CN106568979B - 一种测量刀鲚GnRH-R含量的方法及其应用 - Google Patents
一种测量刀鲚GnRH-R含量的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种测量刀鲚GnRH‑R含量的方法及其应用,包含以下步骤:(1)绘制GnRH‑R标准品标准曲线,所述标准曲线是492nm条件下的绝对吸光度值与GnRH‑R浓度的关系曲线;(2)通过ELISA方法检测待测样品的吸光度值,根据标准曲线计算GnRH‑R的含量。与现有技术相比,本发明具有以下优点:(1)本发明所述测量刀鲚GnRH‑R含量的方法快速、准确,且灵敏度高;(2)所述方法检测过程中克服了以往采用同位素标记的手段,因而减少了放射性污染;(3)所述方法为探明鱼类等低等脊椎动物生殖周期调控机制奠定基础;(4)所述方法具有高特异性,能够检测痕迹量的GnRH‑R酶。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及一种酶的检测方法,尤其涉及一种测量刀鲚GnRH-R含量的方法及其应用。
背景技术
***释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是下丘脑-垂体-性腺轴(Hypohthalamus-Pituitary-Gonadal axis,HPG)重要的神经内分泌因子,也是调节生殖***功能的关键信号分子,能调节垂体及卵巢水平的***(folliclestimulating hormone,FSH)、***(luteinizinghormone,LH)、***(Estradiol,E2)、孕激素(Progestogen,P4)等多种性激素水平。GnRH通常由下丘脑的神经细胞合成并分泌,通过垂体门脉***以脉冲的方式分泌到垂体前叶,与其促性腺细胞表面的GnRH受体(GnRH Receptor,GnRH-R)结合,促进性腺激素即FSH和LH的合成与分泌,从而维持正常的生殖***功能。GnRH-R是GnRH发挥生物活性的必需物质。大量研究表明,GnRH存在三种亚型(GnRH1,GnRH2,GnRH3),其功能既有交叉也有各自特异的作用。大多数高等动物机体内GnRH-R有两种类型GnRH-R I和GnRH-R II。研究发现GnRH-R不仅位于HPG***,在动物机体的其他组织也有分布,尤其是在外周性腺组织中。检测生物机体体液内GnRH-R的含量变化是研究其生殖规律的基础条件。
研究发现GnRH-R是一种大约由327-328个氨基酸构成的,相对分子量约为38kDa的糖蛋白,结构分析发现其含7个跨膜区,是典型的G蛋白(protein G)偶联受体。当GnRH与细胞膜上的GnRH-R结合后,GnRH将激活其受体以刺激垂体前叶的多种信号通路。在GnRH或其它内源因素的刺激下,GnRH和GnRH-R结合,激活磷脂酶C(PLC),促使多聚磷酸肌醇的分解,形成IP3和DG,IP3诱导Ca2+从细胞内质网中释放。GnRH与受体结合的同时也激活了Ca2+通道,促使细胞外Ca2+进入细胞内。Ca2+和DG激活蛋白激酶C,接着细胞内Ca2+和蛋白激酶C(PKC)相互作用进行细胞内反应的调控,从而诱导***的释放。RNA印迹、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、原位杂交和受体结合分析表明,在大鼠等哺乳动物垂体细胞中,GnRH-R大量分布在表达LH或FSH的促性腺细胞上。除下丘脑-垂体轴系以外,GnRH-R在卵泡颗粒细胞和黄体细胞、***细胞、胎盘细胞、滋养层细胞和合体滋养层细胞、正常子宫组织、乳腺组织和***均有GnRH-R的表达。
研究表明,GnRH-R的表达和合成由多种内源性激素如GnRH,E2,P4和抑制素等的调控,而这些激素通常共同存在于血液循环中,而激素之间的相互作用也会影响到GnRH-R的表达和合成。大量研究表明GnRH-R水平在高等脊椎动物生殖周期中呈动态变化,这种动态变化模式与垂体上结合的GnRH数量和从卵巢滤泡分泌的E2产量密切相关,这些结果反映了***、孕酮、抑制素等内分泌激素对GnRH-R相互作用的综合效应。而在鱼类等低等脊椎动物生殖周期的调控中,GnRH-R是否具有类似的调控机制一直是一个悬而未决的科学问题。
综上所述,开展对GnRH-R调控鱼类生殖内分泌机制的研究,将有助于人们进一步了解GnRH-R在体内的调节变化机制及在鱼类生殖发育和生殖调控中的作用机制,这将对它们在鱼类繁育和种苗生产实际的应用产生重大影响。因此,开发一项快速高效、无污染,高特异性而且对人体无毒害的检测鱼类发育和生殖过程中GnRH-R等相关激素受体含量的检测方法势在必行。
自从上个世纪60年代放射免疫测定方法的建立,性腺激素FSH和LH等的测定变得十分方便,但是由于其具有放射性,污染物处理困难,对人体有一定的毒害作用,其应用受到一定程度的限制。上世纪90年代非同位素测定方法出现,酶免疫法,化学发光方法的兴起等均可快速测定FSH和LH等性腺激素。然而到目前为止,关于检测GnRH-R的方法一直未发现高效快捷的方法。为此,本专利在基于ELISA技术和FPLC***,对长江刀鲚等江海洄游性鱼类GnRH-R测定的反复验证,研发出一种可以高效快速检测鱼类生殖洄游和繁殖时期GnRH-R等激素含量的方法,同时探讨了该方法在鱼类繁育生产中的应用。
发明内容
解决的技术问题:为了克服现有技术的缺陷,获得一种GnRH-R含量快速、准确的测定方法,及鱼类人工繁育和生殖内分泌激素的测定手段,本发明提供了一种测量刀鲚GnRH-R含量的方法及其应用。
技术方案:一种测量刀鲚GnRH-R含量的方法,包含以下步骤:
(1)绘制GnRH-R标准品标准曲线,所述标准曲线是492nm条件下的绝对吸光度值与GnRH-R浓度的关系曲线;
(2)通过ELISA方法检测待测样品的吸光度值,根据标准曲线计算GnRH-R的含量。
优选的,所述标准曲线中GnRH-R标准品的浓度范围为0~32mIU/mL,绝对吸光度值范围为0~1.3907。
优选的,所述待测样品为从刀鲚的血液或垂体中分离纯化获得的GnRH-R蛋白。
优选的,所述ELISA方法的具体步骤为:
(1)抗体包被:利用DE-52液相色谱层析柱从刀鲚血清中层析获得anti-GnRH-R蛋白,转移至聚苯乙烯96孔微量滴定板中,加入PBS缓冲液,水浴包被和孵育;
(2)封闭:三步洗涤:PBS-T缓冲液连续洗涤、等体积的PBS缓冲液洗涤、PBS-1%BSA缓冲液洗涤后,37℃培养4小时或在4℃过夜培养;
(3)样品孵育:PBS-T洗涤、PBS洗涤后,在96孔板中加入样品,连续用PBS-BSA稀释,将稀释液加到酶标板中,37℃孵育4小时;
(4)生物素标记的anti-GnRH-R孵育:用缓冲液对步骤(3)孵育后的样品进行1:400的稀释,缓冲液为含有0.1%BSA,0.1%Tween缓冲液和0.002%硫柳汞的混合溶液,pH值调整为7.0,稀释完成后加入生物素标记的抗体,37℃孵育3-4小时;
(5)链霉亲和素-辣根过氧化物酶共轭培养:按照步骤(3)所述洗涤方法再次洗涤滴定板,向各孔中加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶,37℃孵育4-6小时;
(6)酶法显色反应:按照步骤(3)所述方法洗涤步骤(5)孵育后的滴定板,室温黑暗环境中染色,测定492nm处的吸光度值。
优选的,所述步骤(5)中加入的链霉亲和素-辣根过氧化物酶是经PB-BSA-T按1:2000稀释后的产物。
优选的,所述步骤(6)中酶法显色反应的具体步骤为:在每孔中加入邻苯二胺,具体为含有0.02%过氧化氢的3mg/mL 0.1M的柠檬酸-磷酸盐缓冲液,pH值为5.0;并通过HCl终止反应。
所述的测量刀鲚GnRH-R含量的方法在刀鲚人工繁育中的应用。
所述的测量刀鲚GnRH-R含量的方法在测定江海洄游性鱼类的生殖内分泌激素中的应用。
有益效果:(1)本发明所述测量刀鲚GnRH-R含量的方法快速、准确,且灵敏度高;(2)所述方法检测过程中克服了以往采用同位素标记的手段,因而减少了放射性污染;(3)所述方法为探明鱼类等低等脊椎动物生殖周期调控机制奠定基础;(4)所述方法具有高特异性,能够检测痕迹量的GnRH-R酶。
附图说明
图1GnRH-R蛋白SDS-PAGE电泳图;
图2为GnRH-R标准品的ELISA检测标准曲线图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换,均属于本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一种测量刀鲚GnRH-R含量的方法,包含以下步骤:
(1)绘制GnRH-R标准品标准曲线,所述标准曲线是492nm条件下的绝对吸光度值与GnRH-R浓度的关系曲线;
(2)通过ELISA方法检测待测样品的吸光度值,根据标准曲线计算GnRH-R的含量。
所述标准曲线中GnRH-R标准品的浓度范围为0~32mIU/mL,绝对吸光度值范围为0~1.3907,具体如表1所示:
表1 GnRH-R标准品标准曲线绘制表
以绝对OD值为横坐标,标准样品浓度为纵坐标,绘制标准曲线,具体如图2所示。
所述待测样品为从刀鲚的血液或垂体中分离纯化获得的GnRH-R蛋白,具体过程如下:
(1)样品采集与保存
选取鲜活的雌性刀鲚脑垂体组织和尾静脉血液,术者佩戴医用口罩和塑胶手套等防止采样污染;采样过程需要快速进行,需控制在1-2min内完成,样品立即放入装有干冰的冰盒内带回实验室。
(2)样品预处理
血清分离:血液样品带回实验室后,4℃平衡20分钟,6000rpm离心15分钟,分离血清,-20℃保存备用。
垂体抽提物制备:将垂体在0.01M的PBS缓冲液,pH 7.0的等渗盐水中混合均匀,取混合物在4℃中6000rpm离心20分钟,取上层清夜作为垂体提取物。
血清稀释:
为了通过ELISA方法测量GnRH-R的含量,需要准备稀释的血清。在磷酸盐缓冲液(0.2M NaCl,1%牛血清白蛋白BSA和0.05%正常家兔血清NRS)中将血清稀释,取100μL用于后续ELISA方法测量。
(3)GnRH-R蛋白纯化
利用FPLC***提纯刀鲚垂体GnRH-R蛋白,具体操作按照以下方法进行,在0.01MPBS中将刀鲚垂体混合均匀,取在4℃下5000rpm离心20分钟。将上清液在35%饱和度的硫酸铵中沉淀,12000rpm离心30分钟后收集沉淀物,溶解,通过pH 8.0,0.02M Tris-HCl缓冲液透析。把透析物添加到Mono-Q层析柱(FPLC***,Pharmacia,Uppsala,Sweden),用含有0.1~1M NaCl的Tris-HCl缓冲液逐步梯度洗脱。含有GnRH-R的洗脱物在Superose TM 12柱上进行凝胶渗透,凝胶上充满0.02M Tris-HCl缓冲液,含有0.2%NaCl(pH为8.0)。利用anti-GnRH-R的兔抗血清采用免疫印迹评估的方法检测刀鲚GnRH-R重组蛋白的存在。
(4)抗血清制备
通过在家兔皮内注射含1mg抗重组anti-GnRH-R的等体积的弗氏完全佐剂获得抗重组刀鲚anti-GnRH-R血清(anti-GnRH-R),一周内进行相等时间间隔的6次注射,此免疫程序参考Bjornsson,B.,的方法,由于检测到刀鲚GnRH-R有二个亚型,刀鲚anti-GnRH-RII血清与刀鲚GnRH-RI型的交叉反应率分别控制在0.03%和0.05%之间。
(5)免疫印迹法检测
制备的抗血清通过Laemmli,U.K.,所发明的Tris-glycine缓冲液***进行SDS-PAGE凝胶电泳,将0.1%考马斯亮蓝R250溶解在40%乙醇,10%乙酸和50%蒸馏水(CBB)组成的混合溶液中,然后凝胶进行蛋白质染色。蓄积在凝胶中的蛋白质分子量通过以下分子量标记物测量(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。采用1:1000稀释的初级抗血清进行蛋白印迹法,具体结果如图1所示,其中CP(Crude protein,CP)泳道是抽提的总蛋白,PP(PurifiedProtein)泳道是纯化后的蛋白,AS(Anti-serum,AS)泳道是抗血清,NC(Negative Control,NC)泳道是阴性对照,加PBS缓冲液代替GnRH-R抗体。
所述ELISA方法的具体步骤为:
(1)抗体包被:利用DE-52液相色谱层析柱从刀鲚血清中层析获得anti-GnRH-R蛋白,转移至聚苯乙烯96孔微量滴定板中,加入150μL的PBS缓冲液中,26℃水浴包被和孵育4小时;
(2)封闭:三步洗涤:200μL PBS-T(PBS-1%Tween)缓冲液连续洗涤3次、等体积的PBS缓冲液洗涤、再用200μL的PBS-1%BSA缓冲液洗涤后,37℃培养4小时或在4℃过夜培养;
(3)样品孵育:200μL PBS-T(PBS-1%Tween)缓冲液连续洗涤3次、PBS洗涤1次后,在96孔板中加入样品,连续用PBS-BSA稀释,将稀释液加到酶标板中,24℃孵育8小时;
(4)生物素标记的anti-GnRH-R孵育:用缓冲液对步骤(3)孵育后的样品进行1:400的稀释,缓冲液为含有0.1%BSA,0.1%Tween缓冲液和0.002%硫柳汞的混合溶液,pH值调整为7.0,稀释完成后每个样品孔中100μL加入生物素标记的抗体,4℃孵育16小时;
(5)链霉亲和素-辣根过氧化物酶共轭培养:按照步骤(3)所述洗涤方法再次洗涤滴定板,向各孔中加入100μL链霉亲和素-辣根过氧化物酶,28℃孵育1.5小时;所述链霉亲和素-辣根过氧化物酶是经PB-BSA-T按1:2000稀释后的产物。
(6)酶法显色反应:按照步骤(3)所述方法洗涤步骤(5)孵育后的滴定板,室温黑暗环境中染色15分钟,每孔中加入邻苯二胺,(含有0.02%过氧化氢的3mg/mL 0.1M的柠檬酸-磷酸盐缓冲液,pH值为5.0);反应15分钟后,每孔加入150μL的4N HCl终止反应;用ELISA板读数器(Biorad公司2550,Richmond,CA)进行测定492nm的吸光度,利用绘制的标准曲线计算GnRH-R的含量。
通过上述方法测定2015年长江不同江段雌性刀鲚洄游不同时期的GnRH-R的含量,与传统的放射免疫测定法相比,二组数据中除成熟后期的游一定差异,其他各组的数据均无显著差异,具体结果如表2所示。可见,本发明所提供的测量刀鲚等鱼类GnRH-R含量的方法真实可靠,可以用于其他鱼类甚至其他激素或蛋白含量的检测。
表2长江不同江段刀鲚洄游不同时期的GnRH-R的含量与RIA测定法比较结果(mIU/mL)
注:*表示两组数据具有显著差异,即P<0.05;表中括号内为两组数据的P值。
Claims (3)
1.一种测量刀鲚GnRH-R含量的方法,其特征在于,包含以下步骤:
(1)绘制GnRH-R标准品标准曲线,所述标准曲线是492nm条件下的绝对吸光度值与GnRH-R浓度的关系曲线;
(2)通过ELISA方法检测待测样品的吸光度值,根据标准曲线计算GnRH-R的含量;
所述标准曲线中GnRH-R标准品的浓度范围为0~32 mIU/mL,绝对吸光度值范围为0~1.3907;
所述待测样品为从刀鲚的血液中分离纯化获得的GnRH-R蛋白;
所述ELISA方法的具体步骤为:
(1)抗体包被:利用DE-52液相色谱层析柱从家兔血清中层析获得anti-GnRH-R蛋白,转移至聚苯乙烯96孔微量滴定板中,加入 PBS缓冲液,水浴包被和孵育;
(2)封闭:三步洗涤:PBS-T缓冲液连续洗涤、等体积的PBS缓冲液洗涤、PBS-1% BSA缓冲液洗涤后, 37℃培养4小时或在4℃过夜培养;
(3)样品孵育:PBS-T洗涤、PBS洗涤后,在96孔板中加入样品,连续用PBS-BSA稀释,将稀释液加到酶标板中,37℃孵育4小时;
(4)生物素标记的anti-GnRH-R孵育:用缓冲液对步骤(3)孵育后的样品进行1:400的稀释,缓冲液为含有0.1% BSA,0.1% Tween缓冲液和0.002%硫柳汞的混合溶液,pH值调整为7.0,稀释完成后加入生物素标记的抗体,37℃孵育3-4小时;
(5)链霉亲和素-辣根过氧化物酶共轭培养:按照步骤(3)所述洗涤方法再次洗涤滴定板,向各孔中加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶,37℃孵育4-6小时;
(6)酶法显色反应:按照步骤(3)所述方法洗涤步骤(5)孵育后的滴定板,室温黑暗环境中染色,测定492nm处的吸光度值;
其中,步骤(5)中加入的链霉亲和素-辣根过氧化物酶是经PB-BSA-T按1:2000稀释后的产物;步骤(6)中酶法显色反应的具体步骤为:在每孔中加入邻苯二胺,具体为含有0.02%过氧化氢的3 mg/mL 0.1M的柠檬酸-磷酸盐缓冲液,pH值为5.0;并通过HCl终止反应。
2.权利要求1所述的测量刀鲚GnRH-R含量的方法在刀鲚人工繁育中的应用。
3.权利要求1所述的测量刀鲚GnRH-R含量的方法在测定刀鲚的生殖内分泌激素中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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