CN106645757B - 一种诊断早发糖尿病mody的血清蛋白标志物组及其应用 - Google Patents

一种诊断早发糖尿病mody的血清蛋白标志物组及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106645757B
CN106645757B CN201710144734.0A CN201710144734A CN106645757B CN 106645757 B CN106645757 B CN 106645757B CN 201710144734 A CN201710144734 A CN 201710144734A CN 106645757 B CN106645757 B CN 106645757B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mody
serum
protein
early onset
onset diabetes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201710144734.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106645757A (zh
Inventor
帕它木·莫合买提
先锋
热沙来提·阿不都瓦衣特
***江·依马木
木哈达斯·吐尔逊依明
热比亚·努力
伊再提古丽·木提拉
祖力卡提阿衣·阿布都拉
阿瓦古丽·托合提
艾扎提古丽·卡的尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xinjiang Medical University
Original Assignee
Xinjiang Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xinjiang Medical University filed Critical Xinjiang Medical University
Priority to CN201710144734.0A priority Critical patent/CN106645757B/zh
Publication of CN106645757A publication Critical patent/CN106645757A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106645757B publication Critical patent/CN106645757B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

一种诊断早发糖尿病MODY的血清蛋白标志物组及其应用，包括5个蛋白质载脂蛋白C‑IV(APOC4)，载脂蛋白a(LPA)，补体组分C6(C6)，凝血因子v(F5)，甲状腺素结合球蛋白(SERPINA7)。利用iTRAQ结合MALDI‑TOF/MS技术检测，质谱检测所述血清载脂蛋白C‑IV，载脂蛋白a，补体组分C6，凝血因子v蛋白在MODY病人血清中表达水平明显增加，甲状腺素结合球蛋白在MODY病人血清中表达水平明显降低。质谱多反应监测(multiple‑reaction‑monitoring，MRM)也验证这5个蛋白在MODY患者与1型糖尿病、2型糖尿病患者以及健康对照组血清中表达异常，是特异性蛋白。

Description

一种诊断早发糖尿病MODY的血清蛋白标志物组及其应用
技术领域
本发明涉及糖尿病诊断蛋白标志物领域，特别涉及一种诊断早发糖尿病MODY的血清蛋白标志物组及其应用。
背景技术
早发糖尿病(maturity-onset-diabetes of the young，MODY)是一种单基因显性遗传疾病，以往认为它是T2DM的特殊亚型，现将之归为特殊类型的糖尿病。MODY的诊断应符合以下条件：①25岁前发病；②家族中至少有2名患者；③至少三代常染色体显性遗传；④口服降糖药治疗至少5年有效或有正常的血浆C肽水平。
随着遗传连锁分析、候选基因克隆、关联分析及测序等技术的发展，至2013年初，已发现13个比较明确的与MODY发病相关的基因，它们分别是(按照被发现的时间顺序)：肝细胞核因子4α基因(hepatic nuclear factor 4α,HNF 4α；MODY1)，葡萄糖激酶基因(glucokinase,GCK；MODY2)，肝细胞核因子1α基因(hepatic nuclear factor 1α,HNF1 α；MODY3)，胰岛素启动子因子1基因(insulin promote factor1,IPF1；MODY4)，肝细胞核因子1β基因(hepatic nuclear factor 1β,HNF 1β；MODY5)，神经源性分化因子1基因(neurogenic differentiation factor1,NEUROD1；MODY6)以及后来报道的kruppel样因子11基因(kruppel-like factor11，KLF11；MODY7)，羧基酯脂肪酶基因(carboxyl-esterlipase gene，CEL；MODY8)，成对框基因4(paired box gene 4,PAX4；MODY9)，胰岛素基因(insulin gene，INS；MODY10)，B淋巴酪氨酸激酶基因(B lymphoid tyrosine kinase，BLK；MODY11)，MODY12/ABCC8基因(MODY12)，β-细胞腺苷三磷酸-敏感性钾通道基因(KCNJ11，MODY13)。这些基因对成年期与糖代谢有关的基因表达均起着重要的作用，还影响人类胚胎期器官的发育及细胞的分化。由上述基因突变产生的MODY不同遗传亚型在临床，生理表型及遗传特征上均存在着明显的差异。因它们之间的临床表现不同，临床处理方法也不尽相同，临床疗效也各不相同。
作为单基因突变所致的特殊类型糖尿病的一种，MODY在近年来备受各国学者关注。由于MODY具有发病年龄早、呈常染色体显性遗传、外显率高等特点，有利于涉及多代家系的收集,所以，换言之，MODY家系为糖尿病的分子遗传病因与发病机制的研究提供了理想的研究对象，从蛋白质水平明确MODY病因，有助于了解疾病的进程、判断患者的预后，对患者进行具有针对性的治疗。
20世纪90年代中，蛋白质组学(Proteomics)作为一门新的方法学开始出现在各种生命科学领域。蛋白质组学的主要目的便是如何***地识别和定量一个蛋白质组。大多生物体内的某种生物功能的表现或者疾病的发展，都是以蛋白质生物标记物的含量丰度的变化来展现。所以，对蛋白质的相对和绝对浓度进行测量对于蛋白质组学研究就变得尤为重要。
iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技术是2004年由美国应用生物***公司推出的一项新的体外相对和绝对定量同位素标记技术。该技术可以对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白。2007年，出现了一种新的试剂：iTRAQ试剂，可以同时对8个样品进行定量分析，可以用串联质谱进行丰度比较及功能分析。上述试剂在定量及差异表达检测上有着巨大的优势。iTRAQ技术不仅具有灵敏度高，同时分离能力强,并且自动化程度高，甚至自动化操作分析速度。所以，从iTRAQ技术研究开发以来，就凭其独特的优势在蛋白质组学研究中得到了广泛的应用。近年来，蛋白质组学也逐渐应用于糖尿病研究中，Taka-hashi等利用iTRAQ技术对2型糖尿病KK-Ay鼠血清进行研究，确定了8种蛋白存在变化，其中补体因子B、载脂蛋白A-Ⅱ、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K(Serpina3k)、血纤维蛋白溶酶原等水平明显升高。在体外实验发现，人类视网膜微血管同源性Serpina3k能够增加跨内皮通透性，这可能与糖尿病和/或糖尿病视网膜病变的发病机制相关。然而，国内外针对MODY血清蛋白质组学的研究至今尚未见任何报道。对于维吾尔族MODY型糖尿病蛋白质组学的研究更属空白。
随着蛋自质组学研究的深入和发展，尤其是差异蛋白质组学研究的进展，大量功能蛋白质和潜在疾病蛋白质标志物被发现并被鉴定，如何进一步探测这些蛋白质的表达丰度，以阐明其功能和在疾病研究中的意义，已变得越来越重要。质谱多反应监测(multiplereaction monitoring，MRM)技术是基于已知信息或假定信息设定质谱检测规则，对符合规则的离子进行信号记录，去除大量不符合规则离子信号的干扰，从而得到质谱信息的一种数据获取方式。作为一种高特异性、高灵敏度的质谱数据获取方式，MRM技术逐步受到生物标志物研究者们关注，成为定量蛋白质组学研究中的重要技术。对于MRM技术而言关键在于首先要能够检测到具有特异性的母离子，然后只将选定的特异性母离子进行碰撞诱导(collision-induced)，最后去除其他子离子的干扰，只对选定的特异子离子进行质谱信号的采集。因此挑选合适的母子离子(transitions)对和选择合适的碰撞能量非常重要。本发明选取新疆喀什地区一个最具典型MODY临床症状的家系作为主要研究对象，试图采取MODY家系的血清样本，采用8种等重量的同位素iTRAQ试剂同时标记不同样本中的酶解后肽段，从而通过串联质谱方法对肽段进行精确鉴定和定量，确定MODY血清标志物的定量水平，寻找家系中正常与病例组相关的差异表达蛋白，并采用分子生物学等手段，对这些特异性表达的蛋白质进行初步验证。其次，在iTRAQ筛选血清蛋白质的基础上，我们将通过MRM靶标分析技术对这些候选标志物进行规模化的进一步鉴定分析，并综合已有的MODY的研究结果，建立多种血清MODY特异性标志物的MRM检测方法。最终获得维吾尔族早发MODY家系的差异蛋白并确定差异蛋白参与的信号通路等分子机制，为MODY的发病机制寻求规律，确定疾病早期生物标志物。本发明就是iTRAQ技术结合MRM技术在早发糖尿病研究中的新发现。
就目前糖尿病的诊断现状来看，2型糖尿病有一个诊断的“误区”。许多病人可能由于诊断手段受到限制而未能明确的特殊类型糖尿病都被归为2型糖尿病。事实上，随着对疾病认识的深入和诊断技术的不断进步，以往被认为多基因病的2型糖尿病中，有相当一部分被证明是遗传异质性所致，即受单个主基因控制，例如MODY型，线粒体基因糖尿病等就是如此。诊断的偏差是目前造成治疗效果较差的主要原因之一。因此，对糖尿病病人进行正确的诊断，甚至是个体化的诊断对于提高糖尿病疗效和减少大量并发症，以提高病人生命质量和减少病人长期的经济负担都具有重要的现实意义。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种诊断早发糖尿病MODY的血清蛋白标志物组，一组血清蛋白载脂蛋白C-IV，C-反应蛋白，载脂蛋白a，补体组分C6，凝血因子v，α-1-抗胰蛋白酶，甲状腺素结合球蛋白作为早发糖尿病病人血清标志物及其应用，适用于早发糖尿病血清辅助检测，发病机制研究和药物开发。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种诊断早发糖尿病MODY的血清蛋白标志物组，其由如下血清蛋白标志物组成：血清载脂蛋白C-IV：APOC4，其Accession number为P55056，载脂蛋白a：LPA，其Accessionnumber为P08519，补体组分C6：其Accession number为P13671，凝血因子v：F5，其Accessionnumber为P12259，甲状腺素结合球蛋白：SERPINA7，其Accession number为P05543。
进一步的，一种诊断早发糖尿病MODY的血清蛋白标志物组，利用iTRAQ结合MALD1-TOF/MS检测早发糖尿病病人和正常人的血清，载脂蛋白C-IV，C-反应蛋白，载脂蛋白a，补体组分C6，凝血因子v蛋白在MODY病人血清中表达水平明显高于正常人的血清中表达水平，同时α-1-抗胰蛋白酶，甲状腺素结合球蛋白在MODY病人血清中表达水平明显低于正常人的血清中表达水平。
进一步的，该诊断早发糖尿病MODY的血清蛋白标志物组在诊断早发糖尿病方面的应用。
一种诊断早发糖尿病的试剂盒，该试剂盒主要成分为血清载脂蛋白C-IV(P55056,APOC4)，载脂蛋白a(P08519,LPA)，补体组分C6(P13671,C6)，凝血因子v(P12259,F5)，甲状腺素结合球蛋白(P05543,SERPINA7)，5种血清蛋白标志物组。
进一步的，该试剂盒在诊断早发糖尿病方面的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明为一种诊断早发糖尿病MODY的血清蛋白标志物组，同时加入了各种患病血清的平行比较，这里较为重要的是扩大糖尿病病患的血样本收集，主要包括1型、2型糖尿病血样的收集，同时加入了健康人血清样本，采用基于iTRAQ标记的定量蛋白质组学结合MRM技术，同时平行分析这些样本中MODY生物标志物的丰度，从而确定这些标志物是否具备MODY的特异性。结果更为可靠，可为临床应用提供有价值的信息。利用本发明的血清蛋白质标志物组能够准确的诊断早发型糖尿病患者。
基于质谱技术的定量蛋白质组学需要对其中的定量结果进行进一步的验证,而由于对抗体的依赖,传统的免疫学定量检测如Western和ELISA等,并不能满足大规模目标蛋白的验证需求。因而,利用MRM对定量蛋白质组学的数据进行靶向验证是更好的研究策略。Narumi等利用iTRAQ技术对人乳腺癌组织样本进行了大规模的磷酸化定量蛋白质组学分析,发现了133个差异磷酸化肽段,并利用MRM技术对其中的15个磷酸化肽段进行了进一步的定量验证,确认其定量结果的可信性。在Ann等对早期多发性硬化症病人的脑脊液研究中,通过iTRAQ技术对病人及正常人的脑脊液进行了定量分析,在鉴定到的1200个蛋白质中有5个蛋白质具有显著差异,结合文献报道,最终实现了在132个疾病组及正常人中11个蛋白质的MRM定量验证。在Lin等的研究中,实现血清中靶标蛋白的定量检测是实验室基础研究得以转化为临床应用的重要环节。然而,在血清中,白蛋白和球蛋白等20种左右的高丰度及中等丰度蛋白质占血清总蛋白量的99％以上,而其他种类的蛋白质总和仅占血清总蛋白量的不足1％。但大部分疾病相关的目标蛋白往往为中低丰度,因此,血清中存在的高丰度蛋白会极大地影响目标蛋白质的检测。在MRM技术的蛋白质组学应用中,提高MRM技术在血清样本中检测的灵敏度也是重要的研究方向。他们利用ELISA中的捕获抗体对结肠癌患者与正常人血浆中的TIMP1、COMP、THBS2、ENG、MSLN及MMP9进行了免疫富集及MRM检测,结果表明，除ENG外的其他5种蛋白标志物的MRM与ELISA定量的相关系数为0.67～0.97,且IP-MRM的CV为2.3％～19％，表明蛋白水平的IP-MRM的定量准确度及重复性均满足定量检测的要求。Whiteaker等则利用稳定同位素内标抗体捕获(stable isotope standards andcapture by antipeptide antibodies,SISCAPA)技术进行了大规模的目标蛋白定量,他们首先根据选择目标蛋白中肽段的MRM信号,选择了其中的403个肽段进行抗体制备,并最终得到了220个抗肽抗体。对其中11个目标肽段进行免疫富集,MRM检测的结果显示,其灵敏度均能达到1ng/mL,相对于富集前提高了约1000倍。Anderson等也同样通过SISCAPA方法富集,实现了对血清中89个蛋白220个肽段的MRM定量检测,其中50％以上可以检测血浆中浓度为100ng/mL的蛋白质。并且TIMP1等蛋白标志物的ELISA和MRM的定量相关性达到0.95。
MRM技术的优点在于定量方法的快速建立,并获得高重现性和高精度的蛋白质定量信息。因此，MRM技术在未来可能是蛋白质生物标志物定量测定的核心技术。不仅如此,MRM与其他蛋白质组学技术相结合,可完成新型生物标志物的快速验证和确认。然而,MRM技术流程中的许多环节需进一步优化,如样本处理、母子离子的选择、质谱条件、自动化流程和分析结果的信息处理等。此外,MRM与抗体的配合需进一步推进,从而提高对复杂样本,如血清样本的处理。只有当上述技术环节得到足够的改善、整个技术流程足够稳定时,MRM才可能被常规地应用于临床样本生物标记物的检测。
附图说明
图1为MODY家系图谱：
其中，方框为男性，圆圈为女性；空心框表示没有临床表现；实心黑框为糖尿病患者；箭头表示先证者。
图2为不同标签iTRAQ标记蛋白相对定量分布-火山图。
图3为MODY病例与正常对照组MRM肽段水平定量结果-火山图。
其中，X轴代表对肽段水平差异倍数取Log2后的值(4例MODY血清蛋白/4例正常人血清蛋白)，Y轴代表每种蛋白的p-value值取Log2的值。(红色是MODY患者样本中上调的肽段，黑色代表无显著的肽段，蓝色代表MODY患者样本中下调的肽段值)。
图4为12种在MODY病例与正常对照组中有显著差异的蛋白组间蛋白丰度分布对比；其中，红色代表MODY患者血清样本组，绿色代表家系健康对照组血清样本组。
图5.12种在1型糖尿病组与健康对照组中的蛋白组间蛋白丰度分布对比。红色代表人群健康对照组血清样本组，绿色代表1型糖尿病血清样本组。
图6.12种在2型糖尿病组与健康对照组中的蛋白组间蛋白丰度分布对比。红色代表人群健康对照组血清样本组，绿色代表2型糖尿病血清样本组。
图7.12种在4例MODY与10例T1DM相比的蛋白组间蛋白丰度分布对比。红色代表人群健康对照组血清样本组，绿色代表2型糖尿病血清样本组。
图8.12种在4例MODY与10例T2DM相比的蛋白组间蛋白丰度分布对比。红色代表人群健康对照组血清样本组，绿色代表2型糖尿病血清样本组。
图9.12种在4例MODY与10例健康相比的蛋白组间蛋白丰度分布对比。红色代表人群健康对照组血清样本组，绿色代表2型糖尿病血清样本组。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：
实施例1
iTRAQ技术检测MODY患者与健康对照差异表达蛋白
1.检测样本:
一个四代健在的维吾尔族早发糖尿病家系。分为病例和正常对照血清各4例。清晨空腹采集2mL全血，4℃静置l-2h待血液凝固析出血清，3000g离心l0min，收集上清液，冰上分装后存至-80℃备用。
2.检测方法:
(1)使用Proteominer试剂盒去除血清中的高丰度蛋白：向富集好的蛋白样品加入终浓度10mM的DTT，56℃水浴1h；冷却至室温后，加入终浓度55mM的IAM，暗室放置45min；加1mL冷丙酮沉淀过夜，25000rpm*4℃离心15min弃上清；简单风干沉淀中残余丙酮，加适量Lysis Buffer 3，冰浴超声5min，25000rpm*4℃离心15min取上清，定量，电泳。Bradford定量用酶标仪测量OD595，依据OD595与蛋白浓度制作线性标准曲线。稀释待测蛋白质溶液若干倍，在20μl蛋白溶液中加入180μl定量工作液，读取OD595。依据标准曲线以及样品OD595计算样品蛋白浓度。
(2)蛋白酶解：取200μg蛋白溶液(已烷基化处理)加入到10KDa的超滤管中，20℃12,000g离心20分钟，直至蛋白液全部离心至收集管底部，去底部溶液，超滤管中再加入0.5M TEAB100μl，同上离心操作。重复此步骤3次，更换新的收集管。在超滤管中加入50μl0.5M的TEAB，按照蛋白：酶＝40:1的比例加入Trypsin酶，使用Parafilm(封口膜)将超滤管与管盖密封，放置于震荡仪上37℃反应过夜；12,000g离心15分钟后再加入100μl0.5M的TEAB，12,000g离心20分钟，收集管中溶液即酶解后肽段溶液。转出收集管底部的酶解消化液于1.5ml离心管中，冷冻抽干。
(3)肽段标记：取出一定量iTRAQ标签试剂，待试剂恢复至室温后，每管试剂加入50μl异丙醇，涡旋震荡后低速离心，用0.5M TEAB溶解肽段样品，并加入到对应ITRAQ标签试剂中，iTRAQ试剂113、118标记为病例组，119、121标记健康对照组，室温静止2小时。
(4)采用岛津LC-20AB液相***，分离柱为5um 4.6x250mm Gemini C18柱对样品进行液相分离。用2mL流动相A(5％ACN pH9.8)复溶抽干的肽段样品并进样，以1mL/分钟的流速梯度洗脱：5％流动相B(95％CAN，pH9.8)10分钟，5％至35％流动相B 40分钟，35％至95％流动相B 1分钟，流动相B持续3分钟，5％流动相B平衡10分钟。在214nm波长下监测洗脱峰并每分钟收集一个组分，结合色谱洗脱峰图合并样品得到10个组分，然后冷冻抽干。
(5)经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪Q-Exactive(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)进行DDA(data-dependent acquisition)模式检测。主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1600m/z；分辨率设置为70,000；二级质谱起始m/z固定为100；分辨率17,500。二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到7+，峰强度超过10,000的强度排在前20的母离子。离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测。动态排除时间设定为15s。AGC设置为：一级3E6,二级1E5。
(6)质谱数据采用通过Mascot和PD软件对实验中所得到的质谱数据与生物信息数据库在人类Uniprot数据库进行检索并定量分析进行比对，得到可信的蛋白质定量以及定性结果。
3.检测结果:2个上机重复合并分析，质谱共鉴定到327个蛋白，113,118是疾病组；119,121是对照组。其中>＝2个unique肽段蛋白293个蛋白，鉴定过滤标准：PSM和Protein水平FDR<＝1％。根据鉴定的蛋白质丰度比分布(图1)达到严格定量标准(log2比值≥|0.6|的蛋白数：MODY病例组与正常对照组蛋白质表达谱分析筛选出明显差异表达蛋白质点为32个(表1)，表达上调的蛋白质点14个，下调的蛋白质点18个；
表1 32个iTRAQ差异表达蛋白定量结果汇总(log2≥|0.6|)
实施例2
质谱MRM在MODY家系中的验证
1.检测样本:
MODY病人、正常对照血清各4例；均来自家系
2.检测方法:
实验方法的建立1)挑选适合于进行MRM检测分析的MODY相关靶蛋白；2)对所提取的蛋白进行质量评估；3)挑选适合于MRM检测的母子离子对；4)基于分析软件Skyline对质谱仪扫描参数——碰撞能量进行优化；5)对所得到的检测数据进行质量评估和分析。样本分析:
(1)血清蛋白酶解:每个样品取12.5ug，合并为两管MODY病例组和健康对照组，每管中加入01ug/ul的BSA作为内参。用超滤管，取蛋白液，离心20min，去底部溶液，加入100ulTEAB,同上离心操作，重复步骤3次，更换新的收集管，在超滤管中加入50ul 0.5M的TEAB，按照40:1的比例加入胰蛋白酶，用parafilm将超滤管与管盖密封，放置于震荡仪上37℃反应过夜。12000转离心15分钟。加入50ul dd水(两次)12000离心20min收集，再加入100ulTEAB,12000离心20分钟，收集管中即酶解后肽段溶液。转出收集管中底部的酶解消化液于1.5ml离心管中，冷冻抽干。
(2)MRM(多反应监测)实验方法：将制备好的样品按照以下色谱质谱的参数设置进入液相***SHIMADU Prominence HPLC和AB SCIEX5500质谱仪进行分析。仪器参数的设置如下:离子喷射电压：2300，进样体积：4ul，碰撞能量(Collision Energy)：软件依据母子离子对信息自动计算。时间：60.028mins，单个循环时间：3.7518secs，液相设置：流速：0.3ul/mi，流动相A液:98％水，2％乙腈，0.1％甲酸；流动相B液:2％水，98％乙腈，0.1％甲酸。
(3)Skyline软件中肽段选择的参数设置：蛋白质组背景库：uniprot human；酶：Trypsin[KR|P]；最大漏切数：0；氨基酸数目：8～25排除N末端氨基酸的个数：25；排除含有如下氨基酸的肽段：Cys Met；排除潜在的漏切末端：KK KR RK RR；结构修饰：Carbamidomethyl(C)；最大可变修饰数：3,最大中性丢失数目：1；母离子电荷数：2,3；子离子电荷数：1；离子类型：b,y；离子相符耐受度：0.5Th；质荷比范围：50Th～1200Th；每针最大离子数目：300；驻留时间：8ms。
(4)数据分析:用BSA(HLVDEPQNLIK)肽段的积分峰面积进行样品测定的标准化，通过比较不同组之间某蛋白的积分峰面积差异，从而确定某蛋白在不同情况下表达量的相对变化。
3.结果:MRM技术对MODY家系样品进行验证：综合iTRAQ筛选结果，MRM候选标志物的验证主要集中在iTRAQ差异表达蛋白的32个蛋白和9个并没有变化趋势的但我们比较感兴趣的蛋白质上，并对这41个蛋白进行靶标验证，在挑选适合用于代表蛋白的高质量transitions，并首要满足的条件就是能在质谱中响应出足够的信号强度，信噪比相对比较高并且能够呈现出峰形一致的峰簇。按照这一标准进行过滤，在对样本进行MRM实验以后，我们删掉了一些信噪比相对不好，质谱信号不稳定的子离子，最后得到含有对应23个蛋白的45个唯一肽段的母子离子对列表，并对23种蛋白在两组间样本中进行相对定量得到的MRM丰度(峰面积)进行差异倍数的比较，并且以火山图的形式在图3中展示。我们对MRM显著差异蛋白的标准，进行设定，要求差异倍数大于等于1.5倍，且p-value值小于0.05。基于这个标准，我们在MODY血清样本和正常人血清样本中得到了具有显著差异的12种蛋白，其中六种蛋白载脂蛋白C-IV(APOC4),α-1-抗胰蛋白酶(SERPINA1),C-反应蛋白(CRP),载脂蛋白a(LPA),补体组分C6(C6)和凝血因子v(F5)蛋白表达在MODY血清样本呈现显著上调，同时有6种蛋白甲状腺素结合球蛋白(SERPINA7),单核细胞分化抗原CD14(CD14)_,胆固醇酯转移蛋白(CETP),妊娠区蛋白(PZP),肝素辅因子2(SERPIND1)和性激素结合球蛋白(SHBG)在MODY血清蛋白样本中显著上调。12种MODY差异表达蛋白标志物的肽段水平MRM定量结果见表2。另外11种蛋白在两组样本中没有显著差异。(图4)
表2. 12种MODY差异表达蛋白标志物的肽段水平MRM定量结果
实施例3
1.检测样本:
1型糖尿病病人、2型糖尿病病人，健康人群对照血清各10例；
2.检测方法:
实验方法的建立1)将挑选好的母子离子对在扩充的30个样本里进行MRM检测分析；2)基于分析软件Skyline对质谱仪扫描参数——碰撞能量进行优化；4)对所得到的检测数据进行质量评估和分析。
样本分析:
(1)血清蛋白酶解:每个样品取200ug，每管中加入0.1ug/ul的BSA作为内参。向取好的原始血清样品加入终浓度10mM的DTT，56℃水浴1h；冷却至室温后，加入终浓度55mM的IAM，暗室放置45min；加终浓度为100Mm的TEAB，按照蛋白：酶＝40:1的比例加入Trypsin酶，37℃下酶切16小时。15，000g离心10分钟，小心转移全部上清，冷冻浓缩干后，用流动相A复溶。
(2)MRM(多反应监测)实验方法：将制备好的样品按照以下色谱质谱的参数设置进入液相***SHIMADU Prominence HPLC和ABSCIEX5500质谱仪进行分析。仪器参数的设置如下:离子喷射电压：2300，进样体积：4ul，碰撞能量(Collision Energy)：软件依据母子离子对信息自动计算。时间：60.028mins，单个循环时间：3.7518secs，液相设置：流速：0.3ul/mi，流动相A液:98％水，2％乙腈，0.1％甲酸；流动相B液:2％水，98％乙腈，0.1％甲酸。
(3)Skyline软件中肽段选择的参数设置：蛋白质组背景库：uniprot human；酶：Trypsin[KR|P]；最大漏切数：0；氨基酸数目：8～25排除N末端氨基酸的个数：25；排除含有如下氨基酸的肽段：Cys Met；排除潜在的漏切末端：KK KR RK RR；结构修饰：Carbamidomethyl(C)；最大可变修饰数：3,最大中性丢失数目：1；母离子电荷数：2,3；子离子电荷数：1；离子类型：b,y；离子相符耐受度：0.5Th；质荷比范围：50Th～1200Th；每针最大离子数目：300；驻留时间：8ms。
(4)数据分析:用BSA(LVNELTEFAK)肽段的积分峰面积进行样品测定的标准化，通过比较不同组之间某蛋白的积分峰面积差异，从而确定某蛋白在不同情况下表达量的相对变化。
3.结果:
MODY与其它类型糖尿病的MRM验证比较结果
考虑到MODY与1型糖尿病和2型糖尿病在临床表现的相似性，故本次研究中我们同时加入了10例1型，10例2型糖尿病患者以及10例健康人群的血清进行平行比较。分析这些样本中12个MODY潜在血清标志物的丰度，从而确定这些标志物是否具备MODY的特异性，我们的策略分五步进行
1)1型糖尿病与来自人群的健康对照比较
10例T1DM与10例健康人群相比，PZP和SHBG蛋白表达量差异，且有统计学意义。(图5)T1DM人群相对于健康人群的PZP表达量降低，SHBG表达量升高。
2)2型糖尿病与来自人群的健康对照比较
10例T2DM与10例健康人群相比，CRP、CETP和SERPIND1蛋白表达量差异，且有统计学意义。综上所述：因此，APOC4，SERPINA1，LPA、CD14、F5、C6和SERPINA7这7个蛋白在MODY中是特异性表达蛋白，且有统计学意义。(见图6)T2DM人群相对于健康人群的CRP表达升高、CETP表达降低和SERPIND1蛋白表达量降低。
3)MODY患者与1型糖尿病比较
4例MODY与10例T1DM相比，SERPINA7，APOC4，LPA，C6，F5，蛋白表达量差异，且有统计学意义。(见图7)MODY与T1DM人群相比：SERPINA7表达量降低，APOC4表达量升高，LPA表达量升高，C6表达量升高，F5表达量升高。
4)MODY患者与2型糖尿病比较
4例MODY与10例T2DM相比，SERPINA1，SERPINA7，APOC4，LPA，CD14，C6，F5蛋白表达量差异，且有统计学意义。(见图8)MODY与T2DM人群相比，SERPINA1降低，SERPINA7降低，APOC4升高，LPA升高，CD14升高，C6升高，F5升高。
5)MODY患者与来自人群的健康对照比较
4例MODY与10例正常人(control B)相比，SERPINA1，SERPINA7，APOC4，LPA，CD14,C6，F5蛋白表达量差异，且有统计学意义。(见图9)MODY与正常人群(control B)相比，SERPINA1升高，SERPINA7降低，APOC4升高，LPA升高，CD14升高,C6升高，F5升高。
综合上述五个步骤，MRM技术对1型糖尿病，2型糖尿病以及来自人群的正常人群样品进行比较验证，平行分析这些样品中MODY生物标志物的丰度，从而确定了一组(5个)血清生物标志物具有MODY的特异性。它们分别是血清载脂蛋白C-IV(P55056,APOC4)，载脂蛋白a(P08519,LPA)，补体组分C6(P13671,C6)，凝血因子v(P12259,F5)，甲状腺素结合球蛋白(P05543,SERPINA7)。结果如图5-9所示。
一种诊断早发糖尿病MODY的血清蛋白标志物组，其由如下血清蛋白标志物组成：血清载脂蛋白C-IV(P55056,APOC4)，载脂蛋白a(P08519,LPA)，补体组分C6(P13671,C6)，凝血因子v(P12259,F5)，甲状腺素结合球蛋白(P05543,SERPINA7)。；是利用iTRAQ(isobarictags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)结合MALD1-TOF/MS技术检测早发糖尿病病人和正常人的血清，载脂蛋白C-IV，载脂蛋白a，补体组分C6，凝血因子v蛋白在MODY病人血清中表达水平明显高于正常人的血清中表达水平，同时甲状腺素结合球蛋白在MODY病人血清中表达水平明显低于正常人的血清中表达水平，质谱多反应监测(multiplereaction monitoring,MRM)也验证这组蛋白在MODY病人血清中和其他类型糖尿病中的差异。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (4)

1.一种诊断早发糖尿病MODY的血清蛋白标志物组，其特征在于，其由如下血清蛋白标志物组成：血清载脂蛋白C-IV：APOC4 ，其Accession number为P55056，载脂蛋白a，其Accession number为P08519，补体组分C6：其Accession number为P13671，凝血因子v：F5，其Accession number为P12259，甲状腺素结合球蛋白：SERPINA7，其Accession number为P05543。
2.根据权利要求1所述的一种诊断早发糖尿病MODY的血清蛋白标志物组，其特征在于，利用 iTRAQ结合MALD1-TOF/MS检测早发糖尿病病人和正常人的血清，载脂蛋白C-IV，C-反应蛋白，载脂蛋白a，补体组分C6，凝血因子v蛋白在MODY病人血清中表达水平明显高于正常人的血清中表达水平，同时α-1-抗胰蛋白酶，甲状腺素结合球蛋白在MODY病人血清中表达水平明显低于正常人的血清中表达水平。
3.根据权利要求1所述的一种诊断早发糖尿病MODY的血清蛋白标志物组，其特征在于，该诊断早发糖尿病MODY的血清蛋白标志物组在诊断早发糖尿病方面的应用。
4.一种诊断早发糖尿病的试剂盒，其特征在于，该试剂盒主要成分为血清载脂蛋白C-IV(P55056, APOC4 )，载脂蛋白a(P08519)，补体组分C6(P13671, C6)，凝血因子v(P12259,F5)，甲状腺素结合球蛋白(P05543, SERPINA7)，5种血清蛋白标志物组。
CN201710144734.0A 2017-03-13 2017-03-13 一种诊断早发糖尿病mody的血清蛋白标志物组及其应用 Expired - Fee Related CN106645757B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710144734.0A CN106645757B (zh) 2017-03-13 2017-03-13 一种诊断早发糖尿病mody的血清蛋白标志物组及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710144734.0A CN106645757B (zh) 2017-03-13 2017-03-13 一种诊断早发糖尿病mody的血清蛋白标志物组及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106645757A CN106645757A (zh) 2017-05-10
CN106645757B true CN106645757B (zh) 2019-01-15

Family

ID=58847339

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710144734.0A Expired - Fee Related CN106645757B (zh) 2017-03-13 2017-03-13 一种诊断早发糖尿病mody的血清蛋白标志物组及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106645757B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107727729A (zh) * 2017-11-22 2018-02-23 南宁科城汇信息科技有限公司 一种oa候选标志物诊断模型的建立方法
CN109374904A (zh) * 2018-10-29 2019-02-22 浙江医院 一种蛋白质类脓毒症标志物及其在严重脓毒症早期预警的应用及其筛选方法
CN110031632A (zh) * 2019-04-03 2019-07-19 中国医学科学院北京协和医院 一种反映IgG4相关性疾病的疾病活动性的生物标志物及其用途
CN112924675B (zh) * 2019-12-05 2023-01-13 张曼 尿液胰腺甘油三酯脂肪酶蛋白及其多肽片段在正常妊娠中的应用
CN113156133B (zh) * 2020-09-11 2023-11-28 中国人民武装警察部队后勤学院 利用质谱多重反应监测技术检测5、7、55型腺病毒方法
CN114965753A (zh) * 2022-05-13 2022-08-30 重庆医科大学附属第一医院 一种lgals3bp蛋白丰度检测试剂在制备妊娠期糖尿病泪液诊断试剂中的应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103237901B (zh) * 2010-03-01 2016-08-03 卡里斯生命科学瑞士控股有限责任公司 用于治疗诊断的生物标志物
EP3151012B1 (en) * 2010-09-21 2018-03-21 Proteomics International Pty Ltd Biomarkers associated with diabetic nephropathy
US20140141986A1 (en) * 2011-02-22 2014-05-22 David Spetzler Circulating biomarkers
KR20110136776A (ko) * 2011-12-12 2011-12-21 경북대학교 산학협력단 당뇨병성 신증 진단용 바이오마커 및 이의 동정방법
WO2013152989A2 (en) * 2012-04-10 2013-10-17 Eth Zurich Biomarker assay and uses thereof for diagnosis, therapy selection, and prognosis of cancer
CA2883447A1 (en) * 2012-09-04 2014-03-13 Jonathan B. Rothbard Therapeutic compositions and related methods
WO2014193999A2 (en) * 2013-05-28 2014-12-04 Caris Science, Inc. Biomarker methods and compositions

Also Published As

Publication number Publication date
CN106645757A (zh) 2017-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106645757B (zh) 一种诊断早发糖尿病mody的血清蛋白标志物组及其应用
EP3623814A2 (en) Biomarker for monitoring or diagnosing onset of liver cancer in high-risk group for liver cancer and use thereof
CN102027373A (zh) 发现用于***癌诊断和治疗之生物标志物和药物靶标的方法及其确立的生物标志物测定
KR101219519B1 (ko) 렉틴을 이용한 암 진단 방법
JP7179356B2 (ja) 代謝物分析を利用したベーチェット病の診断方法
CN107024590A (zh) 一种诊断1型和2型糖尿病的血清蛋白标志物组
CN106796240A (zh) 糖尿病性肾病的早期预测标志物
Nie et al. DIA-based proteomics analysis of serum-derived exosomal proteins as potential candidate biomarkers for intrahepatic cholestasis in pregnancy
CN108334747B (zh) 获取肿瘤尿蛋白标志物的方法及得到的肿瘤相关离群尿蛋白库
KR101219516B1 (ko) 암 진단용 펩티드 마커 및 이를 이용한 암 진단방법
CN114705866A (zh) 基于血液的遗忘型轻度认知损害早期诊断外周血蛋白标志物、应用及其医疗辅助诊断***
US9880178B2 (en) Method for aiding diagnosis of Alzheimer's disease
CN109870580B (zh) 血清蛋白标志物组在制备鉴别血吸虫病检测试剂盒中的应用及检测试剂盒
CN109374904A (zh) 一种蛋白质类脓毒症标志物及其在严重脓毒症早期预警的应用及其筛选方法
NL2027764B1 (en) Serum protein marker set and test kit for detecting advanced schistosomiasis
CN112379095A (zh) 一种2型糖尿病患者肺腺癌诊断标志物pzp及其elisa试剂盒
JP5748751B2 (ja) 糖尿病前症及び２型糖尿病における血清アミロイドの表現型比率
CN111751551A (zh) 蛋白分子作为诊断肝硬化的生物标志物及其预后方法
CN113552369B (zh) 蛋白标志物联合用于2型糖尿病、2型糖尿病肾病的诊断的用途
CN112394177B (zh) ApoF蛋白在制备或筛选精神***症诊断产品中的用途
Liu et al. Detection of N‑glycoprotein associated with IgA nephropathy in urine as a potential diagnostic biomarker using glycosylated proteomic analysis
CN115656517B (zh) 一种用于肝硬化食管胃静脉曲张的诊断和分层的蛋白标记物及其应用
CN117647645B (zh) Lbp、atf6、m-csfr联用在制备诊断自身免疫性肝病产品中的应用及试剂盒
CN114137192B (zh) 7-甲基黄嘌呤作为检测靶点在制备2型糖尿病高危个体筛查试剂盒中的应用
CN115060834B (zh) 一种与icp辅助诊断相关的血清/血浆代谢分子标志物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20190115

Termination date: 20190313