CN106749536B - 一种黏膜胞转受体gp-2的高亲和性寡肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,具体为一种黏膜胞转受体GP‑2的高亲和性寡肽及其应用。本发明寡肽的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4所示,能够和黏膜上M细胞表面的黏膜胞转受体GP‑2高特异性亲和。使用偶联该寡肽的抗原免疫动物,能显著性增强抗原的黏膜摄入,极大提高血清中IgG、IgG1,黏膜IgA的水平和血清中IFN等细胞因子的水平,并显著增强抗原特异性的脾细胞的增殖。本发明的寡肽用途:作为黏膜疫苗佐剂与抗原混合,或作为抗原配基与抗原共价结合融合成新的分子,以制备成粘膜途径给药的疫苗,可增强疫苗免疫效果;可与其他药物分子以共价结合成新的分子或非共价混合为复合物,以制备成粘膜途径给药***或药物,具有极广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及黏膜胞转受体GP-2的高亲和性寡肽及其应用。
背景技术
黏膜表面在机体和外界环境之间形成了一个大且重要的界面,除正常的生理功能外,还是抵抗病原微生物的第一道防线。黏膜免疫***是由分布在胃肠道、呼吸道、唾液分泌管、泌尿道等的淋巴组织组成的,机体近50%的淋巴组织存在于黏膜***,因此诱导黏膜免疫应答对疾病的预防和控制具有重要意义。但是目前在黏膜疫苗的研究中存在关键性的问题,即抗原不能突破黏膜屏障***而不能被有效地呈递到黏膜免疫***中,因此有效的黏膜疫苗与抗原的有效运输和呈递密切相关。
黏膜免疫的诱导部位负责抗原的捕获、处理和呈递,研究最多的诱导部位是Peyer氏结(PP)。PP的表面覆盖滤泡相关上皮层(FAE),FAE富含M细胞,而M细胞时专门捕获抗原的细胞,是黏膜屏障的门户。抗原突破M细胞门户即可有效地被呈递到黏膜免疫***中,而M细胞表面的黏膜胞转受体GP-2蛋白成为关键靶点。GP-2蛋白负责肠道抗原转移到胞内的过程,因此为了使得肠道抗原能够有效地被呈递到M细胞内,以GP-2蛋白为突破口突破M细胞门户。和GP-2高亲和性亲和的寡肽,能有效地诱导GP-2蛋白将带有该寡肽的抗原转移到M细胞内,从而进一步激活黏膜免疫***。该寡肽可作为黏膜疫苗佐剂,增强M细胞对疫苗的摄取,加强其与疫苗抗原的相互作用,提高疫苗的免疫效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种黏膜胞转受体GP-2的高亲和性寡肽以及该亲和肽在增强抗原呈递到黏膜免疫***以及提高免疫反应功能上的应用。
本发明提供的GP-2高亲和性寡肽,其氨基酸序列为SEQ.ID.NO.1,记为Gb-1肽,具有如下功能特征:①可与GP-2高度亲和,测得解离常数Kd达到68nM(Kd值表示一半受体被配体结合时配体的浓度,Kd值越小代表受体与配体的亲和性越高);②偶联该寡肽的抗原在口服免疫动物时可显著增强针对该抗原的抗体水平和相关细胞因子水平,起到黏膜疫苗佐剂的作用。
本发明还提供编码所述GP-2高亲和性寡肽的亲和寡肽的基因(由相应氨基酸各简并密码子构成),其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
通过生物技术改造,本发明还提供一种具有与所述Gb-1肽相同功能的寡肽序列,其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4所示,分别记为Gb-2肽和Gb-3肽。
本发明还提供一种同时含有黏膜胞转受体GP-2高亲和性肽氨基酸序列的SEQ.ID.NO.1和氨基酸序列为SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4的肽序列,为单次重复或多次重复的串联或分支的肽分子序列,及含有这些核心序列特征(同源性在70%以上)的分子,其肽氨基酸序列为SEQ.ID.NO.5所示。
本发明还提供一种经过生物和化学基团修饰的肽,其含有黏膜胞转受体GP-2高亲和性肽SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4作为核心序列的C端(或N端,或侧链)基团上加抗原或药物或PEG修饰或其他分子基团共价修饰的结构特征分子。
本发明还提供上述各种GP-2高亲和性寡肽,在制备粘膜途径给药***或药物中的应用,包括疫苗或药物的混合物。
本发明还提供一种经过修饰的寡肽,包括上述各种GP-2高亲和性寡肽,其黏膜胞转受体GP-2高亲和性肽的加FITC等荧光基团修饰、同位素标记、化学发光基团或酶标试剂修饰的分子,用于检测黏膜胞转受体GP-2。
本发明还提供上述各种GP-2高亲和性寡肽,在制备黏膜疫苗佐剂中的应用。
本发明还提供上述各种GP-2高亲和性寡肽,在黏膜胞转受体GP-2表达检测和临床检测中的应用。
本发明还提供如核苷酸序列为SEQ.ID.NO.2的肽基因在制备表达黏膜疫苗佐剂中的应用和在示踪检测中的应用。
本发明的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.1的寡肽可起到黏膜疫苗佐剂的作用。该寡肽与GP-2具有很强的亲和性,可提高GP-2对偶联了该寡肽抗原的转运效果,提高针对该抗原的免疫反应。本发明的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4的寡肽同样可以作为潜在的黏膜疫苗佐剂,同样与TNFα具有较强的亲和性,并可在偶联抗原后提高增强抗原的免疫反应。
该寡肽与GP-2亲和性实验:使用5μg/ml的GP-2溶液4℃过夜包被96孔酶标板,加入不同浓度的带有FITC标记的Gb-1肽后孵育1h,再加入带有HRP标记的抗FITC的单克隆抗体孵育1h,然后加入ABTS显色液显色1h,通过酶标仪读取OD410数值,GraphPad Prism5作图并分析。结果证实Gb-1肽与GP-2蛋白具有极强的亲和力,解离常数Kd为68nM。
该寡肽偶联的抗原免疫动物后显著增强了肠道Peyer氏结(PP)对该抗原的摄入:体内结扎一段小鼠小肠,其中包含一到两层PP。注射偶联了寡肽的EGFP和未偶联的EGFP,孵育过后将这段结扎小肠取出,荧光显微镜下观察摄入到PP中的抗原量,发现偶联了该寡肽的EGFP摄入量明显多于未偶联组。
该寡肽偶联的抗原免疫动物后增强了针对该抗原的免疫效果:试验动物分为抗原组(EGFP)和偶联寡肽抗原组(EGFP—Gb-1、EGFP—Gb-3),每组5只6周龄雌性BALB/c小鼠,每周口服给药1次,连续6周。末次给药后5天收集血清和粪便提取物以检测血清中EGFP特异性的IgG和粪便中黏膜分泌型IgA抗体;取出脾脏和肠道Peyer氏结后分离单核细胞并进行培养,EGFP和 EGFP—Gb-1分别刺激细胞后检测脾脏细胞培养上清中细胞因子(IL-4)含量以及Peyer氏结细胞分泌特定细胞因子的细胞数量(IL-5,IL-6)的变化。比较发现,使用EGFP—Gb-1免疫的动物的IgG水平和IgA水平均明显高于单纯EGFP免疫的动物,而且EGFP—Gb-1免疫动物的免疫细胞分泌的IL-4和分泌IL-5,IL-6的细胞数量均显著高于单纯的EGFP免疫动物。即该寡肽能够在偶联抗原之后显著增强该抗原的免疫效果。
由此可见,Gb-1对GP-2蛋白具有极强的亲和性,而且该寡肽偶联抗原后通过黏膜给药能显著增强该抗原的免疫效果,提高血清抗体和黏膜分泌型抗体水平,提高相关细胞因子的水平并促进免疫细胞的增殖,达到更高的免疫水平。该寡肽可作为一种黏膜疫苗的佐剂,提高疫苗的免疫效果,增强机体保护力。
综上,使用偶联本发明寡肽的抗原免疫动物,能显著性增强抗原的黏膜摄入,极大提高血清中IgG、IgG1,黏膜IgA的水平和血清中IFN等细胞因子的水平,并显著增强抗原特异性的脾细胞的增殖。本发明的寡肽可用作:1.作为黏膜疫苗佐剂与抗原混合,或作为抗原配基与抗原共价结合融合成新的分子,以制备成粘膜途径给药的疫苗,可显著提高机体对疫苗抗原的摄入以及产生的免疫反应,增强疫苗免疫效果;2.可与其他药物分子以共价结合成新的分子或非共价混合为复合物,以制备成粘膜途径给药***或药物,具有极广泛的应用前景。
附图说明
图1 Gb-1寡肽对GP-2蛋白的亲和性。
图2 同功能的Gb-2寡肽对GP-2蛋白的亲和性。
图3 Gb-1寡肽偶联抗原后增强血清特异性IgG水平。
图4 Gb-1寡肽偶联抗原后增强PP对抗原的摄入。
图5 Gb-3寡肽序列偶联抗原后增强血清特异性IgG水平。
图6 Gb-1寡肽偶联抗原后增强粪便中黏膜分泌型特异性IgA水平。
图7 Gb-1寡肽偶联抗原后增强动物脾细胞分泌IL-4。
图8 Gb-1寡肽偶联抗原后提高动物肠道Peyer氏结IL-5、IL-6分泌性细胞数量。
具体实施方式
一、寡肽序列的获得与改造
通过化学的方法人工合成所需的寡肽,寡肽具有与GP-2蛋白亲和的作用。
二、寡肽的合成与纯化
Lys(Dde)-WangResin用DCM浸泡10min后抽干DCM,然后加入树脂体积三倍的25%哌啶(哌啶/DMF),用氮气鼓吹20min后抽干哌啶。加入DMF鼓吹1min,循环6次后抽干,取树脂茚三酮检测呈蓝色。产物为:H-Lys(Dde)-WangResin。加入树脂3倍当量的Fmoc-Val-OH,HATU,DIEA在DMF中。用氮气鼓吹20min后抽干DMF反应液,加入DMF用氮气鼓吹1min后抽干,循环3次,茚三酮检测树脂呈透明。产品为:Fmoc-Val-Lys(Dde)-WangResin,依次类推,得到粗产品。用乙腈、Milli-Q水通过汉邦YCM C18柱子进行纯化。从而获得高特异性、高活性的目的寡肽Gb-1、Gb-2和Gb-3;也可通过基因工程方法,将Gb-1、Gb-2和Gb-3肽序列的DNA密码子克隆到合适表达载体质粒(大肠杆菌的PBV220、哺乳细胞的CDNA3.1)导入合适的宿主,表达相应的目的肽或蛋白。
三、Gb-1肽与GP-2蛋白的亲和试验
该寡肽与GP-2蛋白亲和性实验结果:将5μg/ml的TNFα蛋白4℃过夜包被在96孔酶标板上,BSA封闭后加入不同浓度的带有FITC标记的Gb-1肽,共孵育1h,加入带HRP标记的抗FITC的单克隆抗体孵育1h,然后加入ABTS显色液,显色1h后通过酶标仪读取OD410数值,GraphPad Prism 5作图并分析。结果证实Gb-1肽与TNFα蛋白具有极强的亲和力,解离常数Kd为68nM,结果如图1所示。
四、Gb-1肽偶联抗原增强抗原摄入
以上述的亲和肽偶联抗原(抗原可以是疫苗蛋白、药物蛋白、荧光蛋白,此处以EGFP为例,下同)。体内结扎一段含有一到两层PP的小鼠小肠,然后注射偶联寡肽的EGFP和单纯的EGFP,37℃孵育1h,然后切下结扎部位。固定后冷冻切片,使用confocal扫描荧光显微镜观察PP内部的绿色荧光在两组之间的对比,发现寡肽偶联组的EGFP进入PP的量明显多于未偶联组,表面所发明的亲1肽具有促进蛋白大分子进入细胞、吸收和转运的功能。
五、Gb-1肽偶联抗原增强免疫效果
试验动物分为抗原组(EGFP)和偶联寡肽抗原组(EGFP—Gb-1),每组5只6周龄雌性BALB/c小鼠,每周口服给药1次,每次每只100µg,连续6周。末次给药后5天收集血清和粪便提取物,提取脾细胞。
1、ELISA检测血清中EGFP特异性的IgG和粪便中黏膜分泌型IgA抗体,稀释后OD450的值为0.08(Blank组)时的稀释度为抗体效价,取抗体效价的log2值为纵坐标作图分析,发现EGFP—Gb-1组的血清IgG和粪便提取物IgA显著高于EGFP组,结果如图2、图3所示。
2、提取小鼠脾脏和肠道Peyer氏结,在300 U/ml胶原酶D中37℃消化30分钟,然后用尼龙网过滤未消化组织,Percoll分离液分离出单核细胞,继续培养,再次使用EGFP和EGFP—Gb-1刺激后检测脾脏细胞分泌的细胞因子和Peyer氏结细胞的增殖。结果发现EGFP—Gb-1刺激的脾脏单核细胞分泌的IL-4显著高于EGFP组;EGFP—Gb-1刺激Peyer氏结的单核细胞中分泌IL-5和IL-6的细胞数量显著高于EGFP组(ELISPOT检测法)。结果如图4、图5所示。
由此看出,Gb-1对GP-2蛋白具有极强的亲和性,而且该寡肽偶联抗原后通过黏膜给药能显著增强该抗原的免疫效果,该寡肽可作为一种黏膜疫苗的佐剂,提高疫苗的免疫效果。
六、具体应用
目前阻碍黏膜疫苗发展的关键性问题是抗原不能突破黏膜屏障***而不能被有效地呈递到黏膜免疫***中,大分子药物(如蛋白、肽类、核酸等)很难被粘膜吸收,因此研究疫苗抗原更有效地运输和呈递是促进黏膜疫苗发展和粘膜给药***的重要因素。本发明选择黏膜诱导部位中负责捕获抗原的M细胞作为突破口,提供了一种和M细胞表面GP-2蛋白具有高亲和性的寡肽(Gb-1、Gb-2和Gb-3),该寡肽在和抗原偶联后能有效地诱导GP-2蛋白将带有该寡肽相联系的大分子如抗原、蛋白和药物转移到M细胞转运至体内内,从而促进大分子的吸收、激活黏膜免疫***,因此该类寡肽可作为黏膜疫苗佐剂,增强M细胞对疫苗的摄取,加强其与疫苗抗原的相互作用,提高疫苗的免疫效果,并可开发新的粘膜给药产品和技术。
SEQ.ID.NO.1:HPNYDHDRMHTQ(N端→C端)
SEQ.ID.NO.2:CAT CCG AAT TAT GAT CAT GCG ATT ATG CAT ACT CAG
SEQ.ID.NO.3:FRVIYTDMPGAH(N端→C端):
SEQ.ID.NO.4:SMQYADHPVNTG(N端→C端):
SEQ.ID.NO.5:HPNYDHDRMHTQFRVIYTDMPGAHSMQYADHPVNTG(N端→C端)。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学
<120> 一种黏膜胞转受体GP-2的高亲和性寡肽及其应用
<130> 001
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213>
<400> 1
His Pro Asn Tyr Asp His Asp Arg Met His Thr Gln
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213>
<400> 2
catccgaatt atgatcatgc gattatgcat actcag 36
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213>
<400> 3
Phe Arg Val Ile Tyr Thr Asp Met Pro Gly Ala His
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213>
<400> 4
Ser Met Gln Tyr Ala Asp His Pro Val Asn Thr Gly
1 5 10
<210> 5
<211> 36
<212> PRT
<213>
<400> 5
His Pro Asn Tyr Asp His Asp Arg Met His Thr Gln Phe Arg Val Ile
1 5 10 15
Tyr Thr Asp Met Pro Gly Ala His Ser Met Gln Tyr Ala Asp His Pro
20 25 30
Val Asn Thr Gly
35
Claims (6)
1.一种黏膜胞转受体GP-2的高亲和性寡肽,其特征在于,氨基酸序列为SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4之一。
2.一种编码氨基酸序列为SEQ.ID.NO.1的黏膜胞转受体GP-2的高亲和性寡肽的基因,其特征在于,核苷酸序列为SEQ.ID.NO.2所示。
3.一种经过生物和化学基团修饰的肽,其特征在于,以如权利要求1所述的黏膜胞转受体GP-2高亲和性寡肽作为序列的C端、N端或侧链基团上加抗原或药物或PEG修饰的结构特征分子。
4.一种经过修饰的寡肽,其特征在于,如权利要求1所述的黏膜胞转受体GP-2的高亲和性寡肽,其黏膜胞转受体GP-2高亲和性肽的加FITC荧光基团修饰、同位素标记、化学发光基团或酶标试剂修饰的分子,用于检测黏膜胞转受体GP-2。
5.一种如权利要求1所述的黏膜胞转受体GP-2的高亲和性寡肽在制备粘膜途径给药***或粘膜途径给药药物中的应用。
6.一种如权利要求1所述的黏膜胞转受体GP-2的高亲和性寡肽在制备黏膜疫苗佐剂中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |