CN106596977B - ezrin在制备哮喘诊断试剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了ezrin在制备哮喘诊断试剂中的应用，在健康人和哮喘患者的呼出气冷凝液(EBC)和血清(serum)中发现，健康人的ezrin的水平能与哮喘患者明显相区别：哮喘患者的EBC和血清中的ezrin水平显著下降，并且与肺功能呈正相关关系，与血清中IL‑13及骨膜蛋白水平成负相关关系，因此可以通过监测人体血清(serum)或者呼出气冷凝液(EBC)中ezrin的水平，从而对哮喘进行诊断、协助其治疗，并评估预后。本发明能通过更简便的方式在支气管哮喘疾病的预测、诊断和评估方面起到指导作用，并能更敏感地反映哮喘患者的气道屏障功能改变情况。基于此生物标记物的功能，有望制备更可靠更敏感的试剂盒，直接反映哮喘控制情况，并指导其治疗和评估预后。

Description

ezrin在制备哮喘诊断试剂中的应用
技术领域
本发明属于检测试剂领域，特别涉及一种蛋白质在制备哮喘诊断试剂中的应用。
背景技术
支气管哮喘(bronchial asthma)简称哮喘，是指由多种细胞(如嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)和细胞成分共同参与的气道慢性炎症性疾病。哮喘是全球最常见的慢性疾病之一，它可广泛影响各个年龄层次，各个国家的哮喘患病率从1％～18％不等，我国约为0.5％～5％，且呈现逐年上升趋势，现已成为全球健康管理的一个重担。哮喘的死亡率为1.6～36.7/10万，多因为哮喘长期控制不佳、急性发作时治疗不及时造成，而这些大多都是可预防可控制的。哮喘的诊断一直以来都是依靠临床表现和肺功能检查结果(并不含有其它生物标记物)，这其中，肺功能检查结果向来是诊断哮喘和评估哮喘的重要依据。
在诊断哮喘的过程中，肺功能检查主要包括通气功能检测、支气管激发试验(BPT)、支气管舒张试验(BDT)、昼夜呼气峰流速值(PEF)变异率等。哮喘发作时呈阻塞性通气功能障碍表现，用力肺活量(FVC)正常或下降，1秒钟用力呼气容积(FEV1)、1秒率以及最高呼气流量(PEF)均下降，其中以FEV1/FVC％<70％或FEV1低于正常预计值的80％作为判断气流受限的最重要指标。哮喘缓解期，所述的通气功能指标均可逐渐恢复。而病情迁延、反复发作的哮喘患者，其通气功能便会逐渐下降。
虽然上述肺功能检查已经长期应用于哮喘患者的诊断，但是发现更新型、更敏感、更具有特异性的代谢生物标记物尤为重要，这些生物标记物有能力在较早阶段预测或指导哮喘治疗，使其能防止或至少减缓最终引起哮喘急性发作的进展并控制相关的并发症，如气胸、纵膈气肿、肺不张、慢阻肺、支气管扩张、肺源性心脏病的形成等。且哮喘的病程较长，治疗时间更为长久，治疗不佳的情形下稍有外界环境刺激，即有可能引起哮喘急性发作，诱发严重后果。故一个新的生物标记物对于哮喘的病情的评估和治疗指南有着十分重要的作用。
目前已经明确，支气管上皮是抵御外界环境有害刺激的第一道屏障，上皮细胞间紧密连接对于细胞通透性、细胞极性、信号传导以及宿主防御等上皮细胞屏障功能有重要作用。Ezrin是膜连接蛋白(ezrin/radixin/moesin，ERM)家族的一员，现已被确认为是膜蛋白和肌动蛋白细胞骨架间的连接分子，存在于富含肌动蛋白的表面结构。它参与了细胞极性、形态维持、黏附、浸润、迁徙以及信号传导等过程，对调节细胞生命活动如细胞生长、凋亡、运动等起重要作用。Ezrin在炎症疾病、肠道癌症中已被深入研究，并证实其与炎症、肠癌确实存在一定关系。目前临床上以血浆生物标记物单一或联合使用作为疾病诊断手段的研究较多，而对于哮喘这类气道疾病的血浆标记物则缺乏***深入的探究。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种可在制备哮喘诊断试剂中应用的蛋白质。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：ezrin在制备哮喘诊断试剂中的应用。
本发明的有益效果：收集了哮喘患者和相对应的健康人的血清(serum)和呼出气冷凝液(EBC)，用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测其中ezrin的含量，再分析其与肺功能、疾病控制水平的相关性。结果表明，ezrin与哮喘的发生发展密切相关。在健康人和哮喘患者的呼出气冷凝液和血清中发现，健康人的ezrin的水平能与哮喘患者明显相区别：ezrin在哮喘患者EBC和血清中的表达量较健康受试者分别下降了26.46％和40％。控制水平好的哮喘患者EBC和血清中ezrin表达量分别是控制水平差者的1.92和3.77倍。当哮喘患者EBC中Ezrin表达量小于0.1668ng/mL(敏感度95％，特异度87.5％)，或者血清中ezrin水平低于0.2464ng/mL(敏感度70.27％，特异度94.74％)，提示哮喘控制水平不佳，建议咨询专科医生是否需要升级治疗。本研究还发现，ezrin与肺功能(FEV1、FEV1％、FVC、FVC％、FEV1/FVC、PEF、PEF％)呈正相关关系，与血清中IL-13及骨膜蛋白水平成负相关关系，因此可以通过监测人体血清或EBC中ezrin的水平，协助哮喘的诊断和治疗，并评估其预后。本发明能以更为简便的方式诊断和评估支气管哮喘疾病，并能更敏感地反映哮喘中的气道屏障功能改变。基于此生物标记物的功能，有望制备更可靠更敏感的试剂盒，直接反映哮喘控制情况，并指导其治疗和预测预后。
附图说明
图1是采集所得的呼出气冷凝液(EBC)和血浆(serum)中ezrin蛋白的表达情况图。
图2是从哮喘控制情况不同的患者中采集所得的呼出气冷凝液(EBC)和血浆(serum)中ezrin蛋白的表达情况图。
图3是哮喘患者EBC中ezrin表达水平与肺功能(FEV1、FEV1％pred、FEV1/FVC％)呈正相关关系图。
图4是哮喘患者血清(serum)中ezrin表达水平与肺功能(FEV1、FEV1％pred、FEV1/FVC％)呈正相关关系图。
图5是敲降了ezrin的人支气管上皮细胞(16-HBE)在电子显微镜下的形态学改变、屏障功能改变照片，紧密连接蛋白occludin1、ZO-1表达下降图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的说明。
健康人与哮喘患者血清收集：
收集经肺功能检测证实为哮喘的患者61例，其中男性25例，女性36例，根据2015年GINA的ACT评分表(哮喘控制测试表)将哮喘患者分为完全控制、部分控制、未控制三大类；对照组23例，均为健康成年人。采集哮喘患者及健康人静脉血，血样收集后立即于3000rpm离心10分钟，分离血清，将分离出的血清样品置于已标记好的试管中，在超低温冰箱中低于-80℃冷冻保存。收集哮喘患者以及健康人呼出气冷凝液(EBC)15min，测量其量，并置于-80℃冷冻冰箱保存。
EBC中ezrin的检测方法：
对于所取得的EBC进行解冻，并用武汉华美提供的ezrin ELISA试剂盒进行酶联免疫吸附测定，检测其中的ezrin表达水平。
血清(serum)中ezrin的检测方法：
对于所取得的血清进行解冻，并用武汉华美提供的ezrin ELISA试剂盒进行酶联免疫吸附测定，检测其中的ezrin表达水平。
对所得结果进行数理统计：
表1是所进行样本采集的对象资料，包括其数量、性别、年龄、BMI、FEV1、FEV1％。
表1受试者基本特征
健康对照组 哮喘组 P值
受试人数 23 61
性别(男/女) 10/23 25/61
年龄 50.88±1.151 49.35±1.098 0.6549
体重指数(kg/m2) 24.56±0.851 24.11±0.582 0.6886
FEV1 2.378±0.063 1.908±0.123 0.0354*
FEV1％ 96.25±2.390 72.45±3.469 0.0002***
FEV1：第一秒用力呼气容积；FEV1％：第一秒用力呼气容积/用力肺活量；*P<0.05and***p<0.001
图2是从哮喘控制水平不同的患者中采集所得的呼出气冷凝液(EBC)和血浆(serum)中ezrin蛋白的表达情况。其结果表明不同控制情况的哮喘患者EBC和serum中ezrin的表达水平明显与其控制情况存在一定关系，控制越差的患者，其EBC和serum中ezrin表达水平越低。
图3是哮喘患者EBC中ezrin表达水平与肺功能(FEV1、FEV1％pred、FEV1/FVC％)呈正相关关系，提示ezrin可作为与肺功能相同作用的哮喘诊断和评估标志物。
图4是哮喘患者血清(serum)中ezrin表达水平与肺功能(FEV1、FEV1％pred、FEV1/FVC％)呈正相关关系，提示ezrin在气道慢性炎症疾病如哮喘中确实存在，且其与肺功能的正相关关系有望能替代肺功能在诊断和评估哮喘控制情况中的地位。
随后在人支气管上皮细胞(16-HBE)中发现了更深一步的规律：敲降了ezrin的16-HBE细胞形态呈圆形，细胞间连接疏松、空泡及伪足形成，紧密连接蛋白ZO-1、occludin表达下降，炎症因子嗜酸粒细胞趋化因子(CCL11、CCL26)、MCP-1及IL-33表达增加。图5是敲降了ezrin的人支气管上皮细胞(16-HBE)在电子显微镜下的形态学改变、屏障功能改变：气道上皮细胞变成圆形、细胞间连接疏松、空泡及伪足形成；紧密连接蛋白occludin1、ZO-1表达下降。
进一步证实了ezrin与哮喘这类支气管炎症疾病之间确实存在一定的关系，敲降了ezrin蛋白后的支气管上皮细胞炎症反应更加剧烈，气道屏障防御功能下降更为显著。
同时，在小鼠哮喘模型中也发现了相似的规律。用卵白蛋白(OVA)致敏与激发小鼠，从而建立哮喘模型。再进一步用ELISA法检测小鼠肺泡灌洗液(BALF)中Ezrin和炎症因子的表达量，并且使用免疫组化检测小鼠肺组织内Ezrin的组织分布，深入探究了ezrin与哮喘的关系。结果更证实了ezrin在气道慢性炎症疾病如哮喘中表达确有特异性，其与气道相关炎症因子呈现负相关关系。
数据证实ezrin在哮喘患者中表达显著降低，且与哮喘控制水平有相关性。并用SPSS将ezrin表达水平和肺功能检测结果进行分析，证实ezrin表达水平与肺功能(FEV1、FEV1％、FEV1/FVC％)呈现正相关关系。

Claims (1)

1.检测ezrin表达水平的试剂在制备哮喘诊断试剂中的应用，其特征在于采用步骤1或2：
(1)将所取得的EBC用武汉华美提供的ezrin ELISA试剂盒进行酶联免疫吸附测定，检测其中的ezrin表达水平；
(2)将分离的血清用武汉华美提供的ezrin ELISA试剂盒进行酶联免疫吸附测定，检测其中的ezrin表达水平。
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