CN106636052B - 一种马来酸顺反异构酶的热稳定性改造及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种马来酸顺反异构酶的热稳定性改造及其应用，属于酶工程领域。本发明将来源于粘质沙雷氏菌的马来酸顺反异构酶基因maiA通过半理性设计的方法进行了热稳定改造，得到的突变体与野生型的马来酸顺反异构酶相比，突变体G27A‑G171A在55℃的半衰期是野生型的2.9倍，酶活是野生型的1.96倍；突变体G27A‑K104R在55℃的半衰期是野生型的4.18倍，酶活是野生型的1.59倍。
Description
技术领域
本发明涉及一种马来酸顺反异构酶的热稳定性改造及其应用，属于酶工程领域。
背景技术
马来酸顺反异构酶催化马来酸转化为富马酸，而富马酸又可以经过天冬氨酸酶转化为附加值更高的天冬氨酸或经过富马酸酶转化为苹果酸，要想实现从马来酸向天冬氨酸或苹果酸的直接转化而省去中间产物富马酸的分离纯化，就需要将马来酸顺反异构酶与天冬氨酸酶或富马酸酶耦联起来使用。而不管是天冬氨酸酶还是富马酸酶其热稳定性都要高于马来酸顺反异构酶，要想实现这个耦联催化体系的可连续性和重复使用性，就要求马来酸顺反异构酶有较好的活性和热稳定性。粘质沙雷氏菌来源的马来酸顺反异构酶是现有报道中活性最高的马来酸顺反异构酶，而所有菌株来源的马来酸顺反异构酶的热稳定性都较差。
目前关于提高马来酸顺反异构酶热稳定性的研究还很少。酶活性中心的改造往往会造成酶活性的下降或丧失。
发明内容
本发明首先提供了马来酸顺反异构酶突变体，是将如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的第27位甘氨酸突变为丙氨酸并将第171位甘氨酸突变为丙氨酸；或者将第27位甘氨酸突变为丙氨酸并将第104位赖氨酸突变为精氨酸；或者第27位甘氨酸突变为丙氨酸；或者第104位赖氨酸突变为精氨酸；或者将第171位甘氨酸突变为丙氨酸。
本发明还提供了一种表达所述马来酸顺反异构酶突变体的重组菌，是以pET-24a(+)为表达载体，将编码突变体的基因与表达载体连接后，转化宿主大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明选取马来酸顺反异构酶的酶分子表面非保守的Gly或Lys，分别突变成Ala或Arg，获得了热稳定性和酶活性提高了的MaiA突变酶，然后将这些点进行组合突变，获得效果更好的突变体。其中，突变体G27A-G171A在55℃的半衰期是野生型的2.9倍，酶活是野生型的1.96倍；突变体G27A-K104R在55℃的半衰期是野生型的4.18倍，酶活是野生型的1.59倍。本发明提供的马来酸顺反异构酶突变体及相应的重组菌，将在富马酸、天冬氨酸或苹果酸的生产中，发挥更好的作用。
附图说明
图1pET-24a(+)-maiA定点突变全质粒PCR结果；M：DNA marker；1：pET-24a(+)-maiA定点突变全质粒PCR结果
图2马来酸顺反异构酶的纯化结果；M：protein marker；1：重组菌粗酶液；2：纯化后的马来酸顺反异构酶
图3野生型和突变体的初始相对酶活和在55℃下的半衰期；(A)单突变体的相对酶活：(B)单突变体55℃半衰期；(C)组合突变体的相对酶活；(D)组合突变体55℃半衰期
图4突变体热稳定性比较
具体实施方式
酶活的测定方法：
反应体系为50μL 1.5mg/mL的纯化后的马来酸顺反异构酶加100μL 1mol/L的马来酸钾溶液再加350μL的pH8.0的磷酸盐缓冲液组成的500μL的反应体系。在40℃反应10min，然后迅速在100℃煮沸10min，离心取上清液稀释50倍，测定生成的富马酸含量。
底物马来酸和产物富马酸互为异构体，用高效液相色谱发(HPLC)进行测定：
色谱柱为Prevail Organic Acid(250×4.6mm,5μm；Grace DavisonDiscoverySciences)，流动相为25mmol·L-1的磷酸氢二钾溶液，pH＝2.5，流速1mL·min-1，紫外检测器，波长210nm，柱温40℃，进样量10μL。
半衰期的测定方法：
将纯化后的马来酸顺反异构酶稀释到1.5mg/mL，于55℃保温60min后迅速转移到冰上使其冷却，然后按酶活测定方法和反应体系测定55℃保温60min后的残留酶活，然后根据酶催化反应的一级失活反应方程计算出半衰期：
一级失活反应方程：
半衰期：
其中V为在55℃保温t时间后的残留酶活，V0位初始酶活，KD为酶在一定温度下(55℃)的失活常数，t1/2位一定温度下(55℃)的半衰期。
实施例1
根据如SEQ ID NO.1所示的野生型马来酸顺反异构酶的氨基酸序列，设计马来酸顺反异构酶突变体引物如表1所示，以pET-24a(+)-maiA(该质粒的构建，参见文献[王亚，崔文璟，周丽，刘中美，周哲敏.粘质沙雷氏菌马来酸顺反异构酶表达纯化及酶学性质[J].食品与生物技术学报2014年第33卷第11期1204-1209])为模板进行全质粒PCR，实现定点突变。步骤如下：
(1)半理性设计选出需要突变的氨基酸，设计突变引物；
(2)以pET-24a(+)-maiA为模板进行全质粒PCR，实现定点突变(如图1)；
(3)用DpnI酶对PCR产物进行过夜消化；
(4)将消化产物转化到JM109的感受态细胞里，然后涂布到带卡那霉素的LB平板培养基上；
(5)挑取单菌落进行测序；
(6)将正确突变的突变体重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞里然后涂布到带卡那霉素的LB平板培养基上；
(7)挑取单菌落接种于5mL的卡那抗生素浓度为50μg/mL的LB培养基(10g蛋白胨、5g酵母膏、10g NaCl定容到1L)中，37℃、200rpm培养8小时，然后以2％的接种量转接到装有50mL的2YT培养基(16g蛋白胨、10g酵母膏、5g NaCl定容到1L)的250mL的摇瓶中，卡那青霉素浓度为50μg/mL，37℃、200rpm培养到OD600为0.8，然后加终浓度为0.2mmol/L的IPTG在20℃下诱导表达20小时；
(8)参照文献[王亚，崔文璟，周丽，刘中美，周哲敏.粘质沙雷氏菌马来酸顺反异构酶表达纯化及酶学性质[J].食品与生物技术学报2014年第33卷第11期1204-1209])，从补正(7)所得培养物中纯化马来酸顺反异构酶(纯化结果如图2)；
(9)酶活及55℃半衰期的测定。
结果：
突变体与野生型的马来酸顺反异构酶相比，突变体G27A-G171A(第27位甘氨酸突变为丙氨酸和第171位甘氨酸突变为丙氨酸)在55℃的半衰期是野生型的2.9倍，酶活是野生型的1.96倍；突变体G27A-K104R(第27位甘氨酸突变为丙氨酸和第104位赖氨酸突变为精氨酸)在55℃的半衰期是野生型的4.18倍，酶活是野生型的1.59倍(如图3)。
表1定点突变引物设计
注：大号字体标出的为要突变的氨基酸碱基
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种马来酸顺反异构酶的热稳定性改造及其应用
<160> 32
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 250
<212> PRT
<213> 粘质沙雷氏菌来源
<400> 1
Met Ser Asn His Tyr Arg Ile Gly Gln Ile Val Pro Ser Ser Asn Thr
1 5 10 15
Thr Met Glu Thr Glu Ile Pro Ala Met Leu Gly Ala Arg Gln Leu Ile
20 25 30
Arg Pro Glu Arg Phe Thr Phe His Ser Ser Arg Met Arg Met Lys His
35 40 45
Val Asn Lys Glu Glu Leu Ala Ala Met Asp Ala Glu Ser Asp Arg Cys
50 55 60
Ala Leu Glu Leu Ser Asp Ala Arg Val Asp Val Leu Gly Tyr Ala Cys
65 70 75 80
Leu Val Ala Ile Met Ala Met Gly Leu Gly Tyr His Arg Glu Ser Gln
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Gln Val Thr Lys Asp Asn Gln Ala Ala Ala Pro Val
100 105 110
Ile Ser Ser Ala Gly Ala Leu Val Asn Gly Leu Lys Val Ile Gly Ala
115 120 125
Lys Arg Ile Ala Leu Val Ala Pro Tyr Met Lys Pro Leu Thr Gln Leu
130 135 140
Val Val Asp Tyr Ile Gln His Glu Gly Ile Glu Val Lys Val Trp Arg
145 150 155 160
Ala Leu Glu Ile Pro Asp Asn Leu Asp Val Gly Arg His Asp Pro Ala
165 170 175
Arg Leu Pro Gly Ile Val Ala Glu Met Asp Leu Arg Glu Val Asp Ala
180 185 190
Ile Val Leu Ser Ala Cys Val Gln Met Pro Ser Leu Pro Ala Val Pro
195 200 205
Thr Val Glu Ala Gln Thr Gly Lys Pro Val Ile Thr Ala Ala Ile Ala
210 215 220
Thr Thr Tyr Ala Met Leu Thr Ala Leu Glu Leu Glu Pro Ile Val Pro
225 230 235 240
Gly Ala Gly Ala Leu Leu Ser Gly Ala Tyr
245 250
<210> 2
<211> 753
<212> DNA
<213> 粘质沙雷氏菌
<400> 2
atgagcaacc actaccgcat cggccagatc gtgcccagct ccaacaccac gatggaaacc 60
gagatcccgg cgatgctggg cgcgcgccag ctgatacgcc cggagcgttt cacctttcac 120
tccagccgca tgcgcatgaa acacgtcaat aaagaagaat tggcggcgat ggacgccgag 180
tccgatcgct gcgcgctgga gctgtccgac gcgcgggtcg acgtgctcgg ctacgcctgc 240
ctggtggcca tcatggcgat ggggctgggc taccaccgcg aatcgcaggc ccggctggcg 300
caggtgacga aagacaatca ggccgccgcg ccggtcatca gcagcgccgg cgcgctggtc 360
aacggcctga aggtgatcgg cgccaaacgc atcgcgctgg tggcgcccta catgaaaccg 420
ctgacccagc tggtggtgga ctacatccag cacgaaggca tcgaggtcaa ggtatggcgc 480
gcgctggaga tcccggacaa cctcgacgtc ggccggcacg atccggccag gctgccgggg 540
atcgtcgccg agatggactt acgcgaggtc gatgctatcg tgctgtccgc ctgcgtgcag 600
atgccttcgc tgccggccgt cccgacggtg gaggcccaaa ccggcaaacc ggtgatcacc 660
gccgccatcg ccaccactta cgcgatgctg accgcgctgg agctggaacc gatcgttccc 720
ggcgccggcg ccctgctgtc cggcgcttat tga 753
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcgtatcagc tggcgcgccg ccagcatcgc cgg 33
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cctggccgga tcgtgccgcg cgacgtcgag gtt 33
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<212> DNA
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ctggaaccga tcgttcccgc ggccggcgcc ctg 33
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<211> 33
<212> DNA
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<400> 14
ggacagcagg gcgccggccg cgggaacgat cgg 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
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tccagccgca tgcgcatgcg ccacgtcaat aaa 33
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
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ttcttcttta ttgacgtggc gcatgcgcat gcg 33
<210> 17
<211> 33
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<213> 人工序列
<400> 17
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<211> 33
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<213> 人工序列
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catcgccgcc aattcttcgc gattgacgtg ttt 33
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
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cggctggcgc aggtgacgcg cgacaatcag gcc 33
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cgcggcggcc tgattgtcgc gcgtcacctg cgc 33
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gcgctggtca acggcctgcg cgtgatcggc gcc 33
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gcgtttggcg ccgatcacgc gcaggccgtt gac 33
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<211> 33
<212> DNA
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<400> 32
ctcgagtgcg gccgcaaggc gataagcgcc gga 33
Claims (10)
1.一种马来酸顺反异构酶突变体，其特征在于，是将如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的第27位甘氨酸突变为丙氨酸并将第171位甘氨酸突变为丙氨酸；或者将第27位甘氨酸突变为丙氨酸并将第104位赖氨酸突变为精氨酸；或者第27位甘氨酸突变为丙氨酸；或者第104位赖氨酸突变为精氨酸；或者将第171位甘氨酸突变为丙氨酸。
2.编码权利要求1所述的马来酸顺反异构酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述的基因的载体或细胞。
4.一种表达权利要求1所述的马来酸顺反异构酶突变体的重组菌，其特征在于，将编码突变体的基因与表达载体连接后，转化宿主大肠杆菌。
5.根据权利要求4所述的一种表达权利要求1所述的马来酸顺反异构酶突变体的重组菌，其特征在于，表达载体为pET-24a(+)、pET-28a、pRSFDuet-1或pETDuet-1。
6.根据权利要求4所述的一种表达权利要求1所述的马来酸顺反异构酶突变体的重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌是大肠杆菌BL21(DE3)。
7.权利要求1所述的马来酸顺反异构酶突变体在生产富马酸中的应用。
8.权利要求1所述的马来酸顺反异构酶突变体在生产天冬氨酸中的应用。
9.权利要求1所述的马来酸顺反异构酶突变体在生产苹果酸中的应用。
10.权利要求4或5所述的表达马来酸顺反异构酶突变体的重组菌在生产富马酸、天冬氨酸或苹果酸中的应用。
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| CN104962571A (zh) * | 2015-06-26 | 2015-10-07 | 江南大学 | 一种固定化马来酸顺反异构酶及其制备方法与应用 |
| CN105505909A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-04-20 | 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 | 一种利用岩藻糖提高马来酸顺反异构酶酶活力的方法 |
| CN105505908A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-04-20 | 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 | 马来酸顺反异构酶突变体及其编码基因与应用 |
Non-Patent Citations (3)
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