CN106749681A - 靶向人FRα的基因工程化NKT细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种FRα特异性嵌合抗原受体，该FRα特异性嵌合抗原受体由信号肽、FRα单链抗体、标签蛋白、铰链区、跨膜区、免疫受体酪氨酸活化基序以及至少一种共刺激信号分子胞内结构域串联组成。靶向人FRα的基因工程化NKT细胞，该细胞是由上述的FRα特异性嵌合抗原受体修饰的NKT细胞，得到的基因工程化淋巴细胞能够特异性识别肿瘤细胞表面的FRα，介导淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。经体外和体内试验证明，本发明提供的基因工程化淋巴细胞具有显著的抗FRα阳性表达肿瘤的活性，具有很好的应用前景，为本领域提供了一种新的有效选择。

Description

靶向人FRα的基因工程化NKT细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及靶向人FRα的基因工程化NKT细胞及其制备方法和应用。
背景技术
过继性细胞治疗(Adoptive cellular therapy,ACT)是肿瘤生物治疗的重要方法之一，它是通过给肿瘤患者输注经体外扩增和激活的免疫效应细胞，让其在体内识别和杀伤肿瘤细胞，从而达到***的目的。用于过继性细胞治疗的免疫效应细胞主要包括淋巴因子激活的杀伤(lymphokine activated killer，LAK)细胞，肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)、自然杀伤(nature killer，NK)细胞和细胞因子诱导的杀伤(cytokine induced killer，CIK)细胞等。
LAK细胞对恶性黑色素瘤和肾癌具有一定的抗肿瘤效果，但是由于需要同时与大剂量IL-2联合使用，会产生较大的毒副作用，现在临床上已经不再应用。
TIL是从肿瘤组织或者癌性胸、腹水中分离出来的抗原特异性淋巴细胞，主要用于治疗黑色素瘤和肾细胞癌，由于分离困难，限制了其临床应用。
NK细胞是目前比较常用的过继性免疫治疗效应细胞，其表面标记为CD3-CD16+CD56+。NK细胞具有杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞的能力，在机体固有免疫及肿瘤过继免疫治疗中发挥着重要作用。NK细胞识别异常细胞的机制与T淋巴细胞具有的精确抗原特异性不同，它们表达一系列能与主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)或非MHC类配体结合的抑制性和活化性受体，通过辨别“自我”和“非己”(Missing-self)的模式，进而抑制或启动NK细胞的杀伤或免疫调节功能。由于其对肿瘤细胞是非特异性杀伤，其杀伤能力有限，因此临床效果欠佳。
CIK细胞是一群多克隆淋巴细胞，其特征为富含CD3+CD56+细胞。因其同时表达T细胞和NK细胞的表面标志，因此也称为自然杀伤细胞样T(natural killer-like T，NKT)细胞。相对于传统的T淋巴细胞，NKT细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤是不受MHC限制的，而且也不需要预先的抗原刺激就可以产生抗肿瘤效应。此外，NKT细胞较少引起移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)。由于NKT细胞在体外较容易扩增，而且成本较低，因此以NKT细胞作为抗肿瘤效应细胞的过继性免疫治疗方法已经被广泛应用于血液***肿瘤和实体瘤的治疗。但是，由于NKT细胞是终末分化细胞，其在患者体内的存活时间有限，而且其对肿瘤细胞是非特异性杀伤，其杀伤能力有限。除对部分血液***肿瘤、黑色素瘤和肾癌外，其对大多数实体瘤治疗效果欠佳，这些因素制约了其临床疗效。
叶酸受体α(Folate receptor-alpha,FRα)是一种GPI锚定蛋白，与叶酸具有高的亲和力，正常情况下可以介导叶酸内吞。FRα在卵巢癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、肾癌等实体肿瘤都呈高表达。而且其高表达与肿瘤预后不良呈正相关关系。因此，FRα可以作为免疫治疗的靶点。一些靶向FRα的单克隆抗体，如MOv18、MOv19和LK26，被用于卵巢癌的治疗，但是部分FRα阳性的肿瘤对单克隆抗体治疗无效。
通过基因工程方法对效应细胞进行嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)修饰是近年发展而来的靶向免疫治疗新策略。CAR通常由抗原结合区(SCFV)、跨膜区和胞内信号转导区连接而成。抗原结合区可以MHC非限制性识别肿瘤抗原，使免疫效应细胞具有靶向性，随后通过内源性信号途径产生活化性信号，增强免疫效应细胞杀伤活性，并且延长其体内存活期。与常规的TCR只能识别蛋白抗原相比，CAR还可以识别糖类和糖脂类抗原，其应用范围较广。FRα特异性CAR可以用来修饰NKT细胞，经过FRα特异性CAR修饰的NKT细胞可以靶向识别FRα阳性表达的肿瘤细胞，并且可以增强其对肿瘤细胞的杀伤活性，成为FRα阳性表达肿瘤治疗的一个候选策略。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种靶向人FRα的基因工程化NKT细胞及其制备方法和应用。
本发明的目的是以下述方式实现的：
一种FRα特异性嵌合抗原受体，该FRα特异性嵌合抗原受体由信号肽、FRα单链抗体、标签蛋白、铰链区、跨膜区、免疫受体酪氨酸活化基序以及至少一种共刺激信号分子胞内结构域串联组成。
所述信号肽为CD8α信号肽、CD4信号肽、CD28信号肽、IgGκ信号肽、CD3ζ信号肽、CD137/4-1BB信号肽、CD134/OX40信号肽、ICOS信号肽中的任意一种。
所述FRα单链抗体由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)经一个接头蛋白(Linker)连接而成。
所述标签蛋白为c-Myc，Flag，HA中的任意一种。
所述铰链区为CD8α铰链区、IgG铰链区中的任意一种。
所述跨膜区为CD8α跨膜区、CD4跨膜区、CD28跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD137/4-1BB跨膜区、CD134/OX40跨膜区、ICOS跨膜区中的任意一种。
所述免疫受体酪氨酸活化基序为CD3ζ链的胞内信号结构域。
所述共刺激信号分子胞内结构域由CD28胞内信号结构域、CD137/4-1BB胞内信号结构域、CD134/OX40胞内信号结构域、ICOS胞内信号结构域中的至少一种。
所述FRα特异性嵌合抗原受体为FRα-28BBζ特异性嵌合抗原受体，FRα-28BBζ特异性嵌合抗原受体由CD8α信号肽、FRα单链抗体、c-Myc标签蛋白、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、CD28胞内信号结构域、CD137/4-1BB胞内信号结构域和CD3ζ链的胞内信号结构域的核苷酸序列按照首尾相接，串联而成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种重组慢病毒载体，含有并能表达上述的FRα特异性嵌合抗原受体的编码基因，所述慢病毒载体为pLenti-EF1α；其中慢病毒载体指的是不含上述FRα特异性嵌合抗原受体的编码基因的空载体，重组慢病毒载体指的是含有并能表达上述的FRα特异性嵌合抗原受体的编码基因的载体。
靶向人FRα的基因工程化NKT细胞，该细胞是由上述的FRα特异性嵌合抗原受体修饰的NKT细胞。
根据上述的靶向人FRα的基因工程化NKT细胞的制备方法，具体步骤为：首先人工合成FRα特异性嵌合抗原受体DNA片段，克隆至慢病毒载体中，与包装质粒共转染293T细胞，包装成慢病毒颗粒；然后用慢病毒颗粒感染人NKT细胞，获得靶向人FRα的基因工程化NKT细胞。
如上述的靶向人FRα的基因工程化NKT细胞在治疗FRα阳性表达的恶性肿瘤中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果为，本发明创造性的设计了一种嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体能够靶向识别FRα。本发明将靶向FRα的嵌合抗原受体编码基因克隆至慢病毒载体中，包装成慢病毒并感染淋巴细胞，将淋巴细胞基因修饰成为能够靶向识别人FRα的基因工程化淋巴细胞。得到的基因工程化淋巴细胞能够特异性识别肿瘤细胞表面的FRα，介导淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。经体外和体内试验证明，本发明提供的基因工程化淋巴细胞具有显著的抗FRα阳性表达肿瘤的活性，具有很好的应用前景，为本领域提供了一种新的有效选择。
本发明的另外一个有益效果为：本发明基因工程化NKT细胞可以与传统癌症治疗手段，如手术、化疗、放疗联合应用，以提高传统治疗手段的疗效，可以作为手术前或者手术后的辅助治疗手段。本发明基因工程化NKT细胞可以先于化疗或者放疗应用，也可以作为化疗和放疗失败患者的补救治疗。
附图说明
图1是pLenti-EF1α慢病毒载体结构图。
图2是FRα-△ζ特异性CAR构建模式图。
图3是FRα-ζ特异性CAR构建模式图。
图4是FRα-28ζ特异性CAR构建模式图。
图5是FRα-28BBζ特异性CAR构建模式图。
图6是流式细胞术检测未感染慢病毒的NKT细胞表面CAR的表达。
图7是流式细胞术检测pLenti-EF1α-△ζ慢病毒感染的NKT细胞表面CAR的表达。
图8是流式细胞术检测pLenti-EF1α-ζ慢病毒感染的NKT细胞表面CAR的表达。
图9是流式细胞术检测pLenti-EF1α-28ζ慢病毒感染的NKT细胞表面CAR的表达。
图10是流式细胞术检测pLenti-EF1α-28BBζ慢病毒感染的NKT细胞表面CAR的表达。
图11是流式细胞术检测A2780细胞FRα的表达。
图12是流式细胞术检测SKOV3细胞FRα的表达。
图13是流式细胞术检测OVCAR3细胞FRα的表达。
图14是流式细胞术检测PEO1细胞FRα的表达。
图15是流式细胞术检测A2780-FRα-细胞FRα的表达。
图16是流式细胞术检测PEO1-FRα+细胞FRα的表达。
图17是基因工程化NKT细胞与卵巢癌细胞共培养时细胞培养上清中IFN-γ分泌水平。
图18是基因工程化NKT细胞与卵巢癌细胞共培养时细胞培养上清中IL-2分泌水平。
图19是基因工程化NKT细胞与卵巢癌细胞共培养时细胞培养上清中IL-4分泌水平。
图20是基因工程化NKT细胞与卵巢癌细胞共培养时细胞培养上清中IL-10分泌水平。
图21是基因工程化NKT细胞对FRα+的肿瘤细胞系A2780的体外杀伤作用。
图22是基因工程化NKT细胞对FRα+的肿瘤细胞系SKOV3的体外杀伤作用。
图23是基因工程化NKT细胞对FRα+的肿瘤细胞系OVCAR3的体外杀伤作用。
图24是基因工程化NKT细胞对FRα-的肿瘤细胞系PEO1的体外杀伤作用。
图25是基因工程化NKT细胞对FRα-的肿瘤细胞系A2780-FRα-的体外杀伤作用。
图26是基因工程化NKT细胞对FRα+的肿瘤细胞系PEO1-FRα+的体外杀伤作用。
图27是基因工程化NKT细胞对卵巢癌荷瘤小鼠的FRα+肿瘤细胞系A2780的体内抗肿瘤活性。
图28是基因工程化NKT细胞对卵巢癌荷瘤小鼠的FRα-肿瘤细胞系PEO1的体内抗肿瘤活性。
图29是基因工程化NKT细胞对卵巢癌荷瘤小鼠的FRα+肿瘤细胞系A2780的生存期影响。
图30是基因工程化NKT细胞对卵巢癌荷瘤小鼠的FRα-肿瘤细胞系PEO1的生存期影响。
具体实施方式
CD8α信号肽的核苷酸序列为GenBank NM_001768.6中的890-952核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank NP_001759.3中的1-21肽段序列；CD4信号肽的核苷酸序列为GenBankM12807.1中的76-150核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank AAA35572.1中的1-25肽段序列；CD28信号肽的核苷酸序列为GenBank NM_006139.3中的223-276核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank NP_006130.1中的1-18肽段序列；CD3ζ信号肽的核苷酸序列为GenBankAK313946.1中的75-137核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank BAG36664.1中的1-21肽段序列；CD137/4-1BB信号肽的核苷酸序列为GenBank NM_001561.5中的262-330核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank NP_001552.2中的1-23肽段序列；CD134/OX40信号肽的核苷酸序列为GenBank NM_003327.3中的42-125核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank NP_003318.1中的1-28肽段序列；ICOS信号肽的核苷酸序列为GenBank NM_012092.3中的68-127核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank NP_036224中的1-20肽段序列。
重链可变区的核苷酸序列为GenBank X99993.1中的序列全长，氨基酸序列为GenBank CAA68252.1中的序列全长；轻链可变区的核苷酸序列为GenBank X99994中的序列全长，氨基酸序列为GenBank CAA68253.1中的序列全长；接头蛋白的核苷酸序列为GenBankAF363774.1中358-402核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank AAK81714.1中的120-134肽段序列。
c-Myc标签蛋白的氨基酸序列为GenBank CAE84874.1中的1-10肽段序列；Flag标签蛋白的氨基酸序列为GenBank ACH81550.1中的2-8肽段序列；HA标签蛋白的氨基酸序列为GenBank AAB02235.1中的1-9肽段序列。
CD8α铰链区的核苷酸序列为GenBank NM_001768.6中的1301-1435核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank NP_001759.3中的138-182肽段序列；IgG铰链区的核苷酸序列为GenBank X04646.1中的427-477、621-665、809-853、997-1041片段，按照首尾相接串联而成，氨基酸序列为GenBank CAA28307.1中的12-73肽段序列。
CD8α跨膜区的核苷酸序列为GenBank NM_001768.6中的1436-1498核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank NP_001759.3中的183-203肽段序列；CD28跨膜区的核苷酸序列为GenBank NM_006139.3中的679-759核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank NP_006130.1中的153-179肽段序列；CD4跨膜区的核苷酸序列为GenBank M12807.1中的1264-1329核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank AAA35572.1中的397-418肽段序列；CD3ζ跨膜区的核苷酸序列为GenBank AK313946.1中的1655-227核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank BAG36664.1中的31-51肽段序列；CD137/4-1BB跨膜区的核苷酸序列为GenBank NM_001561.5中的820-900核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank NP_001552.2中的187-213肽段序列；CD134/OX40跨膜区的核苷酸序列为GenBank NM_003327.3中的684-746核苷酸片段，氨基酸序列为GenBankNP_003318.1中的215-235肽段序列；ICOS跨膜区的核苷酸序列为GenBank NM_012092.3中的488-550核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank NP_036224中的141-161肽段序列。
免疫受体酪氨酸活化基序为CD3ζ链的胞内信号结构域，其核苷酸序列为GenBankAK313946.1中的228-563核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank BAG36664.1中的52-163肽段序列。
CD28的胞内信号结构域的核苷酸序列为GenBank NM_006139.3中的760-882核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank NP_006130.1中的180-220肽段序列；CD137/4-1BB胞内信号结构域的核苷酸序列为GenBank NM_001561.5中的901-1026核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank NP_001552.2中的214-255肽段序列；CD134/OX40胞内信号结构域的核苷酸序列为GenBank NM_003327.3中的747-872核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank NP_003318.1中的236-277肽段序列；ICOS胞内信号结构域的核苷酸序列为GenBank NM_012092.3中的551-667核苷酸片段，氨基酸序列为GenBank NP_036224中的162-199肽段序列。
实施例1：构建pLenti-EF1α慢病毒载体
首先PCR扩增EF1α基因片段：设计上游引物KpnI-EF1α-F：GGGGTACCTAGGTCTTGAAAGGAGT和下游引物BEXXA-EF1α-R：CGGGATCCGAATTCCTCGAGTCTAGAACCGGTCCTGTGTTCTGGCGGCAAACCCGT；上游引物5’端含有KpnI酶切位点基因序列，下游引物5’端含有多克隆位点基因序列，依次为BamHI、EcoRI、XhoI、XbaI和AgeI；以LentiCRISPRv2质粒(Addgene公司)为模板，采用 HS DNA聚合酶(Takara公司)扩增EF1α基因片段，PCR反应条件为：98℃3分钟，98℃10秒，55℃5秒，72℃20秒，30个循坏，72℃5分钟。分别用KpnI和BamHI(Takara公司)双酶切LentiCRISPRv2质粒和经PCR扩增的EF1α基因片段，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，紫外线下切下经双酶切的LentiCRISPRv2质粒大片段和经双酶切的EF1α基因片段，然后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技北京有限公司)回收DNA片段；用T4-DNA连接酶(Takara公司)将上述所回收的EF1α基因片段酶切产物与LentiCRISPRv2质粒大片段在16℃下连接30min。按照常规操作，将连接产物转化Stbl3感受态细胞(北京博迈德基因技术有限公司)，涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养。次日挑取5～10个单菌落进行PCR扩增，扩增反应体系和条件同前。PCR扩增结果为阳性的菌落，接种于5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12小时；培养结束后，采用质粒提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司)提取质粒，测序正确的质粒命名为pLenti-EF1α，其质粒图谱如图1所示。在构建成功的pLenti-EF1α载体中，增加了多克隆位点，包含AgeI、XbaI、XhoI、EcoRI和BamHI酶切位点，为后续***各种CAR基因提供选择。
实施例2：构建含有FRα特异性CAR的重组慢病毒载体
CAR的构建模式图如图2-5所示。按照FRα-28BBζ的DNA编码序列，如SEQ ID NO.1所示，由人工合成的方法直接合成基因全长(Takara公司)，合成的基因片段克隆至pMD19-T载体中(Takara公司)，命名为pMD19-FRα-28BBζ。设计PCR引物如表1中所示：
表1 PCR引物名称和序列
以pMD19-FRα-28BBζ为模板，用XbaI-KozaK-CD8α-F和BamH1-CD3ζ-R引物扩增FRα-28BBζ片段，以此扩增得到的28BBζ嵌合抗原受体片段；该嵌合抗原受体由CD8α信号肽、FRα单链抗体、c-Myc标签蛋白、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、CD28胞内信号结构域、CD137/4-1BB胞内信号结构域和CD3ζ链的胞内信号结构域的核苷酸序列按照首尾相接，串联而成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
用XbaI-KozaK-CD8α-F和CD28-R引物扩增FRα-scFv-TM-CD28片段；用CD28-CD3ζ-F和BamH1-CD3ζ-R引物扩增ζ-2片段；用XbaI-KozaK-CD8α-F和BamH1-CD3ζ-R引物，以FRα-scFv-TM-CD28和ζ-2为模板扩增FRα-28ζ片段，以此扩增得到的FRα-28ζ嵌合抗原受体片段；该嵌合抗原受体由CD8α信号肽、FRα单链抗体、c-Myc标签蛋白、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、CD28胞内信号结构域和CD3ζ链的胞内信号结构域的核苷酸序列按照首尾相接，串联而成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
用XbaI-KozaK-CD8α-F和CD8TM-R引物扩增FRα-scFv-TM片段；用CD8-CD3ζ-F和BamH1-CD3ζ-R引物扩增ζ-1片段；然后，用XbaI-KozaK-CD8α-F和BamH1-CD3ζ-R引物，以FRα-scFv-TM和ζ-1为模板进行重叠PCR扩增FRα-ζ片段，以此扩增得到的FRα-ζ嵌合抗原受体片段。该嵌合抗原受体由CD8α信号肽、FRα单链抗体、c-Myc标签蛋白、CD8α铰链区、CD8α跨膜区和CD3ζ链的胞内信号结构域的核苷酸序列按照首尾相接，串联而成，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
用XbaI-KozaK-CD8α-F和BamH1-CD8TM-R引物扩增△ζ片段，以此扩增得到的FRα-△ζ嵌合抗原受体片段；该嵌合抗原受体由CD8α信号肽、FRα单链抗体、c-Myc标签蛋白、CD8α铰链区、CD8α跨膜区按照首尾相接，串联而成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
分别采用限制性内切酶XbaI和BamHI(Takara公司)酶切pLenti-EF1α载体和FRα-28BBζ、FRα-28ζ、FRα-ζ和FRα-△ζ嵌合抗原受体片段，酶切产物经1％琼脂糖凝胶进行分离，DNA回收试剂盒(天根生化科技北京有限公司)回收DNA片段。利用T4-DNA连接酶(Takara公司)连接回收片段，然后将连接产物转化Stbl3化学感受态细胞，37℃培养过夜。菌落PCR筛选重组载体阳性克隆。经测序鉴定正确的阳性克隆分别命名为pLenti-EF1α-△ζ、pLenti-EF1α-ζ、pLenti-EF1α-28ζ，pLenti-EF1α-28BBζ。用含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基分别扩大培养含有pLenti-EF1α-△ζ、pLenti-EF1α-ζ、pLenti-EF1α-28ζ和pLenti-EF1α-28BBζ重组载体的大肠杆菌Stbl3，并采用质粒提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司)提取质粒备用。
其中，pLenti-EF1α-28BBζ为实验例，pLenti-EF1α-28ζ、pLenti-EF1α-ζ和pLenti-EF1α-△ζ为对比例。
实施例3：慢病毒颗粒的制备
用含有10％FBS的DMEM高糖培养基于100mm培养皿中培养293T细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞密度达到80-90％时，分别将pLenti-EF1α-△ζ、pLenti-EF1α-ζ、pLenti-EF1α-28ζ和pLenti-EF1α-28BBζ载体和慢病毒包装所需的另外2个质粒psPAX2和pMD2.G(Addgene公司)以比例4：3：1混合，采用转染试剂(Polyplus-transfection公司)共转染293T细胞，转染后的293T细胞置于37℃，5％CO2培养箱中培养。转染后24h和48h分别收集细胞培养上清，500g离心10分钟，收集上清病毒液，0.45μm过滤器过滤，-80℃保存备用。
实施例4：基因工程化NKT细胞的制备
采集人外周静脉血，采用Ficoll淋巴分离液(天津灏洋公司)密度梯度离心法分离单个核细胞(PBMCs)，洗涤后重悬于含1％自体血清的GT-T551培养基中(Takara公司)，调整细胞终浓度为1×106个/mL。加入IFN-γ(上海凯茂生物医药有限公司)，终浓度为1000U/mL，置于25cm2培养瓶中，于饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中培养。24小时后，加入CD3单克隆抗体(ProSpec-Tany公司)，终浓度调整为100ng/mL，加入IL-2(北京四环生物制药有限公司)，终浓度调整为500U/mL，根据培养情况，向培养瓶中补加含有1％自体血清、IL-2终浓度为500U/mL的GT-T551培养基，于饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中培养。如果培养液体积超过20ml，转入T75细胞培养瓶中，如果培养液体积超过50ml，转入T175细胞培养瓶中，相同条件下继续培养。
取培养2周后的NKT细胞，离心弃去培养基，用含500U/mL IL-2的GT-T551新鲜培养基调整细胞浓度为1×106个/mL，总体积为2mL，置于6孔板中，加入实施例3中制备的慢病毒进行感染，置于饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中培养24小时，离心弃去培养基，加入含500U/mL IL-2的GT-T551新鲜培养基,调整细胞浓度为1×106cell/mL，置于饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中继续培养。以此制备的NKT细胞为基因工程化NKT细胞。
实施例5：检测基因工程化NKT细胞CAR的表达
取实施例4中病毒感染24小时后的NKT细胞，依次加入重组人FRα-Fc融合蛋白(R&D公司)和PE标记的羊抗Fc第二抗体(abcam公司)，同时加入PerCP标记的CD3单克隆抗体，室温避光孵育30分钟。孵育结束以后，用FACS Calibur流式细胞仪(BD公司)进行检测，采用FlowJo软件进行数据分析，如图6-10所示。结果显示，未感染的NKT细胞未检测到CAR的表达，而采用pLenti-EF1α-△ζ、pLenti-EF1α-ζ、pLenti-EF1α-28ζ和pLenti-EF1α-28BBζ慢病毒感染的NKT细胞均检测到CAR蛋白的表达，CAR蛋白的表达率均大于70％。
实施例6：流式细胞术检测肿瘤细胞FRα表达
以含有10％胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI 1640培养基(GIBICO公司)，在37℃，5％CO2条件下培养并传代卵巢癌细胞系A2780(Sigma公司)、PEO1(Sigma公司)、SKOV3(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)和OVCAR3(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)细胞。用转染试剂将pRS-FRα质粒(Origene公司)转染PEO1细胞，以5μg/ml的嘌呤霉素进行筛选14天，获得PEO1-FRα+细胞。用转染试剂将pCMV6-NEO-FRα-shRNA质粒(Origene公司)转染A2780细胞，以400μg/ml的G418进行筛选14天，获得A2780-FRα-细胞。
将上述卵巢癌细胞用FITC小鼠抗人FRα单克隆抗体(Novus公司)进行标记，室温避光孵育30分钟。孵育结束以后，用FACS Calibur流式细胞仪(BD公司)进行检测，采用FlowJo软件进行数据分析，如图11-16所示。结果显示，A2780、SKOV3、OVCAR3和PEO1-FRα+细胞FRα呈阳性表达；PEO1和A2780-FRα-细胞FRα呈阴性表达。
实施例7：检测基因工程化NKT细胞与卵巢癌细胞共培养时细胞因子分泌水平
分别以实施例6中的FRα阳性表达(FRα+)和FRα阴性表达(FRα-)的细胞系作为靶细胞，然后将实施例4中制备的基因工程化NKT细胞与上述靶肿瘤细胞按照1：1比例混合在24孔板中培养24小时，离心后取上清，采用ELISA试剂盒(R&D公司)检测细胞培养上清IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10细胞因子的分泌水平，如图17-20所示。
结果显示，当NKT细胞与FRα-的肿瘤细胞系PEO1和A2780-FRα-共培养时，未感染的NKT细胞、pLenti-EF1α-△ζ、pLenti-EF1α-ζ、pLenti-EF1α-28ζ和pLenti-EF1α-28BBζ慢病毒感染的NKT细胞都分泌较低水平的IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10；当基因工程化NKT细胞与FRα+的肿瘤细胞系A2780、SKOV3、OVCAR3和PEO1-FRα+共培养时，未感染的NKT细胞和pLenti-EF1α-△ζ慢病毒感染的NKT细胞仅表达低水平的IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10，pLenti-EF1α-ζ慢病毒感染的NKT细胞也分泌较低水平的IL-2；而pLenti-EF1α-ζ、pLenti-EF1α-28ζ和pLenti-EF1α-28BBζ慢病毒感染的NKT细胞均分泌较高水平的IFN-γ、IL-4和IL-10；与未感染的NKT细胞和pLenti-EF1α-△ζ慢病毒感染的NKT细胞比较，pLenti-EF1α-ζ慢病毒感染的NKT细胞除IL-2外，IFN-γ、IL-4和IL-10分泌明显增加；与pLenti-EF1α-ζ慢病毒感染的NKT细胞比较，pLenti-EF1α-28ζ和pLenti-EF1α-28BBζ慢病毒感染的NKT细胞分泌更高水平的IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10；与pLenti-EF1α-28ζ慢病毒感染的NKT细胞比较，pLenti-EF1α-28BBζ慢病毒感染的NKT细胞分泌更高水平的IFN-γ、IL-2，但是分泌更低水平的IL-4和IL-10。
实施例8：基因工程化NKT细胞对人肿瘤细胞的细胞毒性分析
将实施例4中制备的基因工程化NKT细胞与实施例6中所述的靶肿瘤细胞分别以1:1、5:1和10:1的比率混合培养6小时，以乳酸脱氢酶(LDH)释放试验检测试剂盒(Promega公司)检测NKT细胞对肿瘤细胞的细胞毒性，如图21-26所示。
当NKT细胞与FRα-的肿瘤细胞系PEO1和A2780-FRα-共培养时，未感染的NKT细胞、pLenti-EF1α-△ζ、pLenti-EF1α-ζ、pLenti-EF1α-28ζ和pLenti-EF1α-28BBζ慢病毒感染的NKT细胞均显示出对肿瘤细胞较低的细胞毒性；当NKT细胞与FRα+的肿瘤细胞系A2780、SKOV3、OVCAR3和PEO1-FRα+共培养时，未感染的NKT细胞和pLenti-EF1α-△ζ慢病毒感染的NKT细胞也显示出对FRα+肿瘤细胞较低的细胞毒性，而pLenti-EF1α-ζ、pLenti-EF1α-28ζ和pLenti-EF1α-28BBζ慢病毒感染的NKT细胞均显示出对FRα+肿瘤细胞较高的细胞毒性；随着效靶比的增加，细胞毒性逐渐增加；在相同混合比率的条件下，pLenti-EF1α-ζ和pLenti-EF1α-28ζ慢病毒感染的NKT细胞对FRα+肿瘤细胞的细胞毒性无显著性差异；而pLenti-EF1α-28BBζ慢病毒感染的NKT细胞显示出比pLenti-EF1α-ζ和pLenti-EF1α-28ζNKT细胞对FRα+肿瘤细胞更强的细胞毒性。
实施例9：基因工程化NKT细胞的体内抗肿瘤活性
分别用FRα+肿瘤细胞系A2780和FRα-肿瘤细胞系PEO1建立Balb/c裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)皮下移植瘤模型，两种模型均在建模大约4周后，随机分为6组，分别为PBS对照组、未感染的NKT细胞治疗组、pLenti-EF1α-△ζ慢病毒感染的NKT细胞治疗组、pLenti-EF1α-ζ慢病毒感染的NKT细胞治疗组、pLenti-EF1α-28ζ慢病毒感染的NKT细胞治疗组和pLenti-EF1α-28BBζ慢病毒感染的NKT细胞治疗组，每组6只小鼠。每只小鼠均尾静脉注射1×107的NKT细胞进行过继性细胞治疗，治疗后每隔5天测量小鼠在体肿瘤的长短经；以公式肿瘤体积＝π/6×长经(mm)×短经(mm)2计算肿瘤体积大小。观察并记录各组小鼠的生存时间，如图27-30所示。
结果显示，对于FRα-肿瘤细胞系PEO1建立的皮下移植瘤模型，未感染的NKT细胞、pLenti-EF1α-△ζ、pLenti-EF1α-ζ、pLenti-EF1α-28ζ和pLenti-EF1α-28BBζ慢病毒感染的NKT细胞均未显示出任何体内抗肿瘤活性，与PBS对照组比较，无显著性差异。对于FRα+肿瘤细胞系A2780建立的皮下移植瘤模型，未感染的NKT细胞和pLenti-EF1α-△ζ慢病毒感染的NKT细胞也均未显示出任何体内抗肿瘤活性，与PBS对照组比较，无显著性差异。相反，pLenti-EF1α-ζ、pLenti-EF1α-28ζ和pLenti-EF1α-28BBζ慢病毒感染的NKT细胞均不同程度的抑制在体肿瘤的生长，与PBS对照组比较，有显著性差异；在治疗后的同一时间点上，pLenti-EF1α-28ζ和pLenti-EF1α-28BBζ慢病毒感染的NKT细胞治疗组小鼠的在体肿瘤体积均小于pLenti-EF1α-ζ慢病毒感染的NKT细胞治疗组小鼠的在体肿瘤体积；而且pLenti-EF1α-28BBζ慢病毒感染的NKT细胞治疗组小鼠的在体肿瘤体积小于pLenti-EF1α-28ζ慢病毒感染的NKT细胞治疗组小鼠的在体肿瘤体积。
对于FRα-肿瘤细胞系PEO1建立的皮下移植瘤模型，未感染的NKT细胞、pLenti-EF1α-△ζ、pLenti-EF1α-ζ、pLenti-EF1α-28ζ和pLenti-EF1α-28BBζ慢病毒感染的NKT细胞均未能延长小鼠生存时间，与PBS对照组比较，无显著性差异。对于FRα+肿瘤细胞系A2780建立的皮下移植瘤模型，未感染的NKT细胞和pLenti-EF1α-△ζ慢病毒感染的NKT细胞也均未能延长小鼠生存时间，与PBS对照组比较，无显著性差异。相反，pLenti-EF1α-ζ、pLenti-EF1α-28ζ和pLenti-EF1α-28BBζ慢病毒感染的NKT细胞均不同程度的延长小鼠生存时间，与PBS对照组比较，有显著性差异；pLenti-EF1α-28ζ和pLenti-EF1α-28BBζ慢病毒感染的NKT细胞治疗组荷瘤小鼠的中位生存期长于pLenti-EF1α-ζ慢病毒感染的NKT细胞治疗组荷瘤小鼠的中位生存期，两者比较有显著性差异；pLenti-EF1α-28BBζ慢病毒感染的NKT细胞治疗组的荷瘤小鼠的中位生存期长于pLenti-EF1α-28ζ慢病毒感染的NKT细胞治疗组荷瘤小鼠的中位生存期，两者比较有显著性差异。以上结果提示pLenti-EF1α-28BBζ慢病毒感染的NKT细胞显示更强的体内抗肿瘤活性。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南大学淮河医院
<120> 靶向人FRα的基因工程化NKT细胞及其制备方法和应用
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 8474
<212> DNA
<213> pLenti-EF1α慢病毒载体的核苷酸序列
<400> 1
gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60
atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120
gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180
tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240
attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300
atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360
acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420
tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480
tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540
attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600
tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660
ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 720
accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg 780
gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct 840
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 900
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 960
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 1020
gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 1080
ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 1140
ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 1200
ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 1260
aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 1320
tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 1380
caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 1440
aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 1500
aaagtaagac caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg 1560
agggacaatt ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga 1620
gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata 1680
ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg 1740
acgctgacgg tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg 1800
ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag 1860
ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt 1920
tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt 1980
aataaatctc tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt 2040
aacaattaca caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag 2100
aatgaacaag aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata 2160
acaaattggc tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta 2220
agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta 2280
tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa 2340
gaaggtggag agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc ggcactgcgt 2400
gcgccaattc tgcagacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa aaggggggat 2460
tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt agacataata gcaacagaca tacaaactaa 2520
agaattacaa aaacaaatta caaaaattca aaattttcgg gtttattaca gggacagcag 2580
agatccagtt tggttaatta aggtacctag gtcttgaaag gagtgggaat tggctccggt 2640
gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc 2700
ggcaattgat ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg 2760
tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc 2820
gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggaccggtt ctagactcga 2880
ggaattcgga tccggcgcaa caaacttctc tctgctgaaa caagccggag atgtcgaaga 2940
gaatcctgga ccgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc 3000
cagggccgta cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt 3060
cgatccggac cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt 3120
cgggctcgac atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac 3180
cacgccggag agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga 3240
gttgagcggt tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg 3300
gcccaaggag cccgcgtggt tcctggccac cgtcggagtc tcgcccgacc accagggcaa 3360
gggtctgggc agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc 3420
cgccttcctg gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac 3480
cgtcaccgcc gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc 3540
cggtgcctga acgcgttaag tcgacaatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt 3600
gactggtatt cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc 3660
tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg 3720
gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac 3780
tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg gggcattgcc accacctgtc agctcctttc 3840
cgggactttc gctttccccc tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc 3900
ccgctgctgg acaggggctc ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa 3960
atcatcgtcc tttccttggc tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc 4020
cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc 4080
ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg 4140
ggccgcctcc ccgcgtcgac tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc 4200
cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc actcccaacg aagacaagat 4260
ctgctttttg cttgtactgg gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct 4320
ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta 4380
gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca 4440
gtgtggaaaa tctctagcag ggcccgttta aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc 4500
tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 4560
cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 4620
tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 4680
tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg 4740
gggctctagg gggtatcccc acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 4800
ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 4860
cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct 4920
ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg 4980
tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga 5040
gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc 5100
ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga 5160
gctgatttaa caaaaattta acgcgaatta attctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt 5220
ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca 5280
gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat 5340
ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg 5400
cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc 5460
gaggccgcct ctgcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta 5520
ggcttttgca aaaagctccc gggagcttgt atatccattt tcggatctga tcagcacgtg 5580
ttgacaatta atcatcggca tagtatatcg gcatagtata atacgacaag gtgaggaact 5640
aaaccatggc caagttgacc agtgccgttc cggtgctcac cgcgcgcgac gtcgccggag 5700
cggtcgagtt ctggaccgac cggctcgggt tctcccggga cttcgtggag gacgacttcg 5760
ccggtgtggt ccgggacgac gtgaccctgt tcatcagcgc ggtccaggac caggtggtgc 5820
cggacaacac cctggcctgg gtgtgggtgc gcggcctgga cgagctgtac gccgagtggt 5880
cggaggtcgt gtccacgaac ttccgggacg cctccgggcc ggccatgacc gagatcggcg 5940
agcagccgtg ggggcgggag ttcgccctgc gcgacccggc cggcaactgc gtgcacttcg 6000
tggccgagga gcaggactga cacgtgctac gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg 6060
aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg 6120
atctcatgct ggagttcttc gcccacccca acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 6180
aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 6240
gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg tataccgtcg acctctagct 6300
agagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa 6360
ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga 6420
gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 6480
gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct 6540
cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 6600
cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 6660
acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 6720
ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 6780
ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 6840
gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 6900
gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 6960
ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 7020
actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 7080
gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 7140
ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 7200
ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 7260
gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 7320
tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 7380
tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 7440
aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 7500
aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 7560
tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 7620
gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 7680
agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 7740
aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 7800
gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 7860
caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 7920
cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 7980
ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 8040
ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 8100
gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 8160
cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 8220
gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 8280
caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 8340
tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 8400
acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 8460
aagtgccacc tgac 8474
<210> 2
<211> 1617
<212> DNA
<213> FRα-28BBζ的核苷酸序列
<400> 2
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgcaggtgc agctgcagca gtctggagct gagctggtga agcctggggc ttcagtgaag 120
atatcctgca aggcttctgg ttactcattt actggctact ttatgaactg ggtgaagcag 180
agccatggaa agagccttga gtggattgga cgtattcatc cttacgatgg tgatactttc 240
tacaaccaga acttcaagga caaggccaca ttgactgtag acaaatcctc taacacagcc 300
cacatggagc tcctgagcct gacatctgag gactttgcag tctattattg tacaagatac 360
gacggtagtc gggctatgga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctccggtggc 420
ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc ggcggatctg acatcgagct cactcagtct 480
ccagcttctt tggctgtgtc tctagggcag agggccatca tctcctgcaa ggccagccaa 540
agtgtcagtt ttgctggtac tagtttaatg cactggtacc accagaaacc aggacagcaa 600
cccaaactcc tcatctatcg tgcatccaac ctagaagctg gggttcctac caggtttagt 660
ggcagtgggt ctaagacaga cttcaccctc aatatccatc ctgtggagga ggaggatgct 720
gcaacctatt actgtcagca aagtagggaa tatccgtaca cgttcggagg ggggacaaag 780
ttgctcgagc agaaactgat ctcggaagaa gatctgacca cgacgccagc gccgcgacca 840
ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 900
ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc 960
tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 1020
tgcgtcgaca ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc 1080
cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca 1140
gcctatcgct ccaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg 1200
agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa 1260
gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 1320
cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1380
ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 1440
caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1500
gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 1560
acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa 1617
<210> 3
<211> 1507
<212> DNA
<213> FRα-28ζ的核苷酸序列
<400> 3
gctctagagc caccatggcc ttaccagtga ccgccttgct cctgccgctg gccttgctgc 60
tccacgccgc caggccgcag gtgcagctgc agcagtctgg agctgagctg gtgaagcctg 120
gggcttcagt gaagatatcc tgcaaggctt ctggttactc atttactggc tactttatga 180
actgggtgaa gcagagccat ggaaagagcc ttgagtggat tggacgtatt catccttacg 240
atggtgatac tttctacaac cagaacttca aggacaaggc cacattgact gtagacaaat 300
cctctaacac agcccacatg gagctcctga gcctgacatc tgaggacttt gcagtctatt 360
attgtacaag atacgacggt agtcgggcta tggactactg gggccaaggg accacggtca 420
ccgtctccgg tggcggtggc tcgggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga tctgacatcg 480
agctcactca gtctccagct tctttggctg tgtctctagg gcagagggcc atcatctcct 540
gcaaggccag ccaaagtgtc agttttgctg gtactagttt aatgcactgg taccaccaga 600
aaccaggaca gcaacccaaa ctcctcatct atcgtgcatc caacctagaa gctggggttc 660
ctaccaggtt tagtggcagt gggtctaaga cagacttcac cctcaatatc catcctgtgg 720
aggaggagga tgctgcaacc tattactgtc agcaaagtag ggaatatccg tacacgttcg 780
gaggggggac aaagttgctc gagcagaaac tgatctcgga agaagatctg accacgacgc 840
cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc 900
cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct 960
gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg 1020
ttatcaccct ttactgcagg agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca 1080
tgactccccg ccgccccggg cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg 1140
acttcgcagc ctatcgctcc agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc 1200
agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg 1260
ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc 1320
ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga 1380
ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca 1440
gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaag 1500
gatcccg 1507
<210> 4
<211> 1384
<212> DNA
<213> FRα-ζ的核苷酸序列
<400> 4
gctctagagc caccatggcc ttaccagtga ccgccttgct cctgccgctg gccttgctgc 60
tccacgccgc caggccgcag gtgcagctgc agcagtctgg agctgagctg gtgaagcctg 120
gggcttcagt gaagatatcc tgcaaggctt ctggttactc atttactggc tactttatga 180
actgggtgaa gcagagccat ggaaagagcc ttgagtggat tggacgtatt catccttacg 240
atggtgatac tttctacaac cagaacttca aggacaaggc cacattgact gtagacaaat 300
cctctaacac agcccacatg gagctcctga gcctgacatc tgaggacttt gcagtctatt 360
attgtacaag atacgacggt agtcgggcta tggactactg gggccaaggg accacggtca 420
ccgtctccgg tggcggtggc tcgggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga tctgacatcg 480
agctcactca gtctccagct tctttggctg tgtctctagg gcagagggcc atcatctcct 540
gcaaggccag ccaaagtgtc agttttgctg gtactagttt aatgcactgg taccaccaga 600
aaccaggaca gcaacccaaa ctcctcatct atcgtgcatc caacctagaa gctggggttc 660
ctaccaggtt tagtggcagt gggtctaaga cagacttcac cctcaatatc catcctgtgg 720
aggaggagga tgctgcaacc tattactgtc agcaaagtag ggaatatccg tacacgttcg 780
gaggggggac aaagttgctc gagcagaaac tgatctcgga agaagatctg accacgacgc 840
cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc 900
cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct 960
gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg 1020
ttatcaccct ttactgcaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc 1080
agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt 1140
tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc 1200
aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg 1260
ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta 1320
cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgctaaggat 1380
cccg 1384
<210> 5
<211> 1048
<212> DNA
<213> FRα-△ζ的核苷酸序列
<400> 5
gctctagagc caccatggcc ttaccagtga ccgccttgct cctgccgctg gccttgctgc 60
tccacgccgc caggccgcag gtgcagctgc agcagtctgg agctgagctg gtgaagcctg 120
gggcttcagt gaagatatcc tgcaaggctt ctggttactc atttactggc tactttatga 180
actgggtgaa gcagagccat ggaaagagcc ttgagtggat tggacgtatt catccttacg 240
atggtgatac tttctacaac cagaacttca aggacaaggc cacattgact gtagacaaat 300
cctctaacac agcccacatg gagctcctga gcctgacatc tgaggacttt gcagtctatt 360
attgtacaag atacgacggt agtcgggcta tggactactg gggccaaggg accacggtca 420
ccgtctccgg tggcggtggc tcgggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga tctgacatcg 480
agctcactca gtctccagct tctttggctg tgtctctagg gcagagggcc atcatctcct 540
gcaaggccag ccaaagtgtc agttttgctg gtactagttt aatgcactgg taccaccaga 600
aaccaggaca gcaacccaaa ctcctcatct atcgtgcatc caacctagaa gctggggttc 660
ctaccaggtt tagtggcagt gggtctaaga cagacttcac cctcaatatc catcctgtgg 720
aggaggagga tgctgcaacc tattactgtc agcaaagtag ggaatatccg tacacgttcg 780
gaggggggac aaagttgctc gagcagaaac tgatctcgga agaagatctg accacgacgc 840
cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc 900
cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct 960
gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg 1020
ttatcaccct ttactgctaa ggatcccg 1048
<210> 6
<211> 538
<212> PRT
<213> FRα-28BBζ的氨基酸序列
<400> 6
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
20 25 30
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Ser Phe Thr Gly Tyr Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys
50 55 60
Ser Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe
65 70 75 80
Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser
85 90 95
Ser Asn Thr Ala His Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
145 150 155 160
Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Ile Ile Ser Cys
165 170 175
Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala Gly Thr Ser Leu Met His Trp
180 185 190
Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala
195 200 205
Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
210 215 220
Lys Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala
225 230 235 240
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly
245 250 255
Gly Gly Thr Lys Leu Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
260 265 270
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
275 280 285
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
290 295 300
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
305 310 315 320
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
325 330 335
Ile Thr Leu Tyr Cys Val Asp Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His
340 345 350
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
355 360 365
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
370 375 380
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
385 390 395 400
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
405 410 415
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
420 425 430
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
435 440 445
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
450 455 460
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
465 470 475 480
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
485 490 495
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
500 505 510
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
515 520 525
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
530 535

Claims (13)

1.一种FRα特异性嵌合抗原受体，其特征在于：该FRα特异性嵌合抗原受体由信号肽、FRα单链抗体、标签蛋白、铰链区、跨膜区、免疫受体酪氨酸活化基序以及至少一种共刺激信号分子胞内结构域串联组成。
2.根据权利要求1所述的FRα特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述信号肽为CD8α信号肽、CD4信号肽、CD28信号肽、IgGκ信号肽、CD3ζ信号肽、CD137/4-1BB信号肽、CD134/OX40信号肽、ICOS信号肽中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的FRα特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述FRα单链抗体由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)经一个接头蛋白(Linker)连接而成。
4.根据权利要求1所述的FRα特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述标签蛋白为c-Myc，Flag，HA中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的FRα特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述铰链区为CD8α铰链区、IgG铰链区中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的FRα特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述跨膜区为CD8α跨膜区、CD4跨膜区、CD28跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD137/4-1BB跨膜区、CD134/OX40跨膜区、ICOS跨膜区中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的FRα特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述免疫受体酪氨酸活化基序为CD3ζ链的胞内信号结构域。
8.根据权利要求1所述的FRα特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述共刺激信号分子胞内结构域由CD28胞内信号结构域、CD137/4-1BB胞内信号结构域、CD134/OX40胞内信号结构域、ICOS胞内信号结构域中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的FRα特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述FRα特异性嵌合抗原受体为FRα-28BBζ特异性嵌合抗原受体，FRα-28BBζ特异性嵌合抗原受体由CD8α信号肽、FRα单链抗体、c-Myc标签蛋白、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、CD28胞内信号结构域、CD137/4-1BB胞内信号结构域和CD3ζ链的胞内信号结构域的核苷酸序列按照首尾相接，串联而成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
10.一种重组慢病毒载体，含有并能表达权利要求1所述的FRα特异性嵌合抗原受体的编码基因，其特征在于：所述慢病毒载体为pLenti-EF1α。
11.靶向人FRα的基因工程化NKT细胞，其特征在于：该细胞是由权利要求1所述的FRα特异性嵌合抗原受体修饰的NKT细胞。
12.根据权利要求11所述的靶向人FRα的基因工程化NKT细胞的制备方法，其特征在于：具体步骤为：首先人工合成FRα特异性嵌合抗原受体DNA片段，克隆至慢病毒载体中，与包装质粒共转染293T细胞，包装成慢病毒颗粒；然后用慢病毒颗粒感染人NKT细胞，获得靶向人FRα的基因工程化NKT细胞。
13.如权利要求11所述的靶向人FRα的基因工程化NKT细胞在治疗FRα阳性表达的恶性肿瘤中的应用。
CN201710074413.8A 2017-02-10 2017-02-10 靶向人FRα的基因工程化NKT细胞及其制备方法和应用 Pending CN106749681A (zh)

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