CN106565628A - 一种快速识别超氧根的小分子荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速识别超氧根的小分子荧光探针及其制备方法和应用，属于有机小分子荧光探针领域。该探针分子的结构式如式(I)所示：本发明设计的超氧根荧光探针，制备简单、合成路线成熟，能够对细胞中的O2 ‑进行快速准确检测并可以进行荧光成像研究，是一种简单，快速，灵敏的O2 ‑特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

Description

一种快速识别超氧根的小分子荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种快速识别超氧根的小分子荧光探针及其制备方法和应用，属于有机小分子荧光探针领域。
背景技术
活性氧物种是由氧化能量代谢产生的，通常被认为是活性氧自由基或者其他可以转化为活性氧自由基的物种。它们对细胞功能起着非常重要的作用，可以使得免疫***来防御外源微生物的进攻，如：细菌，病毒和寄生虫的进攻。活性氧物种主要包括：超氧根(O2 -)，双氧水(H2O2)，羟基自由基(●OH)和硝酸根(NO3 -)等。虽然一些活性氧物种在生物体内是必要的，但是活性氧物种的失衡也会造成一系列的疾病，如：中枢神经紊乱，癌症，关节炎，动脉硬化等。超氧根(O2 -)是一些活性氧和活性氮物种的前体，比如：可以由过氧化氢歧化反应和硝酸根氧化一氧化氮得到。所以阐明超氧根的量与疾病之间的关系是很重要的。并且高灵敏性和高选择性的识别和定量检测超氧根是非常具有挑战性的。因此，发展一种可以在生物体和环境中方便快捷检测超氧根的方法非常重要。
目前检测O2 -的常用方法有质谱(MS)、高效液相色谱法(HPLC)和电子顺磁共振波谱(EPR)，相对于以上方法，其中荧光光谱分析法有着操作简单、灵敏度高、选择性好、生物相容性好等优势。但是都存在着检测时间常、无法实现细胞成像等缺点。鉴于此，开发可以实现瞬时检测的荧光探针是非常有必要的，而这一问题一直是目前亟待解决的课题。因此，通过利用萘荧光平台，发展可以瞬时检测超氧根的荧光探针，具有非常重要的科学意义。
发明内容
针对目前有机小分子荧光探针在超氧根(O2 -)的检测中所面临的问题，本发明通过分子设计，合成出一种具有选择性高的O2 -荧光探针。
本发明所采用的技术方案如下：
一种快速识别超氧根的小分子荧光探针，探针的分子式为：C17H13NOS，其结构式如式(I)所示：
上述的快速识别超氧根的小分子荧光探针的制备方法，它包括以下步骤：
将0.5mmol的化合物1与1.1equiv的化合物2在氮气氛围下加至反应瓶中，然后将5.0mL乙醇一次加至上述反应器中，于氮气氛围下在加热回流5h后，点板检测反应至原料消失，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离得到目标探针化合物。
探针NS-O的合成路线如下：
本发明O2 -探针的用途：该荧光探针可以应用于生物体系中内源性O2 -的传感检测；所述的传感检测包含荧光检测和细胞成像应用。
本发明的优点：(1)探针的合成只需要一步就可以完成，且后处理过程相对简单；(2)本发明实现了O2 -分子探针的选择性快速检测，并且选择性好，抗其它分子干扰能力强。基于其特异性和显著的颜色变化，该试剂可作为显示生物细胞内O2 -存在的专一性指示剂，可进行实时定性的目视比色法检测。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的O2 -特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。其性能将在实施例中结合附图给予详细说明。
附图说明
图1是实施例一中探针NS-O的1H NMR图谱；
图2是探针NS-O随O2 -的加入其可见光吸收变化情况；
图3是探针NS-O随O2 -的加入荧光强度的变化情况；
图4是探针NS-O对不同离子和分子的选择性柱状图数据，其中(1)free probe；(2)H2O2(100μM)；(3)NaClO(100μM)；(4)·OH(100μM)；(5)DTBP(100μM)；(6)TBHP(100μM)；(7)NO(100μM)；(8)NaNO2(2.5mM)；(9)NaNO3(2.5mM)；(10)GSH(5mM)；(11)Hcy(5mM)；(12)Cys(5mM)；(13)FeSO4(2.5mM)；(14)KI(2.5mM)；(15)Na2S(2.5mM)；(16)CaCl2(2.5mM)；(17)MgCl2(2.5mM)；(18)CuCl2(2.5m M)；(19)ZnCl2(2.5mM)；(20)KO2(50μM)；
图5是探针NS-O应用于细胞中O2 -的荧光成像图，其中1)为内源性O2 -的细胞成像图；2)为加入抑制剂2-Me之后的细胞成像图，3)为加入抑制剂2-Me之后再加入Tiron试剂激发产生内源性O2 -，再加入探针之后的细胞成像图。其中，图1-3每幅图从左至右依次为：TD为明场成像图，DAPI为DAPI通道荧光图，All为将TD和DAPI通道叠加得到的成像图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制，实施例中化合物的号码对于上述方案中化合物的号码。
实施例1
探针化合物NS-O的合成：
将化合物1(0.5mmol，86.0mg)与化合物2(1.1equiv，68.8mg)在氮气氛围下加至反应瓶中，然后将乙醇(5.0mL)一次加至上述反应器中，于氮气氛围下在加热回流5h后，点板检测反应至原料消失，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离得到探针化合物NS-O，硅胶颗粒大小为200-300目，产率为63％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.12(s,1H),8.56(s,1H),8.17-8.01(m,4H),7.86(d,J＝8.8Hz,1H),7.58-7.45(m,2H),7.22-7.18(m,2H).该探针的1H NMR图谱见图1。
实施例2
探针NS-O随O2 -的加入其可见光吸收变化情况
取实施例1制备的探针NS-O溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，制成1mmol/L储备液。从储备液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，测量其吸收光谱，然后加入O2 -(10equiv)标准溶液，用DMSO/PBS(1:1,v/v)稀释至3mL(10μM)，测量其吸收光谱。光谱图见图2所示。由图2可见，加入探针NS-O后，直接加入O2 -，瞬时可以检测到吸收发生变化，实现了O2 -的检测。
实施例3
探针化合物NS-O荧光探针随O2 -加入当量的增加荧光谱图的变化
从实施例2的储备液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，加入不同当量(0-70equiv)的O2 -标准溶液，用PBS缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝7.4)与DMSO体积比为1:1的溶液稀释至3mL，以400nm为激发光，测量其荧光性质。荧光光谱如图3所示。由图3可见，随着O2 -加入当量的增加荧光逐渐增强。
实施例4
化合物NS-O2 -荧光探针对不同离子的选择性
从实施例2的荧光探针储备液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，分别加入不同分析物的标准溶液，其中一个加入O2 -标准溶液，检测溶液的荧光发射光谱变化，由图4可以发现，其他干扰离子对探针NS-O的荧光几乎没有影响，而O2 -溶液的加入使NS-O的荧光显著增强。
实施例5
NS-O荧光探针对细胞中内源性O2 -荧光成像
我们将本发明探针应用于HeLa细胞中O2 -的检测进行荧光成像应用。结果如图5所示，具体操作步骤如下：1)将10μM探针DMF溶液加入到育有HeLa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养0.5h，明场成像(即TD成像图)，可以看到细胞大致的轮廓；可以清晰地发现DAPI通道有明显的荧光，2)使用2-Me试剂将Hela细胞孵育20min之后，再10μM探针DMF溶液再孵育20min后，发现细胞中超氧根完全得到抑制，在DAPI通道没有荧光；3)将Hela细胞先分别使用2-Me和Tiron试剂各孵育20min之后，加入10μM探针DMF溶液再孵育20min后，可以清晰地发现DAPI通道有明显的荧光，将TD和DAPI通道叠加可得到All的成像图。说明此荧光探针实现细胞中内源性超氧根的检测。

Claims (3)

1.一种快速识别超氧根的小分子荧光探针，其特征在于，探针的分子式为：C17H13NOS，其结构式如式(I)所示：
2.一种权利要求1所述的快速识别超氧根的小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
将0.5mmol的化合物1与1.1equiv的化合物2在氮气氛围下加至反应瓶中，然后将5.0mL乙醇一次加至上述反应器中，于氮气氛围下在加热回流5h后，点板检测反应至原料消失，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离得到目标探针化合物；
所述化合物1结构式如下：
所述化合物2结构式如下：
3.一种权利要求1所述的快速识别超氧根的小分子荧光探针的应用，其特征在于，该荧光探针可以应用于生物细胞体系中O2 -的传感检测；所述的传感检测包含荧光检测和细胞成像检测。
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