CN106729701B

CN106729701B - 阿魏菇多糖作为制备树突状细胞疫苗佐剂的应用

Info

Publication number: CN106729701B
Application number: CN201611178861.4A
Authority: CN
Inventors: 李金耀; 李金玉; 袁鹏飞; 阿地拉·艾皮热
Original assignee: Xinjiang Ding Ju Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Xinjiang Dingju Medical Laboratory Co.,Ltd.
Priority date: 2016-12-19
Filing date: 2016-12-19
Publication date: 2020-02-04
Anticipated expiration: 2036-12-19
Also published as: CN106729701A

Abstract

本发明公开了阿魏菇多糖（PFPS）作为制备树突状细胞疫苗佐剂的应用。阿魏菇多糖具有刺激树突状细胞成熟的作用，从而促进树突状细胞疫苗免疫反应，提高抗肿瘤效果。

Description

阿魏菇多糖作为制备树突状细胞疫苗佐剂的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及阿魏菇多糖作为制备树突状细胞疫苗佐剂的应用。

背景技术

树突状细胞（dendritic cell；DC）是机体专职的抗原递呈细胞，可以识别、捕获和加工抗原，并将抗原递呈给naïve T细胞，激活抗原特异性的免疫反应，从而连接固有免疫***和获得性免疫***。在抗原递呈过程中，不同的信号参与了抗原特异性T细胞的激活，包括MHC-多肽复合物、DC和T细胞表面共刺激分子之间的相互作用、DC分泌的细胞因子等。DC分泌的白细胞介素-12（IL-12）可促进CD4⁺ Th1型免疫反应及细胞毒性T淋巴细胞反应，这两种免疫反应在肿瘤治疗中起着重要作用。DC疫苗（DC-based vaccine）是一种具有前景的肿瘤治疗性疫苗形式，在临床上可以诱导产生抗原特异性的免疫反应，安全性高。然而，由于DC未达到最佳成熟状态，并且分泌的IL-12水平较低，导致DC疫苗的临床效果有限。因此，需要通过佐剂提高DC成熟状态及IL-12分泌水平，从而提高DC疫苗的临床效果。

佐剂（如钟样受体激动剂：toll-like receptor (TLR) agonists）被广泛应用于新型疫苗（如多肽/蛋白疫苗、DNA疫苗及DC疫苗等），以提高疫苗的免疫原性。但是大部分佐剂具有毒副作用，不适合临床应用。目前美国FDA及欧洲批准用于临床应用的佐剂种类非常少，仅包括铝化合物佐剂、MF59、AS03、AF03及AS04。因此，急需开发新型、安全、高效的免疫佐剂增强疫苗的免疫原性，提高抗原特异性免疫反应，发挥疫苗良好的预防和治疗效果。

中草药已经有几千年的临床应用历史，临床效果与其有效成分对机体的免疫调节作用，尤其是对抗原递呈细胞的成熟状态及功能的调节密切相关，其安全性得到了充分的验证，并具有多效性，无依赖性等特征，是筛选安全、高效佐剂的理想来源。

发明内容

本发明的目的是将从中药阿魏菇（Pleurotus ferulae）中提取纯化得到的阿魏菇多糖（PFPS）作为树突状细胞疫苗佐剂，刺激树突状细胞成熟，从而促进树突状细胞疫苗免疫反应，提高抗肿瘤效果。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

阿魏菇多糖作为制备树突状细胞疫苗佐剂的应用。

优选地，所述阿魏菇多糖为均一多糖，分子量为1500～1600kDa。

阿魏菇多糖的提取纯化方法，包括：

（1）采用水提醇沉法得到阿魏菇粗多糖；

（2）将阿魏菇粗多糖溶解于水中，然后过二乙氨基乙基纤维素柱，流动相为水和/或盐水。

优选地，所述盐水为浓度为0.05～0.3mol/L的氯化钠溶液。

优选地，所述盐水为浓度为0.05mol/L的氯化钠溶液。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1 （A）阿魏菇粗多糖的洗脱曲线及洗脱液多糖含量，（B）不同流动相所得的洗脱液体外刺激DC成熟的活性。

图2 （A）为PFPS-0.05的纯化及分子量检测过丙烯葡聚糖凝胶S-300HR的洗脱曲线，（B）PFPS-0.05的高效凝胶渗透色谱图。

图3 为PFPS-0.05对DC成熟及细胞因子表达的影响。收集体外培养的不成熟DC，用10、50、100 μg/ml的PFPS-0.05 或者 20 ng/ml的LPS刺激12小时。（A）通过流式细胞术检测DC表面CD40、CD80、 CD86和MHC II的表达。图中显示了这些蛋白的平均荧光强度（MFI）。（B）酶联免疫吸附法（ELISA）测定DC培养上清中白细胞介素-12（IL-12）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达量。数据来自4个独立的实验，并进行单因素方差分析，*P<0.05、**P<0.01、***P <0.001，处理组与未处理组比较得出。

图4 为TLR4抑制剂对DC成熟及细胞因子表达的影响。收集体外培养的不成熟DC，用TLR4抑制剂（TAK-242）进行预处理，然后用10、50 、100 μg/ml的PFPS-0.05 或者 20 ng/ml的LPS刺激12小时。（A）通过流式细胞术检测DC表面CD40的表达。上边重叠峰图为CD40表达水平，下边为CD40的平均荧光强度（MFI）。（B）ELISA测定DC培养上清中IL-12及TNF-α的表达量。数据来自3个独立的实验，并进行成对t检验。

图5 为TLR4信号通路分子磷酸化水平检测。收集体外培养的不成熟DC，用50 μg/ml的PFPS-0.05进行刺激，在不同时间点收集DC，提取细胞质及细胞核蛋白，通过Westernblot检测TLR4信号通路分子的磷酸化水平。

图6 为PFPS-0.05刺激的DC与人***瘤病毒（HPV）多肽孵育后（HPV+PFPS+DC）对肿瘤的治疗效果。肿瘤模型建立后，治疗分为早期治疗及晚期治疗，早期治疗组在第5天及第12天注射HPV+PFPS+DC，晚期治疗组在第12天及第19天注射HPV+PFPS+DC。对照组分别为在第5天及第12天注射PFPS+DC，或不治疗组。（A）左边为肿瘤体积生长曲线，右边为计算的曲线下面积（AUC）。（B）实验结束后，分离肿瘤并称重。数据进行单因素方差分析，*P<0.05、**P<0.01，治疗组与不治疗组比较得出。

图7 为肿瘤小鼠脾脏中CD4⁺和CD8⁺ T细胞比例及亚群比例。实验结束后，分离脾脏细胞，通过流式细胞术检测CD4⁺（A）和CD8⁺（B）T细胞比例及亚群比例。*P<0.05、**P<0.01，治疗组与不治疗组比较得出。（C）CD4⁺和CD8⁺ Tem细胞比例与肿瘤体积相关性。

图8 为HPV特异性细胞免疫反应及骨髓来源的抑制性细胞（MDSCs）和巨噬细胞的比例。实验结束后，分离脾脏细胞。（A）脾脏细胞用HPV多肽刺激过夜，通过流式细胞术检测HPV特异性细胞免疫反应。（B）CD8⁺ IFN-γ⁺细胞比例与肿瘤体积相关性。（C）MDSCs（CD11b⁺Gr-1⁺）及巨噬细胞（CD11b⁺Gr-1^-）在肿瘤小鼠脾脏中的比例。（D）MDSCs比例与肿瘤体积相关性。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，治疗组与不治疗组比较得出。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

阿魏菇多糖的提取纯化

称取100g阿魏菇冻干粉，用1 L 95%乙醇浸提2小时去脂，5000 rpm/min离心10min收集沉淀，沉淀用1 L去离子水重悬，60℃水浴2小时，超声20min助溶，6000 rpm/min离心15 min，收集上清，滤渣反复浸提4次后，合并上清液，在60℃水浴温度下真空旋转浓缩至1/10体积后，用Sevage试剂法：按浓缩液：Sevage试剂（氯仿：正丁醇=4:1）=3:1比例混合，磁力搅拌30min后，6000rpm/min 离心10 min，保留上清，反复脱蛋白6次，所得上清加无水乙醇至终浓度为80%， 4℃过夜，6000rpm/min离心10 min，沉淀用无水乙醇，丙酮各洗涤一次，自然干燥3小时后得粗多糖。

称取360 mg粗多糖重新溶解于去离子水中（浓度约5 mg/ml），经0.22 μm超滤杯过滤后，真空旋转浓缩至终浓度约为20 mg/ml，过DEAE-52纤维素柱层析（2.6×66 cm），依次用去离子水、0.05 M、0.1 M和0.3 M NaCl溶液阶段洗脱柱子，流速为1.0 ml/min，5 ml/tube收集洗脱液，采用苯酚硫酸法在490 nm处测定多糖含量，绘制洗脱曲线（图1A）。按照洗脱峰收集合并组分，透析冷冻干燥，分别命名为PFPS-W、PFPS-0.05、PFPS-0.1及PFPS-0.3，多糖纯度分别为59%、96%、70%及35%。

阿魏菇多糖刺激DC成熟活性检测

以不同浓度的纯化的PFPS处理体外培养的不成熟DC，12小时后通过流式细胞术检测DC表面CD40的表达（图1B）。可以看出，PFPS-W、PFPS-0.05、PFPS-0.1均具有刺激DC成熟的活性，其中盐洗脱的多糖刺激DC成熟的活性显著高于水洗脱的多糖。

PFPS-0.05的分子量测定

基于多糖纯度及刺激DC成熟活性，我们选取0.05 M NaCl洗脱的PFPS-0.05进行进一步的分析。PFPS-0.05经0.22 μm滤膜过滤后，过丙烯葡聚糖凝胶S-300HR，以去离子水进行洗脱，3 ml/tube收集洗脱液，流速为0.5 ml/min, 苯酚硫酸法测定吸光值，绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线，得到一个纯洗脱峰（图2A）。我们采用高效凝胶渗透色谱法（highperformance gel-permeation chromatography）检测了PFPS-0.05的均一度及分子量检测（图2B）。移动相为0.71%的硫酸钠，流动速率为0.5 ml/min。结果显示，PFPS-0.05为成分均一的多糖。以分子量为9.75, 36.8, 135.35, 300.6 and 2000 kDa的右旋糖苷标准品制备标准曲线，计算PFPS-0.05的分子量大约为1500～1600 kDa。

PFPS-0.05促进DC成熟及细胞因子表达

以不同浓度（10、50和100 mg/ml）的PFPS-0.05刺激体外培养的不成熟DC，12小时后收集细胞，采用流式细胞术检测DC表面CD40、CD80、CD86和MHC II分子的表达。如图3A所示，PFPS-0.05显著提高了CD40及CD86的表达水平，并呈剂量依赖性。CD80及MHC II的表达水平也有一定的提高。收集上述细胞培养上清，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定白细胞介素-12（IL-12）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达量。如图3B所示，PFPS-0.05显著增加了IL-12及TNF-α的分泌水平，水平与阳性对照细菌脂多糖（LPS）相当。结果显示，PFPS-0.05促进了DC的成熟及细胞因子表达。

PFPS-0.05通过TLR4信号通路刺激DC成熟

为了验证PFPS-0.05是否通过TLR4信号通路刺激DC成熟，我们用TLR4抑制剂（TAK-242）对DC进行预处理，然后用不同浓度的PFPS-0.05或LPS刺激。12小时后检测CD40表达及细胞因子分泌。如图4A&B所示，TAK-242预处理显著抑制了PFPS-0.05及LPS诱导的CD40的表达及IL-12和TNF-α的分泌水平，结果暗示PFPS-0.05通过TLR4信号通路刺激了DC成熟。

我们进一步检测了TLR4信号通路下游分子的活性状态。50 mg/ml的PFPS-0.05处理后，在不同时间点收集细胞，提取细胞质及细胞核蛋白，通过Western blot检测TLR4信号通路分子的磷酸化水平。如图5所示，JNK和ERK在10 min时被磷酸化，30 min时磷酸化水平开始降低。p38也在10 min时被磷酸化，并持续到了240 min。我们也观察到，在30 min时被磷酸化并且持续到了240 min。结果显示，PFPS-0.05激活了TLR4下游MAPK及

信号通路。

PFPS-0.05刺激的DCs与人***瘤病毒（HPV）多肽孵育后（HPV+PFPS+DCs）抑制了肿瘤的生长

为了检测PFPS-0.05刺激DC的抗肿瘤效果，我们用TC-1细胞建立了小鼠肿瘤模型。肿瘤模型建立后，治疗分为早期治疗及晚期治疗，早期治疗组在第5天及第12天注射HPV+PFPS+DCs（HPV+PFPS+DCs early），晚期治疗组在第12天及第19天注射HPV+PFPS+DCs（HPV+PFPS+DCs late）。对照组分别为在第5天及第12天注射PFPS+DCs，或不治疗组。每组8只小鼠，每隔一天测量一次肿瘤大小。对照组在27天时死了一只小鼠，肿瘤体积为3097 mm³，PFPS+DCs组在17天时死了一只小鼠，肿瘤体积为242 mm³，HPV+PFPS+DCs late组在31天时死了一只小鼠，肿瘤体积为1742 mm³，而HPV+PFPS+DCs early组所有小鼠均存活到了实验结束。如图6A所示，与对照组相比，早期治疗组和晚期治疗组均显著抑制了肿瘤的生长，抑制率分别为93%和62%。实验结束后，处死肿瘤小鼠，分离肿瘤，拍照并称重。如图6B所示，早期治疗组和晚期治疗组的肿瘤显著小于对照组，肿瘤重量也显著低于对照组。

HPV+PFPS+DCs改变了T细胞的数量及活性状态，诱导产生了HPV特异性的细胞免疫反应，并且降低了骨髓来源的抑制性细胞（MDSCs）的比例

采用流式细胞术，检测了肿瘤小鼠脾脏中T细胞的数量及活性状态，HPV特异性的细胞免疫反应及MDSCs的比例。如图7A&B所示，与对照组相比，早期治疗组和晚期治疗组小鼠脾脏中CD4⁺和CD8⁺ T细胞的比例显著上升。以CD44和CD62L为标志物，检测T细胞活性状态。与对照组相比，HPV+PFPS+DCs early组CD4⁺ Tem（效应记忆细胞），CD8⁺Tem和Tcm（中央记忆细胞）细胞的比例显著上升。进而发现，CD4⁺和CD8⁺Tem细胞的比例与肿瘤体积呈显著负相关性（图7C）。

我们接下来检测了HPV特异性的细胞免疫反应，HPV+PFPS+DCs early及late在一定程度上增加了CD4⁺ T细胞反应，但显著增加了CD8⁺ T细胞反应（图8A），并与肿瘤体积呈显著负相关性（图8B）。与对照组相比，HPV+PFPS+DCs early显著降低了MDSCs的比例，但没有改变巨噬细胞的比例（图8C）。我们也观察到MDSCs的比例与肿瘤体积呈显著正相关性（图8D）。结果显示，HPV+PFPS+DCs增强了T细胞的活性状态，诱导产生了HPV特异性的细胞免疫反应，降低了MDSCs的比例，从而抑制了肿瘤的生长。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.通过阿魏菇多糖的提纯方法获得的阿魏菇多糖作为制备树突状细胞疫苗佐剂的应用，其特征在于，所述阿魏菇多糖为均一多糖，分子量为1500～1600kDa；

所述阿魏菇多糖的提取纯化方法，包括：

（1）采用水提醇沉法得到阿魏菇粗多糖；

（2）将阿魏菇粗多糖溶解于水中，然后过二乙氨基乙基纤维素柱，流动相为盐水，以获得盐洗脱的高纯度阿魏菇粗多糖；

所述盐水为浓度为0.05mol/L的氯化钠溶液。