CN106668008A - 基于stat3蛋白靶点的靶向抗癌药物的发明 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于STAT3蛋白靶点的靶向抗癌药物，细胞内STAT3信号传导***调控机制异常存在于多种乳腺癌的细胞株中，本发明提供了一类化合物是有效的STAT3信号传导的调节剂，能够应用于乳腺癌癌症治疗药物的制备中。

Description

基于STAT3蛋白靶点的靶向抗癌药物的发明

技术领域

本发明涉及一种信号传导***抑制剂化合物在制备治疗癌症药物方面的应用。

背景技术

癌症已成为影响中国国民健康并造成重大经济损失的因素之一。传统治疗癌症的方法-手术、放疗、化疗和生物治疗对肿瘤病人病情的控制有一定的局限性。2001年，第一代靶向药物-格列卫的问世给癌症病人的临床治疗带来新的转机和希望，并具有临床疗效显著和毒副作用较小等优点。中国唯一自主研发的治疗鼻咽癌的靶向性药物-埃克替尼攻击的生物学靶点是表皮生长因子受体(EGFR)，这与治疗非小细胞肺癌的吉非替尼的靶点雷同，缺乏靶点创新、适应症单一，总体反映了国内靶向原创药物的研发水平较欧美落后。加之，已问世的靶向药物在临床长期使用引起的病人耐药性和进口靶向药物价格昂贵使得探求癌症新的生物靶点和研发新靶点靶向药物成为当务之急。Signal Transducer andActivator of Transcription type3(简称为：STAT3)是一种信号传导及转录激活因子，其蛋白作为治疗相关癌症的新靶点目前备受关注，STAT3与头颈癌、乳腺癌、肺癌、***癌和白血病等诸多癌症的发生、转移和归巢密切相关。国际相关研究报道的STAT3抑制剂还有：STAT 21(二代优化的化合物的生物活性没有提高)、STATTIC(没有化合物-蛋白相互作用的结构模型，结构优化无从着手)和香港中文大学研究报道的抑制鼻咽癌的葫芦素I(天然化合物修饰较难)。总之，现用于临床治疗的靶向性抗癌药物的靶点均趋于细胞信号传导通路的上游，容易引起耐药性，而基于STAT3靶点的在研药物能有效的克服这一弱点。本项目采用国际先进的蛋白分子靶标的药物设计理念和高效的药物筛选流程，从近一百万个化合物构建的化合物库中筛选出第一代化合物，依据27个生物活性较高的化合物群建立了化合物的定量构效关系模型，优化后的先导化合物的生物活性较第一代显著提高，是国际STAT3抑制剂研究领域的最新进展。项目申请人发现的第三代STAT3抑制剂的活体生物活性评价较紫杉醇高两倍以上，符合口服药物的药代动力学标准及体内用药标准。本项目依托河南大学淮河医院，利用天然药物和免疫工程实验室的有机合成能力和药学院药物活体评价***，并借助于美国方达医药技术有限公司先进的制剂工艺、药代、安全评价体系和丰富的药事管理经验等，必能达到预期效果，实现国家中长期科技规划的重点突破。

我们拟解决临床癌症靶向治疗中出现的药物耐药性问题。在引进美方先进的药物评价体系和制剂工艺的同时，运用其高效药研管理规范和临床转化方法开发中国独立知识产权的靶 向型新药，并构建中美联合药物研发中心。本项目的研发成功将促成我国癌症治疗方法的重大突破，促进中国医药产业由仿制性模式向创新型模式转化，加速国家中长期科技发展规划的目标实现。同时我们将先进的药物筛选和具有中国特色的药物评价策略推广到国际制药领域，产品外销应用到美国的癌症临床治疗，造就中国单品种靶向型药物在国际制药产业同类产品中的领先势态，同时申报中国CFDA和美国FDA的临床测试和生产批号，探求药物研发和申报“双轨道平行推进”的新型国际合作模式。本项目研发的STAT3抑制剂突破了目前国内外癌症靶向治疗以EGFR、ABL等信号传导上游靶点为主的局限，属于磺酰胺类，合成成本低廉，预计价格仅是埃克替尼的价格的1/3，格列卫的1/20，研发成功有望成就中国第一个自主研发的新靶点靶向型新药，其特点为疗效显著、抗癌谱较宽、价格低廉和换代周期较短等特点，研发成功将提升中国医药产业的原创靶向型药物的研发水平，带动中国医药产业由仿制性产业模式向创新模式转化。本项目符合《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020)》重点领域优先课题”：肿瘤及重大非传染性疾病的防治。

STAT家族及生理机制Signal transducer and activator of transcription简称为Stat，是信号传导及转录激活因子。Stat家族包括STAT1，2，3，4，5a，5b和6，是一组内源性的细胞转录因子。Janus Kinase简称为Jak，包括Jak1，2，3和Tyk2，是一组与Stats息息相关的非受体型酪氨酸激酶。Jak-Stat有机配合构建一组重要的哺乳类动物的细胞信号传导途径，并能将许多重要的细胞因子信号从细胞体外传递于核内，从而控制靶标基因的转录和下游蛋白质的表达。多项相关的研究文献报道：Jak-Stat信号传导途径参于调节正常细胞的繁殖、分化和凋亡。所有哺乳动物的七个Stats蛋白质都具有六个结构区域：N初端区(ND)，复合螺旋区(CC)，DNA结合区(DBD)，连接区(LD)，Src同源结构域2(SH2)，C终端区的转录激活域(CD)。细胞因子(Cytokine)与受体结合触发受体的二聚体化(dimerization)或多聚体化(oligomerization)并让Jaks磷酸化(phosphorylation)从而激活Jak-Stat信号，通过受体细胞膜内C终端区多处的特定酪氨酸的磷酸化并与Stat的SH2区域结合，从而完成受体-Stat的结合。Stat的激活将未磷酸化的冬眠态Stat的N段相互作用形成的反向平行二聚体构象转化为磷酸化的激活态Stat的SH2区域的双向交叉相互作用的平行构象。活化的Stat3二聚体通过相关的输入载体(importin-alpha)的协助转移到细胞核内，并与特定的DNA靶标结合(见图一)。Stat与其它的转录因子相互作用引起染色体重组。核蛋白酪氨酸磷酸化(N-PTPs)协助Stat脱离DNA并使Stat非磷酸化从而完成Stat的激活态向冬眠态转化，并最终完成Stat冬眠态-激活态-冬眠态的循环。细胞因子信号蛋白抑制因子(SOCS2)形成负调节循环，切断Jak-Stat信号的传导。活化Stat蛋白抑制因子(PIAS)通过阻断DNA和Stat3的结合来抑制Stat的活性(1)。

Stat3与Stat1与癌症的关系 在细胞繁殖和分化中，Stat3在抑制细胞凋亡的IL-6-gp130信号传导途径中起关键作用，例如，(IL-6)-gp130-Stat3信号传导参与调控B细胞分化成形成抗体的浆细胞。Stat3参于多种IL-6家族的信号传导途径，包括IL-6，白血病抑制因子(LIF)，睫状神经营养因(CNTF)，抑瘤素-M(OSM)，心肌营养因子1(CT1)。Stat3是多种激酶的下游调节因子。如：v-abl，LMP1，v-eyk，HTLV-1，c-src和Jak家族。Jak-Stat3无间歇的亢奋可引起很多癌症，如：头颈部肿瘤(＞90％)，乳腺癌，急性骨髓性白血病(AML)，慢性淋巴性白血病(CLL)。Stat1是唯一的参与干扰素γ的信号传导来抑制细胞繁殖的Stat家族成员，虽然Stat1有时可与Stat3一起激活，但主要是抑制细胞生长，Stat1被认为是肿瘤抑制因子。剔除Stat1基因的携带恶性肿瘤的小鼠的肿瘤生长比野生型的发展更迅猛(2)。

Stat3 SH2区域作为药理学靶标的理论依据Stat蛋白由冬眠态转化为激活态并参于相关细胞因子的信号传导，其中包括两个重要环节：其一通过自身细胞膜内终端多处特定磷酸化的酪氨酸与Stat SH2区域相互作用来完成受体招募Stat的过程；其二，通过Stat的C端特定磷酸化的酪氨酸(pTyr705)与对应Stat的SH2区域的双向交叉相互作用，Stat-Stat形成平行构象的激活态二聚体。利用Stat3，5在pTyr-SH2区相互作用的机理来阻断Stat3，5的活性，以实现抑制异常Stat3，5信号在癌细胞中传导，是一诱导癌细胞凋亡并治愈癌症的极好的概念性框架(1-4)。

Stat SH2区域是一类拥有大约100氨基酸的蛋白质模块。SH2区域的功能是特异性的识别磷酸化的酪氨酸并使其定位。在Jak-Stat信号传导途径中，酪氨酸磷酸化导致蛋白-蛋白之间的相互作用，并形成瀑布式地活化。其中包括Stat SH2区域与胞浆内细胞因子受体的C-端磷酸化的酪氨酸的相互作用和二聚体中SH2区域与特定磷酸化的酪氨酸(pTyr705)交叉相互作用(3，4)。

SH2区主要的二级结构包括：两个α-螺旋和一个大的β-板状结构。细胞因子受体胞浆C端的多肽序列pYXXQ与Stat3 SH2区域结合的特征和激活态二聚体中Stat3 C-端磷酸化的络氨酸多肽序列PpYLKTK与Stat3 SH2区域结合的特征共同展示Stat3 SH2与其它分子相互作用的特点。位于β-板状结构中央的N-端，ArgβB5(R609/Stat3，R618/Stat5)是与磷酸化酪氨酸结合的关键部位，磷酸化酪氨酸侧链的两个氧分子与ArgβB5碱性氨基的侧链形成极性加静电的相互作用。磷酸化酪氨酸多肽的C端的氨基酸与Stat SH2一个深的疏水区域(其包括重要的特征氨基酸有W623/Stat3，W641/Stat5)相互作用。所以，我们选择的计算机配位模拟(docking)的力场区域主要包括磷酸化酪氨酸作用位点ArgβB5(R609/Stat3，R618/Stat5)和疏水作用位点(W623/Stat3，W641/Stat5)(3，4)。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供了一种信号传导***抑制剂化合物在制备治疗癌症药物方面的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供了下列通式的化合物在制备治疗癌症药物或治疗牛皮癣药物方面的应用：

分子对接的实验结果表明Cpd0460能与Stat3蛋白SH2区间(domain)的关键氨基酸-赖氨酸K591和精氨酸R609，及SH2区间的疏水穴(主要由缬氨酸V637，谷氨酰胺Q635，色氨酸W632，酪氨酸Y640和酪氨酸Y657构成)产生强相互作用，从而阻断多肽中磷酸化酪氨酸与该区间的相互作用，导致阻断Stat3蛋白在细胞因子受体上面的附集和Stat3蛋白活化双体构象的形成，进而达到抑制Stat3信号传导和诱导癌细胞凋亡的作用(见图2)。BIAcore的实验证据证明Cpd0460能在低浓度(与磷酸化多肽竟争中)与Stat3形成强相互作用(见图3)。蛋白免疫印迹(Westernblot)的实验证据证明Cpd0460能在低浓度下有效的抑制Stat3的磷酸化和下游的信号传导(见图4)。MTT细胞凋亡实验证据证明Cpd0460能在低浓度下诱导一系列的对Stat3信号传导依赖性强的乳腺癌癌细胞的细胞凋亡(见图5)。

附图说明

图1是Stat3信号传导***示意图；细胞因子(Cytokine)与受体结合触发受体的二聚体化(dimerization)或多聚体化(oligomerization)，并使Jaks磷酸化(phosphorylation)从而激活Jak-Stat信号，通过受体细胞膜内C终端区的特定酪氨酸的磷酸化使Stat附集于受体上；被磷酸后，Stat形成双向交叉相互作用的双体平行构象；转移到细胞核内，并与特定的DNA靶标结合，诱导DNA转录和下游蛋白的表达。

图2是实施例1中化合物Cpd0460与STAT3蛋白SH2功能域分子对接的实验结果，化合物Cpd0460呈现在绿盒子里，骨架碳原子(C)和末段氢原子(H)均无标记，其余各类原子均用原子符号标记-氧(O)，氮(N)和硫(S)；在Stat3蛋白SH2区间上面，与Stat3-I-Q分子相互作用的关键氨基酸有：赖氨酸K591和精氨酸R609和色氨酸W632分别用K591，R609和W632标记；Stat3蛋白SH2区间的beta-折叠，alpha螺旋和无规则卷曲分别用缓直带，螺旋带和细管表示。

图3是实施例2中化合物Cpd0460的与多肽BIAcore的实验数据，(a)在不同的浓度下，第一次测量BIAcore信号强度差[(Stat3-I-Q与磷酸化多肽结合)-(Stat3-I-Q与非磷酸化多肽结合)]随时间变化的特征曲线；(b)归一化的两次测量结果的平均值随浓度变化的特征曲线，右侧的斜体数字表示各特征曲线的浓度。

图4是实施例3中Cpd0460的蛋白免疫印迹(Western blot)的测试，上位胶-磷酸化Stat3蛋白为测量主题，下位胶-总量Stat3蛋白为测量百分比正对照；依据该测试，化合物在浓度5(uM)时，Stat3蛋白显著减少。

图5是实施例4中Cpd0460的细胞水平的磷酸化Stat3(Y705)蛋白免疫印迹的测试.横坐标为Log(化合物浓度)(浓度单位：摩尔(M))；所测浓度分别为：0.5，1，5，10，50，100和500微摩(uM).纵坐标为磷酸化Stat3/总量Stat3的百分比.所得IC50为4.6微摩(uM)。

图6是实施例5中化合物Cpd0460的MTT细胞凋亡实验

图7是实施例6中化合物Cpd0460有机合成路线图

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

实施例1：分子对接(docking)实验

方法：为了提供一组合理的计算机预测的选择性靶标攻击Stat3的化学探针，我们用Stat3 SH2区的磷酸化络氨酸(pY-705)结合区域作为计算机配位模拟(docking)位点，主要包括磷酸化酪氨酸作用位点R609和疏水作用位点W623。Stat3 SH2的结构坐标取于蛋白质结构数据库(PDB data bank，ID：1BG1)。所选的化学分子库(Chemical compoundlibrary)为LIFE CHEMICALS。分子对接(docking)的方法：所有的计算机配位模拟(docking)的实验均在Schrodinger-Maestro的操作平台上完成，所用的计算机配位模拟(docking)的工具为Glide。首先，将Stat3 SH2从PDB data bank取出并下载于Schrodinger操作平台-Maestro。去水后，将Stat3 SH2的氨基酸加上氢原子和电荷并将PDB文件转化为Maestro文件。依据所选的位点(主要包括磷酸化酪氨酸作用位点R609和疏水作用位点W623)计算，确定势能面(potential gradient)并作计算机配位模拟(docking)的实验(3-5)。结果分 析：依据模拟(docking)的分数(Score)和构象及相互作用分析。我们选取最优的200名化合物作下游的实验测试。Cpd0460构象分别见图1。为验证计算机模拟预测的200余化合物是否能在分子水平抑制Stat3与固定的磷酸化的多肽的相互作用，我们应用SPR技术，在BIAcore 3000仪器上，操作并完成了这项测试。

实施例2：BIAcore实验

方法：所选化合物与Stat3分子间相互作用的实验(BIAcore)是在25℃下，将磷酸化多肽固定在streptavidin附着的BIAcore 3000的生物芯片上(biosensor)，所用的流动缓冲液是pH8的20mM浓度的Tris buffer并含用2mM浓度的mercaptoethanol和5％DMSO水溶液，其流动的速度为10uL/min。测试前，500nM浓度的Stat3蛋白与所选化合物混和至所定浓度0.1、0.5、1、5、10、50、100、500uM。每次测试后，用pH为1.5的10uL的100mM的glycine冲洗生物芯片(biosensor)以待下次测试。无药物混合的500nM的Stat3蛋白从启始到终结根分别测试一次以确定整个测试***始终运行正常(6)。实验(BIAcore)结果分析：Cpd0460的不同浓度的BIAcore信号随时间变化的特征曲线可见(图3(a))，(图3(a)中横坐标数字0、50、100、150、200、250、300、350、400和450秒分别表示不同的时间点。BIAcore的实验结果被表示为归一化的两次测量值的平均值随浓度变化的特征曲线，归一化BIAcore信号为不同化合物的测量值除以无化合物的参照值乘以100(见图3(b))，图3(b)中横坐标数字0、0.1、0.5、1、5、10、50和100uM分别表示化合物浓度。(特征曲线图3(b)中，菱形点表示各浓度的BIAcore信号的测量值，菱形点上的垂直短线表示两次测量的标准误差)。Cpd0460抑制50％的Stat3和磷酸化多肽的相互作用的化合物的浓度值(IC50)皆为1-5(uM)。上述实验证据表明：Cpd0460在亚微摩尔的低浓度下与Stat3结合并能抑制一半的Stat3和磷酸化多肽的相互作用。

实施例3：蛋白免疫印迹(Westernblot)

方法：蛋白免疫印迹(Western blot)的实验方法：在标准条件下，在六孔板中培养人肝肝癌细胞(HepG2)。分别以不同浓度-0.5，1，5，10(uM)，用化合物处理细胞并培养1小时。用浓度为30ng/ml的IL-6处理细胞并培养半小时去刺激Stat3磷酸化。细胞收集后，用高盐缓冲液(high-salt buffer)液分离蛋白。分离后的蛋白与SDS混合，100℃下，加热5分钟。在SDS-PAGE聚丙稀酰胺凝胶做电泳，区别并固定不同质量的蛋白，然后将蛋白转移至PVDF膜并用BSA去覆盖PVDF膜。分子重量标记提前置入SDS-PAGE胶并被转移至PVDF膜。用抗-磷酸化pY705-Stat3的第一抗体和抗-总量Stat3的第一抗体去探测磷酸化pY705-Stat3和总量Stat3；用HRP嵌合羊-抗-鼠IgG作为酶标的第二抗体。用增强化学感光***去探测信号。在转换到总量Stat3抗体探测前，用缓冲液-Restore Western Blot Stripping Buffer 去探测信号(7)。蛋白免疫印迹(Western blot)的实验结果：上位胶为磷酸化Stat3，下位胶为总量Stat3，信号显示从左到右：第一列为信号因子-化合物双负对照(无IL-6刺激并同时无化合物加入)，第二列为信号因子正-化合物负对照(IL-6刺激并同时无化合物加入)，第三列及其后为，在信号因子刺激下，不同浓度(0.5，1，5，10微摩尔)的化合物对磷酸化Stat3的干扰和结果；其结果显示Cpd0460在亚摩尔浓度下均有显著的抑制Stat3磷酸化的能力。

实施例4：细胞水平的磷酸化Stat3(Y705)蛋白免疫印迹(Cell-based ELISAPhospho-STAT3(Y705)immunoassay)

细胞水平的磷酸化Stat3(Y705)蛋白免疫印迹的实验方法：将100微升的大约两万个MBA-MD-231细胞群移植于96孔板(孔底透明而孔测面为黑色)的每一个孔中。将其培养在5％的二氧化碳浓度，37℃温度下的细胞培养箱(cell culture incubator)中过夜。第二天，用化和物处理细胞(化合物浓度分别为0.5，1，5，10，50，100，500微摩尔(uM))并将化合物处理后的细胞放置细胞培养箱培养一小时。然后，用细胞因子-IL-6处理细胞以增生Stat3磷酸化并放置细胞培养箱培养半小时，IL-6浓度为30ng/ml。用100微升(ul)的4％***(formaldehyde)固定细胞并在室温下培养20分钟。三次冲洗后，用100微升的0.6％的H2O2处理细胞并在室温培养20分钟。三次冲洗后，用阻挡缓冲液(Blocking buffer)处理细胞并在室温下培养60分钟。三次冲洗后，用第一抗体(Primary anti-body)混合液(兔的抗-磷酸化705位酪氨酸的Stat3抗体和鼠的抗-普适Stat3的抗体)处理细胞并放置2℃冰箱培养过夜。三次冲洗后，用第二位抗体(Secondary anti-body)混合液(HRP酶联结的羊-抗-兔IgG抗体和AP酶联结的羊-抗-鼠IgG抗体)处理细胞，并在室温下培养两小时。洗涤缓冲液(Washing buffer)两次冲洗并1X PBS两次冲洗后，用75微升的第一底物(Substrate)-F1处理细胞并用锡铂纸包裹，放置室温30分钟。用75微升的第二底物(Substrate)-F2处理细胞并用锡铂纸包裹，放置室温30分钟。最后，用荧光标记读解器(fluorescence platereader，infinite-200，Tecan)读解数据。HRP酶联结的IgG抗体用激发态波长-540nm，辐射态波长-600nm来解释；AP酶联结的IgG抗体用激发态波长-360nm，辐射态波长-450nm来解释(8)。

细胞水平的磷酸化Stat3(Y705)蛋白免疫印迹的实验结果：Cell based ELISAimmunoblot assay的实验结果见图5。横坐标为化合物浓度的Log值，化合物浓度单位为纳摩尔(nM)；所测化合物浓度分别为：0.5、1、5、10、50、100和500微摩(uM)。纵坐标为磷酸化(Stat3P705-STAT3)除以总量Stat3(Total STAT3)的百分比(Ratio of pYSTAT3/TotalSTAT3)。所得Cpd0460的Immunoblot-IC50的测试结果分别为4.6(uM)。以上实验结果证明：在亚微摩尔的浓度下，Cpd0460能有效的抑制MBA-MD-231(一种Stat3信号无间歇活化的乳腺癌癌细胞)细胞株的Stat3磷酸化。

实施例5：诱导乳腺癌癌细胞凋亡MTT的实验

方法：MTT被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测。我们的MTT实验主要是药物对体外培养的细胞毒性的检测。实验准备：刺激因子：IL-6；化合物：Cpd0460，试验用细胞：hepG2、MDA-MB-231阴性对照细胞：MCF-7，干粉溶剂：DMSO或灭菌ddH20，药物：WP1066、F1566-0352、F1566-0424、F1566-0460。实验步骤：1、第一天将hepG2、MDA-MB-231、MCF-7三种状态良好的细胞计数铺板5000个/孔于96孔板中。2、过夜后加IL-6刺激细胞，IL-6终浓度为30ng/ml，刺激时间为30min。然后几种细胞分别药物处理，加药终浓度以1，3，10，30，100(uM)几个梯度进行药物处理，并连续培养48h。3、药物处理后，加入MTT试剂10微升(试剂盒)，37度孵育4小时，然后加入100微升Formanzan溶液至完全溶解(4小时左右)，上酶标仪读值(570nm)，记录结果。

两次实验结果及分析可知：化合物Cpd0460在MDA-MB-231细胞中测得的OD值均大于MCF-7细胞的OD值，说明这种化合物诱导乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)凋亡的作用强于阴性对照MCF-7细胞。

实施例6：有机合成

方法：将2-氯-1，4-萘醌(0.5mmol)和4-甲氧基苯磺酰胺(0.6mmol)溶于四氢呋喃(1.8ml)中，0℃下搅拌加入四氯化钛四氢呋喃混合物(0.6mmol)，并加入三乙胺(1.3mmol)。混合物搅拌至室温后在80w微波条件下加热至60℃反应1h。反应冷却至室温加入20ml乙酸乙酯。反应瓶中物质通过硅藻土过滤，乙酸乙酯洗涤，滤液旋干。在旋干物中加入10ml二氯乙烷，通过硅藻土过滤，旋干滤液后将剩余物溶入10ml的四氢呋喃。向四氢呋喃溶液中加入0.5mmol的3-巯基-1，2，4-***，室温条件下搅拌反应4h，并以10ml乙酸乙酯溶解旋干物。加入5ml水以及2.5mmol硫代硫酸钠。混合搅拌1h。分层萃取，水相经过三次10ml乙酸乙酯洗涤后，将有机相混合使用25ml饱和食盐水洗涤，使用无水硫酸钠干燥后，过滤，旋干得到粗产物，将粗产物进行柱色谱分离得到目标产物。

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Claims (3)

1.下列化学式的信号传导***抑制剂化合物在制备治疗癌症药物的应用：

。

2.根据权利要求1项所述的应用，其特征在于，所述药物为口服药物或静脉注射药物。

3.根据权利要求1项所述的应用，其特征在于，所述药物为治疗乳腺癌的药物。