CN106591364B - 一种获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用单一Cas9切口酶介导NRAMP1定点***获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，本发明通过电穿孔的方法将供体载体和针对打靶位点的单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，供体载体中NRAMP1基因自身启动子可以使NRAMP1实现在专职吞噬性细胞中的特异性表达，嘌呤霉素药物筛选后，经过PCR和Southern Blotting鉴定获得打靶的阳性克隆细胞。以该转基因阳性克隆细胞为核供体，可获得转基因克隆胚胎，进一步将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫内，最终可以获得成活的NRAMP1定点***转基因克隆牛。
Description
技术领域
本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及转基因克隆牛的核供体细胞的构建，特别涉及一种利用单一Cas9切口酶介导NRAMP1基因定点***获取打靶的牛胎儿成纤维细胞的方法。
背景技术
结核病是一种由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)在人与牛之间传播引起的世界性人畜共患病，对畜牧业生产安全、畜产品安全乃至人类健康造成了严重威胁。
NRAMP1(natural resistance-associated macrophage protein-1)又名SLC11A1(solute carrier family 11A member 1)，是研究者发现的首个与结核杆菌易感性相关的基因(Vidal S et al，1995)。在结核杆菌侵入巨噬细胞时，NRAMP1通过参与先天免疫过程促进NO产生和其它促炎症反应(Hedges JF，2013)从而抑制结核杆菌在胞内的增殖，产生抗病效果。
2013年2月，国际著名期刊《Cell》报道了加州大学旧金山分校的研究人员所发现的一种精确沉默基因的方法，称之为CRISPR/Cas9介导的打靶技术。该技术表现出许多优越性，例如可以同时沉默任意数量的基因、具有优良的靶向性、构建简单且成本低等。该技术自发明以来，迅速被广大中外研究人员应用于人类细胞以及小鼠等模式动物研究中，成为当今生命科学技术研究的新热点。
应用转基因技术实现家畜的品种改良具有巨大的应用潜力。通过转基因技术增强家畜对于结核杆菌的抗性，对于未来的牛结核病的预防和治疗具有重大意义。然而，目前CRISPR/Cas9技术介导的基因***在转基因家畜中的应用非常有限。此外，如何在保证外源基因***效率的同时，减弱该***多变的脱靶效应至今依然亟待解决。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用单一Cas9切口酶介导NRAMP1定点***获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，可以采用单一Cas9切口酶与NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体获取NRAMP1基因在牛25号染色体F-A位点(即牛FSCN1基因和ACTB基因间区域内特定序列片段)定点整合的牛胎儿成纤维细胞，以该细胞作为核供体细胞，为研制抗结核病的转基因牛提供坚实的基础。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体(简称pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro)，该打靶载体包括目的基因NRAMP1以及用于将NRAMP1基因通过同源重组定点***牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间的元件序列。
所述元件序列包括用于打靶位点同源重组的同源臂序列，同源臂以牛基因组为模板扩增，扩增产物分别为牛25号染色体上打靶位点的上游577-977bp和下游616-1016bp；打靶位点位于牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间如SEQ.ID.NO.1所示的序列内。
所述目的基因NRAMP1是由外源扩增的NRAMP1基因自身启动子启动转录的。
所述元件序列还包括筛选标记eGFP基因和PURO基因，这两个筛选标记基因都由EF1α启动子启动转录，并由自剪切肽P2A序列串联融合表达。
所述元件序列还包括位于两个筛选标记基因两侧的两个同向LoxP序列。
一种***目的基因NRAMP1的牛胎儿成纤维细胞的构建方法，包括以下步骤：以牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，通过共转染打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro和针对打靶位点的单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体，将目的基因NRAMP1定点整合到牛胎儿成纤维细胞的25号染色体FSCN1和ACTB基因间。
所述宿主细胞为传代2～3代的荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞，以兼顾细胞数量与活性。
所述共转染操作采用电穿孔法。
所述单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体包含有与打靶位点相对应的向导序列，打靶位点位于牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间如SEQ.ID.NO.1所示的序列内。
所述***目的基因NRAMP1的牛胎儿成纤维细胞可作为生产转基因克隆牛的核移植操作供体细胞使用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1.本发明构建了一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro，并通过基因打靶技术使NRAMP1基因定点整合到牛25号染色体F-A位点。该位点附近基因簇为持家基因，在不同组织中均处于活跃表达状态。将NRAMP1***该区域，可以避免其因异染色质化修饰而丧失活性。
2.本发明构建了一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro，可通过单一CRISPR/Cas9切口酶来介导其整合到F-A位点。单一CRISPR/Cas9切口酶可以减少打靶过程中非同源末端重组修复(NHEJ)在基因组范围内引入额外的突变(indels)，从而减少细胞毒性，提高转基因动物的安全性。
3.本发明构建了一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro，其目的基因NRAMP1由外源扩增的该基因自身启动子启动转录。从而使目的基因NRAMP1在且仅在专门性的吞噬细胞中正常转录和表达，提高转基因动物生产的安全性。
4.本发明构建了一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro，该打靶载体内包含有筛选标记基因PURO，方便药物筛选获取阳性克隆细胞；包含有筛选标记基因eGFP，方便在荧光显微镜下直接确定外源基因的***。同时筛选标记两侧的同向LoxP可与cre酶共同作用，去除阳性克隆细胞中的筛选标记。
5.本发明获取的***目的基因NRAMP1的牛胎儿成纤维细胞，经PCR和SouthernBlotting鉴定，证实目的基因为定点整合到牛胎儿成纤维细胞基因组F-A位点。
6.以***目的基因NRAMP1的牛胎儿成纤维细胞作为核移植供体细胞，可以通过SCNT获得转基因克隆牛，为获得对结核病具有更强抗性的新品种转基因牛打下坚实的基础。
附图说明
图1是将打靶位点对应的向导序列克隆至Cas9表达载体的原理图。
图2是Cas9真核表达载体的图谱。
图3是利用Surveyor nuclease assay对Cas9切割活性的检测图。
图4是打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro的图谱。
图5是原代培养(A)及传代培养(B)中的用于基因打靶的牛胎儿成纤维细胞。
图6是转染打靶载体的牛胎儿成纤维细胞经嘌呤霉素筛选出来的单克隆细胞图。
图7是阳性单克隆细胞鉴定示意图。
图8是选取一些具有代表性的单克隆细胞的junction PCR鉴定结果图。
图9是对经PCR验证为发生了NRAMP1基因定点整合的14个单克隆细胞进行Southern blotting验证的结果图。
图10是利用基因打靶的阳性克隆细胞制备的转基因克隆胚胎。
图11是利用基因打靶的阳性克隆细胞制备的转基因克隆牛。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述是对本发明的解释，而不是限定。
本发明首先构建了含有NRAMP1基因的巨噬细胞特异性表达的打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro，然后通过电穿孔的方法将打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro和针对打靶位点的单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，嘌呤霉素药物筛选后，经过PCR和Southern Blotting鉴定获得打靶的阳性克隆细胞。以该打靶的阳性克隆细胞为核供体移入牛去核***中，获得转基因克隆胚胎。最后通过将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫内，获得转基因克隆牛。
具体所涉及的试剂和材料如下：胎牛血清、嘌呤霉素、DMEM、DMEM/F12、Opti-MEM培养基购自美国Invitrogen公司，EDTA和Trypsin购自美国Sigma公司，细胞培养板和培养皿购自美国Corning公司，质粒提取试剂盒和细胞基因组提取试剂盒均购自美国Omega公司，Mutation Detection试剂盒购自Transgenomic公司，PrimeSTAR DNA聚合酶和Solution IDNA连接酶购自Takara公司，转染试剂HD DNA Transfection Reagent购自FuGENE公司，电转染仪(ECM2001)购自美国BTX公司，限制性内切酶购自NEB公司，感受态细胞DH5α和JM110均购自上海TIANGEN公司。
1、CRISPR/Cas9真核表达载体的构建
1.1打靶位点设计及载体构建
选择牛基因组25号染色体上FSCN1(fascin actin-bundling protein 1，FSCN1)基因和ACTB(beta-actin，ACTB)基因间区域设计打靶位点(以下或也称为F-A打靶位点)，全长为560bp，序列如下(参见SEQ.ID.NO.1，左起为5`端)：
Bos Taurus chromosome 25Btau_4.6.1Chr25.position40,631,870-40,632,429
将上述序列输入打靶位点在线筛选工具ZiFiT(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)，随后将总计80个潜在打靶位点全部输入打靶位点在线评估工具Cas-OFFinder(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)中，输出初步的筛选结果。本发明从全部的80个潜在打靶位点中挑选出最理想的14个位点进行后续的CRISPR/Cas9真核表达载体构建工作及进一步的切割效率检测。
如图1所示，本发明所选取的一元表达载体既包含hspCas9蛋白表达所需的完整元件序列，也包含稳定转录sgRNA所需的hU6启动子。该载体在经过限制性内切酶Bbs I酶切处理后，可形成将打靶位点对应的向导序列克隆至该载体所需的接头结构。利用表1所述合成的寡聚核苷酸序列，通过简单的退火与连接反应即可实现CRISPR/Cas9真核表达载体构建。
表1.sgRNA克隆引物序列(5'-3')
表1中下划线部分标识的序列为各打靶位点对应向导序列
将上述核酸序列送至上海生工生物公司合成，构建如下反应体系：2μL Top Guideoligo(100μM)；2μL Bottom Guide oligo(100μM)；加16μL ddH2O至20μL总体积。混匀并短暂离心后，置于PCR仪中进行如下程序：37℃5分钟；95℃10分钟；之后每分钟梯度降温5℃直至4℃。完成退火后，取出样品并置于冰上待用。
构建Cas9表达载体质粒酶切反应体系如下：10μL pSpCas9(BB)-2A-GFP(2μg，addgene，参见图2)；2μL 10×NEBuffer 2.1；1μL Bbs I；加7μL ddH2O至20μL总体积。混匀并短暂离心后，37℃水浴过夜。回收酶切后载体，并与上述退火后样品构建如下连接体系：1μL退火后双链oligo；2μL pSpCas9(BB)-2A-GFP；5μL 2×Solution I；加2μL ddH2O至10μL总体积。混匀并短暂离心后16℃水浴连接1h。连接产物(靶位点***位置位于hU6启动子与sgRNA接头序列scaffold间)按标准程序转化入感受态细胞DH5α中，涂布于固体LB培养基(100mg/mL氨苄青霉素)上37℃培养过夜。挑取数个单克隆扩大培养后送往华大科技测序，选取阳性克隆保存菌种备用。
1.2切割活性检测
当60mm培养皿内牛胎儿成纤维细胞细胞(BFFs)培养至汇合度约60％时，分别取各组Cas9表达载体质粒10μg；FuGENE HD转染试剂20μL；补加Opti-MEM至总体积250μL。充分混匀后室温静置孵育15min，将转染混合物加入到各对应培养皿中，轻柔混匀后放回培养箱中继续培养。转染72h后，收集细胞并使用Omega公司全基因组提取试剂盒提取基因组并进行后续Surveyor错配核酸酶检测。操作按照说明书中标准程序进行，其中PCR扩增打靶区域(1037bp)所用引物序列如下，退火温度60℃：
Surveyor-detect-F 5′-GACTCCTGTAACCTCTGTCCCTG-3′(SEQ.ID.NO.30)
Surveyor-detect-R 5′-TCAGCAGTTGCGGTTCG-3′(SEQ.ID.NO.31)
核酸电泳结果经过软件image-J(http://imagej.net)灰度评估，计算得出切割效率fcut＝酶切后两条带灰度之和/该泳道三条带灰度总和。为了更好的反映出Cas9蛋白在该位点的实际打靶效果，进一步通过以下算法将切割效率折算为实际突变率检测结果见图3。
结果表明，在45号打靶位点处Cas9核酸酶切割活性最高。对于相同的打靶位点，Cas9切口酶相较于Cas9核酸酶切割活性有部分损失，但是前者在通过HDR修复途径介导外源基因打靶***过程中在全基因组范围内引入突变(indels)的概率要小得多。因此选择45号打靶位点和单一Cas9切口酶进行后续的NRAMP1***实验，以兼顾基因打靶的高效性与精准性，提高转基因动物生产的成功概率。
以下如未做另外说明，单一Cas9切口核酸酶表达载体均以表1中编号45所对应序列的带下划线部分作为向导序列。
2、NRAMP1巨噬细胞特异性打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro的构建
2.1目的基因NRAMP1的克隆
根据NCBI公布的牛NRAMP1序列(Gene ID:282470)设计引物扩增目的基因ORF，且后续载体中各元件均通过该引物中的酶切位点进行串联。引物序列为：
NRAMP1-19T-F：5'-ATTTGCGGCCGCGAATTCGTCGACGTGGGGTACCCATGTCAGGTGACACGGGC-3'(SEQ.ID.NO.32)；
NRAMP1-19T-R：5'–AAGCTTCCATGGATCGATGGGACTAGTACGCGTCGCGGATCCTCATCCCGAGGTCCTCCCCTT-3'(SEQ.ID.NO.33)；
反应体系如下：10μL 5×PS Buffer；4μL dNTPs(2.5mmol/L)；1μL NRAMP1-19T-F(10μM)；1μL NRAMP1-19T-R(10μM)；3μL奶牛cDNA(100ng/μL)；0.5μL PrimerStar DNA聚合酶(2.5U/μL)；加双蒸水至50μL总体积。按照产品说明书标准三步法设置反应程序，其中退火温度为60℃，延伸时间90s。回收PCR目的片段并在其末端加A处理后，构建标准T-A克隆连接体系将其重组至pMD19T simple克隆载体(Takara)，转化入商品化DH5α大肠杆菌中，并挑取数个单克隆扩大培养后送上海华大基因测序。测序正确的载体暂命名为pNRAMP1-19T。
2.2NRAMP1启动子的克隆
根据NCBI公布的牛NRAMP1启动子序列(GenBank:AY438096.1)设计引物序列如下：
Promoter-19T-F：5'-CGCGTCGACCATCACAGCCTCCTACC-3'(SEQ.ID.NO.34)
Promoter-19T-R：5'-TTAAGGTACCGGGTGCTTCCTCTCTAGGC-3'
(SEQ.ID.NO.35)
反应体系如下：10μL 5×PS Buffer；4μL dNTPs(2.5mmol/L)；1μL Promoter-19T-F(10μM)；1μL Promoter-19T-R(10μM)；1μL奶牛基因组(200ng/μL)；0.5μL PrimerStar DNA聚合酶(2.5U/μL)；加双蒸水至50μL总体积。按照产品说明书标准三步法设置反应程序，其中退火温度为55℃，延伸时间90s。回收PCR目的片段并在其末端加A处理后，构建标准T-A克隆连接体系将其重组至pMD19T克隆载体(Takara)，转化入商品化DH5α大肠杆菌中，并挑取数个单克隆扩大培养后送上海华大基因测序。
将测序正确的阳性重组子与pNRAMP1-19T载体分别进行SalI和KpnI双酶切处理，通过SolutionI将上述启动子序列连接至pNRAMP1-19T载体上。阳性重组载体暂命名为pPromoter-NRAMP1-19T。
2.3同源臂序列的克隆
设计引物分别扩增牛25号染色体上F-A打靶位点上游序列(777bp)作为左侧同源臂(Left arm，LA)和下游序列(816bp)作为右侧同源臂(Right arm,RA)，引物序列如下：
LA-19T-F：5'-GCGGCCGCGTCTGACCCGTGAGTGTT-3'(SEQ.ID.NO.36)
LA-19T-R：5'-GTCGACGCGGCTAGTTTGGGAGTG-3'(SEQ.ID.NO.37)
RA-19T-F：5'-ATCGATACACCCTTTCTAGTGGTCC-3'(SEQ.ID.NO.38)
RA-19T-R：5'-AAGCTTTCCCGCTGATTGTTCTTC-3'(SEQ.ID.NO.39)
反应体系如下：10μL 5×PS Buffer；4μL dNTPs(2.5mmol/L)；1μL primer F(10μM)；1μL primer R(10μM)；1μL奶牛基因组(200ng/μL)；0.5μL PrimerStar DNA聚合酶(2.5U/μL)；加双蒸水至50μL总体积。按照产品说明书标准三步法设置反应程序，其中退火温度为58℃，延伸时间50s。回收PCR目的片段并在其末端加A处理后，构建标准T-A克隆连接体系将其重组至pMD19T克隆载体，转化入商品化JM110大肠杆菌中，并挑取数个单克隆扩大培养后送上海华大基因测序，测序正确的即为LA阳性重组子和RA阳性重组子。
将LA阳性重组子与pPromoter-NRAMP1-19T载体分别进行NotI和SalI双酶切处理，通过SolutionI将左侧同源臂连接至后者骨架载体上。将连接产物转化入JM110感受态细胞中。NotI和SalI双酶切鉴定出阳性重组子后，提取质粒，然后将其与RA阳性重组子分别进行ClaI和HindIII双酶切处理，通过Solution I将右侧同源臂连接至前者骨架载体上。将阳性重组载体暂命名为pLA-Promoter-NRAMP1-RA-19T。
2.4巨噬细胞特异性表达打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro的构建
将pLA-Promoter-NRAMP1-RA-19T载体与pEGFP-C1载体(Clontech)分别进行BamHI和MluI双酶切处理，分别回收前者的线性化骨架载体与后者包含SV40polyA序列的目的片段，通过Solution I进行连接。将阳性重组载体暂命名为pLA-Promoter-NRAMP1-polyA-RA-19T。
以本实验室已有载体为模板(DOI:10.13345/j.cjb.130529)，扩增筛选标记LoxP-EF1α-EGFP-P2A-Puro-LoxP。引物序列如下：
EEPP-19T-F：5'-GAGCACTAGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTGCGTTATCCCCTGATTCTGT-3'(SEQ.ID.NO.40)
EEPP-19T-R：5'-TACCATCGATGGAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCGCTTACAATTTACGCCTTAAG-3'(SEQ.ID.NO.41)
反应体系如下：10μL 5×PS Buffer；4μL dNTPs(2.5mmol/L)；1μL EEPP-19T-F(10μM)；EEPP-19T-R(10μM)；1μL质粒模板(200ng/μL)；0.5μL PrimerStar DNA聚合酶(2.5U/μL)；加双蒸水至50μL总体积。按照产品说明书标准三步法设置反应程序，其中退火温度为62℃，延伸时间3min。
将PCR产物与pLA-Promoter-NRAMP1-polyA-RA-19T载体分别进行SpeI和ClaI双酶切处理，通过Solution I连接后，测序后保存阳性重组载体，即完成巨噬细胞特异性表达打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro的构建，如图4所示(即供体载体Cas9Donor Vector)。图4中所示载体包括以下顺次排列的元件：LA、NRAMP1启动子，NRAMP1开放阅读框、SV40polyA、上游LoxP位点、EF1α启动子、荧光报告基因EGFP开放阅读框、P2A序列、抗性基因PURO(抗嘌呤霉素)开放阅读框、SV40polyA、下游LoxP位点以及RA。
3、巨噬细胞特异性表达打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro与特异性单一Cas9切口核酸酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞构建核供体细胞。
3.1牛胎儿成纤维细胞培养
本发明中所用牛胎儿成纤维细胞均为组织块贴壁法所得。将采集的牛胎儿(杨凌科元克隆股份有限公司，2013年06月)用含有青链霉素的PBS缓冲液清洗三次以上以避免细菌污染。在无菌工作台上用眼科剪及镊子剥离牛胎儿皮肤组织，并将其剪碎为约1mm3的组织块。小心的将组织块均匀贴附直径60mm培养皿中，并轻柔滴加少量DMEM培养液润湿。将培养皿倒置CO2培养箱中37℃，5％CO2孵育4h后，加入5mL含有青链霉素及10％FBS的DMEM培养液正置培养。约3-4天后可见组织块周围有成纤维细胞迁出，继续培养至细胞汇合度大于90％后弃去残余组织块，此时可选择冻存细胞或者传代培养，如图5A所示。
传代培养与冻存：弃去细胞培养液，加入3mL PBS轻柔洗涤后弃液，加入1mL含0.25％胰酶的PBS消化细胞，37℃孵育3min后加入DMEM培养液终止消化。轻柔吹打剥离贴壁细胞形成细胞悬液，离心弃去上清后选择加入DMEM培养液重悬细胞，按照1:3～1:5的比例传代培养，如图5B所示；或选择加入含10％DMSO的细胞冻存液，彻底重悬细胞并转入冻存管及程序冻存盒中，并最终转置液氮中冻存。细胞复苏：将冻存管从液氮中取出，37℃水浴迅速解冻。低速离心后弃去冻存液，加入1mL含10％FBS的DMEM培养液彻底重悬细胞。转接至对应规格培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
3.2阳性细胞克隆的筛选
本发明使用电穿孔法将打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro与特异性单一Cas9切口核酸酶表达载体共转染入牛胎儿成纤维细胞。电转液配方为KCl：120mM；CaCl2：0.15mM；K2HPO4:10mM；MgCl2:2.50mM。调节pH值至7.6后，与Opti-MEM培养液按照体积比3:1混匀。向500μL混合液中加入上述两种载体质粒各20μg，转移至离心弃去培养液的细胞团块中，轻轻吹打重悬细胞并混匀。将上述细胞悬液转移到新的BTX电转杯中静置5min，调节电转仪电压为510V，脉冲1ms电击3次后静置10min。将细胞悬液转移到90mm培养皿中，于37°、5％的CO2培养箱中继续培养。
转染24h后，向细胞培养液中加入终浓度为2μg/mL的嘌呤霉素进行药物筛选。筛选8d后，基因组中未整合打靶载体的细胞全部死亡，而稳定整合打靶载体的细胞逐渐形成单克隆细胞团，并在荧光显微镜下可见绿色荧光表达。单克隆细胞见图6。挑取单克隆细胞至48孔板继续培养并继续进行后续阳性克隆鉴定。
3.3 PCR鉴定基因打靶的阳性细胞克隆
取部分扩大培养的单克隆细胞，离心弃上清后加入20μL裂解液(10mM Tris-HCl，pH 8.5；50mM KCl；1.5mM MgCl2；0.5％NP-40；0.5％Tween-20；400g/mL proteinase K)，充分重悬后65℃水浴30min，95℃水浴15min完成细胞裂解。取5μL细胞裂解物作为模板，分别利用下述junctionPCR引物进行阳性克隆鉴定。
5'-junction：Lj F(5'-AGTTGTGCCCTCCGTGTA-3'),SEQ.ID.NO.42；
Lj R(5'-CTGCCATGCCCACTCAT-3'),SEQ.ID.NO.43；
3'-junction,Rj F(5'-GCGCATGGCCGAGTTGA-3'),SEQ.ID.NO.44；
Rj R(5'-CCCGCATTGCTCCCTCT-3'),SEQ.ID.NO.45。
其中，5'-junction上游引物匹配序列为5'端同源臂上游基因组序列，下游引物匹配序列为打靶载体上NRAMP1基因启动子序列，产物大小1578bp；3'-junction上游引物匹配序列为打靶载体上puro基因序列，下游引物匹配序列为3'端同源臂下游基因组序列，产物大小应为1978bp，如图7所示。通过5'-junction PCR反应鉴定出的阳性克隆进一步通过3'-junction PCR进行鉴定。只有通过了两轮PCR鉴定的克隆才会在扩大培养后，进行后续实验。典型的利用junction PCR鉴定过程见图8。
3.4 Southern blotting鉴定基因打靶的细胞克隆
将上述鉴定出的阳性克隆细胞扩大培养后取部分细胞提取基因组DNA，使用HindIII进行充分的酶切反应后，分别与地高辛标记的靶向5'端同源臂上游基因组序列的探针(probe 1)和靶向打靶载体上puro基因序列的探针(probe 2)进行杂交。探针序列分别通过下述引物进行PCR扩增获取，地高辛标记过程通过DIG-High Prime DNA Labeling andDetection Starter Kit II(Roche)试剂盒完成。
Probe 1,p1F(5'-CCAGTTCTTTGATGGGTGT-3'),SEQ.ID.NO.46；
p1R(5'-GGCTTGACAGAAGGGTATG-3'),SEQ.ID.NO.47；
Probe 2,p2F(5'-AGCAAGCAGGAGACGTGGAA-3'),SEQ.ID.NO.48；
p2R(5'-CGCTCGTAGAAGGGGAGGTT-3'),SEQ.ID.NO.49。
如图9所示，F-A打靶位点发生精准基因***的阳性克隆可以杂交出1.58kb的条带(probe1)和9.05kb的条带(probe2)。而在使用probe 1时，3.84kb的条带表明了该克隆为杂合，依然保留了一条野生型的正常染色体。统计表明，使用上述方法进行NRAMP1打靶***的阳性率为18.11％，该比例对于转基因动物生产而言是足够高的。
4、以上述基因组定点整合了目的基因NRAMP1的牛胎儿成纤维细胞为核供体细胞，构建转基因克隆牛
4.1***的成熟培养
本发明所用卵巢均为无菌条件下采自西安市屠宰场(2014年10月-1月)，在37℃无菌生理盐水内运输至实验室。抽取3～8mm直径的卵泡并收集卵丘***复合体，在体视显微镜下挑选合适的***用于成熟培养。成熟培养液为加入10％FBS和10ng/mL的表皮生长因子的TCM199(Gibico)。在38.5摄氏度，5％CO2条件下培养20h后，用0.2％的透明质酸酶去除卵丘细胞，并挑选成熟的***用于核移植实验。
4.2转基因克隆胚的构建
本发明采取采用体细胞核移植(SCNT)技术将供体细胞转移到去除细胞核的成熟***中去。核移植时以含10％FBS，5μg/mL细胞松弛素B的PBS作为显微操作液，用内径20μm的去核管在显微操作仪上吸出第一极体及部分胞质。以10μg/mL Hoechst 33342染色10min后，在荧光显微镜下挑出完全去核的***；完全去除第一极体及染色体的***被用于核移植。
以生长至接触抑制状态3d后的NRAMP1精准***的阳性转基因荷斯坦牛胎儿成纤维细胞为供核细胞。用去核管将供体细胞注入去核成功的***透明带下。使用电融合液将核质复合体平衡3min，用与显微操作仪连接的微电极尖部排列重组体，使膜接触面与两电极的连线垂直，并给予28V、10μm电脉冲进行电融合。将融合后的重组体置于含有10％FBS的M199中，38.5℃、5％CO2培养2h后观察融合情况。
4.3转基因克隆胚的激活及体外培养
融合的重组胚在含10％FBS的M199中平衡2h后，用含5μmol/L离子霉素(购自SIGMA公司)的mSOFaa培养液(购自SIGMA公司)处理5min，然后在含2mmol/L二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)的mSOFaa培养液内培养4h，清洗3次后转入矿物油覆盖并预先在CO2培养箱中平衡至少2h的mSOFaa中培养，培养密度为5μL每个重组胚，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度下培养，在第7天检查囊胚发育情况。正常发育至囊胚的转基因克隆胚如图10所示。
4.4转基因克隆牛的制备
将发育良好的囊胚移植到发情的荷斯坦受体牛的子宫角(每头受体牛移植2-3枚囊胚)。60天后，用B超对移植后未返情的受体牛做怀孕检查。此后每月检查一次，观察妊娠维持情况。10个月后，成功产下成活的基因打靶的转基因克隆牛(图11)。F-A打靶位点定点整合NRAMP1基因的转基因克隆牛的制备成功，为预防牛结核打下了坚实的基础。
核苷酸序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 利用单一Cas9切口酶介导NRAMP1定点***获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法
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<213> Bos taurus
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caaaccctaa aggagaagca gaacttaaag aagcagaaag gatgcgtgtg gggagcagag 120
tccattacag accgagagaa caggaagggc agaggccctg aggcagattt ggtgttctaa 180
ggattagaag gcagagtgtc tgggaacaca gagtaaggct ggaggggcaa gggggtgagg 240
ttagccacac tcccaaacta gccgcggtct ccacaactat gtgcagtgtc gacgtgcagc 300
tccttgaatt gccactcaca ggttcccagc acccagatcg acgtacaggc ctagggttcc 360
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ttcttgtgtg tgaagtggga gctcactgtg gtttgcattt gcatttcacg gatgacccgt 540
gatgtcgagt ctcttcttat 560
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Claims (6)
1.一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体，其特征在于：该打靶载体包括目的基因NRAMP1以及用于将NRAMP1基因通过同源重组定点***牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间的元件序列；所述元件序列包括用于打靶位点同源重组的同源臂序列，同源臂以牛基因组为模板扩增，扩增产物分别为牛25号染色体上打靶位点的上游序列777bp作为左侧同源臂和下游序列816bp作为右侧同源臂；
所述左侧同源臂引物序列为：
LA-19T-F：5'-GCGGCCGCGTCTGACCCGTGAGTGTT-3'；SEQ.ID.NO：36；
LA-19T-R：5'-GTCGACGCGGCTAGTTTGGGAGTG-3'；SEQ.ID.NO：37；
所述右侧同源臂引物序列为：
RA-19T-F：5'-ATCGATACACCCTTTCTAGTGGTCC-3'；SEQ.ID.NO：38；
RA-19T-R：5'-AAGCTTTCCCGCTGATTGTTCTTC-3'；SEQ.ID.NO：39；
打靶位点位于牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间，为SEQ.ID.NO：1序列内的394bp-413bp；所述元件序列还包括筛选标记eGFP基因和PURO基因，以及位于所述筛选标记基因两侧的两个同向LoxP序列；所述筛选标记eGFP基因和PURO基因都由EF1α启动子启动转录，并由自剪切肽P2A序列串联融合表达。
2.根据权利要求1所述一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体，其特征在于：所述目的基因NRAMP1是由外源扩增的NRAMP1基因自身启动子启动转录的。
3.一种***目的基因NRAMP1的牛胎儿成纤维细胞的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：以牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，通过共转染打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro和针对打靶位点的单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体，将目的基因NRAMP1定点整合到牛胎儿成纤维细胞的25号染色体FSCN1和ACTB基因间；所述单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体包含有与打靶位点相对应的向导序列，打靶位点位于牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间，为SEQ.ID.NO：1序列内的394bp-413bp。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞为传代2～3代的荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述共转染操作采用电穿孔法。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述***目的基因NRAMP1的牛胎儿成纤维细胞能在生产转基因克隆牛的核移植操作中作为供体细胞使用。
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| CRISPR/Cas9 介导的基因组定点编辑技术;方锐等;《生物化学与生物物理进展》;20131231;第40卷(第8期);第691-702页 * |
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