CN106676031B - 一种解淀粉芽孢杆菌及其在降解氨基甲酸酯类农药中的应用 - Google Patents

一种解淀粉芽孢杆菌及其在降解氨基甲酸酯类农药中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌，它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号：CGMCC No.13143的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JX‑6。本发明保藏号为CGMCC No.13143的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JX‑6，可以有效降解氨基甲酸酯类农药，可用于这些物质污染的土壤、水体的生物修复或生物净化，保护生态环境，应用前景优良。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌及其在降解氨基甲酸酯类农药中的应用
技术领域
本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其在降解氨基甲酸酯类农药中的应用。
背景技术
氨基甲酸酯(Carbamate；通式RO(CO)NRR)类农药是在有机磷酸酯之后发展起来的合成农药，广泛应用于除虫，杀螨，除草等农业生产中。氨基甲酸酯类农药一般无特殊气味，在酸性环境下稳定，遇碱分解，在水中溶解度较高。大多数品种毒性较有机磷酸酯类低，并不是剧毒化合物，但具有致癌性，可经呼吸道、消化道侵入机体，也可经皮肤黏膜缓慢吸收。氨基甲酸酯类农药具有致突变、致畸和致癌作用。例如将西维因以各种方式处理小鼠和大鼠，均可引起癌变，并对豚鼠、狗、小鼠、猪、鸡和鸭有致畸作用。急性氨基甲酸酯类农药中毒是短时间内密切接触氨基甲酸酯类杀虫剂后，因体内胆碱酯酶活性下降而引起的毒蕈碱样，烟碱样和以中枢神经***症状为主的全身性疾病。因此，国际癌症研究机构在2007年把氨基甲酸酯类列为2A类致癌物。如何消除这些危害，已经受到广泛关注，目前以微生物降解是较为行之有效的办法。
氨基甲酸酯类农药是常用的杀虫剂，在尚未找到新型替代化合物之前，未来几十年内仍将被广泛使用，因而迫切需要研究残留农药的降解。
微生物降解是各种农药降解方法中较为绿色和高效的一种。然而，现有细菌对氨基甲酸酯类农药的降解速度慢如，公开号为CN1723276A公开的细菌作用于氨基甲酸酯化合物后10天时，降解率仅60％。
急需提供一种可以快速、高效降解氨基甲酸酯类农药的新的菌株。
发明内容
本发明提供了一种新的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)及其在降解中的应用。
本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌，它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号：CGMCC No.13143的解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens JX-6。
本发明解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6，于2016年10月24日保藏在于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.13143。
本发明还提供了解淀粉芽孢杆菌在降解氨基甲酸酯类农药中的用途。
其中，所述解淀粉芽孢杆菌是保藏号为CGMCC No.13143的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6。
其中，所述氨基甲酸酯类农药是(1-萘基)-N-甲基氨基甲酸酯，即西维因。
本发明还提供了一种降解农药的方法，包括如下步骤：
(1)取解淀粉芽孢杆菌，复苏制备种子液；
(2)将种子液加入待处理的样品中，混匀，即可。
步骤(1)中，所述解淀粉芽孢杆菌是保藏号CGMCC No.13143的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6。
步骤(1)中，所述种子液的浓度不低于106cfu/mL。
优选地，所述种子液的浓度为106～109cfu/mL。
所述种子液的按照如下方法制备：取解淀粉芽孢杆菌，用LB培养基培养，调整浓度，即可。
本发明解淀粉芽孢杆菌JX-6(Bacillus amyloliquefaciens JX-6)，其可以高效、快速降解氨基甲酸酯类农药，用于这些物质污染的土壤、水体的生物修复或生物净化，保护生态环境，具有极好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为降解菌株JX-6培养48h的菌落培养特征。
图2为降解菌株JX-6的细胞形态图。
图3为实验例1中降解菌株JX-6的降解情况。
图4为实验例1中降解菌株JX-6降解西维因及其产物的色谱图。
具体实施方式
本发明培养基：
Luria-Bertani培养基(LB)：酵母浸膏(Yeast extract)5.0g；胰蛋白胨(Caseintryptone)10g；氯化钠(Sodium chloride)10g；蒸馏水(H2O)1000mL；调pH至7.0；此固体培养基是在液体培养基中再加20g/L琼脂(Agar)制成的。培养基于121℃，灭菌20min备用。
实施例1 本发明解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定
1、分离
取醋赔样品4份，分别拌匀，各取5g，置于装有30mL LB培养基的250mL锥形瓶中，于80℃下加热10min，冷至室温再加入西维因使其质量浓度为50mg/L，于30℃、180r/min振荡培养48h。培养结束后按5％接种量再依次进行3次富集培养，每次培养48h，并逐步提高培养基中西维因浓度，使之分别达到100mg/L、200mg/L、400mg/L，筛选得到的一株农药降解菌，编号为JX-6。
2、鉴定
(1)形态、生理生化特征
形态：挑取菌株JX-6至LB固体培养基平板培养，记录其菌落形态特征，挑取单菌落进行涂片、革兰氏染色，于10×100倍油镜下观察记录颜色、大小、形状、排列等。
生理生化鉴定参见《伯杰细菌鉴定手册》第八版。
菌株JX-6的形态鉴定(如图1、图2所示)：革兰氏染色阳性，芽孢杆菌，菌落在LB培养基上呈淡白色不透明菌落，不反光，表面皱褶，有***，边缘不规则。
表1 菌株JX-6生理生化鉴定结果
Figure GDA0001158917750000031
(2)16S rDNA鉴定
对菌株16S rDNA基因的PCR扩增，PCR条件：94℃预变性5min；然后94℃、45s，56℃、45s，72℃、90s，循环30次；最后72℃延伸10min；PCR产物经电泳检测，扩增产物由成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，菌株JX-6的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示:
CTGGCTCTAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTAAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATC。
测定，测序结果与GenBank数据库中序列进行Blast同源性对比，该菌株序列与Bacillus amyloliquefaciens菌株基因序列高度同源。
综上，结合形态特征、生理生化特征、16S rDNA鉴定结果，将本发明分离株JX-6鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，并将其命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13143。
实施例2 采用本发明解淀粉芽孢杆菌降解土壤中的西维因
取本发明解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6，保藏号为CGMCCNo.13143，简称菌株JX-6。菌种活化：挑取菌株JX-6至LB液体培养基中，30℃，180r/min振荡培养24h；然后连续划线、挑取单菌落培养两次(30℃)，挑取单菌落接种至LB斜面30℃培养2d备用。用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整细胞浓度为106cfu/mL，制成种子液。
将种子液加入待处理土壤中，混匀，即可。
实施例3 采用本发明解淀粉芽孢杆菌降解水中的西维因
取本发明解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6，保藏号为CGMCCNo.13143，简称菌株JX-6。菌种活化：挑取菌株JX-6至LB液体培养基中，30℃，180r/min振荡培养24h；然后连续划线、挑取单菌落培养两次(30℃)，挑取单菌落接种至LB斜面30℃培养2d备用。用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整细胞浓度为108cfu/mL，制成种子液。
将种子液加入待处理样品水中，混匀，即可。
实施例4 采用本发明解淀粉芽孢杆菌降解土壤中的西维因
取本发明解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6，保藏号为CGMCCNo.13143，简称菌株JX-6。菌种活化：挑取菌株JX-6至LB液体培养基中，30℃，180r/min振荡培养24h；然后连续划线、挑取单菌落培养两次(30℃)，挑取单菌落接种至LB斜面30℃培养2d备用。用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整细胞浓度为109cfu/mL，制成种子液。
将种子液加入待处理土壤中，混匀，即可。
以下用实验例的方式来证明本发明的有益效果：
实验例1采用本发明解淀粉芽孢杆菌降解西维因的方法
1 材料与仪器
1.1 材料
菌种：本发明解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6，保藏号为CGMCC No.13143，简称菌株JX-6。
西维因：购自中国标准物质中心。
1.2 主要仪器
WondaSil C18柱，购自岛津技迩(上海)商贸有限公司。
2 试验方法
菌种活化：挑取菌株JX-6至LB液体培养基中，30℃，180r/min振荡培养24h；然后连续划线、挑取单菌落培养两次(30℃)，挑取单菌落接种至LB斜面30℃培养2d备用
用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整细胞浓度为106cfu/mL，制成种子液。
将降解菌株JX-6的种子液按5％接种量接种于含有100mg/L、200mg/L、400mg/L西维因的LB液体培养基中,分装30mL/250mL锥形瓶,设接种5％无菌水为空白对照，30℃、180r/min振荡培养，取样时间为0h-96h期间每12h取样1瓶，再从锥形瓶中取均匀培养液1mL，用甲醇定容至10mL，混匀后于10000r/min离心10min，取上清液供液相色谱(HPLC)分析用。
测定条件：色谱柱为WondaSil C18柱(150mm×4.60mm，5.0μm)；流动相为乙腈:水(85:15，V/V)，流速0.5mL/min；紫外检测器，其波长为220nm；进样量10μL。
3 结果与分析
结果如图3所示，降解菌株JX-6在72h内对50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L西维因的降解率依次是82％、75％、75％、62％。
实验结果说明，本发明解淀粉芽孢杆菌JX-6可以有效降解西维因，降解速度快，降解率高；如图4，降解菌株JX-6可以降解西维因的降解中间产物，色谱图中8.57min峰为目标峰(西维因)，随着时间的推移，西维因目标峰在变小的同时(0-72h)，在9.12min出现一个新的峰且逐渐升高(0-72h)，并且在72-120h内降低，判断9.12min峰为西维因的降解中间产物。
实验例2 采用本发明解淀粉芽孢杆菌降解污水中的西维因
1 材料与仪器
1.1 材料
菌种：本发明解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6，保藏号为CGMCC No.13143，简称菌株JX-6。
西维因：购自中国标准物质中心。
1.2 主要仪器
WondaSil C18柱，购自岛津技迩(上海)商贸有限公司。
2 试验方法
菌种活化：挑取菌株JX-6至LB液体培养基中，30℃，180r/min振荡培养24h；然后连续划线、挑取单菌落培养两次(30℃)，挑取单菌落接种至LB斜面30℃培养2d备用。
用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整细胞浓度为106cfu/mL，制成种子液。
从四川省成都市蔬菜地土壤中取一定量的土壤样品，添加西维因使其质量浓度约为100mg/L,将降解菌株的种子液按5％接种量接种(实验组)，设接种5％无菌水为空白对照,30℃培养，每24h取样，用实验例1述方法测定土壤样品中DBP的残留量。
通过HPLC检测样品中西维因的残留量，空白污水样品中西维因含量变化较小，实验组的污水样品在4d时几乎检测不到西维因(表2)。
表2 菌株JX-6在污水中的应用
Figure GDA0001158917750000071
实验结果说明，本发明解淀粉芽孢杆菌JX-6可以有效降解西维因，降解速度快，降解率高。
综上，本发明分离得到了一株新的解淀粉芽孢杆菌JX-6(Bacillusamyloliquefaciens JX-6)，其可以高效、快速降解西维因等氨基甲酸酯类农药，对环境修复的作用佳，具有极好的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都医学院
<120> 一种解淀粉芽孢杆菌及其在降解氨基甲酸酯类农药中的应用
<130> GY044-16P1500
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1394
<212> DNA
<213> 16S rDNA
<400> 1
ctggctctaa aggttacctc accgacttcg ggtgttaaaa ctctcgtggt gtgacgggcg 60
gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat 120
tccagcttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac tgagaacaga tttgtgggat 180
tggcttaacc tcgcggtttc gctgcccttt gttctgtcca ttgtagcacg tgtgtagccc 240
aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc 300
agtcacctta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaga tcaagggttg cgctcgttgc 360
gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca cctgtcactc 420
tgcccccgaa ggggacgtcc tatctctagg attgtcagag gatgtcaaga cctggtaagg 480
ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat 540
tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg agtgcttaat gcgttagctg 600
cagcactaag gggcggaaac cccctaacac ttagcactca tcgtttacgg cgtggactac 660
cagggtatct aatcctgttc gctccccacg ctttcgctcc tcagcgtcag ttacagacca 720
gagagtcgcc ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac gcatttcacc gctacacgtg 780
gaattccact ctcctcttct gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc tccccggttg 840
agccgggggc tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg agccctttac gcccaataat 900
tccggacaac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc 960
tttctggtta ggtaccgtca aggtgccgcc ctatttgaac ggcacttgtt cttccctaac 1020
aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc gtcagacttt 1080
cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt 1140
cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg tgagccgtta 1200
cctcaccaac tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag tggtagccga agccaccttt 1260
tatgtctgaa ccatgcggtt caaacaacca tccggtatta gccccggttt cccggagtta 1320
tcccagtctt acaggcaggt tacccacgtg ttactcaccc gtccgccgct aacatcaggg 1380
agcaagctcc catc 1394

Claims (7)

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为CGMCC No. 13143的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6。
2.解淀粉芽孢杆菌在降解氨基甲酸酯类农药中的用途；
所述解淀粉芽孢杆菌是保藏号为CGMCC No. 13143的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述氨基甲酸酯类农药是(1-萘基)-N-甲基氨基甲酸酯。
4.一种降解农药的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）取解淀粉芽孢杆菌，复苏制备种子液；
（2）将种子液加入待处理的样品中，混匀，即可；
步骤（1）中，所述解淀粉芽孢杆菌是保藏号为CGMCC No. 13143的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述种子液的浓度不低于106cfu/mL。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述种子液的浓度为106~109cfu/mL。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述种子液的按照如下方法制备：取解淀粉芽孢杆菌，用LB培养基培养，调整浓度，即可。
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