CN106645437B - 基于化学修饰和同位素标记多肽氨基酸序列从头测序方法 - Google Patents

基于化学修饰和同位素标记多肽氨基酸序列从头测序方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于化学修饰改性和同位素标记的多肽氨基酸序列从头测序方法。利用N端和C端标记后的多肽分子质量以及保留时间的相关性，将不同标记的相同多肽的二级质谱图进行关联。利用不同标记样品中多肽在质谱碎裂过程中形成的N端和C端碎片离子对，对多肽氨基酸序列进行从头测序。本发明通过对多肽使用带有正电荷的试剂进行修饰改性，有利于多肽在质谱中碎裂时形成丰富的碎片离子；同时，通过使用含有不同轻重同位素的试剂进行标记，多肽在质谱中碎裂时形成成对存在的碎片离子，易于分辨，从而降低干扰信号的影响，提高碎片离子选择特异性以及从头测序的速度；利用N端和C端碎片离子的互补性，提高多肽测序准确度和效率。

Description

基于化学修饰和同位素标记多肽氨基酸序列从头测序方法
技术领域
本发明涉及化学修饰改性和同位素标记辅助的蛋白质氨基酸序列从头测序方法，具体地说是一种通过对多肽的N端和C端分别进行稳定同位素标记以鉴别碎片离子的蛋白质氨基酸序列从头测序方法。
背景技术
蛋白质是重要的生物大分子，在生命活动中发挥着重要作用。对蛋白质进行测序对于蛋白质一级结构的分析至关重要。尽管目前有些物种存在蛋白质数据库，可以用搜库的方法对蛋白质氨基酸序列进行分析。但是，大多数物种仍然没有可供检索的蛋白质数据库，并且对于已经存在数据库的物种，由于基因变异也会导致其蛋白质氨基酸序列发生变化。因此，非常有必要发展不依赖于数据库的蛋白质氨基酸序列从头测序方法。文献报道中对蛋白质氨基酸序列进行从头测序的方法主要有以下几种：(1)通过对多肽的N端，使用带有酸性基团的试剂进行衍生，然后使用MALDI质谱进行分析，使得多肽碎片片段基本不含有a、b离子，主要以y离子形式存在，从而可以对y离子进行鉴别，实现对多肽的从头测序；(2)通过对多肽的N端，使用带有碱性基团的试剂进行衍生，然后使用MALDI质谱进行分析，使得多肽碎片片段基本不含有y离子，主要以a或者b离子形式存在，从而可以对其进行鉴别，实现对多肽的从头测序。
多肽稳定同位素标记方法是蛋白质组学中一种常用的定量方法，通过对不同样品多肽的N端和/或者C端分别进行轻、重稳定同位素标记，在随后的质谱分析中通过比较多肽母离子的信号强度或者碎片离子的信号强度实现不同样品中多肽和蛋白质的定量(Koehler CJ，Arntzen MO，Treumann A，Thiede B，Anal.Bioanal.Chem.，2012，404(4)，1103-1114)。目前的蛋白质氨基酸序列从头测序方法，主要通过对一个样品的多肽一端或者两端进行衍生，使多肽在碎裂时主要产生一个系列的碎片离子，从而简化离子碎片种类，进行从头测序。但是，由于多肽的碎裂机理比较复杂，即使对多肽进行前述处理，多肽在碎裂时仍然会产生其它碎片离子，因此特异性不高，影响从头测序的准确性；此外，随着氨基酸序列长度的增加，较大的碎片离子其产生的几率和强度都会降低，不利于从头测序。为此，我们通过将同一个样品分成两份；将第一份样品进一步分成两份，分别对其中的多肽N端进行稳定同位素标记，通过在质谱分析时形成的成对碎片离子，准确辨别b离子；将第二份样品也分成两份，通过对多肽的C端进行轻重同位素标记，根据质谱分析时形成的成对离子，准确辨别多肽y离子；利用b离子和y离子的互补性，实现对多肽的准确从头测序。
发明内容
蛋白质氨基酸序列从头测序比较困难，由于多肽碎裂机理复杂，造成质谱图的复杂性和难以准确分辨碎片离子。同位素标记被广泛应用于蛋白质定量，通过对不同样品进行不同同位素标记，混合后样品在一级谱或者二级谱存在质量差异，从而可以被分辨，并利用一级谱或者二级谱的峰面积或者强度进行定量。本发明的目的是利用对多肽两端分别进行同位素标记，实现对多肽b和y系列碎片离子的鉴别，利用两者的互补性，提高从头测序的准确度和速度。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
将多肽样品分成两份。其中第一份样品分成两份，使用含有不同轻重同位素的标记试剂对其N端氨基进行标记，使两份样品中多肽的分子量差异在2-8之间，并且其质谱中b离子的质量差异大于4Da；对标记后的肽段，混合后使用液相色谱-质谱联用进行分析；分析时通过适当扩大碎裂窗口宽度，实现对不同标记肽段的同时碎裂；根据产生的碎片离子对质量差来鉴别b离子。对第二份样品，将其分成两份后，使用含有不同轻重同位素的标记试剂对其C端羧基进行标记，使得两份样品中多肽的分子量差异在2-8之间，并且其质谱中y离子的质量差异大于4Da；对标记后的肽段，混合后使用液相色谱-质谱联用进行分析；分析时通过适当扩大碎裂窗口宽度，实现对不同标记肽段的同时碎裂；根据产生的碎片离子对质量差来鉴别y离子。利用N端和C端标记后的多肽分子质量以及保留时间的相关性，将不同标记的相同多肽的二级质谱图进行关联。利用鉴定到的b离子和y离子，实现对多肽的从头测序。
所述蛋白质氨基酸序列的从头测序方法，具体步骤如下：
(1)多肽N端同位素标记：对多肽样品，首先使用胍基化试剂封闭赖氨酸上的氨基，然后将其分成两份，一份用含有轻同位素的标记试剂对多肽N端氨基进行衍生；对另一份样品，用含有重同位素的标记试剂对多肽N端氨基进行衍生。在进行同位素标记时，多肽N端被元素相同但同位素不同标记试剂标记后的质量差异大于或者等于4Da，以防止多肽碎裂形成碎片时同位素的干扰。
(2)多肽C端同位素标记：将多肽样品分成两份，一份用含有轻同位素的标记试剂对多肽C端羧基进行衍生；对另一份样品，用含有重同位素的标记试剂对多肽C端羧基进行衍生。在进行同位素标记时，多肽C端被元素相同但同位素不同标记试剂标记后的质量差异大于或者等于4Da，以防止多肽碎裂形成碎片时同位素的干扰。
(3)标记多肽的质谱分析：将N端不同标记的多肽样品按照1:1的比例混合后，使用反相高效液相色谱进行分离，电喷雾质谱进行鉴定。将C端不同标记的多肽样品按照1:1的比例混合后，使用反相高效液相色谱进行分离，电喷雾质谱进行鉴定。为了保证不同标记的肽段同时碎裂，将碎裂窗口宽度设为4Da。
(4)在对多肽的N端和C端标记时，使用相同的标记试剂(如精氨酸)，使得N端和C端标记的多肽具有类似的分子量和疏水性，从而在色谱上具有相近的保留时间；根据保留时间以及分子量，可以将两种标记的多肽进行关联；结合多肽的N端碎片离子和C端碎片离子，可以实现多肽的从头测序。
发明的蛋白质氨基酸序列从头测序方法可以应用于未知序列蛋白质的准确和快速测序。
本发明具有如下优点：
1.本发明通过将多肽样品分成两份，对其N端氨基进行不同同位素标记，通过扩大质谱碎裂窗口，使得不同标记的同一多肽在质谱中同时碎裂，形成的二级碎片离子其b离子以成对形式存在，易被分辨，提高了碎片离子鉴定的特异性，有利于提高从头测序的准确性；
2.本发明通过将多肽样品分成两份，对其C端羧基进行不同同位素标记，通过扩大质谱碎裂窗口，使得不同标记的同一多肽在质谱中同时碎裂，形成的二级碎片离子其y离子以成对形式存在，易被分辨，提高了碎片离子鉴定的特异性，有利于提高从头测序的准确性；
3.本发明通过对多肽N端和C端分别使用带有正电荷的试剂进行标记，可以显著增强多肽的质谱响应信号，并且有利于多肽的碎裂和碎片离子的形成，从而提高从头测序的效率。
4.本发明通过对多肽样品的b离子和y离子分别进行鉴定，利用两端碎片离子的互补性，有利于提高从头测序的准确性和效率。
附图说明
图1为蛋白质多肽N端精氨酸标记实验流程图；
图2为蛋白质多肽C端精氨酸标记实验流程图；
图3为使用液相色谱-质谱对精氨酸标记的多肽进行分析获得的二级质谱图；
图4为使用液相色谱-质谱对精氨酸标记的多肽进行分析获得的二级质谱图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明提供的方法进行详述，但不以任何形式限制本发明。
实施例1
1.基于精氨酸标记的多肽N端标记及C端标记
如图1所示，按如下流程进行标记：
1)多肽赖氨酸氨基的胍基化：在1ml多肽溶液中加入40μL含有2M O-甲基异脲的100mM碳酸氢钠溶液，用2M氢氧化钠溶液调节pH值至11，在37℃下反应2小时。然后通过加入10％的三氟乙酸终止反应，并将溶液pH调节到8.0。
2)多肽N端精氨酸标记：将1)将精氨酸的氨基使用含有4％甲醛和60mM氰基硼氢化钠的50mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.5)进行封闭；使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)对精氨酸的羧基进行活化；2)获得的多肽样品分成两等份，第一份使用含有50mM羧基活化精氨酸的50mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.5)对多肽N端进行标记。对于第二份样品，使用同样的方法进行标记。不同之处是使用含有50mM羧基活化的重同位素精氨酸(15N4)进行标记。标记时间为10分钟。标记后的多肽使用80％乙腈溶液洗脱后，使用真空蒸干。
3)多肽C端精氨酸标记：将1)获得的多肽样品分成两等份，分别使用混合酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)对多肽C端羧基进行活化。活化后的第一份样品使用含有50mM精氨酸的50mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.5)对多肽C端进行标记。对于第二份样品，使用同样的方法进行标记。不同之处是使用含有50mM重同位素精氨酸(15N4)的50mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.5)进行标记。标记时间为10分钟。标记后的多肽使用80％乙腈溶液洗脱后，使用真空蒸干。
4)标记多肽的质谱分析：标记后的两份样品混合后，使用Triple-TOF5600plus质谱(AB SCIEX,USA)和nano UPLC***(Eskigent,USA)进行分离和分析。流动相A和B(V/V)分别为97.9％水/2％乙腈/0.1％甲酸及97.9％乙腈/2％水/0.1％甲酸。在流速为500nL/min的100％A流动相下，上样到预柱(75μm i.d.×5cm)上，然后被洗脱到分析柱(75μm i.d.×20cm)上。流速设为300nL/min，流动相梯度为：在0到45分钟内从5％到22％B，在45-60分钟内从22％B到35％B，在60-65分钟内从35％B到80％B。在使用80％的流动相B冲洗柱子5分钟后，使用98％的流动相A平衡15分钟。
Triple-TOF 5600plus的喷雾电压设为2.6kV。一级质谱扫描范围为350到1250Da(电荷数从+2到+5，cps>80，累积时间0.25s)，后面跟随60个二级扫描(扫描范围从100到1500Da，累积时间为0.04s)。分离窗口设为4Da。根据N端和C端分别被标记的多肽在分子质量和保留时间上的相关性(质量差异等于二甲基化精氨酸和乙酰化精氨酸之间的质量差异且两者色谱保留时间相近)，找到N端和C端分别被标记的相同多肽的二级质谱图。获得的N端标记多肽二级质谱图如图3所示。获得的原始二级质谱图(图3a)中含有很多碎片离子，难以分辨出b和y离子。根据多肽两端标记形成的碎片离子对之间的质量差异(b离子相差3.988Da),可以分辨出b离子(图3b)；分辨出的b离子使得质谱图大大简化，根据不同离子间的质量差异可以推导出多肽的部分序列(如图3b所示)。获得的C端标记多肽二级质谱图如图4所示。获得的原始二级质谱图(图4a)中含有很多碎片离子，难以分辨出b和y离子。根据多肽两端标记形成的碎片离子对之间的质量差异(y离子相差3.988Da),可以分辨出y离子(图4b)；分辨出的y离子使得质谱图大大简化，根据不同离子间的质量差异可以推导出多肽的部分序列(如图4b所示)。
本发明通过标记形成成对存在的多肽碎片离子而加以分辨，可以有效降低干扰信号的影响，提高碎片离子选择的特异性和多肽测序的准确度；同时通过标记在质谱图中形成成对的b，y碎片离子，有利于实现对b，y离子的分辨，简化了蛋白质氨基酸序列从头测序算法，提高了从头测序的速度。

Claims (7)

1.基于化学修饰和同位素标记多肽氨基酸序列从头测序方法，其特征在于：
将待测多肽样品分成两份；
对第一份样品，使用化学标记的方法对多肽N端的α-氨基进行标记；在进行标记时，将第一份样品分成等量的两份，分别使用含有不同同位素的带有正电荷的轻标记试剂、重标记试剂进行标记，使其中一份样品中的多肽N端采用轻标记试剂进行标记，使另一份样品中的多肽N端采用重标记试剂进行标记，且使得二份样品间轻重标记的相同肽段的分子量相差在0到8Da之间，且不为0；将标记后的二份样品混合，使用液相色谱-质谱联用进行分离和鉴定；在质谱鉴定时，将分离窗口设置为2-8 Da，使得不同标记的多肽同时碎裂；根据同位素标记引起的多肽碎片离子质量差异鉴别N端b离子；
对第二份样品，使用化学标记的方法对多肽C端的羧基进行标记；在进行标记时，将第二份样品分成等量的两份，分别使用含有不同同位素的带有正电荷的轻标记试剂、重标记试剂进行标记，使其中一份样品中的多肽C端采用轻标记试剂进行标记，使另一份样品中的多肽C端采用重标记试剂进行标记，且使得二份样品间轻重标记的相同肽段的分子量相差在在0至8Da之间，且不为0；将标记后的二份样品混合，使用一维或者二维液相色谱-质谱联用进行分离和鉴定；在质谱鉴定时，将分离窗口设置为2-8 Da，使得不同标记的多肽同时碎裂；根据同位素标记引起的多肽碎片离子质量差异鉴别C端y离子；
对多肽N端和C端分别进行标记时，使用分子质量和疏水性类似的标记试剂；利用N端和C端标记后的多肽分子质量以及保留时间的相关性找出N端和C端分别被标记的相同多肽的二级质谱图；结合鉴定到的多肽b离子和y离子，分别对待测多肽样品中的每一肽段进行多肽氨基酸序列从头测序分析。
2.按照权利要求1所述的从头测序方法，其特征在于：所述待测多肽样品，包括：蛋白质酶解肽段或内源性肽段中的一种或二种以上。
3.按照权利要求1所述的从头测序方法，其特征在于：
对多肽的N端进行化学标记；化学标记法包括H(CH2)nCHO（n=0-8），H(CH2)nCOOH（n=0-8），H(CH2)nCOCl（n=0-8）中的一种；不同同位素是指轻标记试剂、重标记试剂中分别含有不同轻重同位素12C及13C、14N及15N，或H及氘中的一种或二种以上。
4.按照权利要求1所述的从头测序方法，其特征在于：
对多肽的C端进行化学标记；化学标记法包括H(CH2)nCH2OH（n=0-8），H(CH2)nNH2（n=0-8）中的一种；不同同位素是指轻标记试剂、重标记试剂中分别含有不同轻重同位素12C及13C、14N及15N，或H及氘中的一种或二种以上。
5.按照权利要求1所述的从头测序方法，其特征在于：对标记后的肽段，使用电喷雾质谱进行检测；为了使不同标记的多肽能够同时碎裂，将二级碎裂窗口设为2-8Da，即母离子质荷比左右各1-4Da的母离子被同时碎裂；
为了实现多肽碎片b离子的分辨，将样品分成两份，一份样品用含有轻同位素的标记试剂对其N端进行标记；对于另一份样品，则使用含有重同位素的标记试剂对其N端进行标记；
为了实现多肽碎片y离子的分辨，将样品分成两份，一份样品使用含有轻同位素的标记试剂对其C端羧基进行标记；对于另一份样品，使用含有重同位素的标记试剂对其C端羧基进行标记。
6.按照权利要求1所述的从头测序方法，其特征在于：根据同位素标记引起的两份样品中多肽碎片N端b离子质量差异MDb，从多肽二级谱图中挑选成对存在且质量差异为MDb的N端b离子；根据同位素标记引起的两份样品中多肽碎片C端y离子质量差异MDy，从多肽二级谱图中挑选成对存在且质量差异为MDy的C端y离子。
7.按照权利要求1所述的从头测序方法，其特征在于：对多肽N端和C端分别进行标记时，使用分子质量和疏水性类似的标记试剂；利用N端和C端标记后的多肽分子质量以及保留时间的相关性，找出N端和C端分别被标记的相同多肽的二级质谱图；相关性是指N端和C端分别被标记后的肽段，其质量差异等于N 端和C端标记试剂之间的质量差异，并且由于N端和C端标记试剂疏水性相似，N端和C端分别被标记后的肽段在色谱上的保留时间接近，根据不同碎片离子之间的质量差异判断存在的氨基酸种类，对多肽氨基酸序列进行从头测序分析。
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