CN106591367B - 一种在体内获得并纯化大量目的LncRNA的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在体内获得并纯化大量目的LncRNA的方法。本发明在LncRNA基因序列3’末端设计PPR蛋白特异性识别碱基，将PPR蛋白和LncRNA过表达质粒共转染细胞，使PPR和LncRNA在细胞内大量表达，然后通过Anti‑Flag抗体富集PPR蛋白，进而间接富集LncRNA，实现了在体内成功获得并纯化大量目的LncRNA。本发明可明显简化现有技术中体外转录获得目的LncRNA的步骤，且经济简便，可行性强，便于LncRNA相关实验的研究，在LncRNA的作用机制研究领域提供了崭新的思路。

Description

一种在体内获得并纯化大量目的LncRNA的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种在体内获得并纯化大量目的LncRNA的方法。

背景技术

目前，长链非编码RNA(LncRNA)的研究十分广泛。已证明LncRNA在肿瘤的发生发展中起到关键作用，并且具有组织特异性和时空特异性。在研究LncRNA的功能机制时，多数研究人员需要在体外获得大量的LncRNA，然后通过体外实验证明LncRNA和核酸以及蛋白之间的相互作用，从而研究其在细胞和组织中的功能特点。通过相应的DNA模板、RNA转录酶、NTP以及其他相应的反应条件，在体外大量获得LncRNA的方法，称为“体外转录法”。通过体外转录法获得LncRNA的方法是目前主流的获得LncRNA的方法，但是该方法有其缺陷：一、体外获得的LncRNA对实验条件研究严格：在体外通过转录获得LncRNA，转录常常不完整，且由于体外难以做到彻底清除RNA酶，转录出的LncRNA如果长度较长，常常会边转录边降解，从而影响后续的实验；二、体外转录的实验成本较大：体外转录的相关试剂常常价格昂贵；三、体外转录后续实验难度大：体外转录获得的LncRNA，后续研究的实验一般也在体外完成，如研究LncRNA和蛋白相关作用，需要将蛋白裂解后再与LncRNA相互作用，通过质谱检测或者WB明确相互作用的蛋白，实验的条件要求严格，费用高。四、由于在LncRNA体外转录相关的后续研究也在体外完成，获得的LncRNA由于未在细胞中进行自然加工与合成，无法很好的还原真实的细胞内环境，往往会导致大量的假阳性结果。

综上所述，亟需一种经济简便，可行性强的获得并纯化大量目的LncRNA的方法。

PPR(pentatricopeptide repeat)蛋白对单链RNA具有序列特异性识别模式，具体模式为：PPR蛋白由数目不等的重复单元串联而成，每个经典PPR重复单元含有35个氨基酸，可以特异性地识别一个RNA碱基，并且第5位和第35位氨基酸在RNA特异识别过程中发挥着重要作用，被称为密码氨基酸。

目前关于应用PPR蛋白在体内高效富集目的LncRNA的方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种在体内获得大量目的LncRNA的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种在体内获得并纯化大量目的LncRNA的方法，包括以下步骤：

a)将带有标签蛋白的PPR蛋白的过表达载体与LncRNA过表达载体共转染工具细胞，所述的LncRNA过表达载体的LncRNA基因序列下游带有PPR蛋白的特异性识别碱基序列；

b)培养工具细胞；

c)裂解工具细胞，富集和纯化PPR蛋白，进而间接地富集和纯化得到LncRNA。

所述的PPR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的PPR蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的PPR蛋白过表达载体的构建方法为：将PPR蛋白的基因序列***到pcDNA3.1载体的HindIII和EcoRI位点之间，并于PPR蛋白的基因序列上游***标签蛋白的编码序列。

所述的PPR蛋白的特异性识别碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的LncRNA过表达载体选自下列中的一种：

a)pcDNA3.1-H19：将SEQ ID NO.4所示的H19的基因序列***到pcDNA3.1载体的HindIII和EcoRI位点之间；

b)pcDNA3.1-HOTAIR：将SEQ ID NO.5所示的HOTAIR的基因序列***到pcDNA3.1载体的HindIII和EcoRI位点之间；

c)pcDNA3.1-BANCR：将SEQ ID NO.6所示的BANCR的基因序列***到pcDNA3.1载体的HindIII和EcoRI位点之间。

所述的工具细胞是HEK-293T细胞。

所述的标签蛋白是Flag标签。

步骤c)是通过标签蛋白的抗体富集PPR蛋白。

步骤c)中的每个具体操作均使用RNA酶抑制剂。

本发明优点在于：

1、本发明成功设计了于体内获得并纯化大量目的LncRNA的方法。通过在LncRNA基因序列3’末端设计PPR蛋白特异性识别碱基，将PPR蛋白和LncRNA共转染细胞，使PPR和LncRNA在细胞内大量表达。然后通过Anti-Flag抗体富集PPR蛋白，由于PPR蛋白可以特异性识别LncRNA，通过该方法可以间接富集LncRNA，从而实现了在体内成功获得并纯化大量目的LncRNA。本发明可以明显简化体外转录获得目的LncRNA的步骤，且经济简便，可行性强，可以很大程度上简化LncRNA相关实验的研究方法，在LncRNA的作用机制研究领域提供了崭新的研究思路；

2、本发明设计的PPR过表达载体可以实现PPR蛋白的高表达，进而可富集更多的LncRNA；

3、本发明设计的LncRNA的PPR蛋白特异性识别碱基序列能够被PPR蛋白高度识别和结合，保证了LncRNA的高回收率；

4、在本发明的具体实施例中，设计的LncRNA的过表达载体可实现LncRNA的高表达，进一步保证可获得大量的LncRNA。

附图说明

图1.PPR蛋白的表达情况。

图2.H19，HOTAIR，BANCR的表达情况。***P<0.01。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一、材料和方法

1.细胞系培养

该试验中使用HEK-293T工具细胞(购买于ACTT公司)，用DMEM培养基(购买于GIBCO公司)，10％胎牛血清(购买于HyClone公司)，1％双抗混合培养液，在细胞孵箱中培养(37℃，5％CO₂)。

2.qRT-RCR实验

该试验中qRT-RCR使用的试剂TransStart Green qPCRSuperMix购买于北京全式金公司，检测仪器7900HT Fast Real-Time PCR System购于Life公司。该试验中逆转录使用的试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit购买于Takara公司。该试验中的三个LncRNA分别为H19，HOTAIR和BANCR。三种LncRNA的PCR检测引物设计如下：H19：S-AGGAATCGGCTCTGGAAGG(SEQ ID NO.7)，A-GCGTAATGGAATGCTTGAAGG(SEQ ID NO.8)；HOTAIR：S-AAGAATTACAAGGAAGCGAAGG(SEQ ID NO.9)，A-TAATAGCAGGAGGAAGTTCAGG(SEQ ID NO.10)；BANCR：S-TTCTTGTAGGGTCTGGATTGG(SEQ ID NO.11)，A-TGAACTGGGAAACTGTTGAAAC(SEQ IDNO.12)。

3.质粒构建

该试验中构建了带有Flag标签的PPR蛋白(SEQ ID NO.1，26.7kilodaltons，其中LRVAPT和ELTYRRVVEY均对三角状五肽结构起到保护作用)的过表达质粒(pcDNA3.1-PPR，于北京金唯智公司构建)。H19，HOTAIR和BANCR的过表达质粒(载体为pcDNA3.1)，并在其后设计PPR蛋白特异性识别的碱基序列(SEQ ID NO.2)。在实验室通过PCR，酶切，连接，转化，涂板筛选，经测序后验证三种LncRNA过表达质粒构建成功。

各过表达质粒具体构建方法如下：

(1)pcDNA3.1-PPR：pcDNA3.1购于北京金唯智公司，然后将PPR蛋白的基因序列(SEQ ID NO.3)***到pcDNA3.1的HindIII-EcoRI位点之间，且在PPR蛋白的基因序列上游***Flag标签的编码序列(SEQ ID NO.13)，Flag标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

(2)pcDNA3.1-H19：pcDNA3.1购于北京金唯智公司，然后将H19的基因序列(SEQ IDNO.4)***到pcDNA3.1的HindIII-EcoRI位点之间。

(3)pcDNA3.1-HOTAIR：pcDNA3.1购于北京金唯智公司，然后将HOTAIR的基因序列(SEQ ID NO.5)***到pcDNA3.1的HindIII-EcoRI位点之间。

(4)pcDNA3.1-BANCR：pcDNA3.1购于北京金唯智公司，然后将BANCR的基因序列(SEQ ID NO.6)***到pcDNA3.1的HindIII-EcoRI位点之间。

4.细胞转染

将过表达载体PPR，H19，HOTAIR和BANCR分别用DNA转染试剂(Biotool，B35101)瞬转进入HEK-293T细胞，培养48小时。实验组：PPR+H19，PPR+HOTAIR，PPR+BANCR；对照组：PPR。转染试剂(购买于Biotool公司)使用步骤和剂量按照说明书。

5.细胞裂解和抗体孵育

用1％NP40将HEK-293T细胞裂解，加入蛋白酶抑制剂(购买于Biotool公司，B14001)，磷酸酶抑制剂(Biotool公司，B15001)，并且在之后的每一步中均加入RNA酶抑制剂(上海生工公司，B54004)以防RNA的降解。使用Anti-Flag Affinity Gel(购买于Biotool公司)富集PPR蛋白，在加入蛋白上样缓冲液前，每组各留3μl沉淀液用于LncRNA的逆转录和PCR。

6.SDS-PAGE电泳和考马斯亮兰染色

将上述沉淀中加入蛋白上样缓冲液，煮沸10min，离心后取上清10μl进行SDS-PAGE电泳(80V，120min)。然后将SDS-PAGE胶进行考马斯亮兰染色以明确PPR蛋白的表达情况。

二、实验结果

1、PPR蛋白的表达情况

见图1，PPR蛋白在实验组和对照组中均有明显的高表达。该结果表明，PPR蛋白过表达载体成功转染HEK-293T细胞，并在其中大量表达。

2、LncRNA：H19，HOTAIR，BANCR表达情况

见图2，通过qRT-PCR的方法，证明了实验组中三种LncRNA的表达量明显高于对照组。该试验结果表明，在HEK-293T细胞内，过表达的PPR蛋白可以特异性识别3’端带有识别碱基的LncRNA，LncRNA被高效富集和纯化，于体外获得了大量的LncRNA。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军第二军医大学

<120> 一种在体内获得并纯化大量目的LncRNA的方法

<130> /

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 366

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Leu Arg Val Ala Pro Thr Val Val Thr Tyr Asn Thr Leu Ile Asp Gly

1 5 10 15

Leu Cys Lys Ala Gly Lys Leu Asp Glu Ala Leu Lys Leu Phe Glu Glu

20 25 30

Met Val Glu Lys Gly Ile Lys Pro Asp Val Val Thr Tyr Asn Thr Leu

35 40 45

Ile Asp Gly Leu Cys Lys Ala Gly Lys Leu Asp Glu Ala Leu Lys Leu

50 55 60

Phe Glu Glu Met Val Glu Lys Gly Ile Lys Pro Asp Val Val Thr Tyr

65 70 75 80

Asn Thr Leu Ile Asp Gly Leu Cys Lys Ala Gly Lys Leu Asp Glu Ala

85 90 95

Leu Lys Leu Phe Glu Glu Met Val Glu Lys Gly Ile Lys Pro Asp Val

100 105 110

Val Thr Tyr Asn Thr Leu Ile Asp Gly Leu Cys Lys Ala Gly Lys Leu

115 120 125

Asp Glu Ala Leu Lys Leu Phe Glu Glu Met Val Glu Lys Gly Ile Lys

130 135 140

Pro Asp Val Val Thr Tyr Ser Thr Leu Ile Asp Gly Leu Cys Lys Ala

145 150 155 160

Gly Lys Leu Asp Glu Ala Leu Lys Leu Phe Glu Glu Met Val Glu Lys

165 170 175

Gly Ile Lys Pro Asn Val Val Thr Tyr Ser Thr Leu Ile Asp Gly Leu

180 185 190

Cys Lys Ala Gly Lys Leu Asp Glu Ala Leu Lys Leu Phe Glu Glu Met

195 200 205

Val Glu Lys Gly Ile Lys Pro Asn Val Val Thr Tyr Asn Thr Leu Ile

210 215 220

Asp Gly Leu Cys Lys Ala Gly Lys Leu Asp Glu Ala Leu Lys Leu Phe

225 230 235 240

Glu Glu Met Val Glu Lys Gly Ile Lys Pro Asp Val Val Thr Tyr Asn

245 250 255

Thr Leu Ile Asp Gly Leu Cys Lys Ala Gly Lys Leu Asp Glu Ala Leu

260 265 270

Lys Leu Phe Glu Glu Met Val Glu Lys Gly Ile Lys Pro Asp Val Val

275 280 285

Thr Tyr Asn Thr Leu Ile Asp Gly Leu Cys Lys Ala Gly Lys Leu Asp

290 295 300

Glu Ala Leu Lys Leu Phe Glu Glu Met Val Glu Lys Gly Ile Lys Pro

305 310 315 320

Asp Val Val Thr Tyr Asn Thr Leu Ile Asp Gly Leu Cys Lys Ala Gly

325 330 335

Lys Leu Asp Glu Ala Leu Lys Leu Phe Glu Glu Met Val Glu Lys Gly

340 345 350

Ile Lys Pro Asp Glu Leu Thr Tyr Arg Arg Val Val Glu Tyr

355 360 365

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttttaatttt aattttaatt tt 22

<210> 3

<211> 1137

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gccgccacca tgcttagagt tgctcctact gttgttactt ataatactct tattgatggt 60

ctttgtaaag ctggtaaact tgatgaagct cttaaacttt ttgaagaaat ggttgaaaaa 120

ggtattaaac ctgatgtcgt cacctacaac accctcatcg acggcctctg caaggccggc 180

aagctcgacg aggccctcaa gctcttcgag gagatggtcg agaagggcat caagcccgac 240

gtagtaacat ataatacact aatagatgga ctatgcaaag caggaaaact agatgaagca 300

ctaaaactat tcgaagaaat ggtagaaaaa ggaataaaac ctgatgtggt gacttacaac 360

actctgattg acgggctgtg taaggctggg aagctggacg aggctctgaa gctgttcgag 420

gagatggtgg agaaggggat taagcccgac gttgttactt actctaccct tatagacggt 480

ctctgtaagg caggcaaact tgacgaggcc ctgaagctct ttgaagagat ggttgagaag 540

ggtatcaagc caaatgtagt aacatatagt actctgatcg atggtctttg caaggctggt 600

aaactggacg aagcactaaa actttttgag gaaatggttg agaagggtat caagccaaac 660

gtcgttactt ataatactct tattgatggt ctttgtaaag ctggtaaact tgatgaagct 720

cttaaacttt ttgaagaaat ggtggaaaaa ggtattaaac ctgatgttgt cacctacaac 780

acactcatcg acggcctctg caaggccggc aagctcgacg aggccctcaa gctcttcgag 840

gagatggtcg agaagggcat caagcccgac gtagtgacat ataatacact aatagatgga 900

ctatgcaaag caggaaaact agatgaagca ctaaaactat tcgaagaaat ggttgaaaaa 960

ggaataaaac ctgatgtggt aacttacaac actctgattg acgggctgtg taaggctggg 1020

aagctggacg aggctctgaa gctgttcgag gagatggtcg agaaggggat taagcccgac 1080

gaactcacat accgaagaag ggtggagtat gattacaagg acgacgacga taagtaa 1137

<210> 4

<211> 2368

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agttagaaaa agcccgggct aggaccgagg agcagggtga gggagggggt gggatgggtg 60

gggggtaacg ggggaaactg gggaagtggg gaaccgaggg gcaaccaggg gaagatgggg 120

tgctggagga gagcttgtgg gagccaagga gcaccttgga catctggagt ctggcaggag 180

tgatgacggg tggaggggct agctcgaggc agggctggtg gggcctgagg ccagtgagga 240

gtgtggagta ggcgcccagg catcgtgcag acagggcgac atcagctggg gacgatgggc 300

ctgagctagg gctggaaaga agggggagcc aggcattcat cccggtcact tttggttaca 360

ggacgtggca gctggttgga cgaggggagc tggtgggcag ggtttgatcc cagggcctgg 420

gcaacggagg tgtagctggc agcagcgggc aggtgaggac cccatctgcc gggcaggtga 480

gtcccttccc tccccaggcc tcgcttcccc agccttctga aagaaggagg tttaggggat 540

cgagggctgg cggggagaag cagacaccct cccagcagag gggcaggatg ggggcaggag 600

agttagcaaa ggtgacatct tctcgggggg agccgagact gcgcaaggct ggggggttat 660

gggcccgttc caggcagaaa gagcaagagg gcagggaggg agcacagggg tggccagcgt 720

agggtccagc acgtggggtg gtaccccagg cctgggtcag acagggacat ggcaggggac 780

acaggacaga ggggtcccca gctgccacct cacccaccgc aattcattta gtagcaggca 840

caggggcagc tccggcacgg ctttctcagg cctatgccgg agcctcgagg gctggagagc 900

gggaagacag gcagtgctcg gggagttgca gcaggacgtc accaggaggg cgaagcggcc 960

acgggagggg ggccccggga cattgcgcag caaggaggct gcaggggctc ggcctgcggg 1020

cgccggtccc acgaggcact gcggcccagg gtctggtgcg gagagggccc acagtggact 1080

tggtgacgct gtatgccctc accgctcagc ccctggggct ggcttggcag acagtacagc 1140

atccagggga gtcaagggca tggggcgaga ccagactagg cgaggcgggc ggggcggagt 1200

gaatgagctc tcaggaggga ggatggtgca ggcaggggtg aggagcgcag cgggcggcga 1260

gcgggaggca ctggcctcca gagcccgtgg ccaaggcggg cctcgcgggc ggcgacggag 1320

ccgggatcgg tgcctcagcg ttcgggctgg agacgaggcc aggtctccag ctggggtgga 1380

cgtgcccacc agctgccgaa ggccaagacg ccaggtccgg tggacgtgac aagcaggaca 1440

tgacatggtc cggtgtgacg gcgaggacag aggaggcgcg tccggccttc ctgaacacct 1500

taggctggtg gggctgcggc aagaagcggg tctgtttctt tacttcctcc acggagtcgg 1560

cacactatgg ctgccctctg ggctcccaga acccacaaca tgaaagaaat ggtgctaccc 1620

agctcaagcc tgggcctttg aatccggaca caaaaccctc tagcttggaa atgaatatgc 1680

tgcactttac aaccactgca ctacctgact caggaatcgg ctctggaagg tgaagctaga 1740

ggaaccagac ctcatcagcc caacatcaaa gacaccatcg gaacagcagc gcccgcagca 1800

cccaccccgc accggcgact ccatcttcat ggccaccccc tgcggcggac ggttgaccac 1860

cagccaccac atcatcccag agctgagctc ctccagcggg atgacgccgt ccccaccacc 1920

tccctcttct tctttttcat ccttctgtct ctttgtttct gagctttcct gtctttcctt 1980

ttttctgaga gattcaaagc ctccacgact ctgtttcccc cgtcccttct gaatttaatt 2040

tgcactaagt catttgcact ggttggagtt gtggagacgg ccttgagtct cagtacgagt 2100

gtgcgtgagt gtgagccacc ttggcaagtg cctgtgcagg gcccggccgc cctccatctg 2160

ggccgggtga ctgggcgccg gctgtgtgcc cgaggcctca ccctgccctc gcctagtctg 2220

gaagctccga ccgacatcac ggagcagcct tcaagcattc cattacgccc catctcgctc 2280

tgtgcccctc cccaccaggg cttcagcagg agccctggac tcatcatcaa taaacactgt 2340

tacagctttt aattttaatt ttaatttt 2368

<210> 5

<211> 2392

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccagttctca ggcgagagcc gcggctgaca gggtctggga cagaaggaaa gccctccagc 60

ctccaggccc tgccttctgc ctgcacattc tgccctgatt tccggaacct ggaagcctag 120

gcaggcagtg gggaactctg actcgcctgt gctctggagc ttgatccgaa agcttccaca 180

gtgaggactg ctccgtgggg gtaagagagc accaggcact gaggcctggg agttccacag 240

accaacaccc ctgctcctgg cggctcccac ccgggactta gaccctcagg tccctaatat 300

cccggaggtg ctctcaatca gaaaggtcct gctccgcttc gcagtggaat ggaacggatt 360

tagaagcctg cagtagggga gtggggagtg gagagaggga gcccagagtt acagacggcg 420

gcgagaggaa ggaggggcgt ctttattttt ttaaggcccc aaagagtctg atgtttacaa 480

gaccagaaat gccacggccg cgtcctggca gagaaaaggc tgaaatggag gaccggcgcc 540

ttccttataa gctcgttggg gcctaagcca gtaccgacct ggtagaaaaa gcaaccacga 600

agctagagag agagccagag gagggaagag agcgccagac gaaggtgaaa gcgaaccacg 660

cagagaaatg caggcaaggg agcaaggcgg cagttcccgg aacaaacgtg gcagagggca 720

agacgggcac tcacagacag aggtttatgt atttttattt tttaaaatct gatttggtgt 780

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gctcgccaca tgaacgccca gagaacgctg gaaaaacctg agcgggtgcc ggggcagcac 900

ccggctcggg tcagccactg ccccacaccg ggcccaccaa gccccgcccc tcgcggccac 960

cggggcttcc ttgctcttct tatcatctcc atctttatga tgaggcttgt taacaagacc 1020

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aggaacatag aagcaaaggt ccagcctttg cttcgtgctg attcctagac ttaagattca 1560

aaaacaaatt tttaaaagtg aaaccagccc tagcctttgg aagctcttga aggttcagca 1620

cccacccagg aatccacctg cctgttacac gcctctccaa gacacagtgg caccgctttt 1680

ctaactggca gcacagagca actctataat atgcttatat taggtctaga agaatgcatc 1740

ttgagacaca tgggtaacct aattatataa tgcttgttcc atacaggagt gattatgcag 1800

tgggaccctg ctgcaaacgg gactttgcac tctaaatata gaccccagct tgggacaaaa 1860

gttgcagtag aaaaatagac ataggagaac acttaaataa gtgatgcatg tagacacaga 1920

aggggtattt aaaagacaga aataatagaa gtacagaaga acagaaaaaa aatcagcaga 1980

tggagattac cattcccaat gcctgaactt cctcctgcta ttaagattgc tagagaattg 2040

tgtcttaaac agttcatgaa cccagaagaa tgcaatttca atgtatttag tacacacaca 2100

gtatgtatat aaacacaact cacagaatat attttccata cattgggtag gtatgcactt 2160

tgtgtatata taataatgta ttttccatgc agttttaaaa tgtagatata ttaatatctg 2220

gatgcatttt ctgtgcactg gttttatatg ccttatggag tatatactca catgtagcta 2280

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<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gattacaagg atgacgacga taag 24

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

Claims (10)

1.一种在体内获得并纯化目的LncRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)将带有标签蛋白的PPR蛋白的过表达载体与LncRNA过表达载体共转染工具细胞，所述的LncRNA过表达载体的LncRNA基因序列下游带有PPR蛋白的特异性识别碱基序列；

b)培养工具细胞；

c)裂解工具细胞，富集和纯化PPR蛋白，进而间接地富集和纯化得到LncRNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PPR蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的PPR蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的PPR蛋白过表达载体的构建方法为：将PPR蛋白的基因序列***到pcDNA3.1载体的HindIII和EcoRI位点之间，并于PPR蛋白的基因序列上游***标签蛋白的编码序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PPR蛋白的特异性识别碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的LncRNA过表达载体选自下列中的一种：

a)pcDNA3.1-H19：将SEQ ID NO.4所示的H19的基因序列***到pcDNA3.1载体的HindIII和EcoRI位点之间；

b)pcDNA3.1-HOTAIR：将SEQ ID NO.5所示的HOTAIR的基因序列***到pcDNA3.1载体的HindIII和EcoRI位点之间；

c)pcDNA3.1-BANCR：将SEQ ID NO.6所示的BANCR的基因序列***到pcDNA3.1载体的HindIII和EcoRI位点之间。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的工具细胞是HEK-293T细胞。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的标签蛋白是Flag标签。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤c)是通过标签蛋白的抗体富集PPR蛋白。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c)中的每个具体操作均使用RNA酶抑制剂。