胎固定牢固，
S3.将注射针的尖端与胚胎的中心点安排在同一聚焦平面上，用注射针尖轻轻地接触胚胎表面，
S4.将注射针的针头***胚胎的卵裂球间隙内，缓慢推动油压注射器，将注射针内的ES细胞推到胚胎内，每个胚胎注射6-8个ES细胞，
S5.注射完毕后将注射针缓慢拔出，
(4)注射后培养：将注射后的胚胎转移至改良胚胎培养基中培养，在37℃，5％CO2条件下培养24小时；
(5)胚胎移植：选取前述步骤(4)中发育良好的胚胎，移植到2.5d的***鼠子宫内；
(6)当***鼠产下小仔F0后，对出生小鼠进行统计和鉴定。
注：上述方法中的注射液和胚胎培养基，按照表1配制。
表1.注射液和胚胎培养基
Figure BDA0001196485850000071
；其中NEAA(100×)的成分为：
Figure BDA0001196485850000072
Figure BDA0001196485850000081
；其中，所述小分子物质选自XAV939、PD184352、A0-6301、PD184352、AZD6244、CT99021、GSK1120212、PS-341类抑制剂中的两种或两种以上。
上述方法中使用的显微注射针为自行拉制，使用SUTTER公司的P-97拉针仪，将内径1mm的薄壁毛细管拉制为细长的尖锥形，用锻针仪在毛细管内径为15-20μm处将尖锥的头部断开(确保断口整齐)，再用磨针仪将断口处的断面磨制为45°的角后备用。
实施例1显微注射液效果对比
1.1实验所需培养基：
M2培养基：购买于SIGMA公司，货号为M7167；
本发明注射液：配方如表1所示。
1.2实验分组：
M组为M2培养基；N组为本发明的注射液，配方如表1所示。
1.3实验步骤
按照上述实验操作流程，胚胎获取和显微注射方法都按照本发明方案的最优方法进行，其它步骤条件都相同，区别仅为：M组的注射液为M2培养基；N组的注射液为本发明表1的注射液。
1.4实验结果：数据统计如表2：
表2数据统计结果
Figure BDA0001196485850000082
从结果可以看出，本发明的注射液比M2培养基的100％ES来源的小鼠出生率高出近20％。
实施例2.注射后的胚胎培养基对比试验
2.1实验所需培养基：
表3.NB培养基配方
试剂名称 品牌 货号 添加比例
Knockout DMEM Gibco 10829018 70-95％
N2(100×) Gibco 17502048 0.1-10×
B27(50×) Gibco 17504044 0.1-10×
NEAA(100×)<sup>注</sup> Cyagen 10201-100 0.1-10×
GlutaMAX(100×) Gibco 35050061 0.1-10×
青链霉素(1000×) 吉诺 GNM15140 0.1-10×
β-巯基乙醇 Sigma M7522 0.01-0.8mM
白血病抑制因子LIF 普欣 123-07 1-20ng/mL
表4 KSR培养基配方
试剂名称 品牌 货号 使用浓度
Knockout DMEM Gibco 10829018 75-90％
KSR Gibco N10828028 5-20％
NEAA(100×)<sup>注</sup> Cyagen 10201-100 0.1-10×
GlutaMAX(100×) Gibco 35050061 0.1-10×
青链霉素(100×) 吉诺 GNM15140 0.1-10×
β-巯基乙醇 Sigma M7522 0.01-0.8mM
白血病抑制因子LIF 普欣 123-07 1-20ng/mL
注：NEAA(100×)成分如下：
成分 浓度(mg/L)
脯氨酸(L-Proline) 1150
丙氨酸(L-Alanine) 890
丝氨酸(L-Serine) 1050
甘氨酸(Glycine) 750
天冬酰胺(Asparagine monohydrate) 1320
天冬氨酸(Aspartic acid) 1330
谷氨酸(Glutamic acid) 1470
M16培养基：购买于SIGMA公司，货号为M7292；
KSOM培养基：购买于Millipore公司，货号为MR-106-D；
本发明培养基：按照表1成分配置。
2.2实验分组：
A组：不培养；B组：M16培养基；C组：KSOM培养基；D组：KSR培养基；E组：NB培养基；F组：KSOM+4％NB；G组：本发明培养基。
2.3实验步骤与结果
按照实验操作流程，胚胎获取方法和显微注射方法均按照本方案的最优方法进行，其它步骤条件都相同，区别仅为各组胚胎培养基不同，根据上述各组进行试验，最终每组的统计数据如下：
表5统计数据结果
Figure BDA0001196485850000101
由上表可知注射后的胚胎若不经短暂培养，获得100％ES来源小鼠数量极少甚至没有；本方明培养基与现有注射后的培养基相比差异显著，其100％ES来源小鼠出生率提高了10％，具有显著性差异。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于ES打靶技术的动物胚胎培养基，其特征在于，所述动物胚胎培养基组成如下：
试剂名称 添加量 氯化钠 2.0-8.0g/L 氯化钾 0.1-1.0g/L 氯化钙 0.1-1.0g/L 磷酸二氢钾 0.1-1.0g/L 硫酸镁 0.1-0.8g/L 碳酸氢钠 1.0-5.0g/L β-巯基乙醇 0.1-10mL/L 转铁蛋白 0.005-0.100g/L 葡萄糖 0.1-1.0g/L 乳酸钠 1.0-5.0mL/L 乳酸钙 0.1-2.0g/L 丙酮酸钠 0.01-0.1g/L 乙二胺四乙酸钠 0.01-0.1g/L 谷氨酰胺 0.1-0.2g/L 牛血清白蛋白 0.0005-3g/L 胎牛血清 5-30％ HEPES 1.0-6.0g/L NEAA(100×) 0.1-10× 小分子物质 0.001-100g/L
其中NEAA(100×)的成分为：
成分 浓度(g/100mL) 脯氨酸 0.01-0.1 丙氨酸 0.01-0.1 丝氨酸 0.01-0.1 甘氨酸 0.01-0.1 天冬酰胺 0.05-0.5 天冬氨酸 0.05-0.5 谷氨酸 0.05-0.5
其中，所述小分子物质选自XAV939、PD184352、A0-6301、PD184352、AZD6244、CT99021、GSK1120212、PS-341类抑制剂中的两种或两种以上。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述动物胚胎培养基组成如下：
Figure FDA0002392297540000011
Figure FDA0002392297540000021
；
其中NEAA(100×)的成分为：
成分 浓度(g/100mL) 脯氨酸 0.05-0.1 丙氨酸 0.05-0.1 丝氨酸 0.05-0.1 甘氨酸 0.05-0.1 天冬酰胺 0.05-0.4 天冬氨酸 0.05-0.4 谷氨酸 0.05-0.4
其中，所述小分子物质选自XAV939、PD184352、A0-6301、PD184352、AZD6244、CT99021、GSK1120212、PS-341类抑制剂中的两种或两种以上。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述动物胚胎培养基组成如下：
Figure FDA0002392297540000022
Figure FDA0002392297540000031
；
其中NEAA(100×)的成分为：
成分 浓度(mg/L) 脯氨酸 1150 丙氨酸 890 丝氨酸 1050 甘氨酸 750 天冬酰胺 1320 天冬氨酸 1330 谷氨酸 1470
其中，所述小分子物质选自XAV939、PD184352、A0-6301、PD184352、AZD6244、CT99021、GSK1120212、PS-341类抑制剂中的两种或两种以上。
4.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述培养体系pH：7.0-7.4；渗透压：260-320mOsm/kg；细菌、真菌检测：阴性；衣原体、支原体检测：阴性；内毒素：<0.5EU/mL。
5.如权利要求1-4任一项所述的培养基用于体外培养哺乳动物早期胚胎的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述早期胚胎包括2细胞期、4细胞期、8细胞期、桑椹期和囊胚期。
7.如权利要求1-4任一项所述的培养基用于ES胚胎显微注射时的注射液的用途。
8.如权利要求1-4任一项所述的培养基用于ES胚胎显微注射后的胚胎培养的用途。
9.根据权利要求5-8任一项所述的用途，其特征在于，所述的胚胎选自小鼠、大鼠、兔、猴、人的胚胎。
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PD0325901和CHIR99021促进牛体细胞克隆胚胎体外发育的研究;吴新颖 等;《西北农林科技大学学报》;20150930;第43卷(第9期);第23-29页 *

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