CN106581151B - 一种活血散结中药组合物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种活血散结的中药组合物及其制备方法和应用。按重量份计，所述中药组合物由包括如下组分的原料制备而成：三七5～10份、丹参10～30份、地龙15～30份、海藻10～30份、昆布10～30份和鳖甲10～30份。本发明的中药组合物发挥特定中药之间的协同增效作用，所得到的中药组合物能起到活血化瘀、软坚散结的功效，能使眼内瘀血痰结之有形之物消散，从而能明显改善PVR患者的眼底情况，提高患者视功能。

Description

一种活血散结中药组合物的应用
技术领域
本发明涉及中药制剂领域，更具体地，涉及一种用于活血散结的中药组合物及其制备方法与应用。
背景技术
增生性玻璃体视网膜病变(proiiferative vitreoretinopathy，PVR)是孔源性视网膜脱离、糖尿病视网膜病变、玻璃体出血以及眼球后段穿通伤等眼底疾病的严重并发症。其以玻璃体腔、视网膜表面和视网膜下增殖膜形成为特征，易造成牵拉性视网膜脱离(tractional retinal detachment,TRD)，是许多眼底疾病继续恶化的重要原因，也是孔源性视网膜脱离复位手术失败及术后复发的主要原因。据报道，75％的视网膜脱离因PVR导致手术失败。临床上孔源性视网膜脱离中PVR发生率约为5％-10％。PVR的发生是致盲的原因之一，轻度的PVR有飞蚊症、视力下降、视物变形、视野缺损等表现，PVR后期甚至会导致光感剥夺和失明，眼压降低甚至眼球萎缩。因此，加强探索PVR的发病机制及治疗具有重要的临床意义。
PVR的基本病理生理过程是细胞增生、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的合成和膜的收缩。RPE细胞为参与PVR细胞增生的基本类型，是重要的介导细胞。目前的研究已证明RPE细胞通过自分泌途径表达多种生长因子受体，PDGF受体就是其中之一[4]。PDGF 与受体结合后表现出多种体外活性，不仅刺激RPE、成纤维细胞和内皮细胞的有丝***，还可促进损伤修复。因此，采用PDGF干预体外培养兔RPE细胞实现PVR的细胞模型具有一定理论基础与依据。
目前PVR的治疗以手术为主，主要目的是封闭视网膜裂孔、松解和对抗视网膜牵拉。手术包括玻璃体切割术、巩膜外垫压、视网膜前膜剥离及眼内气体或硅油填塞术等。手术治疗只能切除已经形成的增生膜，尽可能恢复视网膜解剖形态，仅有60％-80％解剖复位成功率 [7]，手术可能再次刺激细胞移位分化，导致PVR复发。因此，许多学者提出使用药物预防 PVR的发展，主要目的在于抗增殖及炎症，而这些药物或处于实验临床阶段，或因其药物毒性、长期并发症及药物浓度等原因，目前尚无药物作为防治和治疗PVR的临床常规药物。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种通过活血散结的方法治疗增生性玻璃体视网膜病变的中药组合物。
经研究表明，增生性玻璃体视网膜病变即PVR是由于肝胆气滞致瘀血内停，多属气血瘀滞，脾肾失调致阴虚痰结多属痰湿内聚，而后期二者多胶结阻滞致神膏衰损，痰结血瘀，终致有形之物形成而致。
本发明将几述中药成分合用，发挥几者之间的协同增效作用，所得到的中药组合物能起到活血化瘀、软坚散结的功效，能使眼内瘀血痰结之有形之物消散，从而能明显改善PVR患者的眼底情况，提高患者视功能。
为了提高活血散结的效果，本发明的中药组合物由包括如下重量份的成分制备而成：三七5～10份、丹参10～30份、地龙15～30份、海藻10～30份、昆布10～30份和鳖甲10～30份。
为了使其预防或治疗PVR的效果更好，进一步优选为由包括如下重量份的成分制备而成：三七5～9份、丹参13～20份、地龙13～23份、海藻13～19份、昆布13～19份和鳖甲13～ 19份。
更优选为由包括如下重量份的成分制备而成：三七5～7份、丹参14～17份、地龙16～ 20份、海藻14～17份、昆布14～17份和鳖甲14～17份。
最优选为由包括如下重量份的成分制备而成：三七6份、丹参15份、地龙18份、海藻15份、昆布15份和鳖甲15份。
在本发明的实施例中，所述中药组合物中的活性成分为三七、丹参、地龙、海藻、昆布和鳖甲，中药组合物中的活性成分由上述七种中药组成。
所述重量份可以是μg、mg、g、kg等本领域公知的重量单位，也可以是其倍数，如1/10、 1/100、10倍、100倍等。
本发明的中药组合物中可以进一步包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。此处的载体和赋形剂为本领域技术人员所理解，可依据需要制备的不同剂型以选择合适的载体或赋形剂，具体为本领域技术人员所掌握，本领域技术人员可以根据制剂的实际需求加以选择。
用于本发明的中药组合物的载体或赋形剂可选自稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、润湿剂、溶剂、表面活性剂或矫味剂中的一种或多种。
本发明的中药组合物，可经由常规方法制备成药学上各种常见剂型，如片剂、胶囊、丸剂、散剂、颗粒剂、口服液、注射剂或膏剂等。在本发明中，优选为口服液。给药方式可为口服、静脉、皮下、透皮或局部给药等，以单位给药形式给予动物或人。
所述中药组合物优选为口服液，其生药浓度为1g/ml-1.2g/ml，更优选为 1.025g/ml-1.10g/ml。
在本发明的中药组合物，通常以剂量单位配制。依据本领域中临床剂量用量，每日给予 1次或多次。特定情况也可以采用较高或较低剂量，每个患者的适用剂量由医生根据给药模式、患者的年龄、体重和反应来最终决定。通常可根据患者的体重来定，每次给药为每Kg重量给15-30ml药。
本发明的中药组合物优选为口服液，以水为稀释剂，优选采用水煎法制得，其制备方法包括以下步骤：按照配比称取各成分混合，加入水，煮沸，过滤药渣，将滤液浓缩至生药浓度为1g/ml-1.2g/ml，即得。
为了使效果更好，生药浓度为1.025g/ml-1.10g/ml。
当不需要立即使用时，将其冷藏。采用上述方法制得的口服液性能稳定。
本发明的另一个目的在于提供上述中药组合物或上述中药组合物的制备方法在制备治疗增生性玻璃体视网膜病变PVR药物中的应用。
本申请基于中医理论和现代药理的研究成果，经过多年临床试验总结出的中药组合物，配伍合理，具有活血化阏、软坚散结的功能，也具有抗凝、抗纤维、抑制细胞异常增殖的作用，能使眼内阏血痰结之有形之物消散，可有效防治增生性玻璃体视网膜病变，无毒副作用。
附图说明
图1为试验例2中各组别的凝胶电泳实验的结果图；
图2为试验例3中各组别western blot检测蛋白表达图谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下面结合典型实施例对本发明作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所涉及的所有中药均为已知的市售产品，购自湖南中医药大第一附属医院药剂科，所述“份”的单位选为g。
实施例1
本实施例提供了一种中药组合物(口服液)，其由如下原料采用水煎法制备得到：三七6g，丹参15g、地龙18g、海藻15g、昆布15g和鳖甲15g。
本实施例同时提供了上述口服液的制备方法，具体即：将原料混合，向其中加入相对药总量10倍量的水，浸泡30min后煎煮30min，过滤药渣后得混合药液，将混合药液浓缩至生药浓度为1.025g/ml，4℃下保存。
实施例2
本实施例提供了一种中药组合物(口服液)，由如下原料采用水煎法制备得到：三七5g，丹参13g、地龙10g、海藻10g、昆布10g和鳖甲10g。
本实施例同时提供了上述口服液的制备方法，具体即：本实施例同时提供了上述口服液的制备方法，具体即：将原料混合，向其中加入相对药总量10倍量的水，浸泡30min后煎煮 30min，过滤药渣后得混合药液，将混合药液浓缩至生药浓度为1.0g/ml，冷藏保存。
实施例3
本实施例提供了一种中药组合物(口服液)，由如下原料采用水煎法制备得到：三七7g，丹参10g、地龙15g、海藻19g、昆布15g和鳖甲15g。
本实施例同时提供了上述口服液的制备方法，具体即：本实施例同时提供了上述口服液的制备方法，具体即：将原料混合，向其中加入相对药总量10倍量的水，浸泡30min后煎煮 30min，过滤药渣后得混合药液，将混合药液浓缩至生药浓度为1.1g/ml，冷藏保存。
实施例4
本实施例提供了一种中药组合物(口服液)，由如下原料采用水煎法制备得到：三七6g，丹参14g、地龙20g、海藻13g、昆布13g和鳖甲19g。
本实施例同时提供了上述口服液的制备方法，具体即：本实施例同时提供了上述口服液的制备方法，具体即：将原料混合，向其中加入相对药总量10倍量的水，浸泡30min后煎煮 30min，过滤药渣后得混合药液，将混合药液浓缩至生药浓度为1.025g/ml，冷藏保存。
实施例5
本实施例提供了一种中药组合物(口服液)，由如下原料采用水煎法制备得到：三七9g，丹参20g、地龙23g、海藻30g、昆布30g、鳖甲13g。
本实施例同时提供了上述口服液的制备方法，具体即：本实施例同时提供了上述口服液的制备方法，具体即：将原料混合，向其中加入相对药总量10倍量的水，浸泡30min后煎煮30min，过滤药渣后得混合药液，将混合药液浓缩至生药浓度为1.10g/ml，冷藏保存。
实施例6
本实施例提供了一种中药组合物(口服液)，由如下原料采用水煎法制备得到：三七10g，丹参30g、地龙30g、海藻30g、昆布30g和鳖甲30g。
本实施例同时提供了上述口服液的制备方法，具体即：本实施例同时提供了上述口服液的制备方法，具体即：将原料混合，向其中加入相对药总量10倍量的水，浸泡30min后煎煮30min，过滤药渣后得混合药液，将混合药液浓缩至生药浓度为1.20g/ml，冷藏保存。
实施例7
本实施例提供了一种中药组合物(口服液)，由如下原料采用水煎法制备得到：三七6g，丹参17g、地龙20g、海藻17g、昆布17g和鳖甲17g。
本实施例同时提供了上述口服液的制备方法，具体即：本实施例同时提供了上述口服液的制备方法，具体即：将原料混合，向其中加入相对药总量10倍量的水，浸泡30min后煎煮30min，过滤药渣后得混合药液，将混合药液浓缩至生药浓度为1.10g/ml，冷藏保存。
实施例8
本实施例提供了一种中药组合物(口服液)，由如下原料采用水煎法制备得到：三七6g，丹参15g、地龙16g、海藻14g、昆布14g和鳖甲14g。
本实施例同时提供了上述口服液的制备方法，具体即：本实施例同时提供了上述口服液的制备方法，具体即：将原料混合，向其中加入相对药总量10倍量的水，浸泡30min后煎煮30min，过滤药渣后得混合药液，将混合药液浓缩至生药浓度为1.025g/ml，冷藏保存。
以下通过试验例进一步阐述本发明所述的中药组合物对PVR的治疗效果，其中，以实施例1中的组合物(口服液)为例。
实验动物：成年健康家兔10只，雌雄兼用，体重1500-2000g，由湖南中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号：SYXK(湘)2015-0004。常规喂养，控制室温20-26℃，保持空气流通，相对湿度55％左右。实验前所有动物适应性饲养1周。
实验分组：成年健康家兔10只，采用随机数字法分为A、B两组，每组6只。分别为：A代表空白组，B代表中药组合物组。
给药剂量及方法：根据人与家兔体表面积换算方法计算(人以60Kg体重为标准，家兔以 1.6Kg体重为标准)。等效剂量换算法折算家兔中药组合物组的等效临床剂量为20.256g/Kg≈20.5g/Kg，灌服中药组合物口服液，每日20ml/Kg灌胃，分早晚两次灌服，连续灌胃5天。空白组灌服蒸馏水，每日20ml/Kg灌胃，分早晚两次灌服，连续灌胃5天。
试验例1：本发明的中药组合物对在PDGF干预下兔 RPE细胞增殖的影响
实验分组：空白对照组(DMEM)，正常血浆组(正常血浆)，PDGF组(PDGF(10μg·L-1))， PDGF+AG1296组(PDGF(10μg·L-1)+AG1296(10μmol·L-1))，PDGF+含药血浆组(PDGF(10 μg·L-1)+含中药组合物血浆(10wt％))，下文中含中药组合物血浆简称为含药血浆。
实验步骤：
1、从给药后的家兔体内采集含有中药组合物的血浆
采血前禁食禁水12小时，末次给药2小时后，按照10％水合氯醛3.5ml/Kg体重标准腹腔注射麻醉，将家兔固定后，剪除腹部兔毛，组织剪剪开腹部皮肤及腹膜，钝性分离腹主动脉血管周围组织，无菌条件下腹主动脉取血，收集血液于含3.2％枸缘酸钠1:9真空采血管内，颠倒混匀后静置。在3000转每分钟条件下离心10min，收集上清液即为含药血浆。0.22μm过滤器分装，置于-70℃超低温冰箱保存。
2、使用CCK法检测含有中药组合物含药血浆对PDGF干预下兔RPE细胞的活力
1)收集兔RPE对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔(96孔培养板)加入100ul，铺板使待测细胞密度至5000个细胞/孔，边缘孔用PBS填充。
2)5％CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底，加入用无血清培养基配置的不同浓度梯度的药物。
3)5％CO2，37℃培养48h。
4)每孔加入10ul试剂盒中7sea-cell counting kit溶液，同步设调零孔。继续培养 2h。
5)用酶标仪检测450nm处的吸光值(OD)。
6)记录结果，绘制。
3、结果
如表1所示，各组RPE细胞活力的检测结果显示，正常血浆组对RPE细胞无明显的抑制作用，和空白对照组比较，无显著差异(P>0.05)。PDGF组与正常血浆组细胞活力比较明显增加，两组间细胞活力差异有显著统计学意义(P＜0.01)，而PDGF+AG1296组、PDGF+含药血浆组与PDGF组比较，细胞活力显著抑制，差异有统计学意义(P＜0.01)。证明PDGF对RPE细胞活力有一定的促进作用，AG1296作为PDGF的抑制剂能抑制RPE细胞的活力，而10％的含药血浆亦能抑制RPE细胞的活力，与抑制剂作用相当，能够抑制PVR的进程，防治PVR。
表1含药血浆对PDGF干预下RPE细胞活力的影响
Figure GDA0002921835710000061
Figure GDA0002921835710000071
与正常血浆组比较，**P<0.01；与PDGF组比较，△△P<0.01
试验例2：本发明的中药组合物对在PDGF干预下兔 RPE细胞IGF1mRNA表达的影响
实验步骤：
1、从给药后的家兔体内采集含有中药组合物的血浆
采血前禁食禁水12小时，末次给药2小时后，按照10％水合氯醛3.5ml/Kg体重标准腹腔注射麻醉，将家兔固定后，剪除腹部兔毛，组织剪剪开腹部皮肤及腹膜，钝性分离腹主动脉血管周围组织，无菌条件下腹主动脉取血，收集血液于含3.2％枸缘酸钠1:9真空采血管内，颠倒混匀后静置。在3000转每分钟条件下离心10min，收集上清液即为含药血浆。0.22μm过滤器分装，置于-70℃超低温冰箱保存。
2、细胞准备
1)常规培养RPE细胞。
2)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔(6孔培养板)加入300ul，补齐培养基至 2ml，待测细胞密度至75％。按下表2干预方式处理细胞。设4个复孔/组。
表2 RPE对数期细胞组别的干预方式
Figure GDA0002921835710000081
3)干预48h后，收集细胞进行QPCR检测。
3、引物设计
从NCBI中下载以下基因序列，引物设计采用Primer5.0软件，引物序列见下表3。并提前交由生工公司合成备用。
表3引物序列
Figure GDA0002921835710000082
4、RNA提取及逆转录
从RPE细胞中提取RNA并反转录得到cDNA，并以该cDNA为模板，用针对目的基因设计合成的QPCR引物进行real-time PCR，以检测RPE细胞中目的基因的表达。
4.1 RPE细胞中总RNA抽提
1)每孔RPE细胞加入300μL Trizol，吹打，室温静置5min，收集至1.5ml无RNA酶EP管中；
2)每管加入60μL氯仿，剧烈震荡15s，室温静置3min；4℃，12000rpm，离心15min；
3)从每管中吸取上清至另一新的1.5mLEP管。加入等体积异丙醇，混匀后室温静置20min；
4)4℃，12000rpm离心10min后，去上清；加入至少1mL 4℃预冷的75％乙醇，洗涤沉淀；
5)4℃，10000rpm离心5min，弃上清；4℃，10000rpm再次离心5min，吸去残液，室温干燥(不需完全干燥)；
6)加入20μL RNase-free水，至完全溶解，-80℃保存或进行后续实验。
4.2 2％琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA纯度
点样顺序：A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4、C1、C2、C3、C4、D1、D2、D3、D4、E1、 E2、E3、E4。
上样量：2ul/样本+1ul loading buffer
4.3 测RNA浓度与纯度
使用超微量分光光度计，上样量：2ul
4.4 第一链cDNA合成
1)取1.0μg Total RNA加Nuclease-Free Water到无RNA酶的EP管中，混匀后离心，70℃温浴10min，立即置于冰上。
2)按下表4的比例加一下反应体系的其他试剂(冰上进行)，混匀，短暂离心。
表4各试剂的加入量
Figure GDA0002921835710000091
3)上述体系在42℃反应15min，然后在70℃水浴锅中水浴10min使ReverseTranscriptase失活。
4)将得到cDNA置于-20℃保存备用。
5、Real-Time PCR检测目的基因和内参基因表达情况
1)按下表5中的比例配置反应体系：
表5各试剂的加入量
Figure GDA0002921835710000101
2)扩增程序：
94℃4min；
94℃40sec，60℃30sec，×40cycle
3)获得扩增图谱
6、统计数据
根据仪器检测出来的Ct值，计算2-△△Ct。
计算公式：△Ct(实验)＝Ct目的基因(实验)-Ct内参基因(实验)；
△△CT(实验)＝△Ct(实验)-△Ct(对照)；
然后算出相对表达量＝2-△△Ct。
7、结果
1)图1为使用凝胶电泳鉴定所有样本中RNA的纯度。表6为使用超微量分光光度计测量所有样本中RNA浓度与纯度的结果。从图1和表6中可知，所有样本的浓度合适，且纯度完整。
表6超微量分光光度计测RNA浓度与纯度
Figure GDA0002921835710000111
2)IGF1是PVR发生发展过程中一个非常重要的影响因子。如表7所示，PCR检测结果显示:以正常血浆组作为参照，正常血浆组对IGF1基因的表达无影响,与空白组比较,无显著性差异(P>0.05)；PDGF干预可以促进IGF1基因的表达，与正常血浆组比较，有显著差异(P<0.01)； AG1296和含药血浆均能明显下调IGF1基因的表达，于PDGF组比较，有显著差异(P<0.01)；其中AG1296组和含药血浆组间比较，无显著性差异(P>0.05)。
表7含药血浆对PDGF干预下RPE细胞中IGF1mRNA的影响
Figure GDA0002921835710000112
Figure GDA0002921835710000113
与正常血浆组比较，**P<0.01；与PDGF组比较，△△P<0.01
试验例3：本发明的中药组合物对在PDGF干预下兔 RPE细胞IGF1蛋白表达的影响
实验分组：空白对照组(DMEM)，正常血浆组(正常血浆)，PDGF组(PDGF(10μg·L-1))， PDGF+AG1296组(PDGF(10μg·L-1)+AG1296(10μmol·L-1))，PDGF+含药血浆组(PDGF(10 μg·L-1)+含中药组合物血浆(10wt％))。
实验步骤：
1、从给药后的家兔体内采集含有中药组合物的血浆
采血前禁食禁水12小时，末次给药2小时后，按照10％水合氯醛3.5ml/Kg体重标准腹腔注射麻醉，将家兔固定后，剪除腹部兔毛，组织剪剪开腹部皮肤及腹膜，钝性分离腹主动脉血管周围组织，无菌条件下腹主动脉取血，收集血液于含3.2％枸缘酸钠1:9真空采血管内，颠倒混匀后静置。在3000转每分钟条件下离心10min，收集上清液即为含药血浆。0.22μm过滤器分装，置于-70℃超低温冰箱保存。
2、Western Blotting法检测兔RPE细胞IGF1蛋白表达
2.1细胞准备
用胰酶消化液消化并收集对数生长期的RPE细胞；
1)调整细胞悬液密度至5×105cell/ml；
2)取6孔板，根据下述分组情况每个孔板加入相应细胞1ml/孔上述细胞悬液，补足2ml 完全培养基，轻轻混匀；
3)置于5％CO2 37℃培养箱中培养；
4)至每孔内细胞融合率达70-80％，根据表1的干预方式，加入相应干预因素；
5)48h后，收样进行western blot检测。
2.2样品准备
将需要抽提的蛋白的细胞样本加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，4℃充***解，将其刮入1.5ml EP管中，95℃以上加热10分钟，12000g离心10分钟，取上清，进行蛋白质定量后贮存于-80℃冰箱。
2.3蛋白定量
(1)标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表8加入试剂
表8试剂的种类及加入量
Figure GDA0002921835710000131
(2)根据样品数量，将BCA试剂A与试剂B按体积比为50:1配制适量BCA工作液，充分混匀；
(3)各孔加入160μl BCA工作液；
(4)把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下测定吸光度。以吸光值为横坐标，蛋白浓度(μg/μl)为纵坐标，绘出标准曲线；
(5)在酶标板中加入2μl待测蛋白和18μl PBS(稀释10倍)，加入160μl BCA工作液，把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下测定吸光度。
(6)根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白浓度(μg/μl)，乘以样品稀释倍数(10)即为样品实际浓度(单位：μg/μl)。
2.4 PAGE胶的制备
(1)下层分离胶的制备
根据目的蛋白的分子量选择不同的凝胶浓度，高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离，不同浓度的分离胶按下表进行配制，待下层胶凝固后进行上次浓缩胶的配制。本次实验采用的是10％的分离胶。
(2)上层浓缩胶的配制
根据需要按下表9配制浓缩胶，并插好梳子
表9各组份对应的取样量
Figure GDA0002921835710000141
2.5上样及电泳
(1)上样：每孔上样量约为40μg蛋白，可以根据实验要求加大上样量。根据蛋白定量结果取所需蛋白加入适量上样缓冲液，沸水浴10min后离心取上清上样。将配制好的PAGE胶放入电泳槽中，加入适量电泳缓冲液，取下梳子用枪轻轻吹打加样孔，避免孔内有余胶残留影响上样。将准备好的样品用加样枪慢慢加到对应的孔内，注意勿溢出加样孔。
(2)电泳：一般浓缩胶80V 20分钟，分离胶120V 60分钟，可以根据具体实验要求调整电压和时间。当染料到达胶底部时切断电源，停止电泳，进行下一步转膜。
2.6转膜
(1)切取6张大小一样的滤纸，其大小与转印区域一样。然后，把它们浸泡在电转缓冲液中。切取同样大小的一张PVDF膜，在甲醇中浸泡2min至半透明，用清水冲洗干净后，放入电转缓冲液中，平衡10min。
(2)在PVDF膜上垫3张滤纸，然后将凝胶平铺于PVDF膜上，再放上3张滤纸，用玻棒在滤纸面上滚动除去各层气泡，然后放入转移槽内，倒入电转移缓冲液，胶面向阴极，膜面向阳极，4℃，380mA转移1.5h。
2.7膜的封闭及抗体孵育
(1)封闭：5％脱脂奶粉(检测磷酸化蛋白用BSA)室温封闭1小时或4℃过夜。
(2)一抗：根据说明书稀释抗体，将抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，和膜室温孵育 2小时或4℃孵育过夜。
(3)二抗：孵育一抗的膜用TBST洗涤3次，每次5min。随后根据用量，按照1:2000稀释 HRP标记的二抗，与膜37℃孵育1h。用TBST洗涤3次，每次5min。
2.8ECL化学发光检测
按试剂盒说明将ECL液SolA与SolB按1:1混匀，铺于膜上反应5min。(将膜从TBST中取出，在滤纸上吸干洗涤液，放于保鲜膜上，据已标好的记号，使正面朝上，ECL液在正面反应约4min时，用镊子夹住膜在吸水纸上滤干ECL液，将膜铺于另一张保鲜膜上，这时候正面朝下，保鲜膜包好膜后，反转过来，用透明胶固定好，尽量的去掉皱痕，5min时，立即关上显影夹，入暗室显影)。曝光：1min，5min，45min，然后显影，定影，晾干。
2.9凝胶图像分析
将胶片进行扫描，用图像分析软件IPP6.0对图像进行灰度分析。
3、结果
结果见表10和图2。Western blot检测结果显示：正常血浆对IGF1蛋白的表达无影响，与空白对照组比较，无显著性差异(P>0.05)；PDGF干预可以促进IGF1蛋白的表达，与正常血浆组比较，有显著差异(P<0.01)；而AG1296和含药血浆均能明显下调IGF1蛋白的表达，与 PDGF组比较，有显著差异(P<0.01)；其中AG1296组和含药血浆组间比较，无显著性差异(P>0.05)。
表10含药血浆对PDGF干预下RPE细胞中IGF1蛋白表达的影响
Figure GDA0002921835710000151
Figure GDA0002921835710000152
与正常血浆组比较，**P<0.01；与PDGF组比较，□□P<0.01。
在本文的试验例中，采用SPPS17.0统计学软件对所有数据资料进行统计学分析，计量资料均以均值±标准差
Figure GDA0002921835710000153
表示。对样本先进行方差齐性检验，方差齐时，用One-Way ANOVA 检验，并进行组间的多重比较；方差不齐时，用非参数秩和检验，先用Kruskal-Wallis Htest 比较总的差异，再用Mann-Whitney U进行两组之间比较。计数资料采用完全随机设计多样本比较的秩和检验，显著性以P<0.05判定。
最后，本申请的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种活血散结的中药组合物在制备治疗或预防增生性玻璃体视网膜病变药物中的应用，其特征在于，按重量份计，所述中药组合物由如下组分的原料药制备而成：
三七5～10份、丹参10～30份、地龙15～30份、海藻10～30份、昆布10～30份和鳖甲10～30份。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，按重量份计，所述中药组合物由如下组分的原料药制备而成：
三七5～9份、丹参13～20份、地龙15～23份、海藻13～19份、昆布13～19份和鳖甲13～19份。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，按重量份计，所述中药组合物由如下组分的原料药制备而成：
三七6份、丹参15份、地龙18份、海藻15份、昆布15份和鳖甲15份。
4.根据权利要求1-3 中任一项所述的应用，其特征在于，所述中药组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述中药组合物为片剂、胶囊、丸剂、散剂、颗粒剂、口服液、注射剂或膏剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述中药组合物为口服液，其生药浓度为1g/ml-1.2g/ml。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，其生药浓度为1.025g/ml-1.10g/ml。
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中药加针刺治疗血栓性静脉炎证治心得;曹改杰 郝现军;《中国社区医师（医学专业）》;20101030(第20期);150页 *

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