CN106636087B - 一种长链非编码RNA lnc‑HR1用途及克隆方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种长链非编码RNA lnc‑HR1的克隆方法，包括：提取细胞的总RNA，在所述总RAN中加入逆转录酶，所述总RAN逆转录成cDNA，以所述cDNA为PCR反应模板克隆得到所述lnc‑HR1。本发明提供的lnc‑HR1、用途及其克隆方法，实现从源头抑制肝脏内脂类的合成。

Description

一种长链非编码RNA lnc-HR1用途及克隆方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种长链非编码RNA lnc-HR1用途及其克隆方法。
背景技术
临床慢性肝炎、脂肪肝等肝病，主要是由于病毒感染、不合理的饮食、致病细菌感染、药物损伤等引发的脂类在肝脏的代谢异常，从而引发相关的症状。针对大量中性脂类在肝脏内的大量累积，可能应发肝纤维化甚至造成肝硬化肝细胞肝癌等严重的肝病，目前的治疗方法首先是给予患者降脂酶，降低肝脏内脂类的积累，最终恢复肝脏和血液中脂类的含量达到正常值。但是对于常用的降脂药物，只能降低肝脏和血液中脂类的含量，并不能直接抑制脂类的合成，需要长期用药。
发明内容
本发明的目的是提供一种lnc-HR1用途及其克隆方法，实现从源头抑制肝脏内脂类的合成。
为了解决上述技术问题，本发明提供的一种lnc-HR1用途及其克隆方法是这样实现的：
一种长链非编码RAN lnc-HR1的克隆方法，包括：提取细胞的总RNA，在所述总RAN中加入逆转录酶，所述总RAN逆转录成cDNA，以所述cDNA为PCR反应模板克隆得到所述lnc-HR1；所述PCR反应的体系为50ul，所述PCR反应组分为：primescript 1 step Enzyme Mix 2μl，2×1 step buffer 25μl，Template RNA 1μg，Primer(up)10μM 2μl，Primer(down) 10μM 2μl和RNase free water 18μl。
可选的，所述PCR反应的循环条件为：34循环（50°C 30min，92°C 2min ，94°C 30s，56°C 30s，72°C 80s，4°C保温 ）。
可选的，所述PCR反应的引物为：
上游序列：5’-GGAGAATAGCTTTCTTCCTGGAACT-3’
下游序列：5’-CCGCATGCCACAGTTTTTACTTCTTC-3’。
长链非编码RAN lnc-HR1在制备治疗肝癌药物、制备治疗肝炎药物、制备治疗脂肪肝药物或制备降脂药物中的应用。
长链非编码RAN lnc-HR1在制备降低肝脏中脂肪药物中的应用。
长链非编码RAN lnc-HR1在制备降脂药物中的应用，所述脂为甘油三酯。
长链非编码RAN lnc-HR1在制备治疗肝癌药物中的应用中，所述肝癌为肝细胞肝癌。
长链非编码RAN lnc-HR1在制备治疗肝癌药物、制备治疗肝炎药物、制备治疗脂肪肝药物或制备降脂药物中的应用；所述药物抑制甘油三酯的合成。
本发明提供的长链非编码RAN lnc-HR1的克隆方法，提取的lnc-HR1能够抑制SREBP-1c的合成，而SREBP-1c是甘油三酯合成的关键因子，实现抑制甘油三酯的合成。现有技术中，由于lnc-HR1在细胞中含量较少，从细胞中提取lnc-HR1异常困难，通常得不到完整的lnc-HR1；本发明相对于现有技术实现从细胞中提取完整的lnc-HR1，实现从源头抑制肝脏内脂类的合成，有效的降低脂类的含量和保护肝脏。
本发明从Huh7细胞中提取总RNA、克隆lnc-HR1， 构建lnc-HR1的真核表达载体（pMIR-lncHR1），然后将lnc-HR1的真核表达载体转染到Huh7细胞中，经过一段时间的培养，实时荧光定量PCR检测细胞中lnc-HR1、固醇调节元件结合蛋白（SREBP-1c）的mRNA；使用2-△△Ct法分析mRNA转录水平的变化，结果如下：lncHR1的表达量随着pMIR-lncHR1剂量的增加而梯度升高，SREBP-1c 的 mRNA表达水平受到lncHR1的抑制，并且呈剂量依赖性，最终受抑制率达到50%左右。将转染了pMIR-lncHR1的Huh7细胞裂解，进一步验证在蛋白质水平上lncHR1对SREBP-1c的抑制作用， western blot结果显示：随着lncHR1剂量的增加，SREBP-1c的蛋白表达受到抑制。因此，长链非编码RAN lnc-HR1可以作为活性成分制备成药物，用于治疗由于脂类的代谢异常引起的肝病。
附图说明
图1是本发明提供的lnc-HR1复制电泳图；
图2 是本发明构建的真核表达载体pMIR-DFT图谱；
图3是本发明提供的pMIR-lncHR1剂量与lncHR1表达关系图；
图4是本发明提供的lncHR1剂量与SREBP-1c 的 mRNA表达关系图；
图5是本发明提供的lncHR1剂量与SREBP-1c的关系图；
图6是本发明提供的经油酸处理的细胞试验结果对比图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明从细胞中提取总RNA并克隆lncHR1，然后构建质粒表达载体pMIR- lncHR1，然后将pMIR- lncHR1转染到细胞中培养，实时荧光定量PCR确定SREBP-1c 的 mRNA表达水平受到lncHR1的抑制，SREBP-1c的蛋白表达受到抑制；然后油酸处理细胞，设置正常细胞组、转染了pMIR- lncHR1和转染pMIR- DFT空载体质粒细胞组对比试验，得出转染了pMIR-lncHR1的细胞，甘油三酯的积累形式（脂滴）累积受到抑制。
1、提取总RNA并克隆lncHR1
按照Trizol方法，Thermo公司生产的TRIzol试剂提取Huh7细胞的总RNA，在总RAN中加入逆转录酶，逆转录成cDNA，在同一反应体系中以cDNA为模板，使用TAKARA公司生产的一步法RT-PCR试剂盒，按照说明书操作方法克隆lncHR1基因，克隆引物如表1所示；PCR的反应体系和循环条件如表2所示。使用Thermo PCR仪进行的PCR反应。
引物 序列
上游 5’-GGAGAATAGCTTTCTTCCTGGAACT-3’
下游 5’-CCGCATGCCACAGTTTTTACTTCTTC-3’
注：斜体（GGA,CCG）为单酶切位点的保护碱基
表1
表2
获得的PCR产物，采用常规的1%琼脂糖核酸电泳上样量5μl，使用bio-Rad核酸电泳仪，结果如图1所示：本发明克隆得到完整的lncHR1 RNA，大小为420bp，通过测序得到lncHR1 RNA序列为：GGTGATAAGGGTCATCTCTATGAATAGCTTTCTTCCTGGAACTGACTGGACTTCACAACCAATTTTGGGCTAGTGTGGAGAGATCAGCTGTGAGAAACATCCATTGATTTGCTCAGGCTGCCCTTTGTATCTTAATGCTTCAGGTTTTGTTATCCTGCGCCTTTCTTCTGTCTTCTTTCCTCATAAGTTTTTTAGATACAATTTTATTGCCAATAATTAAAGAGTGAGAATGAGCGGCAATGGGCTGGTATGGTTGCATTCAAACTCCAAAGTTCACATTTTGGAATATTGATTTTTGCTTGAGAACAACTTACCTAAAAACCATGGGAATTTGGCAGGGAGGGATGTGATGGGGCATATGTTGAGTTCTTTCAAGGAATTTAACTTTCATTTCTGAAGAAGTAAAAACTGTGGCATGGT，与Genbank中记载lncHR1序列一致。
2、构建真核表达载体pMIR- lncHR1
首先：克隆基因lncHR1的消化和真核表达载体pMIR-DFT的线性化
真核表达载体pMIR-DFT图谱如图2所示，lncHR1在表达载体上的单克隆位点为BglⅡ（A^GATCT）和XhoⅠ（C^TCGAG）。
将lncHR1克隆产物消化、获得两个酶切位点的黏性末端，对表达载体进行线性化；线性化双切酶体系如表3所示。
表3
然后2%琼脂糖核酸电泳，切割下lncHR1消化产物片段和质粒线性化片段，用QUIGEN DNA胶回收试剂盒，按照KIT的操作步骤获得lncHR1线性化片段和线性化质粒DNA。
然后，将线性化质粒和消化回收的lncHR1片段连接
使用NEB 公司生产的T4 DNA ligase，将线性化质粒和消化回收的lncHR1片段连接，T4连接酶反应体系如表4所示：
表4
取5μlT4连接产物，用DH5α感受态细胞做常规的转化实验，培养12h挑取单菌落测序，测序引物为MSCV序列：GGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAAT，以确定lncHR1已经连接到过表达质粒的克隆位点；阳性克隆扩大培养、提取质粒，做后续实验。此时，提取的质粒中已经含有lncHR1基因。
3、细胞转染
在24well plate的Huh7细胞中转染过表达质粒pMIR-lncHR1，以空载体质粒pMIR-DFT为对照。转染具体操作如下：转染试剂使用SignaGen生产的LipoD293；Gibco 生产的FBS、DMEM培养基和双抗抗生素。
1）转染前24h，用含10% FBS的DMEM培养基在24孔板内接种培养细胞，37℃，恒温、5%CO2培养箱培养过夜。2）待细胞长到80％汇合度，转染前1h更换新鲜的完全培基。3）用空DMEM培养基稀释1μg DNA质粒，混匀。4）用空DMEM培养基稀释2μl转染试剂D293，混匀。
5）将转染试剂逐滴加入到稀释的质粒中，轻柔混匀，室温静置温育15min。 6）将步聚5）中质粒和转染试剂的混悬液均匀滴加入待转染的细胞中；轻轻晃动，以使其分布均匀。
7）5～8h换成新的含10% FBS的培养基，继续培养48h，得到转染过表达质粒pMIR-lncHR1的细胞。
4、在mRNA水平验证lncHR1对SREBP-1c的抑制作用
收集过表达质粒pMIR-lncHR1的细胞于Trizol试剂中，提取RNA，以总RNA为模版，对lncHR1以及SREBP-1c和β-actin的mRNA水平进行相对定量测定，进行qRT-PCR实验；使用TAKARA 的One Step SYBR Primescript RT-PCR KIT。.定量引物如下：结果如表5下：
表5
PCR反应体系及循环条件如表6所示：
表6
相对定量中以管家基因β-actin为内参，用2-△△Ct法分析mRNA转录水平的变化。结果如图3和图4所示：lncHR1的表达量随着pMIR-lncHR1剂量的增加而梯度升高，SREBP-1c的 mRNA表达水平受到lncHR1的抑制，并且呈剂量依赖性，最终受抑制率达到50%左右。
结果表明，SREBP-1c在转录水平上受到过表达lncHR1的抑制作用。
5、在蛋白质水平上验证lncHR1对SREBP-1c的抑制作用
收集过表达质粒pMIR-lncHR1的细胞，用2×loading buffer裂解液裂解，用于蛋白质检测实验SREBP-1c抗体（SCRUZ）； Sigma的抗鼠β-actin。,如图5所示，western blot结果显示：随着lncHR1剂量的增加，SREBP-1c的蛋白表达受到抑制，呈现出剂量的梯度依赖性。
6、pMIR-HR1抑制肝细胞中甘油三酯合成
脂滴（LDs，Lipid Droplets）是肝病发生时，肝细胞中重要的脂类累积形式，主要有中性脂类甘油三酯（Triglyceride，TG）组成。首先用0.5μM的油酸（OA ，Oleic Acid）处理Huh7细胞，诱导细胞形成脂肪变性细胞；采用油红染色的方法，观察细胞内LDs的累积。在脂肪变性细胞中，采用3中转染方式转染pMIR-HR1，48h后用油红染色，如图6所示，蓝色的（黑白图中显示为大块黑色）为细胞核，红色的（黑白图中显示为小黑点）为 LDs；图6中A为未经油酸处理的细胞，含有少量的LDs ；B为经油酸处理脂肪变性的细胞，转染pMIR-DFT空载体质粒，含有大量的LDs；C为油酸处理脂肪变性的细胞，转染了pMIR-HR1，LDs量明显减少。结果表示，过表达lncHR1后，LDs的累积受到抑制。
上述研究表明：本发明提供的lnc-HR1能够抑制SREBP-1c的合成，而SREBP-1c是甘油三酯合成的关键因子，从而抑制甘油三酯的合成，实现从源头抑制肝脏内脂类的合成，有效的降低脂类的含量和保护肝脏。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 一种长链非编码RNA lnc-HR1用途及克隆方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 420
<212> DNA
<213> 人体肝癌细胞(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
ggtgataagg gtcatctcta tgaatagctt tcttcctgga actgactgga cttcacaacc 60
aattttgggc tagtgtggag agatcagctg tgagaaacat ccattgattt gctcaggctg 120
ccctttgtat cttaatgctt caggttttgt tatcctgcgc ctttcttctg tcttctttcc 180
tcataagttt tttagataca attttattgc caataattaa agagtgagaa tgagcggcaa 240
tgggctggta tggttgcatt caaactccaa agttcacatt ttggaatatt gatttttgct 300
tgagaacaac ttacctaaaa accatgggaa tttggcaggg agggatgtga tggggcatat 360
gttgagttct ttcaaggaat ttaactttca tttctgaaga agtaaaaact gtggcatggt 420
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人体肝癌细胞(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
ggagaatagc tttcttcctg gaact 25
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人体肝癌细胞(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
ccgcatgcca cagtttttac ttcttc 26
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人体肝癌细胞(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
acttctggag gcatcgcaag ca 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人体肝癌细胞(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
aggttccaga ggaggctaca ag 22
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人体肝癌细胞(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
ccaaccgcga gaagatga 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人体肝癌细胞(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
ccagaggcgt acagggatag 20

Claims (4)

1.长链非编码RNA lnc-HR1在制备治疗脂肪肝药物或制备降脂药物中的应用；所述长链非编码RNA lnc-HR1为：GGTGATAAGGGTCATCTCTATGAATAGCTTTCTTCCTGGAACTGACTGGACTTCACAACCAATTTTGGGCTAGTGTGGAGAGATCAGCTGTGAGAAACATCCATTGATTTGCTCAGGCTGCCCTTTGTATCTTAATGCTTCAGGTTTTGTTATCCTGCGCCTTTCTTCTGTCTTCTTTCCTCATAAGTTTTTTAGATACAATTTTATTGCCAATAATTAAAGAGTGAGAATGAGCGGCAATGGGCTGGTATGGTTGCATTCAAACTCCAAAGTTCACATTTTGGAATATTGATTTTTGCTTGAGAACAACTTACCTAAAAACCATGGGAATTTGGCAGGGAGGGATGTGATGGGGCATATGTTGAGTTCTTTCAAGGAATTTAACTTTCATTTCTGAAGAAGTAAAAACTGTGGCATGGT。
2.权利要求1中所述长链非编码RNA lnc-HR1在制备降低肝脏中脂肪药物中的应用。
3.权利要求2中所述的长链非编码RNA lnc-HR1在制备降脂药物中的应用，所述脂为甘油三酯。
4.权利要求2中所述长链非编码RNA lnc-HR1在制备治疗脂肪肝药物或制备降脂药物中的应用；所述药物抑制甘油三酯的合成。
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