CN106661568A - 对丙型肝炎病毒具有感染抑制活性的抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供具有丙型肝炎病毒(HCV)感染抑制活性的抗丙型肝炎病毒E2蛋白抗体或抗原结合性抗体片段。本发明还提供具有特定可变区的、具有丙型肝炎病毒(HCV)感染抑制活性、显示逃逸突变株出现抑制性的抗丙型肝炎病毒E2蛋白抗体或抗原结合性抗体片段。
Description
技术领域
本发明涉及对丙型肝炎病毒具有感染抑制活性的抗体及其片段。
背景技术
丙型肝炎病毒(C型肝炎病毒，Hepatitis C virus，以下有时也记载为HCV)是被分类为黄病毒科丙型肝炎病毒(Hepacivirus)属的RNA病毒，作为非A非B肝炎(非甲非乙肝炎)的主要原因病毒被鉴定(非专利文献1)。
HCV主要通过输血而感染，但目前已经确立了高灵敏度的HCV的检测方法，因此通过输血而导致的新的HCV感染病人骤降。另一方面，现在已经推定：包含未显现出肝炎的病毒携带者在内的HCV持有者，在日本上升至200万人以上、全世界上升至1亿7000万人以上。最大的原因在于：因HCV感染而导致的肝炎的慢性化率高达70～80%或药物治疗不能显示充分的效果。由于HCV感染而引起的慢性肝炎、即丙型慢性肝炎，其后经过20几年之中有可能进展至肝硬化、最终恶化至肝癌。已知病状进行到肝硬化的丙型慢性肝炎病人可通过活体肝移植进行治疗，但活体肝移植后约半数复发肝炎，现状是没有防止肝炎复发的对策(非专利文献2)。
为了防止活体肝移植后的肝炎复发，期望开发以病毒的感染抑制或排除为目的的抗体药物。作为HCV感染的最初过程的HCV与细胞表面结合，认为HCV包膜蛋白发挥作用，因此研究了制作针对HCV包膜蛋白的抗体。但是，丙型肝炎病人的10%左右在血清中可见抗HCV包膜蛋白抗体，由于抗HCV包膜蛋白抗体的出现而使丙型肝炎自然治愈者，占其中的约10%(非专利文献3)，因此认为由于抗HCV包膜蛋白抗体而治愈的病人只占全部丙型肝炎病人的仅1%左右。推测这是由于存在针对HCV包膜蛋白的抗体产生受到阻碍或抑制的机制(非专利文献4)。另外，还研究了将从多个抗HCV抗体阳性丙型慢性肝炎病人的血浆获得的免疫球蛋白混合而得的制剂。但是，明确了：来源于病人的抗HCV抗体混合制剂，自活体肝移植时给予的情形，也没有抑制血浆中HCV量(非专利文献5)。
另一方面，非专利文献4中公开了：在哺乳动物中表达的、作为HCV的包膜蛋白之一的E2蛋白与存在于人细胞表面的CD81特异性结合。根据该实验结果尝试了从丙型肝炎病人分离显示抑制E2蛋白与CD81结合的NOB(Neutralisation of binding)活性的抗体。作为其代表性的例子，使用噬菌体展示法，自感染了基因型1a的HCV的丙型慢性肝炎病人的骨髓淋巴细胞制作抗体基因文库，从中分离显示NOB活性的抗体(专利文献1)。并且，自感染了基因型1b的HCV的丙型肝炎病人的末梢B细胞制作杂交瘤，从中分离显示NOB活性的抗体(非专利文献6、专利文献2)。但是，还报道了：显示NOB活性的抗体未必均抑制感染(非专利文献7)。
另外，将抗HCV抗体用作抗体药物时，由于病毒基因组突变有可能出现对于HCV感染抑制抗体的抑制活性获得耐性的病毒突变株、即逃逸突变株。由于抗HCV抗体的给予而出现HCV的逃逸突变株在使用黑猩猩的实验中得到了证实(非专利文献8)。
在非专利文献9中，暗示了对基因型2a的HCV具有感染抑制活性的抗HCV抗体抑制逃逸突变株的出现，实际上还公开了暗示逃逸突变株的出现的数据(专利文献3)。另外，在专利文献3中，这些抗体未显示对基因型1b的HCV的感染抑制活性，另外，对公开的基因型1b的HCV的结合活性弱，因此认为这些抗体不具有对基因型1b的HCV的充分的感染抑制活性。并且，在专利文献3中，关于这些抗体对基因型2a以外的基因型的HCV是否抑制逃逸突变株的出现仍未解明。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2003/064473号；
专利文献2：国际公开第2004/005316号；
专利文献3：国际公开第2013/033319号；
非专利文献
非专利文献1：Choo等人、Science、1989年、第244卷、第359-362页；
非专利文献2：Gane等人、Liver Transplantation、2003年、第9卷、第s28-s34页；
非专利文献3：Matsuura等人、J. Virol.、1992年、第66卷、第1425-1431页；
非专利文献4：Gerlach等人、Gastroenterology、1999年、第117卷、第933-941页；
非专利文献5：Davis等人、Liver Transplantation、2005年、第11卷、第941-949页；
非专利文献6：Hadlock等人、J. Virol.、2000年、第74卷、第10407-10416页；
非专利文献7：Burioni等人、J. Virol.、2002年、第76卷、第11775-11779页；
非专利文献8：Morin等人、Plos Pathogens、2012年、第8卷、e1002895；
非专利文献9：Keck等人、Plos Pathogens、2012年、第8卷、e1002653。
发明内容
发明所要解决的课题
对不限于特定基因型的HCV的多个基因型的HCV具有感染抑制活性的抗HCV抗体，不仅对感染了多个基因型的HCV的病人具有效果，而且对象病人的适用范围广，因而作为药物特别有用。因此，期望对多个基因型的HCV具有高的感染抑制活性的抗HCV抗体。并且，期望可强有力地抑制在干扰素和病毒唑治疗中难治性的基因型1b的HCV的感染的抗体。
另外，逃逸突变株的出现成为将抗HCV抗体作为药物开发时的重大障碍。因此，期望难以诱导逃逸突变株的出现、显示逃逸突变株出现抑制性的抗HCV抗体。
因此，本发明的目的在于提供抑制多个基因型的HCV的感染的抗HCV抗体。并且，本发明的另一目的在于提供显示HCV的逃逸突变株出现抑制性的抗HCV抗体。
用于解决课题的手段
本发明人为了解决上述的课题而进行了深入的研究，结果发现了：对多个基因型的HCV具有高的感染抑制活性的抗HCV抗体，并且发现了：显示逃逸突变株出现抑制性的抗HCV抗体。
即，本发明提供以下的内容。
(1) 抗丙型肝炎病毒E2蛋白抗体或抗原结合性抗体片段，其具有丙型肝炎病毒(HCV)感染抑制活性。
(2) 上述(1)所述的抗体或抗原结合性抗体片段，其显示逃逸突变株出现抑制性。
(3) 上述(1)或(2)所述的抗体或抗原结合性抗体片段，其中，上述抗体或抗原结合性抗体片段包含以下的(a)或(b)的重链可变区：
(a) 重链可变区，其包含：由SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列构成的CDR2、和由SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列构成的CDR3；
(b) 重链可变区，其包含SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列。
(4) 上述(3)所述的抗体或抗原结合性抗体片段，其进一步包含轻链可变区。
(5) 上述(1)～(4)的任一项中所述的抗体或抗原结合性抗体片段，其中，上述抗体或抗原结合性抗体片段包含以下的(c)～(f)的任一项的轻链可变区：
(c) 轻链可变区，其包含：由SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO:9所示氨基酸序列构成的CDR2、和由SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列构成的CDR3；
(d) 轻链可变区，其包含：由SEQ ID NO: 23所示氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ IDNO: 24所示氨基酸序列构成的CDR2、和由SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列构成的CDR3；
(e) 轻链可变区，其包含SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列；
(f) 轻链可变区，其包含SEQ ID NO: 22所示氨基酸序列。
(6) 抗体或抗原结合性抗体片段，其与上述(5)所述的抗体或抗原结合性抗体片段识别相同的立体结构表位。
(7) (1)所述的抗体或抗原结合性抗体片段，其包含以下的(g)或(h)所述的重链可变区和以下的(i)或(j)所述的轻链可变区：
(g) 重链可变区，其包含：由SEQ ID NO: 15所示氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ IDNO: 16所示氨基酸序列构成的CDR2、和由SEQ ID NO: 17所示氨基酸序列构成的CDR3；
(h) 重链可变区，其包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列；
(i) 轻链可变区，其包含：由SEQ ID NO: 18所示氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ IDNO: 19所示氨基酸序列构成的CDR2、和由SEQ ID NO: 20所示氨基酸序列构成的CDR3；
(j) 轻链可变区，其包含SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列。
(8) 上述(1)～(7)的任一项中所述的抗体或抗原结合性抗体片段，其中，上述抗体或抗原结合性抗体片段为IgG、Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体、dsFv、(scFv)2、或单结构域抗体。
(9) 上述(1)～(8)的任一项中所述的抗体或抗原结合性抗体片段，其中，上述抗体为人抗体或人源化抗体。
(10) 上述(1)～(9)的任一项中所述的抗体或抗原结合性抗体片段，其中，上述抗体或抗原结合性抗体片段进行了化学修饰。
(11) 核酸，其编码上述(1)～(9)的任一项中所述的抗体或抗原结合性抗体片段。
(12) 编码重链可变区的核酸，所述重链可变区包含：由SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列构成的CDR2、和由SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列构成的CDR3。
(13) 载体，其包含上述(11)或(12)所述的核酸。
(14) 导入了上述(13)所述的载体的宿主细胞。
(15) 抗丙型肝炎病毒E2蛋白抗体或抗原结合性抗体片段的制备方法，该方法包括：培养上述(14)所述的宿主细胞的步骤、和回收所表达的抗体或抗原结合性抗体片段的步骤。
(16) 药物，其含有上述(1)～(10)的任一项中所述的抗体或抗原结合性抗体片段作为有效成分。
(17) 上述(16)所述的药物，其为丙型肝炎的治疗药或预防药。
(18) 上述(17)所述的药物，其为用于在肝脏移植中使用的丙型肝炎的预防药。
(19) 丙型肝炎病毒检测用试剂，其含有上述(1)～(10)的任一项中所述的抗体或抗原结合性抗体片段。
(20) 丙型肝炎病毒感染的治疗或预防方法，该方法包括：将上述(1)～(10)的任一项中所述的抗体或抗原结合性抗体片段给予对象者。
本说明书包含作为本申请的优先权主张基础的日本国专利申请2014-058936号的全部公开内容。
发明效果
本发明的抗体或其抗原结合性片段对多个基因型的HCV具有HCV感染抑制活性。
附图简述
图1是显示编码抗体噬菌体e2d066和抗体噬菌体e2d081所提呈的VH区的核苷酸序列(上段)及其VH区的氨基酸序列(下段)的图。FR1、FR2、FR3和FR4为框架区。CDR1、CDR2和CDR3为互补决定区(Complementarity-determining region；CDR)。
图2显示编码抗体噬菌体e2d066所提呈的VL区的核苷酸序列(上段)及其VL区的氨基酸序列(下段)。
图3显示编码抗体噬菌体e2d073所提呈的VH区的核苷酸序列(上段)及其VH区的氨基酸序列(下段)。
图4显示编码抗体噬菌体e2d073所提呈的VL区的核苷酸序列(上段)及其VL区的氨基酸序列(下段)。
图5显示编码抗体噬菌体e2d081所提呈的VL区的核苷酸序列(上段)及其VL区的氨基酸序列(下段)。
图6显示本发明的IgG抗体对基因型2a的HCVcc(J6/JFH-1 HCVcc)的HCV感染抑制活性。
图7显示本发明的scFv对基因型2a的HCVcc(J6/JFH-1 HCVcc)的HCV感染抑制活性。
图8显示本发明的IgG抗体对基因型3a的HCVcc(S310/JFH-1 HCVcc)的HCV感染抑制活性。
图9显示本发明的scFv对基因型3a的HCVcc(S310/JFH-1 HCVcc)的HCV感染抑制活性。
图10显示本发明的IgG抗体对基因型1b的HCVcc(TH/JFH-1 HCVcc)的HCV感染抑制活性。
图11显示本发明的scFv对基因型1b的HCVcc(TH/JFH-1 HCVcc)的HCV感染抑制活性。
图12显示本发明的IgG抗体对基因型1a的HCVcc(H77/JFH-1 HCVcc)的HCV感染抑制活性。
图13显示本发明的scFv对基因型1a的HCVcc(H77/JFH-1 HCVcc)的HCV感染抑制活性。
图14显示本发明的IgG抗体对未变性E2蛋白(图14A)和变性E2蛋白(图14B)的结合性(表位分析)。作为E2蛋白，使用了TH E2-Fc蛋白。
图15显示本发明的IgG抗体对直链状肽(由E2蛋白氨基酸序列内的12个氨基酸残基构成)的结合性(表位分析)。图15A：e2d066 IgG、图15B：e2d073 IgG、图15C：e2d081 IgG、图15D：MBL-HCV1(IgG)。
图16显示其它抗体对与生物素化e2d066 IgG的E2蛋白(TH E2Fc蛋白)结合的竞争结合抑制作用(表位分析)。
图17显示其它抗体对与生物素化e2d066 IgG的E2蛋白(TH E2Fc蛋白)结合的竞争结合抑制作用(表位分析)。
图18显示本发明的抗体和其它抗体对基因型2a的J6CF株(图18A)的E2蛋白、或基因型1b的TH株(图18B)的E2蛋白的结合性。
图19显示基因型2a的HCVcc(J6/JFH-1 HCVcc)感染后通过e2d066 IgG处置的感染扩大抑制作用。
具体实施方式
本发明涉及抗丙型肝炎病毒E2蛋白抗体或抗原结合性抗体片段，其对多个基因型的丙型肝炎病毒(HCV)具有感染抑制活性。
另外，本发明涉及抗丙型肝炎病毒E2蛋白抗体或抗原结合性抗体片段，其对多个基因型的丙型肝炎病毒(HCV)显示感染抑制活性和逃逸突变株出现抑制性。本发明的抗体或抗原结合性抗体片段优选对多个基因型的HCV显示逃逸突变株出现抑制性。
通常，病毒的增殖在中和抗体的存在下暂时被抑制，但会再次进行增殖。也就是说，如此增殖而来的病毒针对其抗体具有中和抵抗性(neutralization-resistance)，将该病毒称为逃逸突变株。该再次增殖在中和抗体的存在下引起病毒的包膜蛋白的突变，结果使中和抗体无法与包膜蛋白结合。还已知下述的抗体：即使在中和抗体存在下，在其抗体所结合的病毒的包膜蛋白中的表位也不引起突变，难以诱导逃逸突变株的出现。在本申请说明书中，将这样的抗体定义为显示“逃逸突变株出现抑制性”的抗体。本发明的抗体或抗原结合性片段，与以往的抗体相比，难以使病毒的包膜蛋白中的表位产生突变，难以诱导逃逸突变株的出现。
本发明的抗体或抗原结合性抗体片段，优选与立体结构表位结合，显示逃逸突变株出现抑制性。
对于丙型肝炎病毒(HCV)，10种病毒蛋白(核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白)作为以该顺序连接而成的1个前体蛋白(polyprotein，多聚蛋白)来翻译，之后，利用细胞内和病毒的蛋白酶，由前体蛋白分别形成10种成熟的病毒蛋白(核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白)。丙型肝炎病毒(HCV)的实体是以病毒颗粒的形式存在。HCV的病毒颗粒(HCV颗粒)在由HCV的结构蛋白(核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白)构成的病毒壳的内部含有HCV基因组。在本申请说明书中，丙型肝炎病毒(HCV)与HCV颗粒以相同的含义使用。
在本申请说明书中，关于丙型肝炎病毒(HCV)的病毒蛋白中的氨基酸残基的位置(也称氨基酸残基编号或氨基酸编号)，以HCV的前体蛋白为基准，以将前体蛋白的N末端的氨基酸(起始甲硫氨酸)作为第1位时的编号表示。例如，基因型1b的TH株的E2蛋白是起始于第384位的氨基酸残基而中止于第717位的氨基酸残基。
立体结构表位(也称为结构表位)与由一次结构上连续的氨基酸残基构成的直链状表位不同，是依存于由一次结构上离开的不连续性的氨基酸残基构成的蛋白的高级结构的表位。构成立体结构表位的不连续性的氨基酸残基也可部分地连续。本发明的抗体或抗原结合性抗体片段识别立体结构表位，这可通过与利用还原剂和热处理等而变性的E2蛋白的结合性消失或结合性降低来确认。
E2蛋白是参与与存在于宿主细胞表面的受体(HCV受体)结合的包膜蛋白，丙型肝炎病毒(HCV)经由该HCV受体感染宿主细胞。报道了：CD81作为该HCV受体之一被鉴定，是HCV感染的必需因子之一(Akazawa等人、J. Virol.、2007年、第81卷、第5036-5045页)。
抗体(完全抗体)是通常也被称作免疫球蛋白(Ig)的蛋白，其结构是以包含2条重链(Ｈ链)和2条轻链(L链)的异源四聚体作为最小单元、该最小单元的1个或2个以上聚集而成的蛋白。代表性的是，各自的轻链通过1个的二硫共价键与重链连接，但各种免疫球蛋白同种型中重链间的二硫键的数目发生变动。各自的重链和轻链还可在链内具有二硫键。各自的重链具有重链可变区(以下、VH区)，其上连接有恒定区(IgG的情形，CH区：CH1、CH2、CH3)。各自的轻链具有轻链可变区(以下、VL区)，其上具有1个恒定区(以下、CL区)。CL区与重链的最初恒定区CH1并列，且VL区与VH区并列。抗体的可变区(Fv)具有：显示被称为互补决定区(以下、CDR)的特定可变性而对抗体赋予结合特异性的区。可变区除了CDR之外，还具有被称为框架区(以下、FR)的相对性保守的部分。完全的重链和轻链的可变区分别包含通过3个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)连接的4个FR(FR1、FR2、FR3、FR4)，从氨基末端到羧基末端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序配置。完全抗体例如可以是IgG、IgM、IgA。
本发明的抗丙型肝炎病毒E2蛋白抗体(完全抗体)具有带来丙型肝炎病毒E2蛋白特异性结合性的重链可变区和轻链可变区、以及恒定区(CL、CH1和Fc)。
本发明的抗原结合性抗体片段是指，包含完全抗体的部分成分，对该抗体的丙型肝炎病毒E2蛋白保持抗原结合性的蛋白。本发明的抗原结合性抗体片段对HCV保持感染抑制活性。通常，抗原结合性抗体片段与完全抗体(免疫球蛋白分子)相比分子量小，因此细胞浸透性优异，而且可以使用微生物进行生产，因此具有可以比较廉价地制备的优点。
作为抗原结合性抗体片段的例子，可举出：Fab(由VH、VL、CL和CH1构成的抗体片段；通过将IgG抗体用木瓜蛋白酶进行处理而获得)、F(ab)’2(在铰链区中由二硫键交联而得的2个Fab片段构成的抗体片段；通过将IgG抗体用胃蛋白酶进行处理而获得)、Fab’、Fv、单链抗体(scFv等)、dsFv、(scFv)2、双价抗体(Diabody)、微抗体(minibody)等，但不限于这些。单链抗体中包含scFv，scFv(single chain Fv)是指，代表性的是，作为可变区(Fv)的VH区与VL区通过接头连接成单链而得的抗体。dsFv(二硫键稳定性抗体，disulfide-stabilized Fv)是指，经由用于稳定化而导入到框架区的链内二硫键将Fv的VH区与VL区连接而得的抗体。
本发明的抗体或抗原结合性抗体片段可以是例如化学性合成的(合成抗体)、利用基因重组技术制作的(重组抗体)、人抗体、人源化抗体、重链和轻链可变区经由接头或导入的二硫键等连接而得的(单链抗体或双价抗体等)、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、嵌合抗体等。重组抗体是指，代表性的是，使用转染了宿主细胞的重组表达载体而表达的抗体或抗原结合性抗体片段。本发明的抗体或抗原结合性抗体片段可以是多克隆抗体，但优选单克隆抗体。
本发明的抗体或抗原结合性抗体片段的一实施方式包含VH区，所述VH区包含具有SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的CDR2、和具有SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列的CDR3。优选该VH区包含SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列。
本发明的抗体或抗原结合性抗体片段可以是包含VH区、且不包含VL区的单结构域抗体(也称为免疫球蛋白VH结构域片段(Immunoglobulin VH Domain Fragment))。这例如是仅由VH区构成的抗体片段。例如可举出：包含VH区、且不包含VL区的单结构域抗体，例如仅由该VH区构成的抗体片段，所述VH区包含具有SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的CDR2、和具有SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列的CDR3。
另外，本发明的抗体或抗原结合性抗体片段可以是包含VH区、且包含VL区的抗体，所述VH区包含具有SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的CDR2、和具有SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列的CDR3。VL区(轻链可变区)只要是对HCV的特异性结合性没有实质性影响即可，没有特别限定，可以是来源于任意抗体(优选来源于人抗体)的序列。
作为本发明的抗体或抗原结合性抗体片段所具有的VL区的优选例子，例如可举出：包含具有 SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 9所示氨基酸序列的CDR2、和具有SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的CDR3的VL区。作为该VL区，例如可举出：包含SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的区。
作为上述VL区的另外的优选例子，还可举出：包含由SEQ ID NO: 23所示氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO: 24所示氨基酸序列构成的CDR2、和由SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列构成的CDR3的VL区。作为该VL区，例如还可举出：包含SEQ ID NO: 22所示氨基酸序列的区。
作为本发明的抗体或抗原结合性抗体片段的具体例子，可举出包含下述的VH区和VL区的抗体或抗原结合性抗体片段，所述VH区包含SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列。作为本发明的抗体或抗原结合性抗体片段的具体例子，可举出包含下述的VH区和VL区的抗体或抗原结合性抗体片段，所述VH区包含SEQ IDNO: 2所示氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO: 22所示氨基酸序列。
另外，本发明的抗体或抗原结合性抗体片段可以是与上述的抗体或抗原结合性抗体片段识别相同立体结构表位的抗体或抗原结合性抗体片段。例如，本发明的抗体或抗原结合性抗体片段也包括与包含下述的VH区和VL区的抗体或抗原结合性抗体片段识别相同立体结构表位的抗体或抗原结合性抗体片段：VH区包含具有SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的CDR2、和具有SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列的CDR3 (优选包含SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的VH区)；VL区包含具有SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 9所示氨基酸序列的CDR2、和具有SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的CDR3 (优选包含SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的VL区)，或，VL区包含由SEQ ID NO: 23所示氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO: 24所示氨基酸序列构成的CDR2、和由SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列构成的CDR3 (优选包含SEQ ID NO: 22所示氨基酸序列的VL区)。
上述的本发明的抗体或抗原结合性抗体片段对多个基因型(优选包含基因型1a、1b、2a、和3a)的丙型肝炎病毒(HCV)具有感染抑制活性、显示逃逸突变株出现抑制性。在优选的实施方式中，本发明的抗体或抗原结合性抗体片段对2个以上的基因型、优选基因型1a、基因型1b、基因型2a和基因型3a的HCV具有高的感染抑制活性。
本发明的抗体或抗原结合性抗体片段的另一实施方式可以包含下述的VH区和VL区，所述VH区包含具有SEQ ID NO: 15所示氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列的CDR2、和具有SEQ ID NO: 17所示氨基酸序列的CDR3，所述VL区包含具有SEQ IDNO: 18所示氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO: 19所示氨基酸序列的CDR2、和具有SEQ IDNO: 20所示氨基酸序列的CDR3。该VH区优选包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列。该VL区优选包含SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列。这些抗体对多个基因型的HCV具有高的感染抑制活性。作为这样的本发明的抗体或抗原结合性抗体片段的具体例子，可举出包含下述的VH区和VL区的抗体或抗原结合性抗体片段，所述VH区包含SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列。这样的本发明的抗体或抗原结合性抗体片段对多个基因型(包含基因型1b和2a)的丙型肝炎病毒(HCV)具有感染抑制活性。
CDR是确定抗体的特异性的区。本发明的抗体和抗原结合性抗体片段所具有的CDR以外的区(例如，完全抗体的情形，重链和轻链的各FR和各恒定区)的氨基酸序列只要实质上不影响对HCV的特异性结合性即可，没有特别限定，可以是来源于其它抗体的序列。在此，其它抗体也包含来源于人以外的生物的抗体，但从降低副作用的观点出发优选来源于人的抗体。即，本发明的抗体和抗原结合性抗体片段，优选CDR以外的区包含来源于人抗体的对应氨基酸序列。本发明的抗体或抗原结合性抗体片段的CDR是来源于人抗体，因此构成本发明的抗体或抗原结合性抗体片段的其它区只要是来源于人抗体即可，由于形成仅由来源于人抗体的氨基酸序列构成的抗体或抗原结合性抗体片段，所以更优选。本发明的抗体和抗原结合性抗体片段的轻链可具有包含SEQ ID NO: 38～40的任一项所示氨基酸序列的CL区(恒定区)。
本发明的抗体或抗原结合性抗体片段可以是免疫球蛋白分子的任意类别、例如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD和IgY，或任意亚类、例如可以属于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等的任一类别，但优选为IgG。本发明的抗体的轻链可以是λ链或κ链的任一种。
本发明的抗体可以是具有包含上述的重链可变区(VH区)的重链和包含上述的轻链可变区(VL区)的轻链、同时具有恒定区的完全抗体。作为完全抗体的本发明抗体的优选例子，可举出：具有由SEQ ID NO: 26所示氨基酸序列构成的重链和由SEQ ID NO: 27所示氨基酸序列构成的轻链的抗体(与实施例中记载的e2d066 IgG对应)，具有由SEQ ID NO:30所示氨基酸序列构成的重链和由SEQ ID NO: 31所示氨基酸序列构成的轻链的抗体(与实施例中记载的e2d081 IgG对应)，和具有由SEQ ID NO: 28所示氨基酸序列构成的重链和由SEQ ID NO: 29所示氨基酸序列构成的轻链的抗体(与实施例中记载的e2d073 IgG对应)。
另外，本发明的抗体或抗原结合性抗体片段还包含与下述的抗体识别相同立体结构表位的抗体或抗原结合性抗体片段，所述抗体具有由SEQ ID NO: 26所示氨基酸序列构成的重链和由SEQ ID NO: 27所示氨基酸序列构成的轻链(与实施例中记载的e2d066 IgG对应)；或者，所述抗体具有由SEQ ID NO: 30所示氨基酸序列构成的重链和由SEQ ID NO:31所示氨基酸序列构成的轻链(与实施例中记载的e2d081 IgG对应)。
本发明的抗原结合性抗体片段还优选为具有上述的重链可变区(VH区)和上述的轻链可变区(VL区)的单链抗体、例如为scFv。单链抗体也称为一条链抗体，是指至少包含VH区和VL区(可以进一步包含CL区)、且它们连接成单链的抗体片段。关于scFv，代表性的是，构成Fv的VH区1个和VL区1个通过接头连接而得的抗体。但是，在本说明书中，也将除了VH区和VL区之外、还包含CL区的抗体称为scFv。作为本发明的scFv的具体例子，可举出：包含VH区、接头、以及VL区和CL区(VLCL区)的、由SEQ ID NO: 32所示氨基酸序列构成的抗体片段(与实施例中记载的e2d066 scFv对应)、由SEQ ID NO: 34所示氨基酸序列构成的抗体片段(与实施例中记载的e2d081 scFv对应)、和由SEQ ID NO: 33所示氨基酸序列构成的抗体片段(与实施例中记载的e2d073 scFv对应)。
本发明的抗体和抗原结合性抗体片段只要在人体内不具有免疫原性即可，可以包含不是来源于人的免疫球蛋白的氨基酸序列的序列(例如，人为地加入突变的序列)。本发明的抗体和抗原结合性抗体片段可以是例如对于上述记载的构成完全抗体的氨基酸序列，其FR或恒定区中的氨基酸被其它氨基酸取代而得的抗体和抗原结合性抗体片段。这样的氨基酸的取代，优选为1～5个氨基酸、更优选为1个或2个氨基酸的取代。具有这样的氨基酸取代的抗体优选与未取代抗体在功能上同等。因此，氨基酸取代优选为保守性氨基酸取代，这是电荷、侧链、极性、芳香性等的性质类似的氨基酸间的取代。性质类似的氨基酸例如可分类为：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸)、无极性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸)、支链氨基酸(苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸)等。通过将框架区内的氨基酸残基取代成半胱氨酸的氨基酸取代而导入二硫键，由此可以制作稳定化的抗体和抗原结合性抗体片段(dsFv等)，这样的抗体和抗原结合性抗体片段也包含在本发明的范围内。在此，“在功能上同等”是指，具有氨基酸取代的抗体与取代前的抗体具有同样的生物学或生化学活性、特别是具有HCV感染抑制活性。
本发明的抗体或抗原结合性抗体片段例如可利用下述的方法制作。
将编码抗体或抗体片段的核酸(基因)***1个或多个适当的载体，将其导入宿主细胞(例如，哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞等)，使用基因重组技术，使其产生本发明的抗体或抗原结合性抗体片段(P. J. Delves.、ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIALTECHNIQUES.、1997年、WILEY；P. Shepherd and C. Dean.、Monoclonal Antibodies.、2000年、OXFORD UNIVERSITY PRESS；J. W. Goding.、Monoclonal Antibodies: principlesand practice.、1993年、ACADEMIC PRESS)。需要说明的是，编码抗体或抗体片段的DNA，例如可以使用基因重组技术(Sambrook等人、Molecular Cloning A Laboratory Manual、1989年、Cold Spring Harbor Laboratory Press)或DNA合成机进行制作。
具体而言，例如，制作完全抗体时，可将编码抗体可变区的DNA与编码人IgG恒定区的DNA连接，并将其***表达载体。或者，也可将编码抗体可变区的DNA***包含编码抗体恒定区的DNA的表达载体。这些DNA优选在表达载体中的表达控制区例如增强子、启动子的控制下***。其次，用所得的表达载体转化宿主细胞，将该细胞进行培养，由此可产生抗体。这些表达载体可以单独或将2种以上组合使用。
将所得的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，接着***到表达载体中，将其导入宿主细胞使之表达，由此可获得完全抗体(参见欧州专利申请公开第EP239400号、国际公开第1996/02576号)。作为经由CDR而连接的人抗体的FR，可以选择使用下述的FR：互补决定区不妨碍形成与下述实施例中记载的e2d066或e2d081的完全抗体同样结构的抗原结合部位。另外，还可以取代成各种的来源于人抗体的FR(参见国际公开第1999/51743号)。
本发明的抗原结合性抗体片段也可以使用公知的方法、例如完全抗体的酶消化或基因重组技术来制作。本发明的抗原结合性抗体片段只要维持与抗原的结合活性，还可以与其它蛋白融合。例如，将包含VH的Ｈ链片段和包含VL的L链片段经由适当的接头进行连接，使其在宿主细胞中表达、或者在培养细胞中使由各自的载体表达的Ｈ链蛋白和L链蛋白缔合，由此可以制作scFv或Fab等的抗原结合性抗体片段。
例如，在噬菌体展示法中，通过用***有VH和VL的噬菌粒转化大肠杆菌，也可制作本发明的抗原结合性抗体片段。具体而言，使VH和VL分别通过PCR法扩增，将VL***噬菌粒载体，并转化大肠杆菌，进行VL阳性的噬菌粒的纯化，其次，将VH***VL阳性的噬菌粒，使其在大肠杆菌中表达，通过这样的2步克隆法可以制作本发明的抗原结合性抗体片段。另外，使VH和VL分别通过PCR法扩增之后进行连接，将该连接物***噬菌粒，利用该噬菌粒转化大肠杆菌，通过这样的VL-VH装配法也可以制备本发明的抗原结合性抗体片段。
scFv的制备例如可如下进行。利用基因重组技术，向所分离的编码VH和VL的各自的cDNA之间(或者，编码VH和VLCL的各自的cDNA之间)***编码接头的DNA，将编码所得单链抗体的重组DNA***表达载体，将其导入宿主细胞使之表达，由此可以制作scFv。
在本发明的scFv中，将VH区和VL区连接的接头，只要不抑制连接于其两端的VH和VL的表达、或者、VH和VL的结合即可，没有特别限定。接头肽的长度通常为1～100个氨基酸、优选为1～50个氨基酸、更优选为1～30个氨基酸、特别优选为12～18个氨基酸(例如15个氨基酸)。本发明中优选将由(GGGGS)3这样的15个氨基酸构成的多肽(SEQ ID NO: 35)( Kim等人、Protein Engineering Design and Selection(蛋白质工程设计与选择)、2007年、20(9)卷、第425-432页)作为接头使用(需要说明的是，G表示甘氨酸、S表示丝氨酸)。为了制备编码可变区的DNA，例如，可利用PCR法由将设计成CDR与人抗体FR连接的核苷酸序列制作成末端部具有重叠的部分的数个寡核苷酸来合成。
在FR的选择中，例如可以采用2个方法。第1个方法是：使用NEWM、REI等三维结构已经明确的人抗体框架的方法(Riechmann L.等人、Nature、1988年、第332卷、第323-327页；Tempst, PR等人、Protein Engineering、1994年、第7卷、第1501-1507页； Ellis JH.等人、J.Immunol.、1995年、第155卷、第925-937页)。第2个方法是：用人抗体的FR选择最通用的氨基酸的方法(Sato K.等人、Mol Immunol.、1994年、31卷、第371-381页； Kobinger F.等人、Protein Engineering、1993年、6卷、第971-980页； Kettleborough CA.等人、ProteinEngineering、1991年、第4卷、第773-783页)。本发明中还可以使用这些的任一种方法。
另外，作为用于制备与某多肽在功能上同样的多肽的、本领域技术人员熟知的方法，已知有将突变导入多肽的方法。例如，只要是本领域技术人员，使用位点特异性诱变法(Hashimoto-Gotoh T.等人、Gene、1995年、第152卷、第271-275页； Zoller MJ. and SmithM、Methods Enzymol.、1983年、第100卷、第468-500页；Kramer W.等人、Nucleic AcidsRes.、1984年、第12卷、第9441-9456页；Kramer W.and Fritz HJ.、Methods Enzymol.、1987年、第154卷、第350-367页；Kunkel TA.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、1985年、第82卷、第488-492页；Kunkel、Methods Enzymol.、1988年、第85卷、第2763-2766页)等，通过向编码本发明的抗体和抗原结合性抗体片段的规定核酸中导入适宜突变，即可制备与该抗体和抗原结合性抗体片段在功能上同样的抗体和抗原结合性抗体片段。用于实施位点特异性诱变的试剂盒也有市售，可用于本发明的抗体和抗原结合性抗体片段的制作。
本发明的抗体和抗原结合性抗体片段可以是化学性修饰(化学修饰)的抗体和抗原结合性抗体片段。即，本发明的抗体和抗原结合性抗体片段包含经化学修饰的抗体和抗原结合性抗体片段。关于该化学修饰，只要本发明的抗体和抗原结合性抗体片段对于HCV可具有特异性结合性，就可以是任意的化学修饰，例如可以是功能上的修饰或标记。作为这样的化学修饰，例如可举出：糖基化、乙酰化、甲酰化、酰胺化、磷酸化、和PEG化(聚乙二醇)等。而且，关于化学修饰，例如还可以是通过荧光色素(FITC、罗丹明、Texas Red、Cy3、Cy5)、荧光蛋白(例如，PE、APC、GFP)、酶(例如，西洋辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶)、或者生物素或(链霉)亲和素进行的修饰。这些修饰可以使用该技术领域中公知的任意方法来进行。
本发明还提供编码本发明的抗体或抗原结合性抗体片段的核酸。例如，编码本发明的抗体或抗原结合性抗体片段的核酸可以是包含编码SEQ ID NO: 1所示VH区的核苷酸序列和编码SEQ ID NO: 3所示VL区的核苷酸序列的核酸，可进一步包含编码由SEQ ID NO:38所示氨基酸序列构成的CL区的核苷酸序列。编码本发明的抗体或抗原结合性抗体片段的核酸还可以是包含编码SEQ ID NO: 11所示VH区的核苷酸序列和编码SEQ ID NO: 13所示VL区的核苷酸序列的核酸，可进一步包含编码由SEQ ID NO: 39所示氨基酸序列构成的CL区的核苷酸序列。编码本发明的抗体或抗原结合性抗体片段的核酸还可以是包含编码SEQID NO: 1所示VH区的核苷酸序列和编码SEQ ID NO: 21所示VL区的核苷酸序列的核酸，可进一步包含编码由SEQ ID NO: 40所示氨基酸序列构成的CL区的核苷酸序列。本发明还提供编码下述的重链可变区的核酸，所述重链可变区包含由SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列构成的CDR2、和由SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列构成的CDR3。本发明还提供包含编码本发明的抗体或抗原结合性抗体片段的核酸的载体、以及导入有该载体的宿主细胞。
宿主细胞是指载体所导入的对象细胞，例如可以是细菌细胞、哺乳动物细胞(人细胞等)、真菌细胞(酵母细胞等)、昆虫细胞等。导入有载体的宿主细胞由于突然变异或环境的影响等，可成为与导入有载体的当初细胞显示不完全相同的特性(表现型)的细胞，但这样的细胞的后代也包含在该“宿主细胞”中。
本发明还提供抗丙型肝炎病毒E2蛋白抗体或抗原结合性抗体片段抗体的制备方法，该方法包括：培养导入有载体的宿主细胞的步骤，所述载体包含编码本发明的抗体或抗原结合性抗体片段的核酸；以及，回收该培养中所表达的抗体或抗原结合性抗体片段抗体的步骤。更具体而言，可在诱导由该载体表达本发明的抗体或抗原结合性抗体片段的条件下培养宿主细胞，从该培养物中回收目标抗体或抗原结合性抗体片段。所回收的抗体或抗原结合性抗体片段可利用公知的方法进行纯化。
以下，作为本发明的抗体的制备方法的更具体的例子，虽然记载了人源化IgG抗体的制备方法，但与该方法同样地进行也可获取其它抗体。
用于人源化IgG抗体制备的表达用载体(人源化抗体表达用载体)是***有编码人抗体的重链恒定区和人抗体的轻链恒定区的基因的表达载体。该载体可通过将编码人抗体的重链恒定区和人抗体的轻链恒定区的基因分别克隆到表达载体中而构建。
人抗体的恒定区可以是任意的人抗体的重链和轻链恒定区，例如可举出：人抗体的重链的IgG1亚类的恒定区和人抗体的轻链的κ类别的恒定区等。编码人抗体的重链和轻链恒定区的基因可以是包含外显子和内含子的染色体DNA，还可以是cDNA。
作为为了制作人源化抗体表达用载体而使用的动物细胞用表达载体，只要是可***编码人抗体恒定区的基因且表达的载体，可以使用任意的表达载体。例如可举出：pAGE107(Cytotechnology、3、133(1990年))、pAGE103(J. Biochem.、101、1307(1987年))、pHSG274(Gene、27、223(1984年))、pKCR (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、78，1527(1981年))、pSG1βd2-4(Cytotechnology、4、173(1990年))等。作为在动物细胞用表达载体中使用的启动子和增强子，可举出：SV40的初期启动子和增强子(J. Biochem.、101、1307(1987年))、莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR(Biochem. Biophys. Res. Commun.、149、960(1987年))、免疫球蛋白重链的启动子(Cell、41、479(1985年))和增强子(Cell、33、717(1983年))等。
人源化抗体表达用载体可以是抗体重链和轻链存在于各自载体上的型或存在于同一载体上的型(以下，记为串联型)的任一种类型，但从构建人源化抗体表达用载体的容易程度、导入动物细胞的容易程度、在动物细胞内的抗体重链和轻链的表达量的平衡均衡等的角度考虑，优选串联型的人源化抗体表达用载体(J. Immunol. Methods、167、271(1994年))。作为串联型的人源化抗体表达用载体，可举出：pKANTEX 93(Mol. Immunol.、37、1035(2000年))、pEE 18(Hybridoma(杂交瘤)、17、559(1998年))等。
构建的人源化抗体表达用载体可用于人型嵌合抗体和人型CDR移植抗体在动物细胞中的表达。
关于人源化抗体的稳定性生产，可通过将人源化抗体表达载体导入适当的动物细胞，来实现获得稳定生产人型嵌合抗体和人型CDR移植抗体(以下，一并称为人源化抗体)的转化株。作为将人源化抗体表达载体导入动物细胞的方法，可举出：电穿孔法(日本特开平2-257891；Cytotechnology、3, 133(1990年))等。作为导入人源化抗体表达载体的动物细胞，只要是可产生人源化抗体的动物细胞，就可以使用任意的细胞。具体而言，可举出：作为小鼠骨髓瘤细胞的NSO细胞、SP2/0细胞、中国仓鼠卵巢细胞CHO/dhfr-细胞、CHO/DG44细胞、大鼠骨髓瘤YB2/0细胞、IR983F细胞、叙利亚仓鼠肾脏来源的BHK细胞、人骨髓瘤细胞的NAMALWA细胞等，优选可举出：作为中国仓鼠卵巢细胞的CHO/DG 44细胞、大鼠骨髓瘤YB 2/0细胞等。
导入人源化抗体表达载体之后、稳定生产人源化抗体的转化株，可按照日本特开平2-257891中公开的方法，利用包含G418硫酸盐(以下，记为G418；Sigma-Aldrich)或嘌呤霉素(Sigma-Aldrich、P8833)等试药的动物细胞培养用培养基进行选择。作为动物细胞培养用培养基，可以使用RPMI 1640培养基(日水制药)、GIT培养基(日本制药)、EX-CELL302培养基(SAFC Biosciences)、IMDM培养基(Thermo Fisher Scientific)、杂交瘤-SFM培养基(Thermo Fisher Scientific)、EX-CELL CD CHO Fusion(NICHIREI BIOSCIENCE：14365C)、或向这些培养基中添加胎牛血清(以下，记为FCS)等的各种添加物而得的培养基等。通过将所得的转化株在培养基中进行培养，可在培养上清中使人源化抗体生产并蓄积。培养上清中的人源化抗体的生产量和抗原结合活性可利用酶免疫抗体法(以下，记为ELISA法；Antibodies：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter14、1998年；或Monoclonal Antibodies：Principles and Practice、Academic Press Limited、1996年)等进行测定。另外，关于转化株，可按照日本特开平2-257891中公开的方法，利用DHFR基因扩增体系等，使人源化抗体的生产量提高。
人源化抗体可由转化株的培养上清使用蛋白A柱进行纯化(Antibodies：ALaboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Chapter8、1988年；或MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，Academic Press Limited，1996年)。另外，在人源化抗体的纯化中，除此之外，可以使用通常在蛋白的纯化中采用的纯化方法。例如，可以将凝胶过滤、离子交换层析和超滤等组合进行纯化。所纯化的人源化抗体的重链、轻链或抗体分子总体的分子量可利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(以下，记为SDS-PAGE；Nature、227，680(1970年))或蛋白质印迹法(Antibodies：A Laboratory Manual、Cold Spring HarborLaboratory、Chapter12、1988年；或Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press Limited，1996年)等进行测定。
以上，示例了将动物细胞作为宿主的抗体的制备方法，如上所述，在酵母、昆虫细胞、植物细胞、或者非人动物个体或植物个体中也可利用与动物细胞同样的方法制备抗体。
本发明的抗体或抗原结合性抗体片段对多个基因型的HCV具有高的感染抑制活性。本发明的抗体或抗原结合性抗体片段优选对2个以上基因型的HCV、例如选自基因型1a、1b、2a、3a、4a、5a、和6a的2个以上基因型的HCV、特别是包含基因型1b和2a的2个以上基因型的HCV具有感染抑制活性。需要说明的是，作为基因型1a的HCV，有H77株、HCV-1株、HCV-H株、J1株等；作为基因型1b的HCV，有TH株、Con1株、HCV-J株、JT株、BK株等；作为基因型2a的HCV，有J6CF株、JFH-1株、JFH-2株、JCH-1株等；作为基因型3a的HCV，有S310株、E-b1株；作为基因型4a的HCV，有ED43；作为基因型5a的HCV，有EUH1480；作为基因型6a的HCV，有EUK2等。
本发明中，“HCV感染”是指，自HCV颗粒结合于宿主细胞的细胞表面时开始、到在宿主细胞内增殖之后、释放到细胞外为止的过程。因此，本发明中，“HCV感染抑制活性”是指，通过阻碍或抑制HCV感染的上述一系列过程中的至少一个过程来阻止在体内或细胞群中的HCV感染进行的活性。本发明的抗体或抗原结合性抗体片段的HCV感染抑制活性优选为阻碍HCV结合于宿主细胞的细胞表面的病毒受体的途径和/或阻碍HCV基因组侵入到宿主细胞内的途径的活性。需要说明的是，“ HCV颗粒”是指，由HCV包膜蛋白和被该蛋白包装的HCV基因组构成的HCV自身或HCV样结构物。
本发明的抗体或抗原结合性抗体片段的HCV感染抑制活性，例如可通过测定将具有培养细胞感染性的嵌合HCV颗粒感染HCV感受性细胞(例如，Huh-7细胞)时的抑制活性进行评价。具有培养细胞感染性的嵌合HCV颗粒的制作例如可如下进行：将作为某种基因型的HCV基因组的结构基因的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白的编码序列与在培养细胞内高效率地自主复制的基因型2a的HCV株JFH-1的结构基因重组，并导入培养细胞，对其进行培养，使HCV颗粒产生，由此进行制作。通过使用该嵌合HCV颗粒，可评价对各种基因型HCV的感染抑制活性。该基本技术例如记载于Wakita等人、Nature Medicine、2005年、第11卷、第91-796页； Lindenbach等人、Science、2005年、第309卷、第623-626页；Pietschmann等人、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、2007年、第103卷、第7408-7413页中。
关于HCV感染抑制活性的评价，具体而言，例如可通过下述的方法进行：在要评价HCV感染抑制活性的抗体的存在下和非存在下，培养HCV颗粒与HCV感受性细胞(例如，Huh-7细胞)的混合物、或者培养感染了HCV颗粒的HCV感染细胞，检测释放到所得培养物中的HCV基因组RNA或HCV颗粒。在此，关于检测，通常可通过测定(例如，定量)培养物中的HCV基因组RNA或HCV颗粒的量来进行。此时，在培养物中不存在HCV基因组RNA和HCV颗粒、或者与抗体非存在下相比少时，可评价为该抗体对HCV具有感染抑制活性。
作为HCV感染抑制活性的评价方法，更具体而言，例如可举出以下的方法。首先，将包含抗体的试样与HCV颗粒混合，在37℃下使之反应1小时(混合样本)。其次，向前一天在96孔板上以5×103个/孔培养的Huh-7细胞中添加50μL混合样本，在37℃下培养2.5小时。除去培养液，用PBS清洗细胞后，再次加入新鲜培养基继续培养。48小时后，除去培养液，用PBS清洗1次后，加入100μL ISOGEN(Nippon Gene)，由细胞制备RNA。定量RNA之后，通过定量RT-PCR测定HCV基因组RNA量。HCV基因组RNA通过定量RT-PCR的检测可通过按照Takeuchi等人的方法(Gastroenterology、1999年、第116卷、第636-642页)检测HCV基因组RNA的5’非翻译区的RNA来进行。由测定而得的HCV基因组RNA量可算出HCV感染抑制活性。
作为HCV感染抑制活性的评价方法，还可举出以下的方法。将包含抗体的试样与HCV颗粒混合，在室温下使之反应30分钟(混合样本)。其次，向前一天在48孔板上以2×104个/孔培养的Huh-7细胞中添加100μL混合样本，在37℃下培养3小时。除去培养液，用PBS清洗细胞后，再次加入新鲜培养基继续培养。72小时培养后，除去培养液，用PBS清洗细胞后，添加100μL/孔Passive lysis buffer(PLB裂解液)(Promega)，制作细胞溶解液。使用Lumipulse G1200(Fujirebio Inc.、Ortho Clinical Diagnostics)定量所回收的细胞溶解液中所含的HCV核心蛋白。由测定而得的HCV核心蛋白的摩尔浓度可算出HCV感染抑制活性。
在一个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合性抗体片段显示HCV的逃逸突变株出现抑制性。逃逸突变株是指，通过HCV的病毒基因组突变而对于感染抑制抗体的抑制活性获得耐性的病毒突变株，逃逸突变株出现抑制性是指，使逃逸突变株出现的诱导率降低、或者不诱导逃逸突变株出现的性质。
本发明的抗体或抗原结合性抗体片段显示逃逸突变株出现抑制性可如下进行评价：按照Meital等人的方法(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、2008年、第105卷、第19450-19455页)，在评价对象的抗体存在下，使HCV颗粒感染细胞并进行培养之后，将所回收的培养上清和抗体再次混合，使其感染非感染细胞，重复进行操作，最后测定培养上清中所含的HCV的感染效价，由此进行评价(重复继代感染的评价)。具体而言，例如，将各基因型的HCV与JFH-1的嵌合HCV颗粒和人抗HCV抗体进行混合，在37℃下使之反应1小时(混合样本)。其次，向接种于12孔板的非感染Huh-7细胞中添加混合样本，使其感染。感染3天后在6孔板中进行继代，继代后第3天和第6天回收培养上清。通过HCV的感染效价测定来确认所回收的培养上清中包含嵌合HCV颗粒，将确认感染效价后的回收的培养上清(在第3天或第6天所回收的培养上清)和抗体再次混合，使其重新感染非感染细胞，将该继代感染重复8次(继代感染的重复次数：总8次)。测定最后获得的培养上清中所含的HCV的感染效价，可算出感染抑制浓度IC50。即使经过8次的重复继代感染也没有产生感染抑制浓度IC50的显著増加、没有产生感染抑制活性大幅度降低的情形(例如，感染抑制浓度IC50 1μg/mL以下)，可判断为显示逃逸突变株出现抑制性。
另外，在Meital等人的文献(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、2008年、第105卷、第19450-19455页)中，通过上述的重复继代感染评价AP33抗体的结果，显示出：继代感染重复3次时未出现逃逸突变株，但重复5次时出现了逃逸突变株。根据该结果认为：AP33抗体不是显示逃逸突变株出现抑制性的抗体。另外，Keck等人的文献(Plos Pathogens、2012年、第8卷、e1002653)记载了：通过上述的重复继代感染评价的结果，显示出：CBH-2抗体的情形，若继代感染重复3次则出现了逃逸突变株，相对于此，HC-84.1抗体和HC-84.25抗体的情形，继代感染分别重复4次和5次时，抑制逃逸突变体的出现，根据该结果认为：HC-84.1抗体和HC-84.25抗体是显示逃逸突变株出现抑制性的抗体。但是，关于这些抗体，在国际公开第2013/033319号中报道了下述的数据：通过与上述的重复继代感染的评价不同的评价方法，具体而言，病毒量和抗体处置浓度与Meital等人的方法不同，通过从感染抑制活性IC50值的浓度开始的方法来评价重复感染的条件时，在重复感染的过程中将病毒量维持在一定浓度所必要的抗体量増加(即IC50值升高)、即暗示逃逸突变株的出现(国际公开第2013/033319号)。因此，根据公知的信息，优选通过上述的重复继代感染评价的结果、继代感染重复4～5次仍抑制逃逸突变株的出现的情形，可判断为显示逃逸突变株出现抑制性。进一步优选通过上述的重复继代感染评价的结果、继代感染重复8次仍未出现逃逸突变体的情形，可判断为显示逃逸突变株出现抑制性。
对于逃逸突变株出现抑制性不存在(或低)的公知的抗HCV抗体，由于上述的继代感染重复4～5次的过程中产生逃逸突变株，因此认为感染抑制活性大幅度降低。另外，逃逸突变株的出现可如下进行确认：分析上述的重复感染培养的期间或最后所得的培养上清中包含的HCV的核苷酸序列，确定所突变的氨基酸残基，由此进行确认。
作为一个例子，与立体结构表位结合的本发明的抗体或抗原结合性抗体片段优选显示逃逸突变株出现抑制性。
本发明的抗体或抗原结合性抗体片段与HCV的E2蛋白特异性结合。在一个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合性抗体片段，特别是特异性识别(结合)HCV的E2蛋白的结构表位(立体结构表位)。
本发明的抗体或抗原结合性抗体片段对多个基因型的HCV具有高的感染抑制活性，因此可用作药物、特别是丙型肝炎的治疗药或预防药。本发明还提供含有本发明的抗体或抗原结合性抗体片段作为有效成分的药物、特别是丙型肝炎的治疗药或预防药。
本发明的药物可以是含有药学上可接受的载体的药物组合物。“药学上可接受的载体”是指可在制剂的技术领域中常规使用的溶剂和/或添加剂。
药学上可接受的溶剂例如可举出：水、药学上可接受的有机溶剂(例如，乙醇、丙二醇、乙氧基化异硬脂醇、聚氧化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨坦脂肪酸酯类)。这些溶剂优选进行灭菌，根据需要，优选调整为与血液等渗。
另外，药学上可接受的添加剂可举出：胶原、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧基甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性糊精、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、***树胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、作为药物添加物可接受的表面活性剂等。
关于药学上可接受的添加剂，除此之外，根据需要，还可包含赋形剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、乳化剂、流动添加调节剂、润滑剂、矫味矫臭剂、助溶剂(可溶化剂)、助悬剂、稀释剂、表面活性剂、稳定剂、吸收促进剂、增量剂、赋湿剂、保湿剂(例如，甘油、淀粉)、吸附剂、崩解抑制剂、包衣剂、着色剂、保存剂、抗氧化剂、香料、风味剂、甜味剂、缓冲剂等。
关于溶剂和添加剂，根据剂型可以单独或适当组合使用。例如，作为注射用制剂使用时，可以使用将经纯化的抗体溶解于溶剂(例如，生理盐水、缓冲液、葡萄糖溶液)中，向其中添加吸附防止剂(例如，Tween80、Tween20、明胶、人血清白蛋白)而得的制剂。或者，为了在使用前进行溶解而制成再构成的剂型，可以是冻干制品。例如，为了进行冻干可以使用赋形剂(例如，甘露醇、葡萄糖等的糖醇或糖类)。
本发明的药物可以按照常规方法进行制剂化。关于制剂化，例如可以参见Remington’s Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company,Easton, U. S. A.。
本发明的抗体或抗原结合性抗体片段或药物可以通过口服给予、组织内给予(例如，皮下给予、肌肉内给予、静脉内给予)、局部给予(例如，经皮给予)或经直肠给予来进行给予。剂型优选为适合于给予方法的形态。例如，组织内给予时，优选经由血流的注射，此时的剂型，代表性的是液体。
进行注射时，对注入部位没有特别限定。例如可举出：静脉内、动脉内、肝脏内、肌肉内、关节内、骨髓内、髓腔内、心室内、经皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、肠内或舌下等。优选为静脉内注射或动脉内注射等血管内注射。这是由于：经由血流可使本发明的药物直接到达全身，而且侵袭性比较低，给病人等的对象者带来的负担小。或者，还可注射到肝脏内或肝门静脉。这是由于：可使本发明的药物直接作用于HCV所处的部位。
将本发明的抗体或抗原结合性抗体片段或药物给予对象者(病人等)时，优选每一给予单位中含有可发挥HCV感染抑制活性的有效量的本发明的抗体或抗原结合性抗体片段。“有效量”是指，有效成分发挥其功能所必要的量，即本发明中是指抑制HCV感染所必要的量，且是指对所给予的对象者几乎或完全不产生有害副作用的量。该有效量可根据对象者(病人等)的信息、剂型和给予途径等的各种条件而发生变化。“对象者(病人等)的信息”包含：疾病的进展程度或重症程度、全身的健康状态、年龄、体重、性别、饮食生活、药物敏感性、有无并用药物、以及对治疗的耐性等。本发明药物的最终给予量和有效量，基于每个对象者的信息等，通过医师的判断进行确定。在获得HCV感染抑制效果方面，有必要大量给予本发明药物时，为了减轻对于对象者的负担，还可分成数次进行给予。
将本发明的药物给予对象者时，作为有效成分的本发明的抗体或抗原结合性抗体片段的给予量，可在0.001mg～1000mg/次/每kg体重的范围选择。或者，每个对象者可以选择0.01～100000mg/个体(body)的给予量，但不限于这些的给予量。另外，作为上述的给予时机，可在疾病的临床症状产生的前后进行给予。
作为具体的给予量的一个例子，例如，给予丙型肝炎发病初期、不必并用其它药物的成年男子(体重60kg)时，每日的上述药物的有效量通常为1～2000mg、优选为1～1000mg、更优选为1～500mg的范围。根据对象者的信息或给予途径等，还可以给予不足上述范围或超过上述范围的用量。
对成为本发明的抗体或抗原结合性抗体片段或药物的给予对象的对象者没有限定，优选为人等的灵长类、家畜、宠物、实验(试验)动物等的哺乳动物，特别优选为人等的灵长类。对象者可以是罹患丙型肝炎、或者可以是未罹患丙型肝炎但有罹患丙型肝炎风险的对象者。对象者可以是接受肝脏移植的慢性丙型肝炎病人、或者可以是接受需要输血的手术的病人。
本发明的抗体或抗原结合性抗体片段或药物可对任意的丙型肝炎有效，优选对慢性丙型肝炎或急性重症丙型肝炎有效，另外，对由各种基因型的HCV(例如1a、1b、2a、3a、4a、5a、或6a)、例如基因型1a、2a、3a或1b的HCV而引起的丙型肝炎特别有效。本发明的抗体或抗原结合性抗体片段或药物还可以抑制HCV在曾经感染的活体内的细胞水平的感染扩大(HCV向其它细胞的传播)。因此，本发明还涉及丙型肝炎病毒感染的治疗或预防方法，该方法包括：将本发明的抗体或抗原结合性抗体片段或药物给予对象者。
本发明的抗体或抗原结合性抗体片段或药物可以适合用作用于在肝脏移植中使用的丙型肝炎的预防药。例如，为了预防慢性丙型肝炎病人在活体肝移植时复发丙型肝炎，优选在肝脏移植前、肝脏移植中或肝脏移植后给予。
为了补充或增强本发明药物的治疗或预防效果、或者降低给予量，还可以将本发明药物与其它药物适量混合使用或并用使用。作为并用的药物，可举出：现有的抗病毒剂，例如干扰素、病毒唑等。
另外，本发明的抗体或抗原结合性抗体片段还可以用作用于试样中的HCV检测的、HCV检测用试剂。本发明还涉及使用了本发明的抗体或抗原结合性抗体片段的、试样中的HCV的检测方法。
试样是指，可包含HCV(HCV颗粒或其包膜蛋白)的各种试样。例如为：培养细胞、培养细胞破碎液、培养液上清、或来自对象者的试样、例如人试样。人试样是指，采自人的组织(例如，术后采取的组织)、或血液、血清、血浆、尿、骨髓液、唾液、淋巴液、***等的体液等所有的来自人的活体试样，优选为血液、血清、血浆或尿。另外，不仅可以是液体试样，也可以是固体试样。例如，也可以是器官移植的捐献者器官、或组织切片标本等。
HCV的检测可以通过ELISA法、EIA法、荧光免疫测定法、放射免疫测定法、或发光免疫测定法等的使用标记抗体的公知的免疫学检测方法、表面等离子体共振法(SPR法)或石英晶体微量天平测定法(Quartz Crystal Microbalance, QCM法)进行实施，但优选通过使用标记抗体的免疫学检测方法进行实施。
ELISA法也称为酶联免疫吸附测定法，是指下述的方法：对于试样中所含的微量的靶抗原，使用酶标记的抗体或抗原，利用该酶的作用，以显色浓度或荧光强度的形式检测抗原抗体反应，来定量靶抗原。例如，是指下述的方法：将本发明的抗体或抗原结合性抗体片段固定于固相载体，酶性检测该抗体等与试样中的HCV的免疫学反应。关于ELISA法的测定方法，请参见公知的方法(石川荣治等人编“酶联免疫测定法”、1987年、第3版、医学书院等)。作为固相载体，可以使用由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸酯、胶乳、明胶、琼脂糖、纤维素、琼脂糖凝胶、玻璃、金属、陶瓷或磁性体等材质构成的珠、小平板(microplate)、试验管、棒或试验片等形状的不溶性载体。本发明的抗体或抗原结合性抗体片段固定于固相载体，可以按照物理吸附法、化学结合法或这些并用的方法等公知的方法，使之结合来实现。
作为将本发明的抗体或抗原结合性抗体片段标记的标记物质，例如，ELISA法的情形，可以使用过氧化物酶(POD)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脱氢酶、淀粉酶或生物素-亲和素复合物等；荧光免疫测定法的情形，可以使用异硫氰酸荧光素、四甲基异硫氰酸罗丹明、取代异硫氰酸罗丹明、二氯三嗪异硫氰酸酯、Alexa480或Alexa Fluor 488等；而且，放射免疫测定法的情形，可以使用氚、碘125(125I)或碘131(131I)等，但不限于这些。另外，发光免疫测定法可以使用NADH-FMNH2-荧光素酶类、鲁米诺-过氧化氢-POD类、吖啶酯类或二氧杂环丁烷化合物类等。关于标记抗原与抗体的结合法，ELISA法的情形，可以使用戊二醛法、马来酰亚胺法、二硫吡啶法或过碘酸法等公知的方法；放射免疫测定法的情形，可以使用氯胺T法、Bolton-Hunter法等公知的方法。
另外，上述的免疫学测定方法还可以如下实施：将免疫比浊法、胶乳凝集反应、胶乳比浊法、红细胞凝集反应或颗粒凝集反应等的免疫复合物凝集物的生成，通过光学方法测定其透射光或散射光，或者通过目视测定的测定法来实施。此时，可以使用磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、或Good缓冲液等作为溶剂，并且可包含聚乙二醇等的反应促进剂或非特异性反应抑制剂。
作为HCV检测方法的具体例子，对于适用于ELISA夹心法的情形，下面列举例子简单地说明。首先，将本发明的抗体固定于不溶性的载体。需要说明的是，待固定的抗体只要是可特异性地识别HCV即可，可以是1种也可以是多种。其次，使可能含有HCV的试样作用于固定抗体的表面，使固定抗体与HCV的复合物在载体的表面形成。之后，通过使用清洗液进行充分清洗，存在于试样中的HCV以外的未结合物质被除去。并且，制作特异性地识别HCV的其它抗HCV标记体，使该标记抗体与结合有固定抗体与HCV的复合物的载体作用，使用清洗液充分清洗之后，通过利用标记进行检测，可以检测存在于试样中的HCV。
另外，还可以预先将包含标记抗体和HCV的试样混合形成抗原抗体复合物之后，使之作用于固定抗体。只要将待固定的抗体进行生物素标记，则将生物素化固定抗体、包含HCV的试样、实施了生物素以外的标记的抗体全部混合形成抗原抗体复合物之后，使之作用于固定有亲和素的载体，就可以利用生物素化以外的标记来检测抗原抗体复合物。
并且，上述的免疫学测定方法还可以使用免疫层析用试验片(test strip)。免疫层析用试验片例如由下述的部构成：由容易吸收试样的材料构成的试样容纳部、含有本发明诊断药的试剂部、试样与诊断药的反应物所移动的展开部、将已展开的反应物呈色的标记部、已呈色的反应物所展开的提呈部等。市售的妊娠诊断药等与其具有同样的形态。本测定方法的原理如下。首先，若将试样供给到试样容纳部，则试样容纳部吸收试样、使试样到达试剂部。接着，在试剂部中试样中的HCV与抗体进行抗原抗体反应，反应复合物在展开部移动进而到达标记部。在标记部中，产生上述反应复合物与标记二次抗体的反应，若与其标记二次抗体的反应物展开到提呈部，则可确认到呈色。上述免疫层析用试验片的侵袭性极低，完全不会给使用者带来痛苦或试剂使用的危险性，因此可用于家庭中的监控器，针对其结果，在各医疗机构水平进行精密检查并治疗(外科的切除等)，可有利于预防转移、复发。另外，这样的试验片可廉价地大量生产，从该角度考虑也是便利的。
实施例
以下，列举实施例，更具体地说明本发明。
(实施例1) 抗体噬菌体文库的筛选
在以下的人抗HCV抗体的筛选中，使用了记载于下述文献中的一般的噬菌体展示法：Chan等人、J. Gen. Virol、1996年、第77卷、第2531-2539页；Bugli等人、J. Virol、2001年、第75卷、第9986-9990页；以及Jostock等人、J. Immunol. Methods、2004年、第289卷、第65-80页。
1. 抗体噬菌体文库的制作
以下所记载的抗体噬菌体文库的制作按照Gejima等人、Human antibodies、(2002)、第11卷、第121-129页中充分记载的方法来进行。
自人慢性丙型肝炎病人分离编码抗体基因的mRNA，利用RT-PCR合成了cDNA。利用PCR法由cDNA分别扩增了VH区基因和VLCL区基因(VL区基因和CL区基因)。将所扩增的VH区基因和VLCL区基因***到包含编码有(GGGGS)3(SEQ ID NO: 35)等的接头肽序列的接头DNA的噬菌粒载体pTZ19R中，按照VH区基因、接头、VL区基因、CL区基因的顺序制备了scFv基因。将所制备的scFv基因利用限制酶位点HindIII***到噬菌粒载体pTZ19R中，构建了scFv基因文库。将该scFv基因文库转化到TG-1(SupF)等的大肠杆菌中之后，使辅助噬菌体M13K07再感染，制备了scFv噬菌体文库。所制作的抗体噬菌体是提呈将人抗体的VH区和VLCL区用接头连接而成的肽的噬菌体。
2. 用于筛选的HCV的E2蛋白的制作
用于筛选的HCV的E2蛋白的制备使用Drosophila Expression System(果蝇表达***)(Thermo Fisher Scientific)来进行。该方法充分记载于Krey等人、PLOS PATHOGENS、第6卷、e1000762中。
分别使用S2细胞表达载体pMT/BiP/V5-His(Thermo Fisher Scientific)的限制酶位点BglII和XbaI，***了HCV的TH株(基因型1b、Wakita,T.等人、J. Biol. Chem.、1994年、第269卷、第14205-14210页、国际公开第2006/022422号)的编码E2蛋白(氨基酸编号384-711；不含跨膜区)的DNA或JFH-1株(基因型2a、国际公开第2004/104198号)的编码E2蛋白(氨基酸编号384-714；不含跨膜区)的DNA。
转染通过磷酸钙沉淀法来进行。如下制作了转染用溶液。利用HCV的E2蛋白编码基因将重组有***片段的pMT/BiP/V5-His(19μg)、选择用质粒载体pCoHygro(1μg)、2M CaCl2(36μL)混合，用纯净水定容至300μL。将该混合溶液缓慢滴加到HEPES-Buffered Saline(HEPES缓冲盐水(HBS)；50mmol/L HEPES、1.5mmol/L Na2HPO4、280mmol/L NaCl、pH7.1)中，边温和地涡旋边充分混合，制作了转染用溶液。
向6孔板中接种2mL的1×106细胞/mL的S2细胞，在28℃下培养12小时左右，使达到2～4×106细胞/mL。将上述的转染用溶液在室温下静置30分钟之后，向接种有S2细胞的6孔板中没有遗漏地均等地滴加，之后在28℃下培养了24小时。24小时后，交换培养基(Shneider's Drosophila Medium(施耐德的果蝇培养基)、10%FBS、青霉素(50units/mL)、链霉素(50μg/mL)、300μg/mL潮霉素B)，每3～4天边交换培养基边进行了继代培养。进行约3周选择培养，以此作为稳定细胞株。
E2蛋白的表达诱导如下进行：向2×106个的S2细胞(每1个225cm2长颈瓶，40mL)中加入CuSO4 (最终浓度0.5mmol/L)，培养5天。回收培养液，通过离心(2000rpm、5分钟)除去细胞，获得了培养上清。将培养上清使用His标签蛋白纯化用层析载体(Ni-NTA agarose)进行纯化，获得了HCV的TH株(基因型1b)的E2蛋白或HCV的JFH-1株(基因型2a)的E2蛋白。
3. 与HCV的E2蛋白结合的抗体噬菌体的筛选
以下所记载的抗体噬菌体的筛选基于下述文献中充分记载的方法来进行：Gejima等人、Human antibodies、(2002)、第11卷、第121-129页。
使上述2. 项目中制作的HCV的E2蛋白(TH株(基因型1b)的E2蛋白或JFH-1株(基因型2a)的E2蛋白)与免疫管等的塑料表面或磁珠表面结合，添加上述1.项目中制作的scFv噬菌体文库进行反应之后，用含有0.1%Tween20的PBS进行清洗，去除了非特异性的噬菌体。特异性结合的噬菌体用0.1mol/L甘氨酸-HCl(pH2.2)洗脱，使其感染大肠杆菌进行了扩增。通过将该操作重复3次，浓缩并获取了HCV E2蛋白(TH株(基因型1b)的E2蛋白或JFH-1株(基因型2a)的E2蛋白)特异性的噬菌体。
4. 所选拔的抗体噬菌体的可变区
利用常规方法分析了上述3. 项目中选拔的3种抗体噬菌体(e2d066、e2d073、和e2d081)所提呈的肽中的VH区和VL区的核苷酸序列。另外，对于CL区的核苷酸序列，也利用常规方法进行了分析。
(1) 抗体噬菌体e2d066
对于抗体噬菌体e2d066所提呈的VH区和VL区，编码VH区的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1、其氨基酸序列示于SEQ ID NO: 2(图1)，编码VL区的核苷酸序列示于SEQ ID NO: 3、其氨基酸序列示于SEQ ID NO: 4(图2)。另外，对于抗体噬菌体e2d066所提呈的VH区和VL区，VH区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7，VL区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:10。另外，CL区的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 38。
(2) 抗体噬菌体e2d073
对于抗体噬菌体e2d073所提呈的VH区和VL区，编码VH区的核苷酸序列示于SEQ ID NO:11、其氨基酸序列示于SEQ ID NO: 12(图3)，编码VL区的核苷酸序列示于SEQ ID NO: 13、其氨基酸序列示于SEQ ID NO: 14(图4)。另外，对于抗体噬菌体e2d073所提呈的VH区和VL区，VH区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ IDNO: 17，VL区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20。另外，CL区的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 39。
(3) 抗体噬菌体e2d081
编码抗体噬菌体e2d081所提呈的VH区的核苷酸序列与编码抗体噬菌体e2d066所提呈的VH区的核苷酸序列相同。即，编码抗体噬菌体e2d081所提呈的VH区的核苷酸序列示于SEQID NO: 1、其氨基酸序列示于SEQ ID NO: 2(图1)，VH区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7。另外，编码抗体噬菌体e2d081所提呈的VL区的核苷酸序列示于SEQ ID NO: 21、其氨基酸序列示于SEQ ID NO: 22(图5)，VL区的CDR1、CDR2、CDR3分别示于SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25。另外，CL区的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 40。
在图1～5中，显示编码VH区或VL区的核苷酸序列(上段)及其氨基酸序列(下段)、与VH区或VL区的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的对应。需要说明的是，图1显示抗体噬菌体e2d066和抗体噬菌体e2d081所提呈的VH区、图2显示抗体噬菌体e2d066所提呈的VL区、图3显示抗体噬菌体e2d073所提呈的VH区、图4显示抗体噬菌体e2d073所提呈的VL区、图5显示抗体噬菌体e2d081所提呈的VL区。
另外，在表1中，显示抗体噬菌体(e2d066、e2d073、e2d081)所提呈的CDR。
[表1]
(实施例2) scFv的制作
根据所选拔的3种抗体噬菌体(e2d066、e2d073和e2d081)的VH区、以及VL区和CL区(VLCL区)的核苷酸序列和氨基酸序列，利用常规方法制作了将各自的VH区和VLCL区用接头连接而成的scFv。作为接头，使用(GGGGS)3(SEQ ID NO: 35)，利用常规方法将接头与VH区的C末端和VL区的N末端连接。将包含e2d066的VH区(SEQ ID NO: 2)、VL区(SEQ ID NO: 4)和CL区(SEQ ID NO: 38)(VLCL区)以及接头(SEQ ID NO: 35)的scFv(称为e2d066 scFv)的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 32。将包含e2d073的VH区(SEQ ID NO: 12)、VL区(SEQ ID NO:14)和CL(SEQ ID NO: 39)(VLCL区)以及接头(SEQ ID NO: 35)的scFv(称为e2d073 scFv)的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 33。将包含e2d081的VH区(SEQ ID NO: 2)、VL区(SEQ IDNO: 22)和CL区(SEQ ID NO: 40)(VLCL区)以及接头(SEQ ID NO: 35)的scFv(称为e2d081scFv)的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 34。
具体而言，将这些噬菌粒DNA(所选拔的抗体噬菌体)用限制酶SalI消化后，使之自身再结合而变换成蛋白A融合型抗体(scFv-PP型抗体)，使用所得抗体转化了大肠杆菌DH12STM。转化后，用25mL的2×YTGA在30℃下进行了过夜培养。将10mL的该培养液与1L的2×YTA混合，培养3小时之后，加入1mL的1mol/L IPTG，在30℃下培养了20小时。将培养液供于4℃、8000rpm、10分钟的离心处理，回收了上清。向所回收的上清中缓慢加入313g的硫酸铵，在室温下搅拌30分钟之后，供于4℃、8500rpm、30分钟的离心处理。将沉淀物悬浮于加入有20mL的Complete蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的PBS中。接着，相对于PBS在4℃下过夜透析后，供于4℃、10000rpm、10分钟的离心处理。回收上清，将其添加到填充有2mL的IgG琼脂糖凝胶(GE Healthcare)的柱中，在室温下采用自然滴加使其通过柱内。用300mL的PBS清洗柱之后，用8mL的0.2mol/L甘氨酸(pH3.0)进行了洗脱。用2mol/L Tris将洗脱液的pH值调整为7.0之后，装入透析浓缩用管(Millipore、Amicon Ultra-15、4℃、4500rpm转)中，相对于PBS进行了透析、浓缩。之后，进行SDS-PAGE，算出了蛋白浓度。
(实施例3) IgG抗体的制作
根据所选拔的3种抗体噬菌体(e2d066、e2d073和e2d081)的VH区和VL区的核苷酸序列和氨基酸序列，利用常规方法制作了包含VH区和VL区的IgG抗体。
具体而言，以scFv抗体的VH和VLCL基因为模板，使用Ｈ链和L链扩增用引物，进行了PCR。VH的扩增产物预先与包含人IgG1恒定区的构建载体连接、VLCL预先与L链用构建载体连接，将它们进行连接获得了包含IgG型抗体基因的质粒DNA。
将该质粒DNA用限制酶消化，进行线性化，将经线性化的质粒40μg在250V・800μF的条件下通过电穿孔导入到细胞数1×107的CHO-K1细胞。导入后立即悬浮于包含10%FBS的Ham-F12培养基(和光纯药工业：087-08335＋MBL268-1)中，在37℃、5%CO2培养箱开始了培养。
24小时后，添加嘌呤霉素(Sigma-Aldrich、P8833)使最终浓度为10μg/mL，开始了选择。自约10天到14天后确认所选择的集落，将细胞用20mL的PBS清洗，用1mL的0.05%胰蛋白酶-EDTA(和光纯药工业：264-16935)处理后，加入5mL的Ham-F12，自板剥离、回收，测定了细胞数。根据其结果，在0.2细胞/200μL/孔(96孔板5块)的条件下进行了有限稀释。14天培养后，通过使用了各孔的培养上清的ELISA，选择了高表达IgG型抗体的细胞。将所选择的细胞驯化于无血清培养基EX-CELL CD CHO Fusion(NICHIREI BIOSCIENCE：14365C)，按照初期细胞数2×105培养10天，回收了上清。
将1mL的rProteinA Sepharose Fast Flow(GE Healthcare：17-1279-02)填充到柱中，添加培养上清，以流速1滴/2秒进行送液，使表达蛋白(IgG)与柱结合。将10mL的PBS以流速1滴/2秒进行送液，清洗非吸附成分后，将10mL的洗脱缓冲液(0.2mol/L甘氨酸、pH3)以流速1滴/秒进行送液，回收了洗脱液。利用Amicon Ultra-15离心式过滤装置10(Millipore：UFC901096)，通过离心超滤浓缩至1mL，同时进行溶液置换(PBS)，通过SDS-PAGE算出了抗体蛋白的浓度。
将所得的包含e2d066的VH区(SEQ ID NO: 2)和VL区(SEQ ID NO: 4)的IgG抗体(称为e2d066 IgG)的重链全长的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 26，轻链全长的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 27。将所得的包含e2d073的VH区(SEQ ID NO: 12)和VL区(SEQ ID NO:14)的IgG抗体(称为e2d073 IgG)的重链全长的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 28，轻链全长的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 29。将所得的包含e2d081的VH区(SEQ ID NO: 2)和VL区(SEQ ID NO: 22)的IgG抗体(称为e2d081 IgG)的重链全长的氨基酸序列示于SEQ ID NO:30，轻链全长的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 31。
(实施例4) scFv和IgG抗体的感染抑制活性
1. 各基因型嵌合HCV颗粒(HCVcc)的制作
(1) J6/JFH-1嵌合HCV颗粒(J6/JFH-1 HCVcc)的产生
J6/JFH-1嵌合HCV颗粒(J6/JFH-1 HCVcc)按照国际公开第2011/052735号中记载的方法如下进行了制作。
按照Wakita, T等人、Nat. Med.、2005年、第11卷、第791-796页和国际公开第2004/104198号中记载的方法，制作了将HCV JFH-1株(基因型2a)的基因组RNA全区进行逆转录而获得的cDNA(基因组cDNA)克隆到pUC19质粒的T7 RNA启动子序列的下游而得的质粒DNA(pJFH-1)。将该pJFH-1用EcoRI消化后，进一步用BclI部分消化，制备将自EcoRI部位到最初BclI部位的片段(约2840bp)切除而得的质粒DNA片段，且对其进行了纯化。
另一方面，按照国际公开第2006/022422号中记载的方法，制作了将HCV J6CF株(基因型2a)的基因组cDNA(GenBank 登录号AF177036； Yanagi, M.等人、Virology、1999年、第262卷、第250-263页)克隆到pUC19质粒的T7 RNA启动子序列的下游而得的质粒DNA(pJ6CF)。将该pJ6CF用EcoRI和BclI部分消化，将所得的约2840bp片段纯化，将其与切除了上述EcoRI-BclI的pJFH-1片段连接，获得了重组质粒DNA(pJ6/JFH-1)。克隆到该pJ6/JFH-1中的DNA是：将J6CF株基因组cDNA的5’非翻译区、编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白的各蛋白的序列、编码NS2蛋白的自N末端到第16位的氨基酸残基为止的区的序列、以及JFH-1株基因组cDNA的编码NS2蛋白的自第17位的氨基酸残基到C末端为止的区的序列、编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS5B蛋白的各蛋白的序列、和3’非翻译区按照该顺序连接而得的HCV嵌合基因组cDNA。
将所制作的pJ6/JFH-1用XbaI切断之后，加入绿豆核酸酶20U(总反应液量为50μL)，通过在30℃下温育30分钟，将XbaI切断末端平滑化之后，进行了苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀。以该切断的质粒为模板，使用MEGAscript T7试剂盒(Thermo Fisher Scientific)合成了RNA(参见国际公开第2006/022422号)。将如此合成的、J6/JFH-1嵌合基因组RNA用于以下的细胞导入。将3×106个的Huh-7细胞和5μg的J6/JFH-1嵌合基因组RNA悬浮于Cytomix溶液(120mmol/L KCl、0.15mmol/L CaCl2、10mmol/L K2HPO4/KH2PO4、25mmol/L HEPES、2mmol/LEGTA、5mmol/L MgCl2、20mmol/L ATP、50mmol/L谷胱甘肽；400μL)中，转移到4mm杯(Cuvette)中之后，使用Gene Pulser(BioRad Laboratories)，在260Ｖ、950μF下，进行了J6/JFH-1嵌合基因组RNA对Huh-7细胞的电穿孔。之后，将导入有基因组RNA的Huh-7细胞接种于直径10cm的培养皿，进行了继代培养。在继代时，使用HCV抗原ELISA检测试剂盒(OrthoClinical Diagnostics)，定量培养上清中所含的HCV的核心蛋白，进行了HCV颗粒产生的确认。选择核心蛋白的量多的、即HCV颗粒产生的活性高的培养上清，以J6/JFH-1嵌合HCV颗粒的病毒原液(J6/JFH-1病毒原液)的形式进行了保存。
向利用10%FCS-DMEM培养基(包含1%MEM非必需氨基酸溶液(Thermo FisherScientific)、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸钠)进行培养的直径10cm的培养皿中的Huh-7细胞中加入100μL左右的上述获得的J6/JFH-1病毒原液(4×104ffu/mL(集落形成单位/mL(focus forming units/mL)))，使HCV颗粒感染Huh-7细胞。进行适宜的继代使细胞不汇合，由1个225cm2长颈瓶扩大培养为4个、12个。其次，自其中的8个225cm2长颈瓶剥离细胞，接种于CellSTACK(商标)5段2个(Corning)中，添加培养基使达到650mL/个。将自剩余4个的长颈瓶获得的细胞接种于12个的长颈瓶中，由此有效地持续产生病毒颗粒。
在继代的次日去除培养上清，加入了650mL的2%FCS-DMEM培养基(包含1%MEM非必需氨基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸钠)。在交换培养基3天后回收培养上清，通过0.45μm过滤器之后，保存在冰柜中。另外，向回收培养上清之后的CellSTACK中加入650mL的2%FBS-DMEM培养基(包含1%MEM非必需氨基酸溶液、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸钠)，并且进行了继续培养。该2天后进行同样的操作，回收了培养上清。并且，再重复1次同样的操作。在此，利用下述记载的方法从所回收的培养上清中纯化了嵌合HCV颗粒(HCVcc)。
(2) J6/JFH-1嵌合HCV颗粒(J6/JFH-1 HCVcc)的纯化
所产生的病毒颗粒使用以下3个阶段的步骤进行了纯化。
(A) 浓缩和透析过滤
利用中空纤维滤柱Hollow Fiber Cartridge(GE Healthcare：500kDa截留、Model编号UFP-500-C-8A、以下称为“Hollow Fiber”)，将上述(1)中获得的包含HCV颗粒的培养上清浓缩至60倍。
(B) 密度梯度超离心
向Ultra-clear 25×89mm离心管(Beckman Coulter：商品目录编号344058)中加入3mL经冷却的包含60%蔗糖的TNE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA)，复层了7mL包含20%蔗糖的TNE缓冲液。并且，在包含20%蔗糖的TNE缓冲液之上复层了25mL样本。使用SW-28(Beckman Coulter)，以28,000转、4小时、4℃进行了超离心。
使用25G注射针(TERUMO)在管的底面打开穿孔，从该处获得了12管(支)1mL的级分。对于各级分的溶液测定比重，确认形成了蔗糖的密度梯度。自比重大的一管(支)起回收了第3号、第4号、第5号的各级分，用于浓缩和缓冲液置换。
(C) 浓缩和缓冲液置换
使用Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units(排除分子量：100kDa、Millipore)和TNE缓冲液对洗脱级分进行缓冲液置换，同时进行了浓缩。将如此获得的浓缩液作为包含感染性HCV颗粒的病毒液(J6/JFH-1 HCVcc)，用于以下的实施例。
(3) 其它基因型的嵌合HCV颗粒(HCVcc)的制作
关于其它基因型的嵌合HCV颗粒的制作，H77株(基因型1a)与JFH-1株的嵌合HCV颗粒(H77/JFH-1 HCVcc)参见Lindenbach等人、Science、2005年、第309卷、第623-626页；TH株(基因型1b)与JFH-1株的嵌合HCV颗粒(TH/JFH-1 HCVcc)参见国际公开第2009/014216号和国际公开第2009/131203号；S310-A株(基因型3a)与JFH-1株的嵌合HCV颗粒(S310/JFH-1HCVcc)参见国际公开第2013/031956号，进行了制作。这些嵌合HCV颗粒(HCVcc)还详细记载于Pietschmann等人、Proc. Natl. Acad. Sci USA、2006年、第103卷、第7408-7413页的文献中，基本上按照该文献进行制作，利用与J6/JFH-1 HCVcc的制作(产生和纯化)同样的方法进行了纯化。
用于H77/JFH-1 HCVcc制作的嵌合基因组RNA是：将JFH-1株的5’非翻译区、H77株的编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白和NS2蛋白的各蛋白的序列、以及JFH-1株的编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS5B蛋白的各蛋白的序列和3’非翻译区按照该顺序连接而得的HCV嵌合基因组RNA。
用于TH/JFH-1 HCVcc制作的嵌合基因组RNA是：将JFH-1株的5’非翻译区、TH株的编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白的各蛋白的序列、编码NS2蛋白的自N末端到第33位的氨基酸残基的区的序列、以及JFH-1株的编码NS2蛋白的自第34位的氨基酸残基到C末端的区的序列、编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS5B蛋白的各蛋白的序列和3’非翻译区按照该顺序连接而得的HCV嵌合基因组RNA。TH/JFH-1 HCVcc的前体蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 41。
用于S310/JFH-1 HCVcc制作的嵌合基因组RNA是：将JFH-1株的5’非翻译区、S310株的编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白和NS2蛋白的各蛋白的序列(相当于氨基酸编号1-1032)、以及JFH-1株的编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS5B蛋白的各蛋白的序列(相当于氨基酸编号1031-3034)和3’非翻译区按照该顺序连接而得的HCV嵌合基因组RNA。
如上所述，在此制作的各基因型嵌合HCV颗粒(HCVcc)的结构基因部分是来自JFH-1株以外的HCV株的基因组RNA。各基因型嵌合HCV颗粒(HCVcc)的细胞感染时的表型是：J6/JFH-1 HCVcc为基因型2a、H77/JFH-1 HCVcc为基因型1a、S310/JFH-1 HCVcc为基因型3a、TH/JFH-1 HCVcc为基因型1b。
2. 感染抑制活性的测定
向用PBS稀释的、已知的人抗E2蛋白抗体MBL-HCV1 (Broering等人、J. Viol.、2009年、第83卷、第12473-12482页)、本发明的scFv或IgG抗体中，添加包含各基因型嵌合HCV颗粒(HCVcc)(J6/JFH-1 HCVcc(基因型2a)、H77/JFH-1 HCVcc(基因型1a)、S310/JFH-1 HCVcc(基因型3a)、TH/JFH-1 HCVcc(基因型1b))的PBS稀释液，使多重感染度(Multiplicity ofinfection; moi)达到0.1，在室温下反应30分钟，制作了抗体-HCVcc混合液。
之后，除去接种Huh-7细胞(2×104细胞/孔；10%FCS-DMEM培养基(包含1%MEM非必需氨基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸钠))并进行培养的48孔板中的培养上清，以100μL/孔添加抗体-HCVcc混合液，在37℃、5%CO2培养箱中温育了3小时。3小时后除去培养上清，置换成D-MEM 500μL，在37℃、5%CO2培养箱中进一步培养了72小时。培养后，除去D-MEM，用PBS清洗细胞后，以100μL/孔添加Passivelysis buffer(被动性溶解缓冲液)(Promega)，制作细胞溶解液，回收到螺帽管中。回收的细胞溶解液中所含的HCV核心蛋白使用Lumipulse G1200(Fujirebio Inc.、OrthoClinical Diagnostics)进行了定量。由通过测定而得的HCV的核心蛋白的摩尔浓度(核心蛋白量)算出了各抗体(scFv或IgG抗体)的HCVcc感染抑制活性。具体而言，将未加入抗体、使嵌合HCV颗粒(HCVcc)感染的细胞中的HCV核心蛋白量(对照值：图中的横轴“0μg/mL”)设为100%时，将在各抗体的存在下添加有HCVcc的细胞中的HCV核心蛋白量的比率(%)作为其抗体的感染抑制活性的评价值。即，细胞中的核心蛋白量(相对于对照的%)越少，则显示各抗体的感染抑制活性越高。
将针对基因型2a的HCVcc(J6/JFH-1 HCVcc)的IgG抗体和scFv的感染抑制活性分别示于图6和图7，将针对基因型3a的HCVcc(S310/JFH-1 HCVcc)的IgG抗体和scFv的感染抑制活性分别示于图8和图9，将针对基因型1b的HCVcc(TH/JFH-1 HCVcc)的IgG抗体和scFv的感染抑制活性分别示于图10和图11，将针对基因型1a的HCVcc(H77/JFH-1 HCVcc)的IgG抗体和scFv的感染抑制活性分别示于图12和图13。纵轴表示感染抑制活性。横轴表示进行作用的各抗体及其浓度(添加到细胞后的最终浓度)。
另外，针对各基因型的HCVcc的MBL-HCV1抗体、本发明的IgG抗体和scFv的感染抑制活性IC50值示于表2。
[表2]
该结果显示出：如上制作的本发明的scFv (e2d066 scFv、e2d073 scFv、和e2d081scFv)和IgG抗体(e2d066 IgG、e2d073 IgG、e2d081 IgG)均对多个基因型嵌合HCV颗粒(HCVcc)具有强的感染抑制活性。特别是，包含e2d066的VH区(SEQ ID NO: 2)和VL区(SEQID NO: 4)的e2d066 IgG抗体和scFv、以及、包含e2d081的VH区(SEQ ID NO: 2)和VL区(SEQID NO: 22)的e2d081 IgG抗体和scFv显示出对基因型1a、1b、2a和3a的HCV的感染抑制活性，而且对基因型2a(J6/JFH-1 HCVcc)和基因型1b(TH/JFH-1 HCVcc)，显示出高于感染抑制活性已知的细胞受体抗体即抗CD81抗体(Emmanuel等人、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A.、2004年、第101卷、第7270-7274页)和MBL-HCV1抗体的感染抑制活性。对此，本发明的抗体和抗原结合性抗体片段具有抑制HCV的感染自身的效果，因而显示出具有肝脏移植病人的HCV的再感染(丙型肝炎复发)等的预防效果，且显示出可适用于在肝脏移植中使用的丙型肝炎的预防药、特别是慢性丙型肝炎病人的活体肝移植时的丙型肝炎复发预防。
(实施例5) IgG抗体的逃逸突变株出现抑制性的评价
对于各IgG抗体(e2d066 IgG、e2d073 IgG或e2d081 IgG)，评价了逃逸突变株出现抑制性。
逃逸突变株出现抑制性的评价方法基于下述文献中充分地记载的方法来进行：Meital等人、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、2008年、第105卷、第19450-19455页。
将用PBS稀释的IgG抗体和J6/JFH-1 HCVcc混合，在37℃下使之反应1小时，制作了抗体-HCVcc混合液。
之后，向接种于12孔板的Huh-7细胞(培养基：10%FCS-DMEM(包含1%MEM非必需氨基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸钠))中，添加抗体-HCVcc混合液，使HCVcc感染细胞。感染3天后，在6孔板中继代，在继代后第3天和第6天回收了培养上清。通过感染效价测定(与以下记载的“最后回收的培养上清中所含的J6/JFH-1 HCVcc的感染效价”的测定方法同样的方法)确认了所回收的培养上清中包含J6/JFH-1 HCVcc。将确认感染效价后的培养上清(第3天或第6天所回收的培养上清)用于此后的感染。
将确认感染效价后的所回收的培养上清(包含通过感染培养而产生的J6/JFH-1HCVcc)再与IgG抗体混合，将该混合液添加到非感染的Huh-7细胞中，使HCVcc感染细胞。将该操作重复了8次(HCVcc的继代感染的重复次数：总计8次)。
最后回收的培养上清中所含的J6/JFH-1 HCVcc(以下，称为J6/JFH-1 HCVcc-8W)的感染效价如下进行了测定。在感染效价测定的前一天，将Huh-7细胞以1×104细胞/孔接种于聚-D-赖氨酸包被(poly-D-Lysine-coated)96孔板(Corning)。将J6/JFH-1 HCVcc-8W添加到各孔中，在37℃下培养了72小时。培养后，除去培养上清，用PBS清洗细胞后，将细胞用甲醇在-20℃下处置20分钟，进行了固定。所固定的细胞用Block Ace溶液(DSファーマバイオメディカル)封闭1小时，用PBS清洗后，添加抗核心抗体(2H9；Wakita,T.等人、Nat.Med.、2005年、第11卷、第791-796页)使达到10μg/mL，在室温下温育了1小时。除去上清，清洗细胞后，添加Alexa Fluor 488-缀合抗小鼠IgG(Molecular Probes)，在室温下温育了1小时。清洗细胞后，向各孔中添加50μL PBS，利用荧光显微镜观察了细胞。感染效价通过计数发荧光的细胞数、以集落形成单位(focus forming units)/mL(ffu/mL)形式表示。
对J6/JFH-1 HCVcc-8W、或作为比较对照的亲株J6/JFH-1 HCVcc进行IgG抗体的感染抑制活性测定，进行了逃逸突变株的检测。首先，向60μL的J6/JFH-1 HCVcc-8W或J6/JFH-1 HCVcc(分别为100ffu)中同容量添加经稀释的IgG抗体，在37℃下温育1小时，制作了抗体-HCVcc混合液。将预先在8孔室玻片(Thermo Fisher Scientific)的各孔中接种的Huh-7细胞的培养上清除去，添加100μL抗体-HCVcc混合液，在37℃下培养了24小时。之后，除去培养上清，向各孔中添加200μL的10%FCS-DMEM培养基(包含1%MEM非必需氨基酸溶液(ThermoFisher Scientific)、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸钠)，进一步培养了48小时。培养后，利用与上述的感染效价测定同样的方法，使荧光标记抗体与各孔的细胞作用，计数发荧光的细胞数，测定了感染效价。将未加入抗体而感染了J6/JFH-1 HCVcc-8W或J6/JFH-1 HCVcc的细胞的感染效价作为100%，算出添加了各抗体-HCVcc混合液的细胞的感染效价%之后，将50%感染抑制浓度以IC50(μg/mL)表示。IC50的值越低，表示各抗体的感染抑制活性越高。
结果示于表3。表中的“J6/JFH-1 HCVcc”显示各抗体对亲株J6/JFH-1 HCVcc的感染抑制浓度IC50，“J6/JFH-1 HCVcc-8W”显示各抗体对J6/JFH-1 HCVcc-8W的感染抑制浓度IC50。
[表3]
如表3所示，已知的人抗E2蛋白抗体MBL-HCV1(Broering等人、J. Viol.、2009年、第83卷、第12473-12482页)利用与上述同样的方法进行评价的结果，显示出：即使在100μg/mL的浓度下，也没有确认到对J6/JFH-1 HCVcc-8W的感染抑制活性，出现了逃逸突变株。
相对于此，e2d066 IgG和e2d081 IgG对J6/JFH-1 HCVcc-8W的感染抑制活性，与对J6/JFH-1 HCVcc的感染抑制活性相比，为同等程度或略微减少。即，关于e2d066 IgG和e2d081 IgG，显示出：即使经过8次的重复继代感染也抑制逃逸突变株的出现，这些抗体显示逃逸突变株出现抑制性。特别是，e2d066 IgG显示出：没有确认到逃逸突变株的出现，因此显示非常强的逃逸突变株出现抑制性。
e2d066 IgG和e2d081 IgG的VH区的氨基酸序列相同(SEQ ID NO: 2)。因此，显示出：该VH区(SEQ ID NO: 2)(特别是，包含SEQ ID NO: 5所示CDR1、SEQ ID NO: 6所示CDR2、和SEQ ID NO: 7所示CDR3的VH区)可赋予逃逸突变株出现抑制性。
(实施例6) 表位分析
为了判定各IgG抗体(e2d066 IgG、e2d073 IgG和e2d081 IgG)是否识别立体结构表位，试验了是否识别变性E2蛋白。可与变性E2蛋白结合的抗体是识别E2蛋白的直链状表位的抗体，不与变性E2蛋白结合的抗体可称为识别E2蛋白的立体结构表位的抗体。
需要说明的是，作为对照抗体，对于识别HCV E2蛋白的直链状表位的MBL-HCV1抗体、识别立体结构表位的AR3A抗体(国际公开第2010/047830号)也同样地进行了分析。
1. TH E2-Fc蛋白(将人IgG的Fc蛋白附加到TH株的E2蛋白而得的融合蛋白)的制作
利用国际公开第2010/038789号中记载的方法进行了制作。
以TH株(基因型1b)的基因组RNA的cDNA(Wakita,T.等人、J. Biol. Chem.、1994年、第269卷、第14205-14210页、国际公开第2006/022422号)为模板，通过PCR法扩增了编码下述蛋白的基因：以TH株的前体蛋白的N末端的起始甲硫氨酸为第1位时由相当于第384位～第717位的区构成的蛋白(相当于E2蛋白)。将所扩增的DNA片段克隆到PCR-TOPO(ThermoFisher Scientific)中。将编码E2蛋白的基因片段用HindIII和BamHI消化并切出，以符合读框的方式***到p3×FLAG-CMV-13(Sigma-Aldrich)的信号肽序列的下游的HindIII部位和BamHI部位之间。该载体被命名为CMV-13-THE2。将CMV-13-THE2用SacI和BamHI消化，将编码信号肽序列和E2蛋白的DNA片段分别用琼脂糖凝胶电泳分离，用GeneElute(Sigma-Aldrich)进行了纯化。之后，将编码上述信号肽序列和E2蛋白的各自DNA片段以符合读框的方式***到在表达由小鼠IL-7受体-人免疫球蛋白Fc结构域构成的嵌合蛋白的载体CDM-mIL7R-Ig(Sudo等人、Proc Natl. Acad Sci USA、1993年、第90卷、第9125～9129页)的SacI部位和BamHI部位之间，获得了表达附加有人免疫球蛋白的Fc结构域的抗原E2蛋白(以下，TH E2Fc蛋白)的载体CDM-THE2Fc。
将载体CDM-THE2Fc利用DEAE糊精法转染COS1细胞，使TH E2Fc蛋白表达。使用结合有Protein-A的载体Prosep-A(Millipore)，从导入有CDM-THE2Fc的细胞的培养上清中，纯化了TH E2Fc蛋白。
2. 各抗体的生物素化
将各抗体(e2d066 IgG、e2d073 IgG、e2d081 IgG、AR3A抗体、MBL-HCV1抗体)进行生物素化。生物素化使用EZ-Link(注册商标)Sulfo-NHS-LC-Biotin(Thermo FisherScientific)按照附带说明书来进行。向100μL用PBS稀释至0.1mg/mL的IgG抗体中加入2.4μL的20mmol/L Sulfo-NHS-LC-Biotin，进行混合，在冰中静置了2小时。其次，利用Zaba(商标) Spin Desalting Columns(Thermo Fisher Scientific)进行脱盐，除去未反应的生物素，制备了生物素化抗体。
3. 表位分析
使TH E2-Fc蛋白在含有2%SDS、5%2ME的50mmol/L Tris-HCl(pH7.0)中进行95℃、3分钟加热处理，由此进行了变性。
将未变性的TH E2-Fc蛋白和变性的TH E2-Fc蛋白分别用PBS稀释使达到0.5μg/mL，以每孔50μL添加到免疫板(Thermo Fisher Scientific)的各孔中，通过在4℃下静置一夜将各蛋白固定于板上。除去蛋白溶液，将按照付带手册制备的Blocking One溶液(Nacalai Tesque)以每孔200μL添加到各孔中，进行了封闭。
其次，将生物素化抗体用PBS进行3倍梯度稀释，以每孔50μL添加到上述的固定板的各孔中，在室温下反应了1小时。反应结束后，用含有0.05% Tween20的PBS清洗之后，将用含有0.05% Tween20的PBS进行3000倍稀释的亲和素-HRP(GE Healthcare)以每孔50μL添加到各孔中，在室温下反应了1小时。反应结束后，用含有0.05% Tween20的PBS清洗，利用ELISA POD底物TMB溶液(Nacalai Tesque)使之显色之后，用1mol/L硫酸使反应停止，利用酶标仪(Microplate Reader)测定了吸光度(450nm)。
其结果示于图14。图14A显示各IgG抗体与未变性的TH E2-Fc蛋白的结合性，图14B显示各IgG抗体与变性的TH E2-Fc蛋白的结合性。图的纵轴显示吸光度(450nm)，横轴显示生物素化抗体的稀释倍率。
e2d066 IgG、e2d073 IgG和e2d081 IgG、以及AR3A抗体不与变性的TH E2-Fc蛋白结合，但MBL-HCV1抗体与变性和未变性的TH E2-Fc蛋白的任一种蛋白均进行了反应(图14)。
因此，这暗示了：e2d066 IgG、e2d073 IgG和e2d081 IgG与MBL-HCV1抗体不同，识别立体结构表位。
(实施例7) 通过直链状肽进行的表位分析
实施例6暗示了：e2d066 IgG、e2d073 IgG和e2d081 IgG识别立体结构表位。因此，使用由12个氨基酸残基构成的直链状肽组，确认了这些抗体识别立体结构表位。
对于相当于TH株的E2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO: 36)(将TH株的前体蛋白的N末端的起始甲硫氨酸设为第1位时相当于第384位～第717位的氨基酸序列)，合成了由将12个连续的氨基酸按照自N末端起各移动3个氨基酸的方式设计而得的氨基酸序列构成的肽组(肽编号1～82)。使各肽的N末端进行生物素化，C末端为甘氨酰胺。
将各肽溶解于DMSO中后，溶解于PBS中使达到0.01nmol/μL。将该肽溶液以每孔50μL加入到链霉亲和素包被板(Thermo Fisher Scientific)的各孔中，在室温下使之反应了2小时。除去肽溶液，将按照付带手册制备的Blocking One溶液(Nacalai Tesque)以每孔200μL添加到各孔中，在4℃下静置一夜，由此进行了封闭。
除去封闭溶液，用含有0.05% Tween20的PBS清洗4次后，将用含有0.05% Tween20的PBS稀释至1μg/mL的各抗体以每孔50μL添加到各孔中，在室温下使之反应了1.5小时。反应结束后，除去抗体溶液，用含有0.05% Tween20的PBS清洗4次，接着以每孔50μL加入用含有0.05% Tween20的PBS进行5000倍稀释的HRP标记抗人IgG山羊抗体(GE Healthcare)，在室温下反应了1小时。反应后，除去抗体溶液，用含有0.05% Tween20的PBS清洗了5次。清洗后，用过氧化物酶显色试剂盒使之显色，通过测定450nm的吸光度，检测了与肽结合的抗体。
该结果是：MBL-HCV1抗体与肽QLINTNGSWHIN(SEQ ID NO: 37)结合(图15D)，但e2d066 IgG、e2d073 IgG和e2d081 IgG与任一种肽均不结合(图15A、B和C)。由此显示出：MBL-HCV1抗体识别直链状表位，e2d066 IgG、e2d073 IgG和e2d081 IgG识别立体结构表位。
(实施例8) 通过竞争结合ELISA进行的表位的比较
关于识别立体结构表位的e2d066 IgG是否与识别立体结构表位的e2d073 IgG、e2d081IgG和AR3A抗体识别相同表位，通过竞争结合ELISA进行了研究。
作为对照抗体，使用了识别立体结构表位的中和抗体AR3A、识别直链状表位QLINTNGSWHIN(SEQ ID NO: 37)(TH株的E2蛋白的第412位的Q～第423位的N)的中和抗体MBL-HCV1、和识别直链状表位(第522位的D～第534位的N)的非中和抗体8D10-3(国际公开第2010/038789号)。
向各抗体(自20μg/mL起3倍梯度稀释)中等量加入生物素化的e2d066 IgG(记载于实施例6的项目2.中)进行搅拌后，加入到固定有TH E2-Fc蛋白(记载于上述的实施例6中)(0.5μg/孔)的ELISA板(Thermo Fisher Scientific)中。1小时后，用含有0.05% Tween20的PBS清洗后，加入3000倍稀释的亲和素-HRP(GE Healthcare)进行了反应。1小时后，用含有0.05% Tween20的PBS清洗后，利用ELISA POD底物TMB溶液(Nacalai Tesque)使之显色之后，用1mol/L硫酸使反应停止，利用酶标仪(Microplate Reader)测定了吸光度(450nm)。
结果示于图16。图的纵轴显示吸光度(450nm)，横轴显示各抗体的浓度。
生物素化的e2d066 IgG与TH E2-Fc蛋白的结合，被e2d066 IgG和e2d081 IgG抗体浓度依赖性地抑制。因此，显示出：e2d066 IgG和e2d081 IgG识别相同表位。
另一方面，显示出：e2d073 IgG、AR3A抗体、MBL-HCV1抗体和8D10-3抗体没有抑制生物素化的e2d066 IgG与TH E2-Fc蛋白的结合，因此与e2d066 IgG相比表位不同。
e2d066 IgG和e2d081 IgG的VH区的氨基酸序列相同(SEQ ID NO: 2)。因此，显示出：该VH区(氨基酸序列(SEQ ID NO: 2))、特别是包含SEQ ID NO: 5所示CDR1、SEQ ID NO:6所示CDR2、和SEQ ID NO: 7所示CDR3的VH区，可赋予相同的表位识别。
其次，将暗示了显示逃逸突变株出现抑制性的HC-84.1抗体(国际公开第2013/033319号)基于Krey等人的文献(Plos Pathogens，e1003364，2013)进行制作，对于与e2d066相比的表位异同，利用与上述同样的方法进行了研究。向将e2d066 IgG、e2d081IgG、HC-84.1抗体、MBL-HCV1抗体和AR3A抗体自20μg/mL起3倍梯度稀释的样本中，等量加入生物素化的e2d066 IgG(记载于实施例6的项目2.中)进行搅拌后，加入到固定有TH E2-Fc蛋白(记载于上述的实施例6中)(0.5μg/孔)的ELISA板(Thermo Fisher Scientific)中。1小时后，用含有0.05% Tween20的PBS清洗后，加入3000倍稀释的亲和素-HRP(GEHealthcare)进行了反应。1小时后，用含有0.05% Tween20的PBS清洗后，利用ELISA POD底物TMB溶液(Nacalai Tesque)使之显色之后，用1mol/L硫酸使反应停止，利用酶标仪(Microplate Reader)测定了吸光度(450nm)。
结果示于图17。图的纵轴显示吸光度(450nm)，横轴显示各抗体的浓度。生物素化的e2d066 IgG与TH E2-Fc蛋白的结合，被e2d066 IgG和e2d081 IgG抗体浓度依赖性地抑制。
另一方面，显示出：HC-84.1抗体、AR3A抗体和MBL-HCV1抗体没有抑制生物素化的e2d066 IgG与TH E2-Fc蛋白的结合，因此HC-84.1抗体的表位也与e2d066 IgG不同。
(实施例9) 比较各种单克隆抗体与E2蛋白的结合性
比较了e2d066 IgG、e2d081 IgG、HC-84.1抗体、MBL-HCV1抗体和AR3A抗体与J6CF E2-Fc、TH E2-Fc蛋白的结合性。向固定有J6CF E2-Fc或TH E2-Fc蛋白(记载于上述的实施例6中)(0.5μg/孔)的ELISA板(Thermo Fisher Scientific)中加入了将各种单克隆抗体自30μg/mL起10倍梯度稀释的样本。1小时后，用含有0.05% Tween20的PBS清洗后，加入5000倍稀释的山羊抗人IgG F(ab’)2-HRP(Thermo Fisher Scientific)进行了反应。1小时后，用含有0.05% Tween20的PBS清洗后，利用ELISA POD底物TMB溶液(Nacalai Tesque)使之显色之后，用1mol/L硫酸使反应停止，利用酶标仪(Microplate Reader)测定了吸光度(450nm)。
该结果示于图18。显示出：与HC-84.1抗体、MBL-HCV1抗体和AR3A抗体相比，e2d066IgG、e2d081 IgG对于基因型2a的J6CF株、基因型1b的TH株的E2蛋白的结合性高。
(实施例10) IgG抗体对丙型肝炎病毒(HCV)感染扩大的抑制效果
通过对感染了基因型2a的HCVcc(J6/JFH-1 HCVcc)的细胞进行e2d066 IgG的处置，评价了e2d066 IgG对HCV感染扩大的作用。作为比较，对于NS3蛋白的蛋白酶活性的抑制剂特拉匹韦(telaprevir)(VX-950)和干扰素-α(IFN-α)也进行了评价。
在评价的前一天，向12孔板中接种Huh-7细胞(4×104细胞/孔；10%FCS-DMEM培养基(包含1%MEM非必需氨基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)、10mmol/L HEPES-Tris(pH7.3)、1mmol/L丙酮酸钠))并进行了培养。将上述实施例4的项目1.中制作的基因型2a的HCVcc(J6/JFH-1 HCVcc)用PBS制备成moi＝0.03之后，添加到Huh-7细胞中后，将Huh-7细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养了4小时。
4小时后，除去培养上清，置换成分别包含e2d066 IgG、特拉匹韦(VX-950)和IFN-α的D-MEM，在37℃、5%CO2培养箱中进一步培养了96小时。另外，将置换成不含抗体、药物的D-MEM且同样地进行培养的细胞设为对照(图19中的横轴“未处置”)。培养后，回收了细胞培养上清。使用Lumipulse G1200(Fujirebio Inc.、Ortho Clinical Diagnostics)定量了所回收的细胞培养上清液中包含的HCV核心蛋白。
结果示于图19。纵轴表示细胞培养上清中的HCV核心蛋白浓度(pmol/L)，该值越低则显示感染抑制活性越高。横轴显示自左起为“未处置”、所作用的抗体e2d066 IgG、药物特拉匹韦、IFN-α以及它们的浓度(添加到细胞后的最终浓度)。
通过e2d066 IgG的处置，与对照(“未处置”)相比，细胞培养上清中的HCV核心蛋白浓度显示显著的低值，该效果与特拉匹韦(Telaprevir)(VX-950)和IFN-α的效果相比为同等以上。即e2d066 IgG具有抑制HCV感染后的细胞中的HCV产生的效果或具有抑制自HCV感染细胞向周围的HCV未感染细胞的感染的效果。
因此，本发明的抗体和抗原结合性抗体显示出：可抑制HCV对细胞的感染本身，同时即使在HCV的感染成立后也可抑制HCV的感染扩大。本发明的抗体和抗原结合性抗体由于具有抑制HCV感染本身的效果，因此显示出具有肝脏移植病人的HCV的再感染(丙型肝炎复发)等的预防效果，另外，由于具有HCV感染成立后的HCV感染扩大抑制效果，因此显示出具有HCV持续感染者的治疗效果、即丙型肝炎的治疗效果。
产业实用性
本发明的抗体或抗原结合性抗体片段由于具有高的HCV感染抑制活性和HCV感染扩大抑制效果，因此可期待用作丙型肝炎的治疗药或预防药、特别是可期待适用于预防慢性丙型肝炎病人的活体肝移植时的肝炎复发。
本说明书中所引用的所有出版物、专利和专利申请均直接作为参考而纳入本说明书中。
序列表自由文本
SEQ ID NO: 1：编码e2d066(和e2d081)的VH区的核苷酸序列；
SEQ ID NO: 2：e2d066(和e2d081)的VH区的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 3：编码e2d066的VL区的核苷酸序列；
SEQ ID NO: 4：e2d066的VL区的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 5：e2d066(和e2d081)的VH区的CDR1的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 6：e2d066(和e2d081)的VH区的CDR2的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 7：e2d066(和e2d081)的VH区的CDR3的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 8：e2d066的VL区的CDR1的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 9：e2d066的VL区的CDR2的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 10：e2d066的VL区的CDR3的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 11：编码e2d073的VH区的核苷酸序列；
SEQ ID NO: 12：e2d073的VH区的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 13：编码e2d073的VL区的核苷酸序列；
SEQ ID NO: 14：e2d073的VL区的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 15：e2d073的VH区的CDR1的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 16：e2d073的VH区的CDR2的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 17：e2d073的VH区的CDR3的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 18：e2d073的VL区的CDR1的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 19：e2d073的VL区的CDR2的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 20：e2d073的VL区的CDR3的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 21：编码e2d081的VL区的核苷酸序列；
SEQ ID NO: 22：e2d081的VL区的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 23：e2d081的VL区的CDR1的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 24：e2d081的VL区的CDR2的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 25：e2d081的VL区的CDR3的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 26：e2d066的IgG抗体(e2d066 IgG)重链全长的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 27：e2d066的IgG抗体(e2d066 IgG)轻链全长的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 28：e2d073的IgG抗体(e2d073 IgG)重链全长的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 29：e2d073的IgG抗体(e2d073 IgG)轻链全长的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 30：e2d081的IgG抗体(e2d081 IgG)重链全长的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 31：e2d081的IgG抗体(e2d081 IgG)轻链全长的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 32：e2d066 scFv全长的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 33：e2d073 scFv全长的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 34：e2d081 scFv全长的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 35：接头的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 36：TH株的E2蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 37：来源于TH E2蛋白的肽的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 38：e2d066的CL区的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 39：e2d073的CL区的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 40：e2d081的CL区的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 41：TH株与JFH-1株的嵌合HCV颗粒(TH/JFH-1 HCVcc)的前体蛋白的氨基酸序列。
Claims (12)
1.抗丙型肝炎病毒E2蛋白抗体或抗原结合性抗体片段，其具有丙型肝炎病毒即HCV感染抑制活性。
2.权利要求1所述的抗体或抗原结合性抗体片段，其显示逃逸突变株出现抑制性。
3.权利要求1或2所述的抗体或抗原结合性抗体片段，其中，上述抗体或抗原结合性抗体片段包含以下的(a)或(b)的重链可变区：
(a) 重链可变区，其包含：由SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列构成的CDR2、和由SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列构成的CDR3；
(b) 重链可变区，其包含SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列。
4.权利要求1～3的任一项中所述的抗体或抗原结合性抗体片段，其中，上述抗体或抗原结合性抗体片段包含以下的(c)～(f)的任一项的轻链可变区：
(c) 轻链可变区，其包含：由SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO:9所示氨基酸序列构成的CDR2、和由SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列构成的CDR3；
(d) 轻链可变区，其包含：由SEQ ID NO: 23所示氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ IDNO: 24所示氨基酸序列构成的CDR2、和由SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列构成的CDR3；
(e) 轻链可变区，其包含SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列；
(f) 轻链可变区，其包含SEQ ID NO: 22所示氨基酸序列。
5.抗体或抗原结合性抗体片段，其与权利要求4所述的抗体或抗原结合性抗体片段识别相同的立体结构表位。
6.权利要求1～5的任一项中所述的抗体或抗原结合性抗体片段，其中，上述抗体或上述抗原结合性抗体片段为IgG、Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体、dsFv、(scFv)2、或单结构域抗体。
7.权利要求1～6的任一项中所述的抗体或抗原结合性抗体片段，其中，上述抗体为人抗体或人源化抗体。
8.权利要求1～7的任一项中所述的抗体或抗原结合性抗体片段，其中，上述抗体或抗原结合性抗体片段进行了化学修饰。
9.核酸，其编码权利要求1～7的任一项中所述的抗体或抗原结合性抗体片段。
10. 编码重链可变区的核酸，所述重链可变区包含：由SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列构成的CDR2、和由SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列构成的CDR3。
11.药物，该药物含有权利要求1～8的任一项中所述的抗体或抗原结合性抗体片段作为有效成分。
12.权利要求11所述的药物，其中，该药物为丙型肝炎的治疗药或预防药。
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