CN106701976B

CN106701976B - 一种鸡常见细菌病的病原多重pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN106701976B
Application number: CN201710051961.9A
Authority: CN
Inventors: 谷长勤; 张晓茜; 程国富; 张万坡; 胡薛英; 谢长清
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2017-01-23
Filing date: 2017-01-23
Publication date: 2019-10-25
Anticipated expiration: 2037-01-23
Also published as: CN106701976A

Abstract

本发明公开了一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒，所述的试剂盒包括PCR反应液以及多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌这4种细菌的特异性引物，阳性对照（多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌标准品或多杀性巴氏杆菌KMT1基因、沙门氏菌invA基因、大肠杆菌O157:H7 rfbE基因和金黄色葡萄球菌nuc基因的阳性质粒），阴性对照（灭菌的无酶双蒸水）、DNA Marker。本发明运用四重PCR，能快速、准确、同步地检测4种病原菌，且敏感性好，特异性强，检测下限达到0.01ng/μL，准确率高达92.6%。

Description

一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒，还涉及该试剂盒的使用方法。

背景技术

大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和多杀性巴氏杆菌是鸡生长过程中常见的细菌性疾病的病原。它们不仅严重危害我国养禽业的发展，而且大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌还可以通过食品污染感染人类，给人类健康造成威胁。

大肠杆菌(E.Coli)O157:H7是肠出血性大肠杆菌的一个主要菌型，能引起人畜共患病，其潜在的暴发流行趋势、强烈的致病性、致死性，使其对养殖业及人类安全有极大的危害。沙门氏菌(Salmonella)是人畜共患病病原菌，极易产生耐药性，对养殖业危害严重，在引起人类食源性疾病的病原菌中占首位。多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)是引起人和动物接触性、烈性细菌传染病(又称禽霍乱、出血性败血症)的条件致病菌，其高发病率和死亡率，对养殖业影响严重，被列为重点防制的家禽疫病之一，近几年有病例逐渐增多的趋势。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是动物化脓感染、交叉感染最常见的病原菌，有“嗜肉菌”的别称，是目前养鸡生产中危害最严重的疾病之一。同时我国法律对上述细菌(巴氏杆菌除外)在食品中的数量有严格的限定。

目前针对养殖场细菌病的检测，主要依赖于细菌学培养，一般耗时4-7d，检测方法比较繁琐、费时，要同时检测分离养殖场多种致病菌及混合感染情况较麻烦。免疫印迹技术、酶联免疫吸附法、核酸杂交技术、PCR技术等因其特异性强、敏感性高、操作简单快速而被广泛应用，但这些方法通常每次只能检测一种病原菌。多重PCR(Multiplex PCR)是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型DNA扩增技术，是在同一反应体系中同时加入多对引物扩增多条目的DNA片段，可实现多种病原微生物同时检测。多重PCR技术的优势在于可以对病原进行快速、全面、***、准确的检测与鉴定，并且操作和普通PCR一样简单，所以可以大大提高检测效率、缩短检测周期、降低检测成本，特别适合成组病原体的检测，具有显著的经济效益和社会效益。

本发明旨在建立一种四重PCR快速检测方法，实现对大肠杆菌0157：H7、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌引起的四种人畜共患传染病的同步快速检测，对流行病调查及有效进行畜禽疫病监测防控、提高公共卫生安全具有一定意义。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒，该试剂盒由多重PCR反应液、阳性对照以及阴性对照品组成。以往在家禽中检测病原菌大多通过细菌的分离鉴定或运用针对单个菌的PCR检测，本检测试剂盒针对鸡细菌病最常见的4种细菌，设计并筛选出互不干扰的4对检测引物，检测4种病原菌在一个反应中完成，更为高效，且敏感性好，特异性强，检测下限达到0.01ng/μL。

本发明还有一个目的是在于提供了一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒的使用方法，方法简单，快速，所有检测步骤可在4小时内完成。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒，包括多重PCR反应液(TaqDNA聚合酶、不含Mg²⁺的PCR反应缓冲液、Mg²⁺、dNTPs)，多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌这4种细菌的特异性引物(如表1所示)，阳性对照(多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌标准品或多杀性巴氏杆菌KMT1基因、沙门氏菌invA基因、大肠杆菌O157:H7rfbE基因和金黄色葡萄球菌nuc基因的阳性质粒)，阴性对照(灭菌的无酶双蒸水)、DNA Marker。

表1多重PCR特异性引物序列表

一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒的使用方法，其步骤如下：

1、样品的处理与DNA模板的提取：

感染早期肠道是以上4种致病菌的主要寄生部位，活禽取样主要通过采集***棉拭子，死禽可取肠道内容物，肉制品可直接取小块组织。提取样品的基因组DNA，取2μL(20ng)作为待测样品。每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。

2、反应体系与反应条件：

反应体系如下(总体积25μL)：

反应条件：预变性94℃4min；变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃45S，共循环30次；终延伸72℃10min，。

PCR产物鉴定：取8μL PCR扩增产物加2μL 6×Loading Buffer混匀，以DL2000 DNAMarker作为相对分子质量指示，用1.8％琼脂糖凝胶(含EB 0.03μL/mL)在100V电压下电泳30min，置凝胶成像***中进行结果分析。

3、结果的判断：

(1)质控标准

阴性对照：点样孔对应的泳带上无条带；

阳性对照：点样孔对应的泳带上有4条明显的阳性条带：大肠杆菌O157:H7扩增的阳性片段678bp(500-700bp之间)、沙门氏菌284bp(略高于250bp)、多杀性巴氏杆菌460bp(接近500bp)、金黄色葡萄球菌229bp(低于250bp)；

如果阴性对照或者阳性对照有一项不符合标准则本次检测无效。

(2)判定结果

检测样品孔对应的泳道上无条带，结果判定为阴性；

检测样品孔对应的泳道上出现≤4条泳带，与标准阳性孔对应的条带进行比较，如果条带在一条直线上，对应的细菌检测结果判断为阳性；如果不在一条直线上或检测孔的泳道上出现≥5条泳带，可能试验过程污染，建议重做。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

1、目前，养殖业临床病例多种疾病交叉感染、混合感染的情况屡见不鲜，甚至有越来越复杂的势态，但检测畜禽细菌性临床病例及进行流行病学调查主要采取细菌分离鉴定法，需多个检测步骤，操作复杂、耗时费力，并且一次只能检测一种病原菌。本研究建立的多重PCR检测方法克服了以上的不足，细菌培养后，完成同时检测大肠杆菌O157：H7、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌四种病原菌的任务，只需大约4h，有较好的特异性和敏感性(检测下限可达10pg/uL)，比传统的细菌学方法简便经济，有较大的应用价值。

2、多重PCR反应体系中存在多对引物和多个模板，任意两者均存在发生相互作用的情况，造成假阳性的出现，因此引物的设计成为多重PCR检测方法建立的关键因素，本发明提供的检测引物确保不同引物对之间、引物与非靶序列之间没有同源关系，扩增的四条目的基因片段长度亦有一定差距，并使琼脂糖凝胶在一定的浓度范围内，保证电泳时目的条带能明显区分。

3、本发明提供的试剂盒可用于鸡等活禽肛拭子的检测，有利于临床的推广。本试剂盒也可用于肉制品加工过程中的细菌污染检测。该试剂盒为养殖业以及食品卫生中以上四种细菌的检测与防控提供了有效的工具与方法，准确率高达92.6％。

附图说明

图1为本发明所述的多重PCR检测试剂盒内单一引物的特异性检测结果

注：A为大肠杆菌O157引物的特异性检测结果；B为沙门氏菌引物的特异性检测结果；C为多杀性巴氏杆菌引物的特异性检测结果；D为金黄色葡萄球菌引物的特异性检测结果。

图2为本发明所述的多重PCR检测试剂盒内四种细菌引物混合特异性检测结果

注：A为检测一种细菌的特异性扩增结果；B为检测两种细菌的特异性扩增结果；C为检测三种细菌的特异性扩增结果；D为检测四种菌液混合液的检测结果。

图3为本发明所述多重PCR检测试剂盒灵敏度测试的结果图

注：M：DL2000Marker；1：10ng/μL；2：1ng/μL；3：0.1ng/μL；4：0.01ng/μL；5：0.001ng/μL；6：0.1pg/μL。

图4为本发明所述多重PCR检测试剂盒检测模拟样品的结果图

注：M：DL2000Marker；1、4、9：大肠杆菌O157:H7；2、5、8：沙门氏菌；3、6、10：多杀性巴氏杆菌；7、11、12：金黄色葡萄球菌；13-16：四株菌的阳性对照；17-20：阴性对照。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：

鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒及使用方法

一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：多重PCR反应液、阳性对照、阴性对照、DNAMarker2000(100bp,250bp,500bp,750bp,1000bp,2000bp；TaKaRaLtd)，四对细菌的特异性引物(10uM)：rfbE-F(SEQ ID NO.1)，rfbE-R(SEQ ID NO.2)，invA-F(SEQ ID NO.3)，invA-R(SEQ ID NO.4)，KMT1-F(SEQ ID NO.5)，KMT1-R(SEQ ID NO.6)，nuc-F(SEQ ID NO.7)，nuc-R(SEQ ID NO.8)；

所述的多重PCR反应液为：Taq DNA聚合酶(2-5U/μL)、不含Mg²⁺的10×PCR反应缓冲液、25mM Mg²⁺和10mM dNTPs；

所述的阳性对照为：大肠杆菌O157:H7(CICC21530)标准品、沙门氏菌(CVCC3375)标准品、多杀性巴氏杆菌(CVCC44801)标准品、金黄色葡萄球菌(SY1G7)标准品(购自中国微生物菌种保藏中心)或大肠杆菌O157:H7rfbE基因阳性质粒、沙门氏菌invA基因阳性质粒、多杀性巴氏杆菌KMT1基因阳性质粒、金黄色葡萄球菌nuc基因的阳性质粒；

所述的阴性对照为灭菌的无酶双蒸水；

所述的特异性引物为：

rfbE-F 5′-AACGGTTGCTCTTCATTTAG-3′(SEQ ID NO.1)

rfbE-R 5′-GAGACCATCCAATAAGTGTG-3′(SEQ ID NO.2)

invA-F 5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′(SEQ ID NO.3)

invA-R 5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′(SEQ ID NO.4)

KMT1-F 5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′(SEQ ID NO.5)

KMT1-R 5′-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′(SEQ ID NO.6)

nuc-F 5′-AGATAACGGCGTAAATAGAAGTGG-3′(SEQ ID NO.7)

nuc-R 5′-TGCACTTGCTTCAGGACCATA-3′(SEQ ID NO.8)

1、样品的处理与DNA模板的提取：

感染早期肠道是以上4种致病菌的主要寄生部位，活禽取样主要通过采集***棉拭子，死禽可取肠道内容物，肉制品可直接取小块组织。所取样品使用德国QIAGEN公司QIAxtractor高通量核酸纯化工作站提取DNA模板，也可使用其它DNA提取试剂盒提取，具体步骤参照说明书，取2μL(20ng)作为待测样品。每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。

2、反应体系与反应条件：

反应体系如下(总体积25μL)，各成分的浓度同实施例1：

反应条件：预变性94℃4min，变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃45S，共循环30次，终延伸72℃10min。

3、结果的判断：

(1)质控标准:

阴性对照：点样孔对应的泳带上无条带；

(2)判定结果：

检测样品孔对应的泳道上无条带，结果判定为阴性；

实施例2：

鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒特异性引物的设计和筛选

一、材料与方法

1、细菌菌株

标准菌株：多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida CVCC44801)、沙门氏菌(Salmonella enteritidis CVCC 3375)、大肠杆菌O157:H7(Escherichia coliCICC21530)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus SY1G7)标准菌株均购自中国微生物菌种保藏中心。16株实验室临床分离鉴定的细菌及编号：禽源细菌沙门氏菌HZBL08121、沙门氏菌CMCC50051、沙门氏菌HZBL08122、沙门氏菌HZBL08123、多杀性巴氏杆菌HBNKM、多杀性巴氏杆菌HBNK1G1、金黄色葡萄球菌GX12G54、霍乱弧菌HS1201、摩根氏菌HZBL08123、罗斯氏菌GX1202、粪肠球菌HS12E6、鸭疫里默氏杆菌ATCC11845、大肠杆菌HZBL08121、大肠杆菌HZBL08122、伪中间型葡萄球菌GX12G6、松鼠葡萄球菌GX12G5。

2、细菌DNA模板的提取同实施例1。

3、引物的设计与合成

根据GenBank中已发布的基因序列，利用Primer 5.0、Oligo 6.0和BLAST软件分析设计4对特异性引物(由上海生工合成)，引物序列及目的基因片段见表2。

表2多重PCR引物序列

4、单一引物PCR反应时检测4种细菌的特异性比较

为确定引物的特异性及单一PCR的最佳反应条件，将每一对引物分别对上述的20株病原菌进行PCR特异性扩增。初始反应体系为25μL：10×EasyTaq Buffer 2.5μL，dNTPs2.0μL，上下游引物各0.5μL，Taq DNA Polymerase 0.25μL，一种细菌的模板2.0μl，双蒸水补至25μL。初始反应程序为预变性94℃4min；变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃45s，共循环30次；终延伸72℃10min，于4℃保存。PCR结果鉴定同实施例1。

5、四种特异性引物混合后检测一种细菌和多种细菌的结果比较

为了减少引物混合后对目的基因扩增的影响，特设计以下4个试验来评价设计引物的特异性。

(1)四种引物混合后分别PCR反应检测一种细菌

反应条件同上述4，加入任意一种细菌模板。

(2)四种引物混合后分别PCR反应检测两种细菌

反应条件同上述4，加入任意两种组合的细菌模板。

(3)四种引物混合后分别PCR反应检测三种细菌

反应条件同上述4，加入三种任意组合的细菌模板。

(4)四种引物混合后分别PCR反应检测四种细菌

反应条件同上述4，加入四种细菌模板。

二、试验结果

1、单一引物PCR结果

将每对引物分别特异性扩增20个菌株，添加一种引物扩增的结果单一，条带清晰，与预期片段的大小一致，具体检测结果见图1，说明引物特异性良好。

2、四种引物混合PCR反应的特异性检测结果

四种引物混合后，不管是扩增一种细菌，还是多种细菌，对目的基因的扩增都未见影响。扩增的目的片段电泳后，条带清晰；多个目的片段也易于区分(见图2)。说明设计引物质量较高，完全可以用于临床样品的检测。

实施例3：

鸡常见四种细菌病病原多重PCR检测方法的特异性与敏感性：

一、材料与方法

1、标准菌株同实施例2。

2、按照实施例1所述多重PCR检测试剂盒的使用方法，分别提取多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌标准品样本的DNA并进行多重PCR反应。

3、四重PCR反应的特异性检测

选取实验室临床分离的禽源细菌16株(同实施例2)提取DNA，进行多重PCR检测。

4、四重PCR反应的敏感性检测

测定四种菌株(多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌)的DNA浓度并进行稀释，使初始浓度均大约为100ng/μL，进行10倍梯度稀释，稀释后的菌株浓度为10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL(即10pg/μL)、1pg/μL、0.1pg/μL，各菌株每个梯度各取200μL混合均匀，使反应体系中同时含四种DNA，灭菌的无酶双蒸水作为阴性对照，按照实施例1所述的多重PCR反应条件进行扩增。检测其敏感性和最低检测限，每个稀释梯度做3个检测重复。

5、模拟样品检测：分别取临床分离并保存的大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌各3株，编号为1-12，以本实验所用的标准菌株为阳性对照，灭菌的无酶双蒸水为阴性对照，应用优化后的多重PCR方法检测临床分离菌株，鉴定此多重PCR方法的可行性；然后将此12株细菌重新随机编号，并同原编号对应记录，制成人工模拟样品。

人工模拟样品的制备：将健康雏鸡无菌条件下进行剖检，将所取肝脏平均分成12份，将重新编号的12株病原菌分别接种于所取肝脏，各加入10mM/L的PBS200μL，将组织匀浆后分别加入2mL TSB液体培养基，置于恒温摇床中300r/min、37℃培养5h。将以上培养物按照煮沸法提取细菌DNA作为模板。运用已经优化后的多重PCR反应体系及条件对人工模拟样品进行检测。

二、试验结果

1、标准品四重PCR的检测结果

在一个反应体系中同时加入多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌标准品样本的DNA，如图2D所示，扩增出明显的4条泳带，从上到下依次为大肠杆菌O157:H7、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，显示一个反应体系可同时检测含4种菌株的样品，且互不干扰检测结果。

2、四重PCR反应的特异性检测结果

将前述16种菌株以及标准菌株运用本发明检测后，只有多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌反应结果呈阳性，检测结果见表2。

表2四重PCR特异性引物的鉴定

3、四重PCR反应的敏感性

多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌标准菌株样品经过倍比稀释后进行多重PCR扩增，针对各种细菌的检测结果重复性好(见图3)，四种菌株能同时检测至约0.1ng/μL，其中大肠杆菌O157：H7、金黄色葡萄球菌的最低检出限为10pg/μL。

4、模拟临床样品的检测结果

将模拟样品进行随机编号后检测结果(见图4)与已鉴定的临床分离菌株完全相符，说明此方法可用于临床病原菌检测。

实施例4：

多重PCR方法与细菌检测国标法检测临床样品的对比实验

运用建立的四重PCR方法对养殖户送检的90份临床样品进行了检测(可在4小时内完成)。同时与细菌检测国标法(分别为GB/T4789-2008及GB4789-2010、GB4789.10-2010)进行对比检测。

将优化后的多重PCR方法检测临床样品，并同时用国际标准方法进行对比实验，在随机挑选的513份样品中，两种方法检测的阳性数量分别为94份和87份见表3，正确率为92.6％。细菌分离鉴定结果也证实了多重PCR检测结果的正确性。

表3对比试验结果

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aacggttgct cttcatttag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagaccatcc aataagtgtg 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcatcgcacc gtcaaaggaa cc 22

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgaaattat cgccacgttc gggcaa 26

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atccgctatt tacccagtgg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctgtaaacg aactcgccac 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agataacggc gtaaatagaa gtgg 24

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgcacttgct tcaggaccat a 21

Claims

1.一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒，包括PCR反应液、阳性对照、阴性对照、特异性引物及DNA Marker，其特征在于：所述的特异性引物为

rfbE-F 5′-AACGGTTGCTCTTCATTTAG-3′(SEQ ID NO.1)

rfbE-R 5′-GAGACCATCCAATAAGTGTG-3′(SEQ ID NO.2)

invA-F 5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′(SEQ ID NO.3)

invA-R 5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′(SEQ ID NO.4)

KMT1-F 5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′(SEQ ID NO.5)

KMT1-R 5′-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′(SEQ ID NO.6)

nuc-F 5′-AGATAACGGCGTAAATAGAAGTGG-3′(SEQ ID NO.7)

nuc-R 5′-TGCACTTGCTTCAGGACCATA-3′(SEQ ID NO.8)

所述的阳性对照为：大肠杆菌O157：H7、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌的标准品或大肠杆菌O157：H7 rfbE基因阳性质粒、沙门氏菌invA基因阳性质粒、多杀性巴氏杆菌KMT1基因阳性质粒、金黄色葡萄球菌nuc基因阳性质粒；

所述的阴性对照为灭菌的无酶双蒸水。

2.根据权利要求1所述的鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒，其特征在于，PCR反应的体系如下：

反应条件：预变性94℃4min；变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃45s，共循环30次；

终延伸72℃10min。