CN106645347A - 一种基于血红蛋白‑纳米钯‑石墨烯复合材料的电化学生物传感器件的制备及其应用研究 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于血红蛋白‑纳米钯‑石墨烯(Hb‑Pd‑GR)复合材料修饰电极的电化学生物传感器件的制备及其应用研究。用离子液体1 ‑ 己基吡啶六氟磷酸盐作为修饰剂制备碳离子液体电极(CILE)。将Pd‑GR和血红蛋白(Hb)混合涂布在电极表面干燥后,用Nafion膜固定制得修饰电极Nafion/Hb‑Pd‑GR/CILE。光谱研究表明复合膜中的Hb保持自身的结构没有发生变性。采用循环伏安法对Hb的电化学行为进行了研究,在pH 3.0的磷酸盐缓冲液中得到一对峰形良好的准可逆氧化还原峰,说明Hb的直接电化学在修饰电极上得以实现。这是由于Pd‑GR的存在加快了Hb和基底电极之间的电子传递速率。Nafion/Hb‑Pd‑GR/CILE对三氯乙酸(TCA)和亚硝酸钠(NaNO2)表现出良好的电催化性能,可以应用于两种物质的电化学传感分析。
Description
技术领域
本发明涉及电化学、电分析化学方面的化学修饰电极领域,以及电化学生物传感器领域。
背景技术
化学修饰电极的发展在制备方法、修饰剂的组成与类型、电极表面表征及电极过程理论等方面有了很大进步。化学修饰电极突破了传统电化学方法只限于研究裸电极/电解液界面的范围,开创了从化学形态上人为控制电极表面结构与功能的研究。随着材料科学与技术的发展,各种新型材料修饰电极已成为电化学研究的热点方向,功能化纳米材料修饰电极也表现出特殊的功能和应用前景。
目前第三代电化学酶传感器已得到较快发展,其原理是以无媒介体的氧化还原蛋白质和酶的直接电化学行为为基础,利用酶与电极之间的直接电子转移为检测特征的新型生物传感器,这种传感器无需引入媒介体,与氧及其他电子媒介体无关,因此制作过程相对简单,无外加有毒性物质,是当前最理想的生物传感器。近年来以氧化还原蛋白质的直接电化学为基础的第三代无媒介体传感器因具有简单便携、灵敏度高、检测范围广和检测限低等优点,已被广泛应用于电化学与电分析化学研究。氧化还原蛋白质的电活性中心大都被深埋在其结构内部,一般很难与基底电极间发生直接的电子传递,从而影响其直接电化学行为。由此科研工作者不断创新设计了各种化学修饰电极来提高电极表面电子转移速率。
纳米材料具有高比表面积、优良的生物相容性以及高表面自由能等独特性质,在化工催化、生物医药、电子信息等方面广阔应用。石墨烯是继纳米碳管、富勒烯球后的又一重大发现,纯净的石墨烯是一种只有一个原子厚的结晶体,具有超薄、超坚固和超强导电性能等特性,石墨烯具有优异的电学、热学和力学性能,在高性能纳电子器件、复合材料、场发射材料、气体传感器及能量存储等领域获得广泛应用。近年来石墨烯纳米金属复合材料已被合成和应用于不同领域。纳米钯是一种具有较高催化活性的贵金属纳米材料,常用于电化学、电池等领域。以石墨烯为载体将纳米钯复载于石墨烯表面构建的复合材料兼有三种材料的特性,表现出良好的协同作用。
发明内容
本发明构建了一种新型第三代电化学酶传感器克服了前两代酶传感器的诸多问题,例如线性范围窄、受测定体系的限制、使用介体制作电极过程复杂,且介体有可能污染电极等。利用纳米钯-石墨烯(Pd-GR)复合材料为电子转移催进剂,通过将血红蛋白(Hb)固定在Pd-GR修饰电极表面,制备出一种新型电化学生物传感器。
为了实现上述任务,本发明采取如下的技术解决方案:
一种基于纳米钯-石墨烯复合材料修饰电极的电化学生物传感器件的制备,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将石墨粉、1-己基吡啶六氟磷酸盐(HPPF6)和液体石蜡按一定比例混合后研磨成碳糊,然后将所述的碳糊填入玻璃电极管中压实,内嵌一根铜丝即可得到碳离子液体电极(CILE),使用前打磨至镜面;
(2)修饰电极的制备
配制一定浓度的Pd-GR溶液,超声分散均匀后将一定浓度的血红蛋白(Hb)加入该溶液中得到血红蛋白-纳米钯-石墨烯混合溶液(Hb-Pd-GR),震荡混合均匀后采用滴涂的方式将此混合溶液修饰到CILE表面,室温晾干后将Nafion滴涂到Hb-Pd-GR/CILE上表面,干燥后可制得相应的电化学生物传感器件。用同样的方法可以制备Nafion/CILE、Nafion/Pd-GR/CILE、Nafion/Hb/CILE等不同修饰电极。
所述的碳离子液体电极,其特征在于,离子液体为1-己基吡啶六氟磷酸盐(HPPF6)用量为0.8 g,石墨粉的用量为1.6 g,液体石蜡的用量为500 µL。
所述的修饰电极,其特征在于,修饰材料Pd-GR的用量和浓度分别为8.0 μL和1 .0mg·mL-1;Hb的用量和浓度分别为8 .0 μL和15 mg·mL-1;Nafion的用量和质量分数分别为8.0 μL 和 0.5 %。
所述的修饰电极,利用扫描电子显微镜(SEM)表征电极表面修饰材料的微观形貌结构。
所述的修饰电极,利用紫外可见吸收光谱(UV-vis)研究Hb是否保持生物活性。
所述的修饰电极,利用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)研究Hb是否发生构象变化。
所述的纳米钯-石墨烯-血红蛋白复合材料,采用循环伏安法(CV)考察了修饰电极上Hb的直接电化学行为。
所述Hb的直接电化学行为,其特征在于,电解质溶液为pH 3.0的磷酸盐缓冲溶液,扫速为100 mV·s-1。
一种基于血红蛋白-纳米钯-石墨烯修饰电极的电化学生物传感器件的应用,在于利用所构建的生物传感器对三氯乙酸(TCA)和亚硝酸钠(NaNO2)进行电催化还原检测。
根据上述的生物传感器应用,其特征在于,以pH 3.0的PBS缓冲溶液为测试溶液,采用循环伏安技术测试生物传感器的实际应用性能,扫速为100 mV·s-1。
附图说明
图1:Pd-GR纳米复合材料的扫描电子显微镜表征。
图2:(a)Hb水溶液和(b)Hb-Pd-GR混合溶液的紫外可见吸收光谱图。
图3:(a)Hb和(b)Hb-Pd-GR的傅里叶变换红外光谱图。
图4:不同修饰电极的循环伏安图(a)CILE;(b)Nafion/CILE;(c)Nafion/Pd-GR/CILE;(d)Nafion/Hb/CILE;(e)Nafion/Hb-Pd-GR/CILE(pH 3.0 PBS缓冲溶液,扫速为100mV·s-1 )。
图5:修饰电极在不同浓度TCA存在下的循环伏安图(a到j为3.0,7.0,14.0,20.0,28.0,36.0,44.0,52.0,60.0,68.0 mmol L-1)(插图:还原峰电流与TCA浓度之间的关系曲线)。
图6:修饰电极在不同浓度NaNO2存在下的循环伏安图(a到i为0.04,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.7,0.9,1.1 mmol L-1)(插图:还原峰电流与TCA浓度之间的关系曲线)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述,但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例1
Pd-GR纳米复合材料的扫描电子显微镜表征
图1所示展示了在放大倍数为10000的Pd-GR纳米复合材料的扫描电子显微镜表征图。层状结构为石墨烯的特征形貌,钯纳米粒子沉积、嵌插、包埋在层状的石墨烯表面及内部。
实施例2
紫外可见吸收光谱分析
紫外可见吸收光谱法是一种用于检测蛋白质的二级结构是否变化的常用手段,通过蛋白质Soret 吸收带的位置是否发生迁移可以提供蛋白质的物理结构信息,如果蛋白质变性或其物理结构发生改变就会使其吸收带发生迁移或消失。图2呈现了Hb水溶液和Pd-GR-Hb混合溶液的UV-vis吸收光谱图,Hb在水溶液中Soret吸收带在405 nm(曲线a)和Hb-Pd-GR混合溶液中的Soret吸收带405 nm(曲线b)完全相同,表明Hb在与Pd-GR复合材料混合后仍然保持原有的构像,没有发生结构变化,这也进一步说明Hb在同Pd-GR复合材料混合的复合膜内依然保持原有的生物活性。
实施例3
红外光谱分析
傳里叶变换红外光谱(FT-IR)通过检测蛋白质的酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ两个吸收特征带的变化来判断其二级结构是否发生变化。蛋白质的肽段结构含有的C=O键伸缩振动引起酰胺I(1700-1600 cm-1)变动,N-H键弯曲振动和C-N键伸缩振动引起的酰胺Ⅱ(1620-1500 cm-1)的变动。如果蛋白质发生改变或变性,可能引起酰胺I和酰胺Ⅱ两个吸收带产生明显位移甚至是消失不见。如图3所示混有Pd-GR复合材料的Hb酰胺I和酰胺Ⅱ红外吸收带位置分别在1639 cm-1和1524 cm-1(b),而天然Hb的吸收带分别为1647 cm-1和1543 cm-1(a)。从红外光谱图谱形的相似性可以认为Hb在与Pd-GR复合材料混合溶液中基本保持其原有构象。而酰胺I和酰胺Ⅱ的轻微位移可以看作是Hb与纳米Pd-GR之间存在相互作用力,这种作用力可能是氧键作用或是静电引力,这说明Pd-GR复合材料为Hb提供了有效的且生物相容性良好的微环境。
实施例4
Hb在修饰电极上的直接电化学
Nafion/Hb-Pd-GR/CILE在pH 3.0磷酸盐缓冲溶液里的循环伏安曲线如图4所示,在0.2~ - 0.8 V扫描范围内电极CILE(曲线a)、Nafion/CILE (曲线b)和Nafion/Pd-GR/CILE(曲线c)上没有出现特征的氧化还原峰,表明Nafion、Pd-GR、CILE均不存在电活性物质。在Nafion/Hb/CILE(曲线d)上出现一对明显的氧化还原峰,氧化还原峰电位分别为 - 0.147V和 - 0.214 V,峰电位差(∆Ep)为67 mV,这是血红素辅基Fe(III)/Fe(II)的特征峰。而在Nafion/Hb-Pd-GR/CILE(曲线e)上,氧化还原峰电位分别为 - 0.143 V和 - 0.214 V,∆Ep为71 mV。Nafion/Hb-Pd-GR/CILE电极上循环伏安峰较其它类型电极峰型好并且峰电流显著增加,这是由于纳米钯-石墨烯复合材料具有良好的生物相容性、高导电性和较大的比表面积,从而加速了电子的转移速率。
实施例5
Hb修饰电极对TCA的电催化
实验表明TCA的浓度为0.6 mmol·L-1以上在 -0.5 V处出现了新的还原峰,如图5所示峰电流与TCA浓度在0.6 ~ 13.0 mmol·L-1和13.0 ~ 61.0 mmol·L-1范围内呈良好的线性关系,线性回归方程为Iss (µA)=1.067 C (mmol·L-1) + 0.193 (γ= 0.995),Iss(µA)=2.63 C (mmol·L-1) - 24.78 (γ= 0.997)。当TCA的浓度超过61.0 mmol·L-1之后,还原峰电流变化较小,表现出Michaelis-Menten动力学机制。根据Lineweaver-Burk方程的电化学形式利用双倒数作图法(1/Iss~1/[TCA])求出催化反应中表观米式常数K M app 为0.63mmol·L-1,检测限为0.35 µmol·L-1。表明纳米钯-石墨烯复合材料有着良好的生物相容性和导电性,这为Hb与底物TCA更好的反应提供了重要的媒介。
实施例6
Hb修饰电极对NaNO2的电催化
实验表明当NaNO2浓度在0.04 mmol·L-1以上时,修饰电极在-0.6 V处出现了新的还原峰,如图6所示当NaNO2浓度为0.04 ~ 0.5 mmol·L-1和0.5 ~ 0.75 mmol·L-1范围内呈良好的线性关系,线性回归方程为Iss(µA)= 71.02 C (mmol·L-1)+2.038 (γ= 0.995),Iss(µA)= 27.27 C (mmol·L-1) + 22.19 (γ= 0.993),根据Lineweaver-Burk方程的电化学形式利用双倒数作图法(1/Iss~1/[NaNO2])求出催化反应中表观米式常数K M app 为2.75 µmol·L-1,检测限为0.2 µmol·L-1。表明纳米钯-石墨烯复合材料有着良好的生物相容性和导电性,这为Hb与底物NaNO2更好的反应提供了重要的媒介。
Claims (10)
1.一种血红蛋白-纳米钯-石墨烯复合材料修饰电极的制备及其电化学行为研究,包括:制备碳离子液体电极的方法,制备血红蛋白-纳米钯-石墨烯复合材料的方法,在碳离子液体电极表面修饰上述复合材料的方法,测试所述纳米钯-石墨烯-血红蛋白复合材料电化学行为的方法;其特征在于,包括以下步骤:
(1) 将石墨粉、1-己基吡啶六氟磷酸盐(HPPF6)和液体石蜡按一定比例混合后研磨成碳糊,然后将所述的碳糊填入玻璃电极管中压实,内嵌一根铜丝即可得到碳离子液体电极(CILE),使用前打磨至镜面;
(2) 配制一定浓度的纳米钯-石墨烯(Pd-GR)溶液,超声分散均匀后将一定浓度的血红蛋白(Hb)加入该溶液中得到纳米Hb-Pd-GR混合溶液,震荡混合均匀后采用滴涂的方式将此混合溶液修饰到CILE表面,室温晾干后将Nafion滴涂到Hb-Pd-GR/CILE上表面,干燥后可制得相应的电化学生物传感器件;
用同样的方法可以制备Nafion/CILE、Nafion/Pd-GR/CILE、Nafion/Hb/CILE等不同修饰电极。
2.根据权利要求1所述的碳离子液体电极,其特征在于,离子液体为1-己基吡啶六氟磷酸盐(HPPF6)的用量为0.8 g,石墨粉的用量为1.6 g,液体石蜡的用量为500 µL。
3.根据权利要求1所述的修饰电极,其特征在于,修饰材料Pd-GR的用量和浓度分别为8.0 μL和1 .0 mg·mL-1;Hb的用量和浓度分别为8 .0 μL和15 mg·mL-1;Nafion的用量和质量分数分别为8.0 μL 和 0.5 %。
4.根据权利要求1所述的修饰电极,利用扫描电子显微镜(SEM)表征电极表面修饰材料的微观形貌结构。
5.根据权利要求1所述的混合溶液,利用紫外-可见吸收光谱(UV-vis)研究混合溶液中的Hb是否保持生物活性。
6.根据权利要求1所述的混合溶液,利用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)研究混合溶液中的Hb是否发生构象变化。
7.根据权利要求1所述的Hb-Pd-GR混合溶液,采用循环伏安法(CV)考察了修饰电极上Hb的直接电化学行为。
8.根据权利要求7所述Hb的直接电化学行为,其特征在于,电解质溶液为pH 3.0的磷酸盐缓冲溶液,扫速为100 mV·s-1。
9.一种基于血红蛋白-纳米钯-石墨烯修饰电极的电化学生物传感器件的应用,在于利用所构建的生物传感器件对三氯乙酸(TCA)和亚硝酸钠(NaNO2)进行电催化还原检测。
10.根据权利要求9所述的生物传感器件应用,其特征在于,以pH 3.0 的磷酸盐缓冲溶液为测试溶液,采用循环伏安技术测试生物传感器件的实际应用性能,其扫速为100 mV·s-1。
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