CN106591346A - 一种利用基因敲除技术构建细菌缺陷株的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用基因敲除技术构建细菌缺陷株的试剂盒及方法。其中试剂盒包括：盒体、试剂A和试剂B。该试剂盒利用含有sgRNA、CRISPR/Cas9蛋白、ku蛋白与ligD蛋白的pCAG‑NHEJ载体，将质粒转化入目标细菌感受态，通过CRISPR/Cas9***剪切细菌目的基因组DNA，从而实现基因组敲除，再利用NHEJ***即可自动连接DNA断端，使细菌存活。本发明的优点在于可以简单、快速构建针对任何靶基因的pCAG‑NHEJ载体，并且无需人工引入与靶序列具有同源性的双链DNA修复DNA断端，从而简化CRISPR/Cas9技术的操作步骤。

Description

一种利用基因敲除技术构建细菌缺陷株的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种利用基因敲除技术构建细菌缺陷株的试剂盒及方法。

背景技术

CRISPR/Cas9技术***是由一种来自链球菌的Cas9核酸酶、一个序列恒定的tracrRNA(trans activating crRNA)和一个与靶基因特异性互补的20nt crRNA组成。与ZFNs和TALENs技术不同的是CRISPR/Cas9技术对靶位点的识别依赖于核酸之间碱基互补配对，可对任何紧随PAM(NGG)的20bp的靶位点序列进行编辑，且其靶点在基因组中的分布频率很高，对于需要定点编辑的靶基因更容易找到合适的靶位点。而且由于该技术只需要针对靶基因设计一段特异性的crRNA序列，即可快捷地实现基因的定点敲除。这一技术不仅彻底改变了传统基因组定点编辑技术的概念，并在短短两年内被成功应用于对多种生物的基因组进行走点敲除、敲入或者突变。

sgRNA分子由间隔序列(spacer)和trancrRNA两段序列构成：(1)间隔序列长度为20nt，与基因的靶位点互补，它位于PAM(Protospacer Adjacent Motif)序列(NGG)的5’端，需要根据靶基因序列单独设计；(2)tracrRNA序列恒定，能结合并激活Cas9蛋白质。在spacer的引导下，sgRNA将活化的Cas9蛋白带至基因的靶位点，在PAM序列上游3-8个碱基间将靶基因的DNA双链切断，形成钝性末端的断裂。

在CRISPR/Cas9技术发明以前，细菌的基因敲除主要依靠基于同源重组技术。这种技术存在效率低下，操作过程复杂，需要耗费长的时间筛选阳性克隆等缺点。研究表明，与上述同源重组技术相比，CRISPR/Cas9技术具有以下有点：(1)效率高，CRISPR/Cas9技术敲除目的基因是同源重组技术的1000倍；(2)可采用同一个CRISPR/Cas9载体同时或先后对多个靶点进行敲除；(3)操作简便，只需要根据靶基因设计一条或者两条sgRNA，并将sgRNA的编码DNA克隆入载体，然后转化细菌即可实现基因敲除。

然而，由于绝大部分细菌不具备自主的非同源末端链接***，Cas9蛋白切割细菌基因组DNA造成的DSB将直接导致细菌死亡，基因敲除操作也随之失败。因此，现有技术中，为避免细菌死亡，需要同时向细菌内导入与靶序列具有高度同源性的线性双链DNA，从而增加了操作步骤和费用。由于构建同源线性双链DNA需要经过多次PCR并连接PCR产物，进一步增加了操作步骤和费用。因此，现有技术的CRISPR/Cas9***存在操作繁琐、操作难度大、基因敲除效率仍然不够高的缺点。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种利用基因敲除技术构建细菌缺陷株的试剂盒及方法。

本发明根据CRISPR/Cas9技术原理和NHEJ(Non-homologous End Joining)修复机制进行设计，形成含有sgRNA筛选***和NHEJ修复***的pCAG-NHEJ载体的试剂A。

首先，本发明中sgRNA筛选***和NHEJ修复***的pCAG-NHEJ载体的构建，采用基础质粒pBBRlMCS-2(本领域常规质粒)，使用BamHI和XbaI双酶切线性化和CIAP碱性磷酸酶去磷酸化。人工合成J23119(SpeI)-sgRNA，与线性化的pBBRlMCS-2进行连接反应，经热激转化大肠杆菌后涂布平板，挑取单克隆，测序确定序列完全正确，获得pBBRlMCS-2-sgRNA质粒。再经BamHI和HindIII双酶切线性化和CIAP碱性磷酸酶去磷酸化，分别人工合成J23119-Cas9-J23119-ligD-J23119-mKu基因全长CDS,与BamHI和HindIII双酶切线性化的pBBRlMCS-2-sgRNA进行连接反应。经热激转化大肠杆菌后涂布平板，挑取单克隆，测序确定序列完全正确，获得pCAG-NHEJ(SEQ ID NO:1)质粒。在后续sgRNA筛选***使用过程中可替换针对不同靶基因DNA的sgRNA，获得针对不同靶基因DNA的pCAG-NHEJ质粒。

其次，CaCl₂法可用于制备大多数革兰氏阴性菌感受态。

最后，通过质粒转化，进行抗性筛选并验证sgRNA对目的基因DNA敲除作用的有效性，从而获得细菌敲除株。

本发明的有益效果是：本试剂盒和方法采用CRISPR/Cas9技术原理和NHEJ修复机制进行设计，形成可以高效进行sgRNA筛选***的试剂，该方法操作简单、快速，可有效缩短实验周期和成本。

附图说明

图1为pCAG-NHEJ质粒图谱；

图2为pCAG-NHEJ质粒转化后，大肠杆菌抗性筛选图；

图3为错位酶酶切鉴定结果电泳图，其中A为DL2000的marker，B为实验组，C为对照组。

具体实施方式

本发明根据CRISPR/Cas9技术原理和NHEJ(Non-homologous End Joining)修复机制进行设计，形成含有sgRNA筛选***和NHEJ修复***的pCAG-NHEJ载体的试剂A，含有DH5α感受态细胞的试剂B。

载体构建方法如下：

1.pCAG-NHEJ质粒载体的构建

采用基础质粒pBBRlMCS-2(GI:773412)，使用BamHI和XbaI双酶切线性化和CIAP碱性磷酸酶。人工合成J23119(SpeI)-sgRNA，与线性化的pBBRlMCS-2进行连接反应，经热激转化大肠杆菌后涂布平板，挑取单克隆，测序确定序列完全正确，获得pBBRlMCS-2-sgRNA质粒。再经BamHI和HindIII双酶切线性化和CIAP碱性磷酸酶，分别人工合成J23119-Cas9-J23119-ligD-J23119-mKu基因全长CDS,与BamHI和HindIII双酶切线性化的pBBRlMCS-2-sgRNA进行连接反应。经热激转化大肠杆菌后涂布平板，挑取单克隆，测序确定序列完全正确，获得pCAG-NHEJ(SEQ ID NO:1)质粒。在后续sgRNA筛选***使用过程中可替换针对不同靶基因DNA的sgRNA，获得针对不同靶基因DNA的pCAG-NHEJ质粒。

2.细菌感受态的制备(CaCl₂转化法)

2.1划线复苏宿主菌，37℃过夜。挑一单菌落于30ml LB液体培养基中，37℃，200rpm摇至OD600＝0.2-0.4，取出置于冰上10-15min。

2.2取1mL菌液于灭菌的1.5ml离心管中。4℃，5000rpm离心5min回收细胞。弃上清，吸干残存培养基，加500μl冰预冷的0.1M CaCl₂，重悬菌体，置冰浴15-30min。

2.35000rpm，4℃离心5min回收细胞。弃上清，吸干水，加100μl冰预冷的0.1MCaCl2重悬菌体。放置于4℃用于转化，若不用则加30％甘油置-70℃备存。

3.质粒转化及抗性筛选

取50μL大肠杆菌感受态细胞，加入适量质粒(体积不得超过4μL)冰浴30min后，42℃热激90s，马上放回冰上，冰浴2min；加400μL LB培养基，于37℃摇床慢摇振荡培养45-60min；取100μL涂在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。

4.单克隆挑取及基因组提取

4.1挑取单克隆于5ml菌液中，37℃，200rpm，过夜。

4.2利用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根，DP302)提取细菌基因组。

5.提取细胞基因组DNA并扩增靶基因，将扩增结果进行错位酶酶切鉴定。

实施例1

1.pCAG-NHEJ质粒载体的构建

本发明中CRISPR/Cas9***的靶基因sgRNA pCAG-NHEJ质粒的构建，其中试剂A含有pCAG-NHEJ质粒,采用人工合成靶基因lacZ sgRNA：ACTAGTTCTGAGCGCATTTTTACGCGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGGGATCC(SEQ ID NO:2)，序列两端含有SpeI及BamHI酶切位点，其中5端为SpeI，3端为BamHI；pCAG-NHEJ质粒和人工合成好的靶基因lacZsgRNA用BamHI及EcoRI双酶切后混合，采用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌感受态细胞(试剂B)。经培养后摇菌并提取质粒，即完成并获得pCAG-NHEJ质粒。

2.TOP10大肠杆菌感受态的制备(CaCl₂转化法)

2.1划线复苏TOP10大肠杆菌，37℃过夜。挑一单菌落于30ml LB液体培养基中，37℃，200rpm摇至OD600＝0.2-0.4，取出置于冰上10-15min。

2.2取1mL菌液于灭菌的1.5ml离心管中。4℃，5000rpm离心5min回收细胞。弃上清，吸干残存培养基，加500μl冰预冷的0.1M CaCl₂，重悬菌体，置冰浴15-30min。

2.35000rpm，4℃离心5min回收细胞。弃上清，吸干水，加100μl冰预冷的0.1MCaCl₂重悬菌体。放置于4℃用于转化，若不用则加30％甘油置-70℃备存。

3.质粒转化及抗性筛选

取50μL TOP10大肠杆菌感受态细胞，加入适量质粒(体积不得超过4μL)冰浴30min后，42℃热激90s，马上放回冰上，冰浴2min；加400μL LB培养基，于37℃摇床慢摇振荡培养45-60min；取100μL涂在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜，结果显示(图2)。

4.单克隆挑取及基因组提取

4.1挑取单克隆于5ml菌液中，37℃，200rpm，过夜。

4.2利用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根，DP302)提取细菌基因组。

5.提取细胞基因组DNA并扩增靶基因，将扩增结果进行错位酶酶切鉴定。

用提取的细菌基因组DNA作为模板扩增靶基因，上游引物：tacggtcaatccgccgtttgt(SEQ ID NO:3)下游引物：ttcgggatttcggcgctcca(SEQ ID NO:4)，将扩增结果进行错位酶酶切鉴定，该步骤酶切鉴定采用Genloci Cruiser突变检测试剂盒(吉锐生物)，操作步骤依据该试剂盒说明书进行，结果显示(图3)，实验组经Cruiser核酸酶切割后形成三个明显片段，分别为600bp、400bp、200bp，对照组经Cruiser核酸酶切割后只有1个600bp片段，说明lacZ靶基因被敲除，验证了pCAG-NHEJ质粒筛选***的有效性。

本发明的目的在于提供一种利用基因敲除技术构建细菌缺陷株的试剂盒及方法，采用CRISPR/Cas9技术原理和NHEJ修复机制进行设计，形成可以高效进行基因敲除***的试剂，该方法操作简单、快速，无需进行同源基因组DNA转化，可有效缩短实验周期和成本。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏睿玻生物科技有限公司

<120> 一种利用基因敲除技术构建细菌缺陷株的试剂盒及方法

<130> 20170117

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12674

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ctcgggccgt ctcttgggct tgatcggcct tcttgcgcat ctcacgcgct cctgcggcgg 60

cctgtagggc aggctcatac ccctgccgaa ccgcttttgt cagccggtcg gccacggctt 120

ccggcgtctc aacgcgcttt gagattccca gcttttcggc caatccctgc ggtgcatagg 180

cgcgtggctc gaccgcttgc gggctgatgg tgacgtggcc cactggtggc cgctccaggg 240

cctcgtagaa cgcctgaatg cgcgtgtgac gtgccttgct gccctcgatg ccccgttgca 300

gccctagatc ggccacagcg gccgcaaacg tggtctggtc gcgggtcatc tgcgctttgt 360

tgccgatgaa ctccttggcc gacagcctgc cgtcctgcgt cagcggcacc acgaacgcgg 420

tcatgtgcgg gctggtttcg tcacggtgga tgctggccgt cacgatgcga tccgccccgt 480

acttgtccgc cagccacttg tgcgccttct cgaagaacgc cgcctgctgt tcttggctgg 540

ccgacttcca ccattccggg ctggccgtca tgacgtactc gaccgccaac acagcgtcct 600

tgcgccgctt ctctggcagc aactcgcgca gtcggcccat cgcttcatcg gtgctgctgg 660

ccgcccagtg ctcgttctct ggcgtcctgc tggcgtcagc gttgggcgtc tcgcgctcgc 720

ggtaggcgtg cttgagactg gccgccacgt tgcccatttt cgccagcttc ttgcatcgca 780

tgatcgcgta tgccgccatg cctgcccctc ccttttggtg tccaaccggc tcgacggggg 840

cagcgcaagg cggtgcctcc ggcgggccac tcaatgcttg agtatactca ctagactttg 900

cttcgcaaag tcgtgaccgc ctacggcggc tgcggcgccc tacgggcttg ctctccgggc 960

ttcgccctgc gcggtcgctg cgctcccttg ccagcccgtg gatatgtgga cgatggccgc 1020

gagcggccac cggctggctc gcttcgctcg gcccgtggac aaccctgctg gacaagctga 1080

tggacaggct gcgcctgccc acgagcttga ccacagggat tgcccaccgg ctacccagcc 1140

ttcgaccaca tacccaccgg ctccaactgc gcggcctgcg gccttgcccc atcaattttt 1200

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acaccaagtg gaaggcgggt caaggctcgc gcagcgaccg cgcagcggct tggccttgac 1320

gcgcctggaa cgacccaagc ctatgcgagt gggggcagtc gaaggcgaag cccgcccgcc 1380

tgccccccga gcctcacggc ggcgagtgcg ggggttccaa gggggcagcg ccaccttggg 1440

caaggccgaa ggccgcgcag tcgatcaaca agccccggag gggccacttt ttgccggagg 1500

gggagccgcg ccgaaggcgt gggggaaccc cgcaggggtg cccttctttg ggcaccaaag 1560

aactagatat agggcgaaat gcgaaagact taaaaatcaa caacttaaaa aaggggggta 1620

cgcaacagct cattgcggca ccccccgcaa tagctcattg cgtaggttaa agaaaatctg 1680

taattgactg ccacttttac gcaacgcata attgttgtcg cgctgccgaa aagttgcagc 1740

tgattgcgca tggtgccgca accgtgcggc accctaccgc atggagataa gcatggccac 1800

gcagtccaga gaaatcggca ttcaagccaa gaacaagccc ggtcactggg tgcaaacgga 1860

acgcaaagcg catgaggcgt gggccgggct tattgcgagg aaacccacgg cggcaatgct 1920

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actttccaag ctcatcggac gttctttgcg gacggtccaa tacgcagtca aggacttggt 2040

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ggacgatggc gagccgttgg agccgccgac acgggtcacg ctgccgcgcc ggtagcactt 2460

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ccctatacct tgtctgcctc cccgcgttgc gtcgcggtgc atggagccgg gccacctcga 2580

cctgaatgga agccggcggc acctcgctaa cggattcacc gtttttatca ggctctggga 2640

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agtcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca 3000

aaatattaac gcttacaatt tccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg 3060

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caaatgagat ggcgaaagta gatgatagtt tctttcatcg acttgaagag tcttttttgg 3780

tggaagaaga caagaagcat gaacgtcatc ctatttttgg aaatatagta gatgaagttg 3840

cttatcatga gaaatatcca actatctatc atctgcgaaa aaaattggta gattctactg 3900

ataaagcgga tttgcgctta atctatttgg ccttagcgca tatgattaag tttcgtggtc 3960

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aaaatgaaaa gctctatctc tattatctcc aaaatggaag agacatgtat gtggaccaag 5940

aattagatat taatcgttta agtgattatg atgtcgatca cattgttcca caaagtttcc 6000

ttaaagacga ttcaatagac aataaggtct taacgcgttc tgataaaaat cgtggtaaat 6060

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gatagcgcaa ccgggctggc ctggatcgcc caacaggcgg cgctggaggt gcacgtgccg 7980

cagtggcggt ttgtcgccga gcccggatca ggtgagttaa atccgggccc ggcaacgcgt 8040

ttggtgttcg acctggaccc gggcgaaggc gtgatgatgg cccagctggc cgaggtggcg 8100

cgcgcggttc gtgatcttct cgccgatatc gggttggtca ccttcccggt caccagcggc 8160

agcaagggat tgcatctgta cacaccgctg gatgagccgg tgagcagcag gggagccacg 8220

gtgttggcca agcgcgtcgc gcagcgattg gagcaggcga tgcccgcgtt ggtcacctcg 8280

accatgacca aaagcctgcg ggccgggaag gtgtttgtgg actggagcca gaacagcggc 8340

tcgaagacca ccatcgcgcc gtactcacta cgtggccgga cgcatccgac cgtcgcggcg 8400

ccacgcacct gggcggagct cgacgacccc gcactgcgtc agctctccta cgacgaggtg 8460

ctgacccgga ttgcccgcga cggcgatctg ctcgagcggc tggatgccga cgctccggta 8520

gcggaccggt tgacccgata ccgccgcatg cgcgacgcat cgaaaactcc cgagccgatt 8580

cccacggcga aacccgttac cggagacggc aatacgttcg tcatccagga gcatcacgcg 8640

cgtcggccgc actacgattt ccggctggaa tgcgacggcg tgctggtttc gtgggcggta 8700

ccgaaaaacc tgcccgacaa cacatcggtt aaccatctag cgatacacac cgaggaccac 8760

ccgctggaat acgccacgtt cgagggcgcg attcccagcg gggagtacgg cgccggcaag 8820

gtgatcatct gggactccgg cacttacgac accgagaagt tccacgatga cccgcacacg 8880

ggggaggtca tcgtgaatct gcacggcggc cggatctctg ggcgttatgc gctgattcgg 8940

accaacggcg atcggtggct ggcgcaccgc ctaaagaatc agaaagacca gaaggtgttc 9000

gagttcgaca atctggcccc aatgcttgcc acgcacggca cggtggccgg tctaaaggcc 9060

agccagtggg cgttcgaagg caagtgggac ggctaccggt tgctggttga ggctgaccac 9120

ggcgccgtgc ggctgcggtc ccgcagcggg cgcgatgtca ccgccgagta tccgcaattg 9180

cgggcattgg cggaggatct cgccgatcac cacgtggtgc tggacggcga ggccgtcgta 9240

cttgactcct ctggtgtgcc cagcttcagc cagatgcaga atcggggccg cgacacccgt 9300

gtcgagttct gggcgttcga cctgctctac ctcgacggcc gcgcgctgct aggcacccgc 9360

taccaagacc ggcgtaagct gctcgaaacc ctagctaacg caaccagtct caccgttccc 9420

gagctgctgc ccggtgacgg cgcccaagcg tttgcgtgct cgcgcaagca cggctgggag 9480

ggcgtgatcg ccaagaggcg tgactcgcgc tatcagccgg gccggcgctg cgcgtcgtgg 9540

gtcaaggaca agcactggaa cacccaggaa gtcgtcattg gtggctggcg cgccggggaa 9600

ggcgggcgca gcagtggcgt cgggtcgctg ctcatgggca tccccggtcc aggtgggctg 9660

cagttcgccg ggcgggtcgg taccggcctc agcgaacgcg aactggccaa cctcaaggag 9720

atgctggcgc cgctgcatac cgacgagtcc cccttcgacg taccactgcc cgcgcgtgac 9780

gccaagggca tcacatatgt caagccggcg ctggttgcag aggtgcgcta cagcgagtgg 9840

actccggagg gccggctgcg tcaatcaagc tggcgtgggc tgcggccgga caagaaaccc 9900

agtgaggtgg tgcgcgaatg agctagcttg acagctagct cagtcctagg tataatgcta 9960

gctactagag aaagaggaga aatactagat gcgagccatt tggacgggtt cgatcgcctt 10020

cgggctggtg aacgtgccgg tcaaggtgta cagcgctacc gcagaccacg acatcaggtt 10080

ccaccaggtg cacgccaagg acaacggacg catccggtac aagcgcgtct gcgaggcgtg 10140

tggcgaggtg gtcgactacc gcgatcttgc ccgggcctac gagtccggcg acggccaaat 10200

ggtggcgatc accgacgacg acatcgccag cttgcctgaa gaacgcagcc gggagatcga 10260

ggtgttggag ttcgtccccg ccgccgacgt ggacccgatg atgttcgacc gcagctactt 10320

tttggagcct gattcgaagt cgtcgaaatc gtatgtgctg ctggctaaga cactcgccga 10380

aaccgaccgg atggcgatcg tgcatttcac gctgcgcaac aagaccaggc tggcggcgtt 10440

gcgcgtcaag gatttcggca agcgagaggt gatgatggtg cacacgttgc tgtggcccga 10500

tgagatccgc gaccccgact tcccggtgct ggaccagaag gtggagatca aacccgcgga 10560

actcaagatg gccggccagg tggtggactc gatggccgac gacttcaatc cggaccgcta 10620

ccacgacacc taccaggagc agttacagga gctgatcgac accaaactcg aaggtgggca 10680

ggcatttacc gccgaggacc aaccgaggtt gctggacgag cccgaagacg tctccgacct 10740

gctcgccaag ctggaggcca gcgtgaaggc gcgctcgaag gccaactcaa acgtcccaac 10800

gcctccgtga aagcttatcg ataccgtcga cctcgagggg gggcccggta cccagctttt 10860

gttcccttta gtgagggtta attgcgcgct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg 10920

tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta 10980

aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg 11040

ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 11100

gaggcggttt gcgtattggg cgcatgcata aaaactgttg taattcatta agcattctgc 11160

cgacatggaa gccatcacaa acggcatgat gaacctgaat cgccagcggc atcagcacct 11220

tgtcgccttg cgtataatat ttgcccatgg gggtgggcga agaactccag catgagatcc 11280

ccgcgctgga ggatcatcca gccggcgtcc cggaaaacga ttccgaagcc caacctttca 11340

tagaaggcgg cggtggaatc gaaatctcgt gatggcaggt tgggcgtcgc ttggtcggtc 11400

atttcgaacc ccagagtccc gctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc 11460

gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc 11520

caagctcttc agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac 11580

ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca 11640

agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc 11700

tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga 11760

caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga 11820

atgggcaggt agccggatca agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata 11880

ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata 11940

gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg 12000

tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca 12060

ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat 12120

cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg 12180

ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct 12240

cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt 12300

ttactttgca gggcttccca accttaccag agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc 12360

ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagct atcgccatgt aagcccactg caagctacct 12420

gctttctctt tgcgcttgcg ttttcccttg tccagatagc ccagtagctg acattcatcc 12480

caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg cccgcgttcc tgctggcgct gggcctgttt 12540

ctggcgctgg acttcccgct gttccgtcag cagcttttcg cccacggcct tgatgatcgc 12600

ggcggccttg gcctgcatat cccgattcaa cggccccagg gcgtccagaa cgggcttcag 12660

gcgctcccga aggt 12674

<210> 2

<211> 118

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

actagttctg agcgcatttt tacgcgcggt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa 60

ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt tgggatcc 118

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tacggtcaat ccgccgtttg t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttcgggattt cggcgctcca 20

Claims (5)

1.一种利用基因敲除技术构建细菌缺陷株的试剂盒及方法，其特征在于，所述试剂盒包括：用于快速敲除目的基因组DNA的载体pCAG-NHEJ，用于载体构建的DH5α感受态细胞。

2.一种利用基因敲除技术构建细菌缺陷株的试剂盒及方法，包括试剂A和试剂B,其特征在于：所述的试剂A含有pCAG-NHEJ载体,所述的试剂B含有用于载体构建的DH5α感受态细胞。

3.如权利要求2所述的一种利用基因敲除技术构建细菌缺陷株的试剂盒及方法，其特征在于，所述的pCAG-NHEJ为本发明所改造的载体，其序列为SEQ ID NO:1。

4.如权利要求2所述的一种利用基因敲除技术构建细菌缺陷株的试剂盒及方法，其特征在于，所述的pCAG-NHEJ载体双酶切位点优选的为SpeI及BamHI内切酶。

5.一种利用基因敲除技术构建细菌缺陷株的试剂盒及方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

(1)细菌转化所用质粒的构建，所述的细菌转化所用质粒的构建包括pCAG-NHEJ质粒的构建；

(2)细菌转化，细菌转化所用的细菌优选的为E.coli；

(3)抗性筛选；

(4)验证sgRNA对目的基因DNA敲除作用的有效性。