CN106729987A - 一种负载kgn的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架。该支架以胶原、壳聚糖、透明质酸钠、KGN（kartogenin）和PLGA为原料制备，制备方法包括负载KGN小分子的PLGA微球制备、PLGA微球的混合及胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架的制备步骤。本发明制备的复合支架具有良好的生物相容性好、可生物降解等特点，同时兼具透明质酸钠的润滑作用和KGN的促骨髓间充质干细胞软骨分化作用，有利于中、早期骨性关节炎的软骨缺损修复，是一种较好的骨关节炎软骨缺损的组织再生材料。

Description

一种负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架
技术领域
本发明属于生物医用领域，具体涉及一种负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架。
背景技术
近年来随着人口老龄化加速，越来越多的人为关节软骨损伤而困扰，其中尤以骨关节炎（Osteoarthritis, OA）患者为重。OA是一种由多因素引起的退行性病变，以关节软骨退化、关节边缘和软骨下骨反应性增生为特征，临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。临床上治疗OA最有效的方法为关节置换术， 但该方法有可能引起诸多不良反应，并且价格昂贵，一般只应用于晚期的OA患者。目前，对于早、中期OA患者尚无有效的治疗手段，大多数方法只能暂时缓解患者的症状，无法延缓或阻止OA的进程。因此，开发一种有效的OA治疗方法和技术迫在眉睫。
近年来，大量的研究表明OA与关节软骨退变有关。因此，有效修复OA患者关节软骨退变可能是OA临床治疗的一个有效途径。在关节软骨缺损修复中，应用干细胞定向分化的方法再生关节软骨已经成为研究热点。间充质干细胞（Mesenchymal stem cell, MSC）具有多向细胞分化潜能，如能合理促进OA患者MSC向软骨细胞定向分化则对治疗OA具有重要意义。
在2012年，一种新的小分子化合物kartogenin (KGN)被发现，它是由Johnson等从22000多种结构不同的杂环类药性分子中筛选出的一种复合物，能有效地促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，因此，应用KGN促MSC软骨定向分化作用开发一种负载KGN的软骨修复支架可能有效应用于OA的软骨缺损修复。
胶原( Collagen, COL)是很多组织的细胞外基质成分，并已应用于多种组织工程支架材料中，但由于其单独应用具有降解速率快、机械性能差等不足，因此常与其他材料复合。
壳聚糖（Chitosan，CS）是一种天然高分子生物材料，主要存在于海洋生物的壳中以及真菌细胞壁中，是一种来源广泛、容易获得并具有良好生物相容性的可降解生物材料。它具有无毒性、无刺激性、生物相容性、生物可降解性、易于改性等优良性能，是一种应用较多的组织工程支架材料，在骨、软骨和皮肤组织工程等方面表现出了良好的应用前景。
透明质酸钠（Hyaluronic acid sodium salt，HAS）是皮肤和其它组织中广泛存在的天然生物分子，是构成人体细胞间质、关节滑液等***的主要成分，在关节腔中几乎以纯态形式存在。它能促进细胞的增殖、分化，清除氧自由基，促进伤口愈合、调节渗透压、润滑、促进细胞修复及改善关节的重要作用。在临床OA非手术治疗中，补充外源性透明质酸钠是常用方法之一，具有提高滑液中透明质酸钠含量、改善病理情况下滑液的生理功能、缓解关节疼痛、保护软骨和滑膜免受破坏等作用。
本发明综合KGN、天然胶原、壳聚糖、透明质酸钠的各自优点，制备一种可用于骨关节炎软骨缺损修复的复合支架。它可通过释放负载的KGN促使自体骨髓来源MSC软骨方向分化，同时通过支架降解释放透明质酸钠增强修复效果，以达到缓解和治疗OA的目的。
发明内容
本发明目的是提供一种用于骨关节炎软骨缺损修复的负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架及其制备方法。所制备的复合材料，具有良好的生物相容性、可降解性和无免疫原性的特点，同时该支架材料可有效促进关节软骨的重建和再生，是一种较好的适用于中、早期骨关节炎治疗的医用材料。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架，以胶原溶液、壳聚糖溶液、透明质酸钠溶液和负载KGN小分子的PLGA微球为主要原料制得，所述胶原溶液浓度为0.6wt%，壳聚糖溶液浓度为1wt%，透明质酸钠溶液浓度为1wt%；所述胶原溶液、壳聚糖溶液和透明质酸钠溶液的体积比为1~10:10:1~10；复合支架中负载KGN小分子的PLGA微球的质量百分数为0.03wt%。
所述胶原来源于鱼皮、猪皮、牛皮或牛腱。
所述负载KGN小分子的PLGA微球制备方法如下：
（A）准确称取200 mg PLGA溶于10 mL 二氯甲烷，超声振荡形成油相（O）；
（B）再准确称量10mg KGN置于1 mL的超纯水与甲醇的混合液（超纯水与甲醇的体积比为1:1）中，在37℃下使其完全溶解形成内水相（W1）；
（C）将步骤（B）所述内水相（W1）缓慢注入步骤（A）所述油相（O）中持续搅拌乳化10 min，使其均匀分散形成初乳乳剂（W1/O）；
（D）将步骤（C）所述初乳乳剂（W1/O）按60滴/min滴入含有5 mL 0.1wt%吐温-20的50 mL1wt% PVA溶液中形成外水相（W2），持续搅拌形成复乳（W1/O/W2）；
（E）将步骤（D）所述复乳（W1/O/W2）充分离心，弃上清液，再经超纯水反复冲洗离心3次，冷冻干燥，在-20℃下避光保存。
如上所述的负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架的制备方法，包括如下步骤：（1）分别将胶原、壳聚糖溶于0.1wt%的冰醋酸中制备成胶原溶液和壳聚糖溶液；
（2）将透明质酸钠溶于蒸馏水或去离子水制备成透明质酸溶液；
（3）将步骤（1）所得胶原溶液与壳聚糖溶液混合，漩涡搅拌混合均匀；
（4）将步骤（2）所得透明质酸钠溶液缓慢加入步骤（3）的混合漩涡溶液中，混合均匀；
（5）将负载KGN小分子的PLGA微球加入步骤（4）所得混合溶液中，磁力搅拌过夜，冷冻干燥后添加交联剂进行交联；
（6）交联后用Na2HPO3、NaCl和蒸馏水反复冲洗至中性，二次冷冻干燥后即得负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架。
步骤（5）中所述交联剂是由2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物、1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺溶于体积浓度为40%的乙醇溶液中制得，其中2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物、1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为50:33:8。
步骤（6）中所述Na2HPO3和NaCl分别为0.1M Na2HPO3、1M NaCl和2M NaCl。
本发明的有益效果在于：本发明制备的负载KGN胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架呈三维网状结构，具有良好的吸湿性，制备过程简单、成熟。所得材料可改善胶原机械性能不足、降解过快的缺点，具有良好的生物相容性、无毒性、可降解性和无免疫原性，其中透明质酸可发挥润滑和改善关节的重要生理过程作用，同时该材料所负载的KGN释放可长达12周，是一种较好的适用于中、早期骨关节炎治疗的医用材料。
附图说明
图1为负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架吸水率图；
图2（A）为本发明制备的负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架的扫描电镜图；
图2（B）为未负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明。
实施例一
（1）准确称取200 mg PLGA溶于4 mL 二氯甲烷，超生振荡形成油相（O）；
（2）再准确称量10 mg KGN置于1 mL的超纯水与甲醇的混合液，在37℃下使其完全溶解形成内水相（W1）；其中超纯水和甲醇体积比为1:1；
（3）将步骤（2）所述内水相（W1）缓慢注入步骤（1）所述油相（O）中持续搅拌乳化10 min，使其均匀分散形成初乳乳剂（W1/O）；
（4）将步骤（3）所述初乳乳剂（W1/O）按60滴/min滴入含有5 mL 0.1wt%吐温-20的50 mL1wt%PVA溶液中形成外水相（W2），持续搅拌形成复乳（W1/O/W2）；
（5）将步骤（4）所述复乳（W1/O/W2）充分离心，弃上清液，再经超纯水反复冲洗离心3次，冷冻干燥，在-20℃下避光保存，制得负载KGN小分子的PLGA微球；
（6）称取45.1127 g牛腱胶原溶于100mL浓度为0.1wt% 的冰乙酸溶液中，放置在搅拌器上搅拌溶解，制备质量分数为0.6 %的胶原（COL）溶液；
（7）称取1.0 g壳聚糖溶于100 mL浓度为0.1% 的冰乙酸溶液中，放置在搅拌器上搅拌溶解，制备质量分数为1%的壳聚糖（CS）溶液；
（8）称取0.5 g透明质酸钠溶于50 mL蒸馏水或去离子水溶液中，放置在搅拌器上搅拌溶解，制备质量分数为1%的透明质酸（HAS）溶液；
（9）将牛腱胶原溶液加入50 mL的离心管中，放在漩涡器上漩涡，然后在漩涡中加入壳聚糖溶液混合，再缓慢加入透明质酸钠溶液，制成混合的胶原/壳聚糖/透明质酸钠溶液；
（10）再将步骤（5）制作的负载KGN小分子的PLGA微球按500 μg/mL加入到胶原/壳聚糖/透明质酸钠混合溶液中；将其混合液放在磁力搅拌器上搅拌过夜，其中0.6%的COL、1%的CS和1%的HAS溶液的体积比为1:1:1；
（11）在冷冻干燥机里面进行冷冻干燥；利用交联剂交联冻干的复合材料，用0.1MNa2HPO3、1M NaCl、2M NaCl蒸馏水反复冲洗至中性，其交联剂由2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物（MES）、1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺溶于体积浓度为40%乙醇溶液中制得，其中MES/EDC/NHS的质量比为50:33:8；然后二次冷冻干燥即得负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架。
实施例二
在实施例一的步骤（6）中，将牛腱胶原改为鱼皮胶原；步骤（10）中，改变0.6%的COL、1%的CS和1%的HAS溶液的体积比为5：10：10，其他步骤与实施例一相同，制备负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架。
实施例三
在实施例一的步骤（6）中，将牛腱胶原改为猪皮胶原；步骤（10）中，改变0.6%的COL、1%的CS和1%的HAS溶液的体积比为1：10：10，其他步骤与实施例一相同，制备负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架。
实施例四
在实施例一的步骤（6）中，将牛腱胶原改为牛皮胶原；步骤（10）中，改变0.6%的COL、1%的CS和1%的HAS溶液的体积比为10：10：5，其他步骤与实施例一相同，分别制备负载和未负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架。
实施例五
在实施例一的步骤（10）中，改变0.6%的COL、1%的CS和1%的HAS溶液的体积比为10：10：1，其他步骤与实施例一相同，制备负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架。
负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架吸水率测试：
将以上实施例制备的干燥负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架用打孔器取直径7 mm圆，称其质量W1，浸入PBS (Ph=7.4)，37℃水浴溶胀24 h后取出，吸干表面水分，称其重量W0，按下式计算吸水率，实验平行3次，取其平均值。
吸水溶胀率（%）=（W0-W1）/W1×100％
式中W1为干材料重(mg)，W0为溶胀后材料重(mg)。
结果见图1。从图1中可见，上述实施例制备的不同比例负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架均表现出良好的吸水性能，其中0.5:1:1比例最佳，其他几种材料吸水性无差别。
用SEM对复合支架进行表征。结果发现：制备的负载和未负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架均呈三维网状结构（图2（A）和图2（B）），孔隙相互贯通，其中负载KGN的复合支架中（图2（B））清晰可见包埋有负载KGN的PLGA微球。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (8)

1.一种负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架，其特征在于：以胶原溶液、壳聚糖溶液、透明质酸钠溶液和负载KGN小分子的PLGA微球为主要原料制得，所述胶原溶液浓度为0.6wt%，壳聚糖溶液浓度为1wt%，透明质酸钠溶液浓度为1wt%；所述胶原溶液、壳聚糖溶液和透明质酸钠溶液的体积比为1~10:10:1~10。
2.根据权利要求1所述的负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架，其特征在于：所述复合支架中负载KGN小分子的PLGA微球的质量百分数为0.03wt%。
3.根据权利要求1所述的负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架，其特征在于：所述胶原来源于鱼皮、猪皮、牛皮或牛腱。
4.根据权利要求1所述的负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架，其特征在于：所述负载KGN小分子的PLGA微球制备方法如下：
（A）准确称取200 mg PLGA溶于10 mL 二氯甲烷，超声振荡形成油相；
（B）再准确称量10mg KGN置于1 mL的超纯水与甲醇的混合液中，在37℃下使其完全溶解形成内水相；
（C）将步骤（B）所述内水相缓慢注入步骤（A）所述油相中持续搅拌乳化10 min，使其均匀分散形成初乳乳剂；
（D）将步骤（C）所述初乳乳剂按60滴/min滴入含有5 mL 0.1wt%吐温-20的50 mL 1wt%PVA溶液中形成外水相，持续搅拌形成复乳；
（E）将步骤（D）所述复乳充分离心，弃上清液，再经超纯水反复冲洗离心3次，冷冻干燥，在-20℃下避光保存。
5.根据权利要求4所述的负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架，其特征在于：步骤（B）中所述超纯水与甲醇的混合液中，超纯水与甲醇的体积比为1:1。
6.一种如权利要求1~5中任一项所述的负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）分别将胶原、壳聚糖溶于0.1wt%的冰醋酸中制备成胶原溶液和壳聚糖溶液；
（2）将透明质酸钠溶于蒸馏水或去离子水制备成透明质酸溶液；
（3）将步骤（1）所得胶原溶液与壳聚糖溶液混合，漩涡搅拌混合均匀；
（4）将步骤（2）所得透明质酸钠溶液缓慢加入步骤（3）的混合漩涡溶液中，混合均匀；
（5）将负载KGN小分子的PLGA微球加入步骤（4）所得混合溶液中，磁力搅拌过夜，冷冻干燥后添加交联剂进行交联；
（6）交联后用Na2HPO3、NaCl和蒸馏水反复冲洗至中性，二次冷冻干燥后即得负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架。
7.根据权利要求5所述的一种负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述交联剂是由2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物、1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺溶于体积浓度为40%的乙醇溶液中制得，其中2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物、1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为50:33:8。
8.根据权利要求5所述的一种负载KGN的胶原/壳聚糖/透明质酸钠复合支架制备方法，其特征在于：步骤（6）中所述Na2HPO3和NaCl分别为0.1M Na2HPO3、1M NaCl和2M NaCl。
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