CN106701917A - 一种用于鉴定甜瓜抗蔓枯病的专用引物及分子标记方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鉴定甜瓜抗蔓枯病的专用引物及分子标记方法；针对目前甜瓜在抗蔓枯病育种工作中存在的问题，如人工接种致病菌，鉴定蔓枯病抗性存在不准确、工作量大的缺点，通过提取甜瓜待检测样品的基因组DNA作为模板，利用分子标记专用引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，再通过电泳对扩增产物进行检测。提供了一种鉴定甜瓜蔓枯病抗性SSR分子标记及其专用引物，在甜瓜植株早期，就可完成对抗蔓枯病和不抗蔓枯病的甜瓜材料进行筛选的目的，具有鉴定准确，不受发病条件的限制，取材方便等优点。利用本发明进行甜瓜辅助育种，具有选择目标明确，节约育种时间和人工成本，提高育种效率等优点。

Description

一种用于鉴定甜瓜抗蔓枯病的专用引物及分子标记方法

技术领域

本发明涉及一种鉴定甜瓜蔓枯病抗性的专用引物及分子标记方法，属于分子生物学技术领域领域。

背景技术

甜瓜(Cucumis melo L.)属葫芦科黄瓜属草本植物，其果实具有甜、香、脆等特点，深受消费者喜爱，是我国重要的经济作物。各种病虫害，对甜瓜的生长发育造成严重影响，降低了甜瓜的产量和品质，为防治病虫害的发生，增加了甜瓜的生产成本，同时造成生态环境的破坏。

甜瓜蔓枯病(Gummy stem blight，GSB)是由子囊菌瓜类黑腐小球壳菌(Didymellabryoniae(Auersw)Rehm)引起的一种世界性的土传真菌病害，又称黑腐病、油秧病，致病菌无生理小种的发现。该病每年都给甜瓜造成巨大危害，特别是在高温高湿条件下，发病更加严重。化学方法是目前防治蔓枯病最常用的措施，成本较高，对环境不友好，易造甜瓜的成农药残留超标问题。通过筛选抗蔓枯病的甜瓜种质资源，培育抗蔓枯病的甜瓜品种是防治甜瓜蔓枯病最经济、有效的措施。

传统育种对甜瓜新品种的选育做出了巨大贡献，不过传统育种需要采用传统的杂交、回交和表型选择等工作，存在工作量大，育种周期长，受环境因素影响大等因素，分子标记辅助育种是利用物种的特定遗传标记与特定表型间的连锁性，通过检测分子标记，从基因型水平筛选种质资源，已被广泛应用到育种工作中，能够减少传统育种工作的工作量，缩短育种周期，具有较好的效果。筛选连锁型好，区分度高的分子标记及其专用引物，是分子标记辅助育种得以应用的前提条件。

随着甜瓜基因组测序的完成，特别是甜瓜各种SSR和SNP分子标记的公布，已有关于甜瓜抗蔓枯病种质资源和分子标记的报道。已报道的甜瓜抗蔓枯病的种质资源有Pl140471、Pl157082、Pl511890、Pl482398、Pl482399和Pl420145，其抗性基因分别为Gsb-1、Gsb-2、Gsb-3、Gsb-4、Gsb-5和Gsb-6，不过至今为止，还没有任何一个甜瓜抗蔓枯病的基因被成功定位和克隆。除Gsb-5为抗蔓枯病隐性基因外，其余都为抗蔓枯病的显性基因。刘文睿等设计了与Gsb-1连锁的分子标记CMCR505，张永冰等利用ISSR技术获得了与Gsb-2连锁的分子标记ISSR-57₅₆₀，王红英等筛选出与GSb-4连锁的SSR分子标记CMTA170a、SCAR分子标记SCAR_GB1，毕研飞等创建了与Gsb-6连锁的分子标记SGSB1800。这些抗蔓枯病甜瓜种质资源的发现和分子标记的开发，辅助了甜瓜抗蔓枯病新品种的培育。

甜瓜种质资源异常丰富，目前公布的抗蔓枯病的种质资源和分子标记数目较少，不能覆盖所有抗蔓枯病的甜瓜种质材料，且有些分子标记的特异性和连锁性较差，严重制约了甜瓜抗蔓枯病新的种质资源的开发和利用。需要筛选新的抗蔓枯病的甜瓜种植资源和分子标记，用于甜瓜抗蔓枯病的分子辅助育种工作。

发明内容

针对目前甜瓜在抗蔓枯病育种工作中存在的问题，如人工接种致病菌，鉴定蔓枯病抗性存在不准确、工作量大的缺点，本发明提供了一种鉴定甜瓜蔓枯病抗性SSR分子标记及其专用引物，通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)，在甜瓜植株早期，就可完成对抗蔓枯病和不抗蔓枯病的甜瓜材料进行筛选的目的，具有鉴定准确，不受发病条件的限制，取材方便等优点。

本发明的技术方案如下：

一种鉴定甜瓜蔓枯病抗性专用引物，其特征是所述引物为从5`端到3`端的第1-22位的单链DNA序列的正向引物CAAAGACATGGCGAGAAATTTG；从5`端到3`端的第1-21位单链DNA序列的反向引物GAAGGACGGTTAGCTTTGAGG。

利用本发明的分子标记专用引物，以待检测材料的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得分子标记，通过测序发现，在抗忙枯病的甜瓜材料中分子标记大小为135bp的PCR产物，从5`端到3`端的单链DNA序列为：CAAAGACATGGCGAGAAATTTGCGTTATTATCGATATATATATTATATTTGATTGACGTGTACTTTTGCCTTCATAGCTATATTAAATAATTAGCCATTGACCGTTATGAAAACCTCAAAAGCTAACCGTCCTTC；在易感蔓枯病甜瓜材料中为105bp的PCR产物，从5`端到3`端的单链DNA序列为：CAAAGACATGGCGAGAAATTTGCGTTATTATATATATATATATTATATTTGTTTTGGTATTTCCTAAGTCGCCGCCATGAAAACCTCAAAAGCTAACCGTCCTTC。

本发明的专用引物鉴定甜瓜蔓枯病抗性的分子标记方法，其特征是提取甜瓜待检测样品的基因组DNA作为模板，利用分子标记专用引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，再通过电泳对扩增产物进行检测。

具体步骤如下：

1)利用CTAB法提取甜瓜待测样品任意组织或器官的基因组DNA；

2)以步骤1所得的待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记专用引物对不同材料进行PCR扩增，获得扩增产物；

3)利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对步骤2所得的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，使不同大小的PCR扩增产物处于不同的位置；

4)利用银染的方法检测凝胶电泳的结果，经过银染，肉眼就可看到PCR扩增的DNA片段在凝胶中的位置，距离上样孔距离远的，是小的DNA片段105bp，距离上样孔近的，为大的DNA片段135bp；

5)通过判断片段大小，PCR扩增片段较大的为抗蔓枯病的甜瓜材料，扩增片段较小的为易感抗蔓枯病的甜瓜材料。

本发明获的优点如下：

利用本发明鉴定和筛选甜瓜抗蔓枯病的种质资源和辅助育种，具有选择目标明确，减少工作量，节约时间和人工成本，提高育种效率等优点。

本发明开发的分子标记用于鉴定甜瓜是否具有抗蔓枯病的特征，获得的片段相差30bp，结果易于观察，且在相同来源的甜瓜材料间具有普遍适用性。

此外，本发明所开发的分子标记与甜瓜的蔓枯病抗性紧密连锁，提供了快速、简便鉴定甜瓜是否具有蔓枯病抗性的分子标记，为甜瓜蔓枯病的抗病育种提供一种新的技术基础，可以加速甜瓜抗蔓枯病性状向优异骨干甜瓜品系的转育，加快甜瓜抗蔓枯病的新品种的选育。

附图说明

图1为本发明的分子标记专用引物以PI482398和白皮脆的杂交后代B、E、H、F、G的基因组DNA为模板进行PCR扩增结果；其中M表示DNA Marker，1为负对照，是以蒸馏水为模板进行PCR扩增的结果，2为杂交后代B的PCR扩增结果，3为杂交后代E的PCR扩增结果，4为杂交后代H的PCR扩增结果，5为杂交后代F的PCR扩增结果，6为杂交后代G的PCR扩增结果

图2为本发明的分子标记专用引物以甜瓜材料PI482398、白皮脆及其杂交后代A、C、D的基因组DNA为模板进行PCR扩增结果；其中M表示DNA Marker，1为负对照，是以蒸馏水为模板进行PCR扩增的结果，2为高感材料白皮脆的PCR扩增结果，表示感病材料的PCR结果，3为高抗材料PI482398的PCR扩增结果，表示抗蔓枯病材料的PCR结果，4为杂交后代A的PCR扩增结果，5为杂交后代C的PCR扩增结果，6为杂交后代D的PCR扩增结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中说使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所述的材料、试剂和仪器等，如无特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂和仪器，均可通过商业途径获得。

实施例1：供试材料与基因组DNA的提取

供试甜瓜材料

全部为甜瓜高代自交品系材料，为甜瓜材料PI482398与白皮脆，以及两者杂交后选育的后代，其中PI482398源自美国农业部国家植物种子资源***，是一种抗蔓枯病的甜瓜种植资源；白皮脆原产于新疆，为易感蔓枯病的优质、常规品种。将PI482398与白皮脆分别作为母本和父本进行杂交，在杂交后代中选育，获得对蔓枯病抗性不同的高代自交品系A、B、C、D、E、F、G、H，同PI482398、白皮脆一起用于分子标记检测甜瓜材料对蔓枯病的抗病性。

供试甜瓜材料基因组DNA的提取

采取CTAB法提取甜瓜材料的基因组DNA，具体步骤的步骤为：取待检测的不同甜瓜幼嫩叶片材料0.2g，加入1.5ml离心管中，加50μL 2％CTAB提取缓冲液，研磨，后补齐至400μL，65℃水浴40min，每10min轻摇一次；加入400μL氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻摇晃5min。12000rpm，离心5min；取上清200μL，加入预冷的异丙醇200μL混匀，-20℃放置20min；12000rpm离心10min；弃上清，加入150μL预冷乙醇，轻轻混匀，洗净异丙醇，10,000rpm，离心5min；弃上清，于室温下自然晾干或置于通风橱吹干；加蒸馏水100uL溶解DNA，室温放置1h；测定浓度之后，用蒸馏水将DNA原液稀释到50ng/μL，-20℃保存备用。

实施例2：分子标记的筛选及专用引物的设计

利用高通量测序技术，对已确定的抗蔓枯病甜瓜材料PI482398和易感蔓枯病甜瓜材料白皮脆两个甜瓜品系进行重测序，并进行序列比对，将获得的SSR分子标记与之前抗蔓枯病甜瓜种质资源及相关的分子标记做对比，寻找处于相似染色***置的标记，在分子标记的两端，设计专用引物，选择引物长度在20～26bp，退火温度在58～60℃，GC含量为40％-60％之间。

实施例3：PCR扩增获得目的片段

以实施例1中提取的待测样品的基因组DNA为模板，实施例2中设计的分子标记专用引物为引物，进行PCR扩增获得分子标记目的片段。PCR扩增的反应体系采用10μL的反应体系，所述混合液组成如下：

反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃变性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。

实施例4：PCR扩增产物的电泳分离与检测

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离实施例3获得的PCR扩增产物，具体步骤为：配置8％的非变性聚丙烯酰胺，待凝胶后，加入TBE缓冲液，将PCR产物加入上样孔中，进行电泳，至指示剂溴酚蓝电泳至胶板底部时，终止电泳。

利用银染的方法对电泳结束的胶进行染色，具体步骤为：电泳结束后，将胶放入固定液(含10％无水乙醇，0.5％冰醋酸)中固定5min；然后将胶转移到含0.02％硝酸银的溶液中进行银染12min，之后将利用蒸馏水洗涤30s，再转移到含Na₂SO₃的蒸馏水洗涤胶30之后s；将胶转移到显色液(7.5g NaOH，1.5mL甲醛溶于500mL蒸馏水)中，摇动至显色；再将胶转移到固定液中定影2-3min，再用蒸馏水水洗1min后，观察结果。

检测结果如图1和图2所示：

图1为甜瓜材料PI482398和白皮脆的杂交后代B、E、H、F、G的基因组DNA为模板的PCR扩增结果，其中M表示DNA Marker，1为负对照，是以蒸馏水为模板进行PCR扩增的结果，2为B的PCR扩增结果，3为E的PCR扩增结果，4为H的PCR扩增结果，5为F的PCR扩增结果，6为G的PCR扩增结果。

图2为甜瓜材料PI482398、白皮脆及其杂交后代A、C、D的基因组DNA为模板的PCR扩增结果，其中M表示DNA Marker，1为负对照，是以蒸馏水为模板进行PCR扩增的结果，2为高感材料白皮脆的PCR扩增结果，表示感病材料的PCR结果，3为高抗材料PI482398的PCR扩增结果，表示抗蔓枯病材料的PCR结果，4为A的PCR扩增结果，5为C的PCR扩增结果，6为D的PCR扩增结果。实施例5甜瓜蔓枯病抗性表型的田间复查

采取人工接种，苗期蔓枯病抗性分析采用苗期伤根法接种蔓枯病致病菌鉴定甜瓜材料的蔓枯病抗性，具体步骤为：待鉴定甜瓜幼苗张至1对真叶时，将幼苗挖出清水洗净，于蔓枯病孢子悬浮液中浸泡15min，再种植到营养杯中培养，条件为：温度为28℃，16小时光/8小时暗，相对湿度约为60％～80％，接种后7天，判断甜瓜的蔓枯病发病情况，病害的病情分级及反应型参照《中华人民共和国农业行业标准》中的规定。同时结合多年田间的统计数据，综合的统计结果如下：

表1：(列表描述结果)

由表1及图1、图2可以得出本发明中的分子标记能够有效区分甜瓜材料是否具有蔓枯病抗性。

本发明已经将较佳的实施例公开如上，不过其并非用于限制本发明，任何熟悉此发明的人，在不脱离本发明精神和范围的前提下，都可以做各种改动，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书界定的范围为准。

序列表

天津大学

一种用于鉴定甜瓜抗蔓枯病的专用引物分子标记方法

1

22

人工序列

正向引物

CAAAGACATGGCGAGAAATTTG

2

21

人工序列

反向引物

GAAGGACGGTTAGCTTTGAGG

3

135

PCR扩增产物

CAAAGACATGGCGAGAAATTTGCGTTATTATCGATATATATATTATATTTGATTGACGTGTACTTTTGCCTTCATAGCTATATTAAATAATTAGCCATTGACCGTTATGAAAACCTCAAAAGCTAACCGTCCTTC

4

105

PCR扩增产物

CAAAGACATGGCGAGAAATTTGCGTTATTATATATATATATATTATATTTGTTTTGGTATTTCCTAAGTCGCCGCCATGAAAACCTCAAAAGCTAACCGTCCTTC

Claims (3)

1.一种鉴定甜瓜蔓枯病抗性专用引物，其特征是所述引物为从5`端到3`端的第1-22位的单链DNA序列的正向引物CAAAGACATGGCGAGAAATTTG；从5`端到3`端的第1-21位单链DNA序列的反向引物GAAGGACGGTTAGCTTTGAGG。

2.利用权利要求1的专用引物鉴定甜瓜蔓枯病抗性的分子标记方法，其特征是提取甜瓜待检测样品的基因组DNA作为模板，利用分子标记专用引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，再通过电泳对扩增产物进行检测。

3.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤如下：

1)利用CTAB法提取甜瓜待测样品任意组织或器官的基因组DNA；

2)以步骤1所得的待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记专用引物对不同材料进行PCR扩增，获得扩增产物；

3)利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对步骤2所得的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，使不同大小的PCR扩增产物处于不同的位置；

4)利用银染的方法检测凝胶电泳的结果，经过银染，肉眼就可看到PCR扩增的DNA片段在凝胶中的位置，距离上样孔距离远的，是小的DNA片段105bp，距离上样孔近的，为大的DNA片段135bp；

5)通过判断片段大小，PCR扩增片段较大的为抗蔓枯病的甜瓜材料，扩增片段较小的为易感抗蔓枯病的甜瓜材料。