CN106661574B - 涉及油基质的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本文提供了保持植物组织如植物胚的活性的方法。还包括在油双层中储存基因组DNA和/或分子标记测定材料作为高吞吐量分子表征***的一部分的方法。此外，可在油基质中时处理植物胚。处理可包括染色体加倍、农杆菌介导的转化、或作为胚挽救过程的一部分的除草剂选择。

Description

涉及油基质的方法和装置
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2014年8月29日提交的美国国家专利申请14/473183和2014年8月29日提交的美国国家专利申请14/473114的权益，将所述文献全文以引用方式并入本文。
背景技术
遗传、生化或表型分析所使用的现有传统种子分析法需要至少移取并且加工一部分种子。在移取一些种子组织时，可能需要满足各种目标。这些目标可包括以下目标中的一项或多项：
(a)如果需要，在收集种子组织后保持种子的活力，
(b)获得至少最小所需量的组织，而不影响活力，
(c)从种子上的特定位置获得组织，通常需要将种子定向在特定位置的能力，
(d)为了效率目的，维持特定的吞吐量水平，
(e)减少或几乎消除污染，并且
(f)允许跟踪分离的组织及其与获得组织的种子的相关性。
当前的常规种子测试技术并未充分解决这些需求，导致对资金和劳动力资源造成压力，从而说明本领域需要提供其中达成最大目标数目的种子分析方法。如果种子分析方法可与种子生产过程中的其它方法结合使用，则也是有益的。
发明内容
本文提供了用于储存、处理和选择植物胚的方法。还提供了在油双层中储存基因组DNA和分子标记测定材料以用于高吞吐量分子分析的方法。此外，提供了用于在油基质中处理植物胚的方法，其处理可以是染色体加倍、农杆菌介导的转化、或作为胚挽救过程的一部分的除草剂选择。
在一些实施方案中，可通过将植物胚或植物胚组织悬浮在由一种或多种油的基质包围的水性溶液中，来储存植物胚。优选地，一种或多种油中的至少一种具有大于水性溶液密度的密度。在一些方面，可将抗微生物剂和/或最小生长培养基加入到水性溶液中。在其它方面，植物胚或植物胚芽组织可在寒冷(优选4℃)和/或黑暗条件下储存以防止过早发芽。在一些实施方案中，可转移植物胚或植物胚组织以连续储存。在其它实施方案中，可将植物胚转移至发芽培养基中，并且可使一个或多个植物胚发芽。在其它实施方案中，可移取水性溶液的等分试样，可从等分试样中的细胞材料获得遗传物质，并且遗传物质可用于分子分析(例如对储存的植物胚进行基因分型)。分子分析可为基因分型的，其可通过以下方式发生：单核苷酸多态性检测、限制性片段长度多态性识别、随机扩增多态性检测、扩增片段长度多态性检测、聚合酶链式反应、DNA测序、全基因组测序、等位基因特异性寡核苷酸探针、或DNA与DNA微阵列或小珠的杂合。在其它实施方案中，上述步骤中的一个或多个可以是自动的。
在一些实施方案中，提供了储存基因组DNA的方法，其中将浸入水性溶液中的基因组DNA放置于两种油之间，一种密度比水大，而另一种密度比水小。油层之间的基因组DNA可在光照或黑暗条件下储存。油层之间的基因组DNA可在室温和约-25摄氏度之间，或优选在约-20摄氏度的温度下储存。所述方法还可包括移取所述基因组DNA的等分试样作为自动化过程的一部分，以进行分子分析，例如但不限于基因分型。
在一些实施方案中，提供了储存浸入水性溶液中的分子标记测定材料的方法，其中将基因组DNA放置于两种油之间，一种密度比水大，而另一种密度比水小。分子标记测定材料可包含引物和探针。介于油层之间的分子标记测定材料可在光照或黑暗条件下储存。介于油层之间的分子标记测定材料可在介于室温和-25摄氏度之间的温度下储存。所述方法还可包括移取所述分子标记测定材料的等分试样作为自动化过程的一部分，以进行分子分析，例如但不限于基因分型。
在一些实施方案中，提供了用倍增剂处理植物胚的方法。所述方法包括在两种油之间放置倍增培养基，其中一种油密度比水大，而另一种密度比水小；在光照条件下，将一个或多个植物胚在倍增培养基中放置8-48小时；选择植物胚；并且将所选择的植物胚转移至用于发芽或储存的培养基中。所述植物胚可为单倍体。此外，可移取培养基的等分试样，可从等分试样中的细胞材料获得遗传物质，并且遗传物质可用于分子分析(例如对处理的植物胚进行基因分型)。分子分析可为基因分型的，
在一些实施方案中，提供了在双倍单倍体生产期间选择植物胚的方法。在所述方法中，(a)将倍增培养基放置于两种油之间，其中一种油密度比水大，而另一种密度比水小；(b)在光照条件下将植物胚在倍增培养基中放置8-48小时，并且(c)选择植物胚进行发芽或储存。在步骤(b)和(c)之间，可从一个或多个植物胚收集细胞材料；DNA可从细胞材料获得；并且可获得基因型信息，允许基于基因型信息选择一个或多个胚。所述方法还可包括将所选择的植物胚转移至用于发芽或储存的培养基中。所述倍增培养基可包含抗微管剂。所述倍增培养基可包含秋水仙碱、炔苯酰草胺、氟硫草定、甲基胺草磷或氟乐灵。放置于倍增培养基中的植物胚可以是单倍体。
在一些实施方案中，植物胚是通过雄性诱导剂谱系和目标雌性谱系之间的杂交产生的玉米单倍体胚，其中雄性诱导剂谱系包含胚组织中表达的标记基因。所述标记基因可表达仅在二倍体胚中表达的花青苷色素。因此，可进一步选择不表达花青苷的白色胚，以转移至用于发芽或储存的培养基中。可使用相机或其它成像装置进行选择。所述方法还可包括发芽或储存所选择的胚。
为了促进白色胚的选择，花青苷的表达可通过倍增培养基的通气或通过将植物胚放置于包含全氟萘烷(PFC)的低渗倍增培养基中来增强。
在一些实施方案中，提供了转化植物组织的方法，其中包含根癌农杆菌的悬浮液，其在其基因组内包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体在两种油之间包含一种或多种目标基因和选择性标记基因，其中一种油密度比水大，而另一种密度比水小；将所述植物组织放置于所述悬浮液中；从所述悬浮液中移取植物组织，并且在培养基中培养所述植物组织；将所述植物组织静置于培养基中；并且使所述植物组织与培养基接触，所述培养基包含对应于所述选择性标记基因的选择剂。所述方法还可包括从所述植物组织再生植物，其中所述植物组织是植物胚或植物愈伤组织。所述植物组织可在所述悬浮液中储存至多1小时。步骤(d)可包括在约28摄氏度的温度下，将植物组织在培养基中，在黑暗中静置至多14天的时段。包含对应于选择性标记基因的选择剂的培养基可位于两种油之间，其中一种油密度比水大，而另一种密度比水小。
在一些实施方案中，提供了在包含选择剂的溶液中培养植物组织的方法，其中所述溶液中的植物组织位于两种油之间，其中一种油密度比水大，而另一种密度比水小。选择剂可以是草甘膦、草胺膦、双丙氨磷、潮霉素B、卡那霉素、巴龙霉素、甘露糖、草胺膦、氟丙嘧草酯或R-吡氟氯禾灵。所述方法还可包括选择在培养后保持活性的植物组织。所述植物组织可为植物胚或植物愈伤组织。
具体实施方式
植物育种程序可受益于保存活体植物来源，其可包括以保持生长成植物的能力保持活体植物来源，以及以防止发芽的方式保持活体植物来源。可看到一个有益效果，即可获得用于分子表征的遗传物质，允许在生长植物之前进行选择。附加有益效果可包括在保存时用染色体倍增剂处理单倍体植物胚，同时保存或转化活体植物来源。
活体植物来源可以是种子、植物胚、植物组织或整个植物。最典型地，活体植物来源能够长成植物，但不是一定的。种子的保存通常不需要特别注意。然而，当活体植物来源是胚胎时，应特别注意保持活性。
在一个优选的方法中，将植物胚悬浮在由一种或多种油的基质包围的水性溶液中。具有小于水的密度的油将覆盖水性溶液中的一个或多个植物胚，而具有大于水的密度的油将支撑水性溶液中的一个或多个植物胚。在一些实施方案中，将一种或多种植物胚悬浮在由两种或多种油的基质包围的水性溶液中，其中两种或多种油中至少一种的密度大于水性溶液，并且两种或更多种油中至少一种的密度小于水性溶液，此外其中水性溶液被比密度高于水性溶液的油和密度低于水性溶液的油包围。在一些实施方案中，可向水性溶液加入抗微生物剂和/或最小生长培养基。在一些实施方案中，植物胚可在寒冷和/或黑暗条件下储存以防止过早发芽。在优选的实施方案中，将植物胚在约4℃的温度下储存。在一些实施方案中，可将植物胚转移以连续储存。在其它实施方案中，可将植物胚转移至发芽培养基中，并且可使植物胚发芽。在优选的实施方案中，可移取水性溶液的等分试样；遗传物质可从等分试样中的细胞材料获得；并且可使用遗传物质以进行分子分析(例如对储存的植物胚进行基因分型)。
可用于该方法的高密度油包括但不限于具有12种化合物的全氟化合物(例如DuPont的较低粘度油)。可用于该方法的低密度油包括但不限于苯基甲基聚硅氧烷。本领域普通技术人员已知的其它无毒油可替代这些化合物使用或与这些化合物组合使用。
获得用于分子表征的遗传物质
为了对遗传物质进行分析，必须将其从细胞中取出，以便其可用于分子分析。这可能涉及物理处理如暴露于冷-热氛或仅热氛、用酶培养或甚至DNA提取技术(然而重要的是要注意，提取不是获得用于分子分析的DNA的必要步骤)。基本上，破坏组织并且破碎开放细胞，从而释放可用于分子表征的DNA的任何过程可用于本文提供的方法中。
在一些实施方案中，可通过将细胞材料暴露于冷-热氛或热氛，搅拌混合物，并且任选重复，从细胞材料获得DNA。在其它实施方案中，可通过用酶培养细胞材料获得DNA；所述酶可为L，一种包含宽泛范围的糖酶的多酶复合物，包括***糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、和木聚糖酶。(参见Sigma Aldrich产品目录)。在其它实施方案中，获得DNA可包括提取DNA，例如通过使用结合遗传物质的磁性颗粒或本领域普通技术人员已知的任何方法。然而，提取对于获得DNA不是必需的。
分子表征来自多个活体植物来源的遗传物质
在从胚组织获得的DNA的产量不足以用于某些分子分析(例如高密度基因分型)的情况下，可使用全基因组扩增技术。Qiagen REPLI-g试剂盒、Sigma-Aldrich SeqPlex试剂盒或本领域普通技术人员已知的任何其它技术可用于扩增来自植物胚组织的DNA。
其它可用的分子表征可涉及对从种子提取的组织的全部或部分基因组测序，或使用分子标记和荧光探针进行基因分型。分子表征不需要关注所提取组织的基因型，而是可测量其它性质，例如油含量、油组成、蛋白质含量、或组织中存在或不存在特定分子。
在优选的实施方案中，将遗传物质放置于包含双层油的多孔板的孔中，一层的密度大于水，并且一层的密度小于水。多个孔包含多种不同遗传物质。将荧光标记探针加入到遗传物质，并且在多孔板中进行热循环以造成探针扩增和杂合。照射孔，并且从标记物检测荧光以产生基因型数据。另选地，遗传物质可在多孔板中全部或部分测序。
基因组DNA和/或分子标记测定材料(例如但不限于引物和探针)也可储存在油的双层中，以促进自动化和高吞吐量分子表征。在两种情况下，将材料浸入放置在两种油之间的水性溶液中，一种密度比水大，而另一种密度比水小。基因组DNA和/或分子标记测定材料的储存可在光照或黑暗条件下进行，并且可在约4摄氏度或室温下进行。以该方式储存允许机械装置从储存的基因组DNA和储存的分子标记测定材料中获得等分试样，并且将它们结合在反应混合物中以进行高吞吐量分子表征。
选择一个或多个活体植物来源
在分子育种程序中，基于它们的基因型选择植物或潜在植物以参与后代。通常，这涉及确定植物是否遗传了由遗传标记指示的一个或多个期望的性状，可基于基因分型来确定其存在或不存在。植物育种人员选择具有所需性状的那些植物以参与进一步育种、近交、或作为通过单倍体倍增技术产生近交系的过程的一部分。基于存在由它们基因型确定的期望性状而选择的那些植物可生长成成熟植物，以获得单倍体材料以产生双单倍体近交系，与其自身一起育种以产生近交系，或与其它植物一起育种以改善种质并使其多样化。
上述植物胚储存方法允许获得正在储存的植物胚的基因型信息，允许基于基因型信息选择胚。
植物胚储存方法也可用于处理植物胚，同时将植物胚储存(短期或长期)在油基质中。
一种处理可用倍增剂使植物胚倍增。在所述方法中，将倍增培养基放置于两种油之间，其中一种油密度比水大，而另一种密度比水小；将植物胚在光照条件下，在倍增培养基中放置8-48小时；选择植物胚；并且将选择的植物胚转移至用于发芽或储存的培养基中。植物胚可进一步发芽或储存。所述植物胚可为单倍体。遗传物质可从植物胚获得，并且植物胚可进行分子表征(例如基因分型)。植物胚的选择可基于基因型信息。
玉米染色体倍增的方法公开于Antoine-Michard，S.等人，Plant cell，tissueorgan cult.，Cordrecht，the Netherlands，Kluwer Academic Publishers，1997，48(3)：203-207；Kato，A.，Maize Genetics Cooperation Newsletter 1997，36-37；Wan，Y.等人，TAG，1989，77：889-892；Wan，Y.等人，TAG，1991，81：205-211；US 8,865,971；和US 8,404,930中；所述文献的公开内容以引用方式并入本文。典型的方法涉及使细胞与秋水仙碱、抗微管剂或抗微管除草剂、炔苯酰草胺、一氧化二氮、或任何有丝***抑制剂接触，以产生纯合的双倍单倍体细胞。培养基中所用的秋水仙碱的量通常为0.01％-0.2％，或约0.05％或APM(5-225μM)。秋水仙碱的量可在约100-600mg/L范围内，并且优选可为约500mg/L。培养基中炔苯酰草胺的量为约0.5-20μM。其它试剂可与有丝***抑制剂一起使用以改善倍增效率。此类试剂可为二甲基亚砜(DMSO)、辅助剂、表面活性剂等。
在一些实施方案中，提供了在双倍单倍体生产期间选择植物胚的方法。在所述方法中，(a)将倍增培养基放置于两种油之间，其中一种油密度比水大，而另一种密度比水小；(b)在光照条件下将植物胚在倍增培养基中放置8-48小时，并且(c)选择植物胚。在步骤(b)和(c)之间，可从一个或多个植物胚收集细胞材料；DNA可从细胞材料获得；并且可获得基因型信息，允许基于基因型信息选择一个或多个胚。所述方法还可包括将所选择的植物胚转移至用于发芽或储存和/或使所述植物胚发芽的培养基中。所述倍增培养基可包含抗微管剂。所述倍增培养基可包含秋水仙碱、炔苯酰草胺、氟硫草定、甲基胺草磷或氟乐灵。放置于倍增培养基中的植物胚可以是单倍体。
玉米单倍体胚可通过雄性诱导剂谱系和目标雌性谱系之间的杂交产生，其中雄性诱导剂谱系包含胚组织中表达的标记基因。所述标记基因可表达仅在二倍体胚中表达的花青苷色素。因此，可进一步选择不表达花青苷的白色胚，以转移至用于发芽或储存的培养基中。可使用相机或其它成像装置进行选择。
在上文中，花青苷的表达(或其观察)可通过倍增培养基的通气来增强。这可通过在与植物胚接触之前摇动液体培养基或通过使过滤的空气鼓泡通过三层(第一油层、液体培养基、第二油层)而发生，因为一旦空气供应关闭就会发生相分离。另一种方法包括将植物胚放置于包含全氟萘烷(PFC)的低渗倍增培养基中。低渗倍增培养基还可包含漂白剂以减少细菌生长。
目标雌性谱系可以是或可以不是近交系，并且可具有期望的基因构成。目标雌性谱系还可在其基因组内包含一个或多个目标转基因。
本文所述的单倍体诱导剂谱系已结合掺入到它们基因组中的花青苷颜色标记；所述标记在籽粒果皮和盾片内表达。颜色标记用于筛选胚。单倍体胚缺少具有颜色标记的父本基因，因此显示为白色或无色。
使用液体培养基的限制之一是，当胚浸没在培养基中时颜色标记不能表达，因此在倍增后难以从单倍体胚分离二倍体。为克服该限制，增加培养基中溶解氧含量的方法可用于增强花青苷表达的水平或其观察。在本文所述的方法中，可通过将胚在由全氟萘烷(PFC)、氧气饱和的液体、和0.1％商业漂白剂(5％NaOCl v/v)组成的低渗液体培养基中培养，通过摇动，和/或通过用过滤的空气鼓泡培养基(通气)，来增强液体培养基中的花青苷表达。可在液体培养基位于油基质中的油之间时，进行液体培养基中花青苷表达的增强；然而，液体培养基不必介于油之间。无论液体培养基是否位于油基质内的油之间，均促进选择。此外，使用包含全氟萘烷(PFC)的低渗倍增培养基来增强花青苷表达并不排除液体培养基，并且可用于消除二倍体胚，而不论如何储存植物胚。
另一种处理可为用根癌农杆菌转化植物组织，其在其基因组内具有重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含一个或多个目标基因和选择标记基因。所述方法包括将包含农杆菌的悬浮液放置在两种油之间，其中一种油密度比水大，而另一种密度比水小；将所述植物组织放置于所述悬浮液中；从所述悬浮液中移取植物组织，并且在培养基中培养所述植物组织；将所述植物组织静置于培养基中；并且使所述植物组织与培养基接触，所述培养基包含对应于所述选择性标记基因的选择剂。所述方法还可包括从所述植物组织再生植物，所述植物组织可为植物胚或植物愈伤组织。所述植物组织可在所述悬浮液中储存至多1小时。“静置”可包括在约28摄氏度的温度下，将植物组织在培养基中，在黑暗中放置至多14天的时段。包含选择剂的培养基也可位于两种油之间，其中一种油密度比水大，而另一种密度比水小。然而，选择胚的步骤也可在不位于油基质内的培养基中进行。
在油基质中进行农杆菌介导的胚转化的有益效果是简化下游多重培养过程、顺从自动化、降低与消耗品相关的成本、以及减少可消耗的废物。
另一种处理可以是在包含选择剂的溶液中培养植物组织。这也可在植物组织位于两种油之间时进行，其中一种油密度比水大，而另一种密度比水小。选择剂可以是草甘膦、草铵膦、双丙氨磷、潮霉素B、卡那霉素、巴龙霉素、甘露糖、草胺膦、氟丙嘧草酯或R-吡氟氯禾灵。所述方法还可包括选择在培养后保持活性的植物组织。所述植物组织可为植物胚或植物愈伤组织。该方法可用于确定植物组织是否包括赋予承受选择剂的能力的天然性状。
尽管本文提供的示例涉及单子叶植物(特别是玉米)，但是本领域普通技术人员将理解如何将相同或相似的方法应用于其它单子叶植物和双子叶植物；所述方法可适用于任何植物。例如，植物可包括但不限于玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、粟、甘蔗、或柳枝稷。
实施例1：玉米中的胚基因分型
A.收集玉米胚材料：
使用2mL无菌水将玉米胚洗涤3次。使玉米胚在包含10μL、20μL、50μL、75μL或150μL无菌水的管中培养10分钟、20分钟或过夜。发现用任何稀释体积可获得足够的基因分型数据，并且10分钟是足够的培养时间。用于洗涤和培养玉米胚的所有方案与下述所有三种组织收集方法一起使用。
方法1：通过轻敲10次搅拌包含玉米胚的管，然后在台式离心机中旋降5秒。然后从每个管中移取水用于分析。发现该方法对基因分型获得了最好的结果。
方法2：使用2mL无菌水将玉米胚洗涤3次。使玉米胚在包含50μL无菌水的管中培养10分钟。然后从管中移取水用于分析。
方法3：使用2mL无菌水将玉米胚洗涤3次。使玉米胚在包含50μL无菌水的管中培养10分钟。通过轻拍10次，搅拌包含玉米胚的管。然后从每个管中移取水用于分析。
B.获得DNA的方法：
冷-热休克：
将使用上述所有三种方法获得的玉米胚材料在-80℃冷冻机中放置20分钟；然后在100℃的热循环仪上放置10分钟，并且上下吸取混合。将该过程重复共两轮。将所得混合物在-20℃下储存。发现使用该方法获得的DNA达到基因分型的最佳结果。
仅热休克：
将玉米胚组织在100℃热循环仪上放置10分钟，并且上下吸取混合。将该过程重复共两轮。将混合物在-20℃下储存。
酶促方法：
将来自前述步骤的混合物在95℃烘箱中培养，以蒸去剩余的水。加入18.0μL的PBS溶液和2.0μL稀释的L(可从Sigma-Aldrich商购获得；在PBS溶液中以1∶200稀释，pH 7.4；总体积20μL)，并且将所述混合物在37℃下培养2小时。加入2.0μL量的稀释的蛋白酶K(可从Sigma-Aldrich商购获得；在PBS溶液中以1∶20稀释，pH 7.4)，并且将所述混合物在55℃下培养50分钟，然后在95℃下加热10分钟。将所述混合物在-20℃下储存。
DNA提取：
将来自实施例1B方法的混合物在95℃烘箱中培养，以蒸去剩余的水。将45μL裂解缓冲液PN(LGC Genomics)加入到每个混合物，然后将其各自短暂离心，并且在65℃下培养1小时。向新管加入60μL结合缓冲液PN、5μL Sbeadex颗粒(结合遗传物质的磁性颗粒，其可从LGC Genomics商购获得)，然后加入裂解物混合物，接着将其在室温下培养4分钟，以允许DNA与颗粒的结合，短暂涡旋并且放置于磁架中以浓缩小珠。移取裂解缓冲液，并且加入100μL洗涤缓冲液PN1(LGC Genomics)以使小珠重新悬浮。使用100μL洗涤缓冲液PN2(LGCGenomics)，然后用100μL纯水洗涤，来重复洗涤。加入10μL洗脱缓冲液PN，并且将混合物在55℃下培养10分钟，每3分钟涡旋。使用磁架浓缩小珠，并且将洗脱液转移到新管，并且在-20℃下储存。
C.全基因组扩增
当需要全基因组扩增时，使用单细胞试剂盒(可从Qiagen商购获得)遵循以下方案。进行全基因组扩增以实现更高的DNA产量，并且促进高密度标记组的检测。
将2.5μL模板DNA与2.5μL缓冲液D1(可从Qiagen商购获得；总体积5.0μL)组合，并且在室温下培养3分钟。加入5.0μL缓冲液N1(可从Qiagen商购获得；总体积10.0μL)，并且将混合物涡旋并且短暂离心。每次反应使用包含9.0μL无核酸酶水、29.0μL反应缓冲液(可从Qiagen商购获得)和2.0μLDNA聚合酶(可从Qiagen商购购得)的主混合物，得到50.0μL总体积。将混合物在采用30℃的热循环仪上运行8小时，之后在4℃下运行。使用Qubit测定(可从Life Technologies商购获得)进行DNA定量。DNA产物直接用于基因分型步骤。
D.分子分析
标记物分析
采用分析(可从Life Technologies商购获得)进行标记物分析。将DNA稀释至20ng/μL的目标浓度。将包含DNA的384板加载到LC480实时PCR热循环仪中，并且使用以下程序运行：预培养：1个循环(95℃下5分钟)；扩增：45个循环，(-95℃下30秒，-60℃下45秒(单次采集)，-72℃下1分钟(单次采集)；冷却：1个循环，(-72℃下10分钟，-40℃下30秒)。使用Roche LC480软件(可从Roche Diagnostics商购获得)读取调用。
结果
上述方法均给出可接受的基因分型结果。
实施例2：玉米胚储存
选择两系玉米种质用于测试油基质中延长的胚储存对发芽率的影响。在放置于它们各自储存条件之前，用手分离来自各系的胚。将所有胚铺展在发芽培养基上，以评定受控生长室中的发芽率。将各系的6个胚立即铺在未经任何储存暴露的发芽培养基上，以作为在受控生长室中发芽的对照。分离各系的七十二(72)个胚，并且用每个胚的专用储存管在三个储存条件下均匀分配：
储存条件1：将24个胚放置于由具有显著不同密度的两层油包围的50μL水性溶液中，一层密度显著大于水，而一层密度显著小于水。
储存条件2：将24个胚放置于具有添加的抗微生物剂的50uL水性溶液小滴中，由条件1的两种油包围。
储存条件3：将24个胚放置于具有添加的抗微生物剂的50uL最小生长培养基小滴中，由条件1的两种油包围。
在实验期间，将所有试管放置在4摄氏度的黑暗冷藏机中。在四(4)个时间点，从它们的储存条件中移取各系的6个胚，并且铺在受控生长室中的发芽培养基上，以评定发芽率。时间点如下：
时间点1：放置储存后15分钟。
时间点2：放置储存后1天。
时间点3：放置储存后5天。
时间点4：放置储存后10天。
然后监测胚发芽率以确定最佳储存条件。发现，三种储存方法的每一个中储存的胚的发芽率均优异。
实施例3：基因分型试剂储存研究方法和材料
选择端点SNP基因分型反应的两个组分，基因组DNA和分子标记测定(引物和探针)，以测试各种条件下在油双层中长期储存后对试剂活力的影响。
通过已知的提取方案，从玉米叶片组织和玉米种子组织中分离基因组DNA，以评定与基线相比的延长储存的影响。将来自每种组织类型提取的体积子集保持在原液提取浓度下，并且将剩余体积稀释至非常适于SNP基因分型反应的系数。进一步分配DNA浓度体积以提供专用体积，所述专用体积用于评定光照与黑暗条件、和室温与4摄氏度条件、以及各条件组合下的储存影响。
选择用于玉米端点SNP基因分型的四种分子标记测定，以评定与基线相比的延长储存的影响。将每个分子标记测定的体积子集保持在原液浓度下，并且将每个分子标记测定的剩余体积稀释至非常适于SNP基因分型反应的系数。进一步分配分子标记测定体积以提供专用体积，所述专用体积用于评定光照与黑暗条件、和室温与4℃条件、以及各条件组合下的储存影响。
在体积分离步骤之前，从每种试剂中移取基线样品，以产生用于在每个储存时间点进行比较的基线数据集。针对对照分子标记测定(不是测试分子标记测定)筛选提取的测试DNA试剂，并且针对对照DNA样品(而不是测试DNA样品)筛选测试分子标记测定。在它们各自的储存条件(光照/黑暗，室温/4℃)下储存之前，将每个试剂体积放置在油双层中。在预定的时间点，对于每个反应组分，采集来自每个测试储存条件的试剂等分试样，并且在端点SNP基因分型反应内针对对照试剂互补物进行筛选。将来自所有时间点的基因型数据与反应完成效率和总体数据质量的基线进行比较。来自储存的分子标记测定试剂的数据质量与基线的数据质量相当。
实施例4：单倍体胚在油基质中的倍增和选择
进行实验以确定是否可对储存在油双层中的胚应用倍增处理。
制备由以下组成的2X秋水仙碱选择培养基：2x DCS培养基(倍增，秋水仙碱，蔗糖)、2X DCS培养基组分(每升)、300.00g蔗糖II级、8.67g MS基础盐混合物、0.80g L-天冬酰胺一水合物、10.00mL 36J维生素溶液、2.50mL硫胺素溶液、0.20mL BAP溶液、1.00g秋水仙碱、41.66mLDMSO(20％)、和补足至1.00L的RO水。将2X秋水仙碱选择培养基放置在螺旋盖微量离心管中，并且用等量的无菌水稀释至1X浓度。将50μL的1X液体秋水仙碱选择培养基加入到每个管中，所述管包含高密度油和低密度包封油。秋水仙碱培养基沉降在油层之间。
从雄性诱导剂谱系和目标雌性谱系之间的杂交产生的穗，挽救二十个胚，所述雄性诱导剂谱系在其基因组中包含在胚组织中表达花青苷色素的标记基因。使用灭菌的刮刀将胚转移至秋水仙碱培养基中，并且将管在光照生长室中放置8-48小时。基于来自照相机的彩色图像选择胚。丢弃紫色或二倍体胚，同时将白色胚转移至生长培养基板中。然后将板放回培养室中以萌发。单倍体和二倍体胚的发芽率与不使用油包封的标准方案相当。
实施例5：增强花青苷表达以改善选择
在实施例5所述的方法中，花青苷表达的水平可以增强，致使选择改善。下文描述的方法以及本领域普通技术人员已知的其它方法可用于增加培养基中溶解的氧含量，从而提高花青苷表达的水平或其观察。
在一个实验中，在将胚引入油基质环境之前，对培养基通气。在50mL Falcon管内制备4mL培养基，并且在最大速度的摇床中放置数小时。在通气之后，将培养基立即转移到油基质管中。结果表明，培养基中的氧含量有助于检测二倍体胚的花青苷着色。另选地，液体培养基也可通过使过滤的空气鼓泡通过三层(第一油层、液体培养基、第二油层)而通气，因为一旦空气供应停止就会发生相分离。
在另一个实验中，胚在低渗液体培养基中培养，所述培养基包含PFC(全氟萘烷；未稀释，并且为覆盖胚所需的任何体积)和0.1％商业漂白剂(5％NaOCl v/v)。与对照相比时，漂白剂的加入足以抑制细菌生长而不影响发芽。花青苷颜色在秋水仙碱处理的12小时内显现在盾片的边缘，然后继续向心显现，直至整个胚变成***(如果是二倍体)。液体培养基中的发芽在统计学上类似于使用固体培养基的对照。
实施例6：油基质中农杆菌介导的玉米胚的转化
可制备农杆菌悬浮液(例如US 5,981,840中所示)，然后放置于两种油之间，其中一种油密度比水大，而另一种油密度比水小。包含农杆菌的悬浮液将沉降在油层之间。
分离胚，然后在位于油层之间的包含农杆菌的悬浮液中放置5分钟。然后从包含农杆菌的悬浮液中移取胚，接着培养2-4天。对于静置步骤，将胚转移至新板中，并且在黑暗中，在约28℃下培养至多14天，以消除任何残留的农杆菌。为了选择，接着放置胚以与包含选择剂的培养基接触，所述选择剂对应于***农杆菌内载体中的选择标记基因，以便杀死任何非转化事件。选择步骤也可在位于油基质内两种油之间的培养基中进行。然后使用组织培养方法，将转化的细胞再生以形成完整植物。
在由油双层包围的培养基中时允许胚转化发生的有益效果是为简化下游多重培养过程。该***比使用基于琼脂的培养基转移培养物的常规方法更自动化，并且将降低消耗品的成本以及相关的废物。
实施例7：油基质中玉米胚的性状选择
有效选择是选择包含目标转基因或天然性状的植物和植物组织中最关键的步骤之一。选择剂的存在允许转基因组织增殖，同时抑制或杀死未转化的组织。类似地，选择剂可用于确定植物组织是否包含赋予承受选择剂的能力的天然性状。理想的选择剂不应对随后的再生、生根和植物生长具有负面影响。抗生素和除草剂均可用作选择剂。常用的试剂包括草甘膦、草铵膦、双丙氨磷、潮霉素B、卡那霉素、巴龙霉素、甘露糖、草胺膦、氟丙嘧草酯、和R-吡氟氯禾灵。
可以将转化的植物组织或具有抗性性状的植物组织如植物胚放置在pH5.6的培养基中，所述培养基由以下组成：MS盐4.3g/L；肌醇0.1g/L；硫胺素HCL 0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、烟酸0.5mg/L、和蔗糖40.0g/L。可将选择剂直接加入到此类培养基，然后可使包含所述试剂的培养基连同植物组织位于两种油之间，其中一种油密度比水大，而另一种密度比水小。
可使用灭菌的刮刀将植物胚转移至包含选择的培养基中，并且将位于两种油之间的包含选择的培养基中的胚在8摄氏度至26摄氏度下放置至多7天以供选择。只有在它们的基因组内具有向选择剂赋予耐受性的基因的胚才将存活。可使用基于形态学差异的图像选择，例如通过机器视觉和计算机处理，来区分活胚和死胚。

Claims (29)

1.一种用倍增剂处理一个或多个植物胚的方法，所述方法包括：
a. 将倍增培养基放置于两种油之间，其中所述油中的一种密度比水大，而另一种密度比水小；
b. 将一个或多个植物胚放置于所述倍增培养基中；
c. 选择一个或多个植物胚；以及
d. 将所选择的植物胚转移至用于发芽或储存的培养基中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个植物胚为单倍体胚。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（c）和（d）之间，从所述一个或多个植物胚收集细胞材料；从所述细胞材料获得DNA；并且从一个或多个植物胚获得基因型信息。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述植物胚基于基因型信息来选择。
5.一种在倍增单倍体生产期间选择一个或多个植物胚的方法，所述方法包括：
a. 将倍增培养基放置于两种油之间，其中所述油中的一种密度比水大，而另一种密度比水小；
b. 将一个或多个植物胚放置于所述倍增培养基中，以及
c. 选择一个或多个植物胚以进行发芽或储存。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在步骤（b）和（c）之间，从所述一个或多个植物胚收集细胞材料；从所述细胞材料获得DNA；并且从一个或多个植物胚获得基因型信息。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述一个或多个植物胚基于基因型信息来选择。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法还包括将所选择的植物胚转移至用于发芽或储存的培养基中。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述倍增培养基包含抗微管剂。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述倍增培养基包含秋水仙碱、炔苯酰草胺、氟硫草定、甲基胺草磷、或氟乐灵。
11.根据权利要求5所述的方法，其中所述一个或多个植物胚为单倍体。
12.根据权利要求5所述的方法，其中步骤（c）中的所述一个或多个植物胚为通过雄性诱导剂谱系和目标雌性谱系之间的杂交产生的单倍体玉米胚。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述雄性诱导剂谱系包含在胚组织中表达的标记基因。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述标记基因表达花青苷色素。
15.根据权利要求14所述的方法，其中为白色的植物胚被选择为转移至用于发芽或储存的培养基中。
16.根据权利要求15所述的方法，其中使用相机或其它成像设备进行所述白色植物胚的选择。
17.根据权利要求15所述的方法，其中通过将所述倍增培养基通气来增强花青苷的表达。
18.根据权利要求15所述的方法，其中通过将所述植物胚放置于包含全氟萘烷的低渗倍增培养基中来增强花青苷的表达。
19.根据权利要求15所述的方法，所述方法还包括萌发或储存所选择的植物胚。
20.一种转化植物组织的方法，所述方法包括：
a. 形成包含根癌农杆菌的悬浮液，其中所述根癌农杆菌在其基因组内包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体在两种油之间包含一种或多种目标基因和选择性标记基因，其中所述油中的一种密度比水大，而另一种密度比水小；
b. 将所述植物组织放置于所述悬浮液中；
c. 从所述悬浮液中移取所述植物组织，并且在培养基中培养所述植物组织；
d. 使所述植物组织静置于培养基中；以及
e. 使所述植物组织与培养基接触，所述培养基包含对应于所述选择性标记基因的选择剂。
21.根据权利要求20所述的方法，所述方法还包括从所述植物组织再生植物。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述植物组织为植物胚或植物愈伤组织。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述植物组织在所述悬浮液中储存至多一小时。
24.根据权利要求20所述的方法，其中步骤（d）包括在约28摄氏度的温度下，将所述植物组织在黑暗中的培养基中静置至多14天的时段。
25.根据权利要求20所述的方法，其中包含对应于所述选择性标记基因的选择剂的所述培养基位于两种油之间，其中所述油中的一种密度比水大，而另一种密度比水小。
26.一种培养植物组织的方法，所述方法包括在介于两种油之间的溶液中培养植物组织，其中所述油中的一种密度比水大，而另一种密度比水小，所述溶液包含选择剂。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述选择剂为草甘膦、草铵膦、双丙氨磷、潮霉素B、卡那霉素、巴龙霉素、甘露糖、草胺膦、氟丙嘧草酯或R-吡氟氯禾灵。
28.根据权利要求26所述的方法，所述方法还包括在所述培养步骤后选择保持活力的植物组织的步骤。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述植物组织为植物胚或植物愈伤组织。
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