CN106591451A - 测定胎儿游离dna含量的方法及其用于实施该方法的装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过高通量测序技术进行无创产前基因检测的领域。具体地，本发明涉及母体外周血中胎儿游离DNA含量的测定方法。

Description

测定胎儿游离DNA含量的方法及其用于实施该方法的装置
技术领域
本发明涉及通过高通量测序技术进行无创产前基因检测的领域。具体地，本发明涉及母体外周血中胎儿游离DNA含量的测定方法。
背景技术
目前的无创产前基因检测通过采集母体外周血，提取其中的血浆游离DNA，并采用新一代高通量测序技术，结合生物信息分析，最终评估胎儿患染色体非整倍体(21-三体又称唐氏综合征，18-三体，13-三体)的风险。该方法最佳检测时间为孕周大于12周，具有无创取样、无流产风险、高灵敏度，准确性高的特点，目前被广泛应用于产前临床检测中。
胎儿游离DNA的存在于1997年被首次证实。Lo等人通过PCR法扩增母体外周血浆中的Y染色体特异DNA片段，从而在怀有男胎的母体血浆中检测到胎儿游离DNA(cell-freefetal DNA，cffDNA)(参见Lo,Y.M.等,Presence of fetal DNA in maternal plasma andserum.Lancet,1997.350(9076):p.485-7)。此后多篇报告母体血循环中既有完整胎儿细胞，又有自由循环的细胞游离核酸，使得利用cffDNA来无创性产前评价胎儿遗传特性成为可能。
进一步的研究发现，胎儿游离DNA在母体外周血浆中以小片段存在，平均仅为166bp。血浆中的游离DNA含量很低，一般每毫升血浆中的游离DNA含量仅为纳克级，而其中来自胎儿的游离DNA含量更低，仅占全部游离DNA的3％-6％(该比例随着孕周增加而缓慢上升)。此外，胎儿游离DNA的半衰期非常短，为16分钟左右，在正常分娩后2小时的母体外周血中已经检测不到。胎儿游离DNA的这种快速降解的特性使其可以作为无创产前检测的最优材料。
2008年，Chiu等人第一次***性证明了使用母体外周血浆cffDNA可以实现无创产前非整倍体检测(参见Chiu,R.W.等,Noninvasive prenatal diagnosis of fetalchromosomal aneuploidy by massively paralel genomic sequencingof DNA inmaternal plasma.Proc Natl Acad Sci U S A,2008.105(51):p.20458-63)。其理论依据如下：以出生缺陷中最常见的唐氏综合征(T21)为例，正常胎儿和正常母亲的21号染色体均为2条，患有唐氏综合征的胎儿其21号染色体为3条。假定母亲外周血中胎儿游离DNA的含量为20％，母体自身游离DNA占80％，为了方便说明，假定共有10份DNA拷贝。怀有正常胎儿的母体外周血浆的21号染色体游离DNA就是10份，2份来源于胎儿，8份来源于母亲。对于怀有唐氏综合征胎儿的母体来说，则不难算出其外周血浆的21号染色体游离DNA有11份，3份来源于胎儿，8份来源于母亲。怀有唐氏综合征胎儿和正常胎儿的母体外周血浆中21号染色体游离DNA比例就是11：10。同样，对于胎儿游离DNA的含量为5％的情况而言，怀有唐氏综合征胎儿和正常胎儿的母体外周血浆中21号染色体游离DNA比例就是10.25：10。因此，无需分离胎儿来源的游离DNA，总体上怀有唐氏综合征胎儿的母体外周血浆中21号染色体游离DNA的总含量将微微升高。理论上通过区分这一微小的差异，便可以实现利用cffDNA来进行胎儿染色体疾病产前检测。
可以看出，胎儿游离DNA的含量直接影响待检测染色体的比例，从而最终影响无创产前检测的准确度。因此，胎儿游离DNA含量是检测准确度的重要影响因素。在游离DNA含量较低的情况下，检测结果可能出现假阴性或假阳性。2014年，Hudecova等报道了对于怀有男胎的母体，可以通过比对到Y染色体序列数占比对到常染色体序列数的百分比chrY％轻易计算出胎儿游离DNA含量cff％(因为男胎含有Y染色体，而母体基因组不含Y染色体)(Hudecova,I.,et al.,Maternal plasma fetal DNA fractions in pregnancies withlow and high risks for fetal chromosomal aneuploidies.PLoS One,2014.9(2):p.e88484)。然而，该方法对于女胎样本却并不适用。
2014年，Yu等人发现由于胎儿游离DNA片段长度通常短于母体来源血浆游离DNA片段，通过高通量双端测序计算得到血浆游离DNA片段分布，从而证实短片段(100-150bp)与长片段(163-169bp)的比值与胎儿游离DNA含量存在线性相关性(Yu,S.C.等,Size-basedmolecular diagnostics usingplasma DNA for noninvasive prenatal testing.ProcNatl Acad Sci U S A,2014,111(23):8538-8588)。这为胎儿游离DNA含量的检测提供了新的思路，即可以通过血浆游离DNA片段长度的分布来进行估算。该方法也被证明可以应用于临床，并且不依赖于胎儿的性别。
然而，目前无创产前检测普便使用的是单端测序的方法。如上所述，Yu等人的方法是基于双端测序的结果，而双端测序的成本和时间均高于单端测序，其分析所需要的服务器硬件支持也相应地增加。因此，需要一种基于单端测序结果来计算胎儿游离DNA的方法，从而降低无创产前检测的成本和时间。
发明内容
胎儿游离DNA含量是衡量无创产前检测结果准确度的一个重要指标。基于目前无创产前检测普遍使用的单端测序方法，本发明人提出了一种通过高通量单端测序来有效检测胎儿DNA含量的方法，可以和传统无创产前检测单端测序配合使用，而无需额外的实验步骤。
本发明基于以下事实：高通量单端测序的方法有一定几率同时测到来自同一DNA片段的双链DNA的两端序列，从而可以根据单端测序数据计算DNA片段长度。具体地，按标准上机测序流程，通过单端测序测到同一片段两端的事例几率计算如下：
(1)以Illumina NextSeq为例，测序一张Illumina NextSeq高通量Flowcell至少需要1.3mL浓度为2.5pmol/L的DNA溶液，其中分子个数约为1.3×10-3×2.5×10-12×6×1023＝2.0×109。
(2)假设测序结果不少于400M条序列，则每条DNA分子被测序到的几率约为400×106/2.0×109＝0.2。因此，双链分子同时被测序到的几率约为0.2×0.2＝0.04。
(3)按平均每个样本约4M个序列的测序量计算，测到双链分子的计数可达到4×106×0.04＝1.6×105，即16万个事例。
根据上述理论计算，可以从单端测序数据中得到足够显著的两端序列数据(参见实施例1和图1)，从而根据两端序列在基因组的位置计算出血浆DNA片段长度分布，进一步有效计算胎儿游离DNA含量。
因此，本发明提供一种测定母体外周血中胎儿游离DNA含量的方法，包括以下步骤：
(1)对母体外周血的血浆DNA进行高通量单端测序，获得测序序列；母体
(2)将所述测序序列与人类参考基因组进行比对，以确定每条测序序列在染色体上的编号及在染色体上的位置；和
(3)根据测序序列在染色体上的位置关系计算得到血浆DNA片段的长度分布，并根据血浆DNA片段的长度分布与胎儿游离DNA含量的关系计算胎儿游离DNA的含量。
根据本发明的一个实施方案，所述步骤(1)包括：提取母体外周血的血浆DNA，构建测序文库，并对所述测序文库进行高通量单端测序，获得测序序列。
根据本发明的一个实施方案，高通量单端测序的读长短于血浆游离DNA长度，优选短于166bp，更优选为30-50bp。
根据本发明的一个实施方案，所述测序文库的构建不包含PCR扩增步骤(即PCR-free方案)。这意味着最终用于测序的文库能够保持样本DNA的原始状态，没有引入任何由PCR造成的DNA序列改变(例如突变等)，并且不会稀释有效数据。因此，“不包括PCR扩增步骤”的测序文库构建能够有效确保测序数据的准确度，同时缩短构建文库的时间，节约成本。
根据本发明的一个实施方案，每个样本的测序序列数不小于4M。
根据本发明的一个实施方案，测序芯片序列数与上机DNA分子数比例不小于0.1％。该比例对应的是能够被测到的分子数与总共上机的分子数的比例。如果该比例小于0.1％，则意味着双端事例发生的概率较小，从而导致不能从单端测序的结果中提取足够的双端事例来计算DNA长度。
根据本发明的一个实施方案，血浆DNA片段的长度分布与胎儿DNA含量的关系是通过用男胎血浆DNA片段的长度分布和胎儿游离DNA含量做线性拟合获得。如上所述，男胎样本中胎儿游离DNA含量可以通过比对到常染色体序列数的百分比chrY％轻易计算。
根据本发明的一个实施方案，其中所述血浆DNA片段的长度分布是指长度为100-150bp的片段与长度为163-169bp的片段的比例。
在另一个方面，本发明提供用于测定母体外周血中胎儿游离DNA含量的装置，包括：
–检测模块，用于对母体外周血的血浆DNA进行高通量单端测序，获得测序序列；
–比对模块，用于将所述测序序列与人类参考基因组进行比对，以确定每条测序序列在染色体上的编号及其在染色体上的位置；
–计算模块，用于根据测序序列在染色体上的位置关系计算得到血浆DNA片段的长度分布，并根据血浆DNA片段的长度分布与胎儿游离DNA含量的关系计算胎儿游离DNA的含量；和
-输出模块，用于输出所述胎儿游离DNA的含量。
根据本发明的一个实施方案，检测模块包括本领域已知的任何可以进行高通量单端测序的平台，例如Illumina的cBot仪器和Illumina的Genome Analyzer或NextSeq CN500测序仪或ABI公司的SOLiD系列的测序仪。比对模块包括本领域技术人员已知的各种比对软件，包括但不限于Bowtie、Bowtie2、BWA、Subread等。
本领域的技术人员理解，上述的本发明的一些模块或一些步骤可以用通用的计算装置来实现，它们可以集中在单个的计算装置上，或者分布在多个计算装置所组成的网络上，可选地，它们可以用计算装置可执行的程序代码来实现，从而，可以将它们存储在存储装置中由计算装置来执行，或者将它们分别制作成各个集成电路模块，或者将它们中的多个模块或步骤制作成单个集成电路模块来实现。这样，本发明不限制于任何特定的硬件和软件结合。
因此，在通过高通量单端测序获得产前诊断结果的同时，还可以根据本发明的方法计算胎儿游离DNA含量，从而评估产前诊断结果的准确性。换言之，除高通量测序之外，本发明的方法不需要额外的实验操作便能够为产前诊断结果的有效性提供一个重要的衡量指标。
附图说明
图1.针对同一样品的胎儿游离DNA片段的长度分布图。PE：基于双端测序结果的长度分布。SE：基于单端数据计算结果的长度分布。
图2.单端测序数据片段长度分布与胎儿游离DNA含量的拟合关系图。
图3.根据本发明方法和用Y染色体比对方法(ChrY)计算的胎儿游离DNA含量cff％的比较。
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1：双端测序结果与基于单端测序数据计算的结果的比较
该实施例对母体血浆DNA进行双端测序，根据测序结果对胎儿游离DNA片段的长度分布进行统计并做图。同时，从双端测序结果中提取单端数据，基于该单端数据进行计算，并根据计算结果对胎儿游离DNA片段的长度分布进行统计并做图。以下示出对母体血浆DNA进行测序并对测序结果进行分析的一个具体实施例。
步骤1：提取约5ng血浆DNA。
步骤2：末端补平和末端悬A。制备如表1所示的反应混合液，在37℃温浴20分钟(末端补平)，然后72℃温浴20分钟(末端悬A)。此时不进行纯化步骤。
表1：
步骤3：接头连接。向上述反应溶液中加入额外的反应试剂，制备如表2所示的反应混合液，在20℃温浴15分钟，65℃温浴10分钟，保持在4℃。用Beckman Ampure XP beads回收连接后的血浆DNA样本，并用22μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液洗脱，得到测序文库。其中DNA接头包括第一端测序接头和第二端测序接头，且第一端测序接头和第二端测序接头带有不同标记。
表2：
步骤4：文库定量及混合。取1μl文库qPCR定量，文库浓度大于等于20pM为质控合格。根据通道安排，将同一通道内不同接头的96个样品文库等量混合；再次取1μl混合样品qPCR定量。
步骤5：上机测序。根据qPCR定量结果将文库稀释到浓度2.5pmol/L，取1.3mL按照NextSeq CN500操作说明上机，进行36bp双端测序。
步骤6：分析双端测序结果。将双端测序结果与人类基因组参考序列进行比对，根据同一DNA片段的双端测序序列比对位置相减，计算DNA片段长度，统计得到测序DNA片段长度的分布情况(参见图1，PE)。此处排除比对到性染色体、线粒体等的序列。
步骤7：使用单端数据计算DNA片段长度的分布情况。根据标记不同，从双端测序结果中提取来自第一端测序的数据(使用来自第二端测序的数据结果与此类似)，将其与人类基因组参考序列进行比对，记录每条测序序列在染色体上的编号及在染色体上的位置。挑选比对到同一染色体上且比对位置距离较近(考虑到胎儿游离DNA的长度一般不超过200bp且大量集中在167bp左右，此处选择的比对位置距离为200bp或以内)两条序列，计算“DNA片段”长度。此处排除比对到性染色体、线粒体等的序列。用F(Foward)标记36bp序列比对方向为正向，R(Reverse)标记比对方向为反向。两条序列比对位置接近的事例可能是来源同一DNA片段(即“双端”信号事例)，也可能是不相关的两个DNA片段分布位置接近的偶然事件(即“本底事例”)。如果信号事例来自同一DNA片段两端，序列比对方向应该相反并且指向朝内(记作FR)。换言之，定位到同一参考序列上的比对起始位置在前的36bp序列为正向比对，比对位置在后的36bp序列为反向比对。然而，DNA片段随机分布的本底事例对序列方向并无偏好。因而可以假设两条序列在各种比对方向的4种组合(FR、RF、FF、RR)中，本底事例的分布是平均的。根据上述分析，通过两条36bp序列的比对方向将事例划分为四类，其中FR同时包含信号和本底，RF、FF、RR都只含有本底，并且FR、RF、FF、RR每类的本底水平是一样的。所以可以统计RF、FF、RR三者的平均事例数，以此估计FR的本底事例数，再从FR的总事例中减去本底事例数，即可得到“双端”信号事例。然后分析该“双端”信号事例，即可得到片段长度的分布(参见图1，SE)。
如图1所示，基于该样本的双端测序结果直接得到的片段长度分布与基于单端数据计算得到的片段长度分别在总体趋势上符合较好，尽管单端数据因统计量明显低于双端数据而导致统计涨落较大。该结果表明，本发明中基于单端数据的分析能够很好地反应母体血浆DNA片段的实际分布情况。
实施例2：基于单端测序结果计算胎儿游离DNA含量与血浆DNA片段分布的关系
挑选男胎样本作为训练集，通过比对到Y染色体的方法(chrY)计算得到胎儿游离DNA含量cff％。由于根据Y染色体比对计算胎儿游离DNA含量的方法的精度与测序数据量正相关，因此为确保训练集胎儿游离DNA含量计算的准确性，应尽量选择数据量足够的样本。本实施例选择测序量6M reads以上的样本共计130个。具体操作步骤如下：
1：根据实施例1中步骤1-步骤5所述制备测序文库并进行高通量测序，区别仅在于本实施例使用36bp单端测序。
2：根据实施例1中步骤6和7所述，计算母体血浆DNA片段的长度分布。
3：基于步骤2的结果，根据以下公式计算大小比例(size ratio,SR)：
SR＝P(100-150)/P(163-169)，其中P(100-150)是指长度为100-150bp的片段的百分比，P(163-169)是指长度为163-169bp的片段的百分比。
步骤4：根据训练集每个样本的片段分布结果与胎儿游离DNA含量，用最小二乘法一次线性函数拟合，即SR＝a+b*cff％，其中a是截距，b是斜率。
拟合结果如图2所示，其中拟合参数截距0.7890，斜率0.0328，相关系数R＝0.768。
步骤5：根据以上拟合得到的参数可用于计算胚胎DNA含量，即：cff％＝(SR-a)/b。
实施例3：测量女胎样本中的胎儿游离DNA含量
本实施例根据实施例2中拟合的参数来计算40个女胎样本中的胎儿游离DNA含量。
1：根据实施例1中步骤1-步骤5所述制备测序文库并进行高通量测序，区别仅在于本实施例使用36bp单端测序。
2：根据实施例1中步骤6和7所述，计算母体血浆DNA片段的长度分布。
3：基于步骤2的结果，根据以下公式计算SR。
SR＝P(100-150)/P(163-169)
步骤4：根据实施例2中拟合得到的a、b参数，计算胎儿游离DNA含量：cff％＝(SR-a)/b。
各样本的胎儿游离DNA含量cff％计算结果如下表1所示。
表1：
实施例4：测量男胎样本中的胎儿游离DNA含量
本实施例根据实施例2中拟合的参数来计算20个男胎样本中的胎儿游离DNA含量。
1：根据实施例1中步骤1-步骤5所述制备测序文库并进行高通量测序，区别仅在于本实施例使用36bp单端测序。
2：根据实施例1中步骤6和7所述，计算母体血浆DNA片段的长度分布。
3：基于步骤2的结果，根据以下公式计算SR’。
SR’＝P(100-150)/P(163-169)
步骤4：根据实施例2中拟合得到的a、b参数，计算胎儿游离DNA含量：cff％＝(SR’-a)/b。
下表2示出了分布根据本发明方法和用Y染色体比对方法(ChrY)计算的各样本的胎儿游离DNA含量cff％。
表2：
将表2中根据本发明方法和用Y染色体比对方法(ChrY)计算的各样本的胎儿游离DNA含量cff％作图(参见图3)。从图3可以看出，用本发明方法计算的胎儿游离DNA含量与用Y染色体比对方法(ChrY)计算的胎儿游离DNA含量总体上非常一致，表明本发明的计算方法准确性较高。
需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。血浆DNA测序文库构建中所涉及的反应试剂、反应条件等等可以根据具体的需要进行相应的调整和改变。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种测定母体外周血中胎儿游离DNA含量的方法，包括以下步骤：
(1)对母体外周血的血浆DNA进行高通量单端测序，获得测序序列；
(2)将所述测序序列与人类参考基因组进行比对，以确定每条测序序列在染色体上的编号及在染色体上的位置；和
(3)根据每条测序序列在染色体上的位置关系计算得到血浆DNA片段的长度分布，并根据血浆DNA片段的长度分布与胎儿游离DNA含量的关系计算胎儿游离DNA的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(1)包括：提取母体外周血的血浆DNA，构建测序文库，并对所述测序文库进行高通量单端测序，获得测序序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，高通量单端测序的读长短于血浆游离DNA长度，优选短于166bp，更优选为30-50bp。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述测序文库的构建采用PCR-free方案。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序序列数不小于4M。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，测序芯片序列数与上机DNA分子数的比例不小于0.1％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血浆DNA片段的长度分布与胎儿DNA含量的关系通过用男胎血浆DNA片段的长度分布和胎儿游离DNA含量做线性拟合获得。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述血浆DNA片段的长度分布是指长度为100-150bp的片段与长度为163-169bp的片段的比例。
9.一种用于测定母体外周血中胎儿游离DNA含量的装置，包括：
–检测模块，用于对母体外周血的血浆DNA进行高通量单端测序，获得测序序列；
–比对模块，用于将所述测序序列与人类参考基因组进行比对，以确定每条测序序列在染色体上的编号及其在染色体上的位置；
–计算模块，用于根据测序序列在染色体上的位置关系计算得到血浆DNA片段的长度分布，并根据血浆DNA片段的长度分布与胎儿游离DNA含量的关系计算胎儿游离DNA的含量；和
-输出模块，用于输出所述胎儿游离DNA的含量。
10.根据权利要求9所述的装置，其中所述高通量单端测序包括：用母体外周血的血浆DNA构建测序文库，并对所述测序文库进行高通量单端测序，获得测序序列。
11.根据权利要求9所述的装置，其中所述高通量单端测序的读长短于血浆游离DNA长度，优选短于166bp，更优选为30-50bp。
12.根据权利要求10所述的装置，其特征在于，所述测序文库的构建采用PCR-free方案。
13.根据权利要求9所述的装置，其特征在于，所述测序序列数不小于4M。
14.根据权利要求9所述的装置，其特征在于，测序芯片序列数与上机DNA分子数的比例不小于0.1％。
15.根据权利要求9所述的装置，其特征在于，所述血浆DNA片段的长度分布与胎儿DNA含量的关系通过用男胎血浆DNA片段的长度分布和胎儿游离DNA含量做线性拟合获得。
16.根据权利要求9所述的装置，其中所述血浆DNA片段的长度分布是指长度为100-150bp的片段与长度为163-169bp的片段的比例。
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