CN106719601A - 一种脐带保存液及其应用 - Google Patents

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葛啸虎
王飞
王一飞
黄幸
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    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0215—Disinfecting agents, e.g. antimicrobials for preserving living parts

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Abstract

本发明涉及医学领域，公开了一种脐带保存液及其应用。本发明所述脐带保存液包括生理盐水、甲砜霉素和甲硝唑。本发明选择生理盐水、甲砜霉素和甲硝唑作为脐带保存液的组分，相比传统的生理盐水加双抗的保存液，本发明在保持简单组成的基础上，在脐带保存效果上表现出更为出色的功效，不仅能够保证脐带正常化，而且降低染菌的程度，为脐带提供更加有利的保存环境。

Description

一种脐带保存液及其应用
技术领域
本发明涉及医学领域，具体的说是涉及一种脐带保存液及其应用。
背景技术
脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构，其外被羊膜，内含2条脐动脉、1条脐静脉，在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样***-华尔通氏胶(Whartonps Jelly)，从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)。
1991年McElreavery首次从人脐带华通氏胶分离培养出一种具有多项分化潜能的成纤维样细胞，即人脐带间充质干细胞(human umbilical cordmesenchymal stem cells，hUC-MSCs)。hUC-MSCs比来源于骨髓、脂肪以及其他组织的MSCs更具有优势，首先，脐带来源不受伦理争议，并且成本较低；其次，hUC-MSCs不会引起畸胎瘤，并且具有抑癌性，由于hUC-MSCs还具有低免疫原性、免疫调节、基质支持、旁分泌、迁移和基因稳定性，故具有良好的临床治疗潜能。
脐带在采集、运输、分离的过程中都需要处于无菌状态，由于孕妇分娩时间的不确定性，脐带在采集后不能完全保证马上用于原代分离，大多数情况下都需要保存一段时间，脐带保存液的功效决定了脐带原代分离的成功率，传统采用将脐带组织浸没在含多种组分的PBS中，例如专利CN101868536A公开了一种保存液，配方为186μg/mL CaCl2·2H2O，400μg/mL KCl，60μg/mL KH2PO4，200μg/mLMgSO4·7H2O，8000μg/mL NaCl，350μg/mL NaHCO3，90μg/mL NaH2PO4·7H2O，2000μg/mL葡萄糖、及青霉素和链霉素的1％等摩尔混合物。但是，这种PBS保存液配制较为复杂和繁琐，自行配置工作量较大，而购买成品，因为其价格昂贵导致成本增加。
针对上述问题，现有专利CN102550543A公开了一种成分简单的脐带保存液，由生理盐水、青霉素和链霉素组成。虽然在该保存液制备上比较简单，而且成本也较低，但是随着青霉素和链霉素的大面积使用，导致一些耐药性的细菌产生，使得这种双抗的保存液在保存脐带的效果方面不尽如人意。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于一种脐带保存液及其应用，使得所述脐带保存液组成简单，同时保证脐带较好的保存效果。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种脐带保存液，包括生理盐水、甲砜霉素和甲硝唑。
针对现有的含有双抗的脐带保存制剂保存效果不佳的问题，本发明从脐带的保存效果角度考虑调整保存液中的成分，选择甲砜霉素、甲硝唑和生理盐水组成全新的保存液对脐带进行保存，达到了较高的保存效果。
其中，作为优选，甲砜霉素浓度为5-20mg/ml，更优选为6mg/ml；甲硝唑浓度优选为5-20mg/ml。在本发明具体实施方式中，上述两个组分浓度可选择如下：
(1)甲砜霉素浓度为10mg/ml，甲硝唑浓度为15mg/ml；
(2)甲砜霉素浓度为20mg/ml，甲硝唑浓度为10mg/ml；
(3)甲砜霉素浓度为15mg/ml，甲硝唑浓度为8mg/ml；
(4)甲砜霉素浓度为8mg/ml，甲硝唑浓度为18mg/ml；
(5)甲砜霉素浓度为6mg/ml，甲硝唑浓度为5mg/ml；
本发明保存液和专利CN102550543A实施例1保存液进行保存效果的对比试验，结果显示，经过本发明保存液保存24h后，脐带污染率在5％以下，而专利CN102550543A实施例1保存液在保存脐带24h后，污染率为10％。同时，本发明还将经过保存液保存过的脐带进行hUC-MSCs的分离，在经过传代第3代时绘制细胞生长曲线，结果表明，本发明保存液和现有专利的保存液均不影响hUC-MSCs的增殖能力。
由此，本发明随之提供了本发明所述脐带保存液在保存脐带和/或制备保存脐带的产品中的应用。
同时，本发明提供了一种保存脐带的方法，将脐带分离后置于本发明所述脐带保存液中，于4℃下保存。
由以上技术方案可知，本发明选择生理盐水、甲砜霉素和甲硝唑作为脐带保存液的组分，相比传统的生理盐水加双抗的保存液，本发明在保持简单组成的基础上，在脐带保存效果上表现出更为出色的功效，不仅能够保证脐带正常化，而且降低染菌的程度，为脐带提供更加有利的保存环境。
附图说明
图1所示为不同保存液保存脐带后分离的hUC-MSCs的生长曲线。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种脐带保存液及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明产品和应用已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种脐带保存液及其应用做进一步说明。
实施例1：本发明所述脐带保存液
生理盐水，甲砜霉素浓度为10mg/ml，甲硝唑浓度为15mg/ml；
实施例2：本发明所述脐带保存液
生理盐水，甲砜霉素浓度为20mg/ml，甲硝唑浓度为10mg/ml；
实施例3：本发明所述脐带保存液
生理盐水，甲砜霉素浓度为15mg/ml，甲硝唑浓度为8mg/ml；
实施例4：本发明所述脐带保存液
生理盐水，甲砜霉素浓度为8mg/ml，甲硝唑浓度为18mg/ml；
实施例5：本发明所述脐带保存液
生理盐水，甲砜霉素浓度为6mg/ml，甲硝唑浓度为5mg/ml；
实施例6：脐带保存试验
保存液A-E：实施例1-实施例5保存液；
保存液F：专利CN102550543A实施例1保存液；
方法：
采集脐带50条(均经过产妇授权同意，胎儿均足月生产且产妇无传染性疾病)，每条脐带平均截断6份，分别置于中保存液A-F中，均置于4℃保存24h。保存24h后，统计六组标本采集液的阳性率，即依据药典检测是否含有微生物。结果见表1。
表1脐带保存试验结果
保存液 污染率(污染数/总数)
保存液A 1/50，2％
保存液B 1/50，2％
保存液C 1/50，2％
保存液D 1/50，2％
保存液E 1/50，2％
保存液F 5/50，10％
由表1可以看出，经过本发明保存液保存过的脐带，其污染率均在5％以下，而现有专利中的保存液污染率已经达到10％。
实施例7：保存液对hUC-MSCs的影响
将实施例4中相同来源的脐带经保存液E和保存液F保存24h后按照常规方法分离hUC-MSCs，并传代至第3代，分别取两组对数生长期的第3代细胞，取12孔培养板，每孔以10000cell/孔的密度将复苏后的细胞各接种于孔中，每孔加入含相关培养液1mL，置于37℃,5％CO2培养箱中培养，每三天换液一次。从第2天开始(刚刚复苏的细胞需要约24h适应环境)，每隔24h取出板，随机选择3孔，吸弃旧培养液并用PBS清洗，加胰酶消化细胞，终止消化后，制备单细胞悬液，吹匀，取10μL细胞悬液与10μL0.4％台盼蓝混匀后加样到血细胞计数板上，10倍镜下计数计数板四角大方格内细胞的数量，以时间为横轴，细胞数为纵轴绘制细胞生长曲线，结果见图1和表2。
表2
天数 保存液E*104cell 保存液F*104cell
2 1.1 1.12
3 1.2 1.41
4 1.33 1.68
5 2.76 2.89
6 5.82 6.11
7 12.13 12.21
8 12.14 12.2
由表2和图1可以明显看出，两个保存液均对hUC-MSCs的增殖无影响。
实施例8：细胞免疫表型分析
取保护液E组第3代细胞，消化后清洗3次，制成细胞悬液，加入抗体，流式细胞仪检测分析CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR的表达情况。结果见表2。
表2
CD73 CD90 CD105 CD11b CD19 CD34 CD45 HLA-DR
100.00％ 99.90％ 95.70％ 0.50％ 0.00％ 0.30％ 0.10％ 0.60％
由表2的流式细胞学检测结果可知，保护液E组第3代细胞不表达造血细胞标记CD34，CD45，CD11，HLA-DR和CD19，而整合素和黏附分子CD90，以及常用的人间充质干细胞标记CD73，CD105则均呈高表达，符合脐带间充质干细胞的特性。此外，将保护液A-D四组第3代细胞进行检测，结果相同。
实施例9：体外向脂肪细胞诱导分化检测
保护液E组第3代细胞，按2.5*104细胞浓度接种于含有DMEM/F12+20％FBS培养基的24孔板中，至细胞80％融合时，更换为含有1nmol/L***、10mg/L胰岛素、0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、100μmol/L吲哚美辛的培养液，每周换液2次，3周后用多聚甲醛固定，油红O染色。
结果显示，保护液E组第3代细胞可以形成脂肪细胞，油红O染色发现后者细胞浆充满了油滴空泡，说明该保存液保存脐带后得到的细胞具有正常的分化能力。此外，将保护液A-D四组第3代细胞进行成脂分化，结果相同。
以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。

Claims (6)

1.一种脐带保存液，其特征在于，包括生理盐水、甲砜霉素和甲硝唑。
2.根据权利要求1所述脐带保存液，其特征在于，甲砜霉素浓度为5-20mg/ml。
3.根据权利要求2所述脐带保存液，其特征在于，甲砜霉素浓度为6mg/ml。
4.根据权利要求1所述脐带保存液，其特征在于，甲硝唑浓度为5-20mg/ml。
5.权利要求1-4任意一项所述脐带保存液在保存脐带和/或制备保存脐带的产品中的应用。
6.一种保存脐带的方法，其特征在于，将脐带分离后置于权利要求1-4任意一项所述脐带保存液中，于4℃下保存。
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