CN106568979B - 一种测量刀鲚GnRH-R含量的方法及其应用 - Google Patents

一种测量刀鲚GnRH-R含量的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测量刀鲚GnRH‑R含量的方法及其应用，包含以下步骤：(1)绘制GnRH‑R标准品标准曲线，所述标准曲线是492nm条件下的绝对吸光度值与GnRH‑R浓度的关系曲线；(2)通过ELISA方法检测待测样品的吸光度值，根据标准曲线计算GnRH‑R的含量。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述测量刀鲚GnRH‑R含量的方法快速、准确，且灵敏度高；(2)所述方法检测过程中克服了以往采用同位素标记的手段，因而减少了放射性污染；(3)所述方法为探明鱼类等低等脊椎动物生殖周期调控机制奠定基础；(4)所述方法具有高特异性，能够检测痕迹量的GnRH‑R酶。

Description

一种测量刀鲚GnRH-R含量的方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种酶的检测方法，尤其涉及一种测量刀鲚GnRH-R含量的方法及其应用。
背景技术
***释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是下丘脑-垂体-性腺轴(Hypohthalamus-Pituitary-Gonadal axis，HPG)重要的神经内分泌因子，也是调节生殖***功能的关键信号分子，能调节垂体及卵巢水平的***(folliclestimulating hormone，FSH)、***(luteinizinghormone，LH)、***(Estradiol，E2)、孕激素(Progestogen，P4)等多种性激素水平。GnRH通常由下丘脑的神经细胞合成并分泌，通过垂体门脉***以脉冲的方式分泌到垂体前叶，与其促性腺细胞表面的GnRH受体(GnRH Receptor，GnRH-R)结合，促进性腺激素即FSH和LH的合成与分泌，从而维持正常的生殖***功能。GnRH-R是GnRH发挥生物活性的必需物质。大量研究表明，GnRH存在三种亚型(GnRH1，GnRH2，GnRH3)，其功能既有交叉也有各自特异的作用。大多数高等动物机体内GnRH-R有两种类型GnRH-R I和GnRH-R II。研究发现GnRH-R不仅位于HPG***，在动物机体的其他组织也有分布，尤其是在外周性腺组织中。检测生物机体体液内GnRH-R的含量变化是研究其生殖规律的基础条件。
研究发现GnRH-R是一种大约由327-328个氨基酸构成的，相对分子量约为38kDa的糖蛋白，结构分析发现其含7个跨膜区，是典型的G蛋白(protein G)偶联受体。当GnRH与细胞膜上的GnRH-R结合后，GnRH将激活其受体以刺激垂体前叶的多种信号通路。在GnRH或其它内源因素的刺激下，GnRH和GnRH-R结合，激活磷脂酶C(PLC)，促使多聚磷酸肌醇的分解，形成IP3和DG，IP3诱导Ca2+从细胞内质网中释放。GnRH与受体结合的同时也激活了Ca2+通道，促使细胞外Ca2+进入细胞内。Ca2+和DG激活蛋白激酶C，接着细胞内Ca2+和蛋白激酶C(PKC)相互作用进行细胞内反应的调控，从而诱导***的释放。RNA印迹、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、原位杂交和受体结合分析表明，在大鼠等哺乳动物垂体细胞中，GnRH-R大量分布在表达LH或FSH的促性腺细胞上。除下丘脑-垂体轴系以外，GnRH-R在卵泡颗粒细胞和黄体细胞、***细胞、胎盘细胞、滋养层细胞和合体滋养层细胞、正常子宫组织、乳腺组织和***均有GnRH-R的表达。
研究表明，GnRH-R的表达和合成由多种内源性激素如GnRH，E2，P4和抑制素等的调控，而这些激素通常共同存在于血液循环中，而激素之间的相互作用也会影响到GnRH-R的表达和合成。大量研究表明GnRH-R水平在高等脊椎动物生殖周期中呈动态变化，这种动态变化模式与垂体上结合的GnRH数量和从卵巢滤泡分泌的E2产量密切相关，这些结果反映了***、孕酮、抑制素等内分泌激素对GnRH-R相互作用的综合效应。而在鱼类等低等脊椎动物生殖周期的调控中，GnRH-R是否具有类似的调控机制一直是一个悬而未决的科学问题。
综上所述，开展对GnRH-R调控鱼类生殖内分泌机制的研究，将有助于人们进一步了解GnRH-R在体内的调节变化机制及在鱼类生殖发育和生殖调控中的作用机制，这将对它们在鱼类繁育和种苗生产实际的应用产生重大影响。因此，开发一项快速高效、无污染，高特异性而且对人体无毒害的检测鱼类发育和生殖过程中GnRH-R等相关激素受体含量的检测方法势在必行。
自从上个世纪60年代放射免疫测定方法的建立，性腺激素FSH和LH等的测定变得十分方便，但是由于其具有放射性，污染物处理困难，对人体有一定的毒害作用，其应用受到一定程度的限制。上世纪90年代非同位素测定方法出现，酶免疫法，化学发光方法的兴起等均可快速测定FSH和LH等性腺激素。然而到目前为止，关于检测GnRH-R的方法一直未发现高效快捷的方法。为此，本专利在基于ELISA技术和FPLC***，对长江刀鲚等江海洄游性鱼类GnRH-R测定的反复验证，研发出一种可以高效快速检测鱼类生殖洄游和繁殖时期GnRH-R等激素含量的方法，同时探讨了该方法在鱼类繁育生产中的应用。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，获得一种GnRH-R含量快速、准确的测定方法，及鱼类人工繁育和生殖内分泌激素的测定手段，本发明提供了一种测量刀鲚GnRH-R含量的方法及其应用。
技术方案：一种测量刀鲚GnRH-R含量的方法，包含以下步骤：
(1)绘制GnRH-R标准品标准曲线，所述标准曲线是492nm条件下的绝对吸光度值与GnRH-R浓度的关系曲线；
(2)通过ELISA方法检测待测样品的吸光度值，根据标准曲线计算GnRH-R的含量。
优选的，所述标准曲线中GnRH-R标准品的浓度范围为0～32mIU/mL，绝对吸光度值范围为0～1.3907。
优选的，所述待测样品为从刀鲚的血液或垂体中分离纯化获得的GnRH-R蛋白。
优选的，所述ELISA方法的具体步骤为：
(1)抗体包被：利用DE-52液相色谱层析柱从刀鲚血清中层析获得anti-GnRH-R蛋白，转移至聚苯乙烯96孔微量滴定板中，加入PBS缓冲液，水浴包被和孵育；
(2)封闭：三步洗涤：PBS-T缓冲液连续洗涤、等体积的PBS缓冲液洗涤、PBS-1％BSA缓冲液洗涤后，37℃培养4小时或在4℃过夜培养；
(3)样品孵育：PBS-T洗涤、PBS洗涤后，在96孔板中加入样品，连续用PBS-BSA稀释，将稀释液加到酶标板中，37℃孵育4小时；
(4)生物素标记的anti-GnRH-R孵育：用缓冲液对步骤(3)孵育后的样品进行1:400的稀释，缓冲液为含有0.1％BSA，0.1％Tween缓冲液和0.002％硫柳汞的混合溶液，pH值调整为7.0，稀释完成后加入生物素标记的抗体，37℃孵育3-4小时；
(5)链霉亲和素-辣根过氧化物酶共轭培养：按照步骤(3)所述洗涤方法再次洗涤滴定板，向各孔中加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶，37℃孵育4-6小时；
(6)酶法显色反应：按照步骤(3)所述方法洗涤步骤(5)孵育后的滴定板，室温黑暗环境中染色，测定492nm处的吸光度值。
优选的，所述步骤(5)中加入的链霉亲和素-辣根过氧化物酶是经PB-BSA-T按1:2000稀释后的产物。
优选的，所述步骤(6)中酶法显色反应的具体步骤为：在每孔中加入邻苯二胺，具体为含有0.02％过氧化氢的3mg/mL 0.1M的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH值为5.0；并通过HCl终止反应。
所述的测量刀鲚GnRH-R含量的方法在刀鲚人工繁育中的应用。
所述的测量刀鲚GnRH-R含量的方法在测定江海洄游性鱼类的生殖内分泌激素中的应用。
有益效果：(1)本发明所述测量刀鲚GnRH-R含量的方法快速、准确，且灵敏度高；(2)所述方法检测过程中克服了以往采用同位素标记的手段，因而减少了放射性污染；(3)所述方法为探明鱼类等低等脊椎动物生殖周期调控机制奠定基础；(4)所述方法具有高特异性，能够检测痕迹量的GnRH-R酶。
附图说明
图1GnRH-R蛋白SDS-PAGE电泳图；
图2为GnRH-R标准品的ELISA检测标准曲线图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一种测量刀鲚GnRH-R含量的方法，包含以下步骤：
(1)绘制GnRH-R标准品标准曲线，所述标准曲线是492nm条件下的绝对吸光度值与GnRH-R浓度的关系曲线；
(2)通过ELISA方法检测待测样品的吸光度值，根据标准曲线计算GnRH-R的含量。
所述标准曲线中GnRH-R标准品的浓度范围为0～32mIU/mL，绝对吸光度值范围为0～1.3907，具体如表1所示：
表1 GnRH-R标准品标准曲线绘制表
以绝对OD值为横坐标，标准样品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，具体如图2所示。
所述待测样品为从刀鲚的血液或垂体中分离纯化获得的GnRH-R蛋白，具体过程如下：
(1)样品采集与保存
选取鲜活的雌性刀鲚脑垂体组织和尾静脉血液，术者佩戴医用口罩和塑胶手套等防止采样污染；采样过程需要快速进行，需控制在1-2min内完成，样品立即放入装有干冰的冰盒内带回实验室。
(2)样品预处理
血清分离：血液样品带回实验室后，4℃平衡20分钟，6000rpm离心15分钟，分离血清，-20℃保存备用。
垂体抽提物制备：将垂体在0.01M的PBS缓冲液，pH 7.0的等渗盐水中混合均匀，取混合物在4℃中6000rpm离心20分钟，取上层清夜作为垂体提取物。
血清稀释：
为了通过ELISA方法测量GnRH-R的含量，需要准备稀释的血清。在磷酸盐缓冲液(0.2M NaCl，1％牛血清白蛋白BSA和0.05％正常家兔血清NRS)中将血清稀释，取100μL用于后续ELISA方法测量。
(3)GnRH-R蛋白纯化
利用FPLC***提纯刀鲚垂体GnRH-R蛋白，具体操作按照以下方法进行，在0.01MPBS中将刀鲚垂体混合均匀，取在4℃下5000rpm离心20分钟。将上清液在35％饱和度的硫酸铵中沉淀，12000rpm离心30分钟后收集沉淀物，溶解，通过pH 8.0，0.02M Tris-HCl缓冲液透析。把透析物添加到Mono-Q层析柱(FPLC***，Pharmacia，Uppsala，Sweden)，用含有0.1～1M NaCl的Tris-HCl缓冲液逐步梯度洗脱。含有GnRH-R的洗脱物在Superose TM 12柱上进行凝胶渗透，凝胶上充满0.02M Tris-HCl缓冲液，含有0.2％NaCl(pH为8.0)。利用anti-GnRH-R的兔抗血清采用免疫印迹评估的方法检测刀鲚GnRH-R重组蛋白的存在。
(4)抗血清制备
通过在家兔皮内注射含1mg抗重组anti-GnRH-R的等体积的弗氏完全佐剂获得抗重组刀鲚anti-GnRH-R血清(anti-GnRH-R)，一周内进行相等时间间隔的6次注射，此免疫程序参考Bjornsson,B.,的方法，由于检测到刀鲚GnRH-R有二个亚型，刀鲚anti-GnRH-RII血清与刀鲚GnRH-RI型的交叉反应率分别控制在0.03％和0.05％之间。
(5)免疫印迹法检测
制备的抗血清通过Laemmli,U.K.,所发明的Tris-glycine缓冲液***进行SDS-PAGE凝胶电泳，将0.1％考马斯亮蓝R250溶解在40％乙醇，10％乙酸和50％蒸馏水(CBB)组成的混合溶液中，然后凝胶进行蛋白质染色。蓄积在凝胶中的蛋白质分子量通过以下分子量标记物测量(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。采用1:1000稀释的初级抗血清进行蛋白印迹法，具体结果如图1所示，其中CP(Crude protein,CP)泳道是抽提的总蛋白，PP(PurifiedProtein)泳道是纯化后的蛋白，AS(Anti-serum,AS)泳道是抗血清，NC(Negative Control,NC)泳道是阴性对照，加PBS缓冲液代替GnRH-R抗体。
所述ELISA方法的具体步骤为：
(1)抗体包被：利用DE-52液相色谱层析柱从刀鲚血清中层析获得anti-GnRH-R蛋白，转移至聚苯乙烯96孔微量滴定板中，加入150μL的PBS缓冲液中，26℃水浴包被和孵育4小时；
(2)封闭：三步洗涤：200μL PBS-T(PBS-1％Tween)缓冲液连续洗涤3次、等体积的PBS缓冲液洗涤、再用200μL的PBS-1％BSA缓冲液洗涤后，37℃培养4小时或在4℃过夜培养；
(3)样品孵育：200μL PBS-T(PBS-1％Tween)缓冲液连续洗涤3次、PBS洗涤1次后，在96孔板中加入样品，连续用PBS-BSA稀释，将稀释液加到酶标板中，24℃孵育8小时；
(4)生物素标记的anti-GnRH-R孵育：用缓冲液对步骤(3)孵育后的样品进行1:400的稀释，缓冲液为含有0.1％BSA，0.1％Tween缓冲液和0.002％硫柳汞的混合溶液，pH值调整为7.0，稀释完成后每个样品孔中100μL加入生物素标记的抗体，4℃孵育16小时；
(5)链霉亲和素-辣根过氧化物酶共轭培养：按照步骤(3)所述洗涤方法再次洗涤滴定板，向各孔中加入100μL链霉亲和素-辣根过氧化物酶，28℃孵育1.5小时；所述链霉亲和素-辣根过氧化物酶是经PB-BSA-T按1:2000稀释后的产物。
(6)酶法显色反应：按照步骤(3)所述方法洗涤步骤(5)孵育后的滴定板，室温黑暗环境中染色15分钟，每孔中加入邻苯二胺，(含有0.02％过氧化氢的3mg/mL 0.1M的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH值为5.0)；反应15分钟后，每孔加入150μL的4N HCl终止反应；用ELISA板读数器(Biorad公司2550，Richmond，CA)进行测定492nm的吸光度，利用绘制的标准曲线计算GnRH-R的含量。
通过上述方法测定2015年长江不同江段雌性刀鲚洄游不同时期的GnRH-R的含量，与传统的放射免疫测定法相比，二组数据中除成熟后期的游一定差异，其他各组的数据均无显著差异，具体结果如表2所示。可见，本发明所提供的测量刀鲚等鱼类GnRH-R含量的方法真实可靠，可以用于其他鱼类甚至其他激素或蛋白含量的检测。
表2长江不同江段刀鲚洄游不同时期的GnRH-R的含量与RIA测定法比较结果(mIU/mL)
注：*表示两组数据具有显著差异，即P<0.05；表中括号内为两组数据的P值。

Claims (3)

1.一种测量刀鲚GnRH-R含量的方法，其特征在于，包含以下步骤：
（1）绘制GnRH-R标准品标准曲线，所述标准曲线是492nm条件下的绝对吸光度值与GnRH-R浓度的关系曲线；
（2）通过ELISA方法检测待测样品的吸光度值，根据标准曲线计算GnRH-R的含量；
所述标准曲线中GnRH-R标准品的浓度范围为0～32 mIU/mL，绝对吸光度值范围为0～1.3907；
所述待测样品为从刀鲚的血液中分离纯化获得的GnRH-R蛋白；
所述ELISA方法的具体步骤为：
（1）抗体包被：利用DE-52液相色谱层析柱从家兔血清中层析获得anti-GnRH-R蛋白，转移至聚苯乙烯96孔微量滴定板中，加入 PBS缓冲液，水浴包被和孵育；
（2）封闭：三步洗涤：PBS-T缓冲液连续洗涤、等体积的PBS缓冲液洗涤、PBS-1% BSA缓冲液洗涤后， 37℃培养4小时或在4℃过夜培养；
（3）样品孵育：PBS-T洗涤、PBS洗涤后，在96孔板中加入样品，连续用PBS-BSA稀释，将稀释液加到酶标板中，37℃孵育4小时；
（4）生物素标记的anti-GnRH-R孵育：用缓冲液对步骤（3）孵育后的样品进行1:400的稀释，缓冲液为含有0.1% BSA，0.1% Tween缓冲液和0.002%硫柳汞的混合溶液，pH值调整为7.0，稀释完成后加入生物素标记的抗体，37℃孵育3-4小时；
（5）链霉亲和素-辣根过氧化物酶共轭培养：按照步骤（3）所述洗涤方法再次洗涤滴定板，向各孔中加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶，37℃孵育4-6小时；
（6）酶法显色反应：按照步骤（3）所述方法洗涤步骤（5）孵育后的滴定板，室温黑暗环境中染色，测定492nm处的吸光度值；
其中，步骤（5）中加入的链霉亲和素-辣根过氧化物酶是经PB-BSA-T按1:2000稀释后的产物；步骤（6）中酶法显色反应的具体步骤为：在每孔中加入邻苯二胺，具体为含有0.02％过氧化氢的3 mg/mL 0.1M的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH值为5.0；并通过HCl终止反应。
2.权利要求1所述的测量刀鲚GnRH-R含量的方法在刀鲚人工繁育中的应用。
3.权利要求1所述的测量刀鲚GnRH-R含量的方法在测定刀鲚的生殖内分泌激素中的应用。
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