CN106562994A - 鸭胚胎素制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸭胚胎素的制备方法，包括以下过程：对鸭胚胎干细胞进行细胞破膜处理，去杂，提取得到鸭多能胚胎素。还公开采用该制作方法获得的鸭胚胎素及其应用。本发明从鸭胚胎干细胞中分离得到鸭多能胚胎素，已达到人胚胎素的作用，即能使人体内各种细胞保持活力，延长工作细胞的寿命；修复损伤细胞，恢复细胞的功能；激活体内休眠细胞，补充有效的工作细胞；保护自身干细胞的衰减和促进干细胞生成；激活自身休眠干细胞分化出新的细胞替补死亡的细胞，达到复原脏器的作用。

Description

鸭胚胎素制备方法及应用

技术领域

本发明涉及药物药品技术领域，尤其是一种鸭胚胎素，具体述及该鸭胚胎素的制备方法和应用。

背景技术

人类疾病虽然有上千种，然而真正的疾病只有一种，那就是细胞病，任何一个器官的细胞新陈代谢出了问题，细胞死亡达到一定程度，那么这个器官才会生病，导致细胞故障主要的原因是二方面：一是细胞营养、氧气供应不足，二是代谢废物不能及时排出导致细胞中毒所致，而现在对疾病的认识只是疾病的表现，而不是真正的原因，在治疗上多为对症治疗(如疼痛、发热等的处理)或对抗治疗(对肿瘤的切除，放、化疗等)，绝大多数疾病都是对症治。本研究是采用鸭胚胎素这组生物分子激活自身体内干细胞***出新的功能细胞替代损伤与死亡的细胞，且恢复及正常功能，达到从根本上治疗疾病的目的。

1912年，瑞士科学家卡尔教授首次发现羊胚胎细胞中有一种能使细胞恢复活力的神奇物质--羊胚胎素；1931年，尼翰教授首次通过注射的方式将小羊的甲状旁腺细胞应用于一位在手术中甲状旁腺受损的临危病人挽救了其生命；1937年，尼翰教授第一次将活细胞疗法应用到大脑神经细胞，以后，尼翰教授将活细胞疗法扩展应用到肝脏、胰腺、肾脏、心脏、十二指肠、胸腺和脾脏。由于羊胚胎素来源于羊的胚胎细胞，与人类细胞有诸多方面不同，临床应用时有许多禁忌症，如过度敏感性人群，甲状腺机能亢进、严重的高血压患者，孕期妇女使用、肿瘤患者等不能应用。

由于鲜活细胞不能长时间保存，1949年尼翰教授和瑞士雀巢公司的科学家共同协作，首次研制出冻干活细胞进行细胞活化治疗；1955年瑞士Dr.Alfred Pfister医学博士部分解决了细胞提取时(冻干或冻结)造成的损伤和恶化过程与保存技术的缺陷。

1970年Martin Evans首次从小鼠胚囊中分离出与体外培养出小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs，简称ES、EK或ESC细胞。)；1998年美国科学家体外培养人胚胎干细胞成功，此后国内外学先学者采用不同的干细胞治疗不同的疾病，其短期治疗效果可以肯定，但目前存在以下问题：无论是羊胎素还是胚胎干细胞，由于是异种(羊)与异体都存在着免疫排斥反应、过敏、体外培养时污染细菌引起全身感染等严重并发症。

1980年，由于鲜活羊胚胎素缺乏严格的消毒抑菌措施，无法长期保存，发生感染的危险性很大，瑞士医学界一直致力于发展提纯，消毒，杀菌，保存技术，但仍不能达到长时间保存的目的。

1983年，爱德华·贝驰博士继承尼翰羊胚胎素活性疗法的成就，发展出个性化的治疗技术，提纯为小分子的“全器官精华素”，更加易于吸收；帮助人体活化和新生出结构完整，功能活跃的新细胞；替换由于各种致害因素所导致的衰老病变细胞，增强各生命***的功能，恢复人体精力和体力，达到更加显著的抗衰老疗效。

2006年，陈正跃，黄丽君，许建文从孵化10～13天后鸡胚中提取胚胎素的制备方法。采用鸡胚胎素灌胃对血虚小鼠具有较好的促红细胞造血功能，同时对环磷酰胺造成的免疫器官质量下降具有明显的增重作用，同时证明鸡胚胎素具有抗衰老和免疫调节作用，但后继有关报告不多，无临床治疗病人的报告。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提出一种鸭胚胎素制备方法及应用，且证明鸭胚胎素能修复机体损伤的细胞和激活机体内休眠状态的干细胞***，产生新的细胞替代死亡的细胞，且发挥其作用，达到从根本上防治疾病的效果，且操作简便，功效广泛，从而解决了这一技术难题。

鸭(学名：Anatinae，英文名：duck)，脊索动物门，脊椎动物亚门，鸟纲雁形目，鸭科鸭属动物，是由野生绿头鸭和斑嘴鸭驯化而来。是一种常见家禽。鸭是雁形目鸭科鸭亚科水禽的统称。是一种水、陆两栖动物。但不能在水中待太久，是卵生动物，鸭有丰富的营养和药用价值。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种鸭胚胎素的制备方法，包括如下步骤：

(1)从鸭胚胎中提取鸭胚胎干细胞；

(2)对鸭胚胎干细胞进行细胞破膜处理，依次包括细胞破碎处理、离心处理，得到鸭胚胎素；

其中，鸭胚胎取自孵化9天的鸭卵；

所得胚胎干细胞为全能与多能干细胞，所得鸭胚胎素为鸭多能胚胎素。

优选地，所述步骤(2)中，所述细胞破碎处理为在鸭胚胎干细胞中加入3倍于鸭胚胎干细胞体积的无菌纯水，采用超声波将细胞破碎；

所述离心处理为在5℃-50℃的温度条件下，3000r/min，离心15分钟。

优选地，所述步骤(1)中，所述鸭胚胎干细胞为采用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理鸭胚胎组织分离得到。

优选地，所述制备方法还包括对鸭胚胎素的灭菌处理，60℃温度下10小时。

本发明还提供一种鸭胚胎素，采用上述制备方法得到。

优选地，所述鸭胚胎素包括42％的辅酶Q10，6％的氨基酸，5％的表皮生长因子，41％的熊果甙、核酸、泛酸、免疫球蛋白、假马齿苋、表皮修复因子和超氧化物歧化酶，所述鸭胚胎素的纯度为98％以上。

本发明还提供一种由上述方法制得的鸭胚胎素的用途，用于制备治疗心脑血管、糖尿病、恶性肿瘤、胃十二指肠溃疡、肝炎这些慢性疾病以及抗衰老的药物。

优选地，所述鸭胚胎素在制备药物中占单位剂量药物的20％-30％，所述鸭胚胎素为万能胚胎素或定向胚胎素或二者的混合。

优选地，用量为：鸭胚胎素浓度为20％的液体制剂，每次摄入万能胚胎素0.5ml，或者定向胚胎素1ml，每1-2日1次，连续治疗10-60次。

优选地，所述药物通过皮下注射、皮内注射、肌肉注射、病部注射、静脉注射、动脉注射、鞘内注射、介入治疗、立体定向、病灶表面喷洒或局部封闭的方式给药。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：目前无鸭胚胎素基础实验与临床试验报告，也没有任何关于鸭胚胎素的制备方法的公开报道。本发明从鸭胚胎干细胞中分离得到鸭多能胚胎素和单能胚胎素混合物，本发明提供的制备方法，采用鸭卵孵化，孵化出胚胎的比率高；在孵化第9天，鸭胚胎重达1.28克；因此，本发明的制备方法出胚胎率高；胚胎干细胞产量高；胚胎素的效价高。能使人体内各种细胞保持活力，延长工作细胞的寿命；修复损伤细胞，恢复细胞的功能；激活体内休眠细胞，补充有效的工作细胞；保护自身干细胞的衰减和促进干细胞生成；激活自身休眠干细胞分化出新的细胞替补死亡的细胞，达到复原脏器的作用，它既超过目前干细胞移植的治疗作用，又无干细胞移植后可能出现的并发症，如免疫排斥反应、过敏反应、感染等，为从根本上治疗各类、各种疾病，尤其是慢性、疑难性疾病，抗衰老、延长寿命、美容等。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。

本发明是通过从鸭胚胎干细胞(duck embryonic stem cell，DES)中提取的鸭胚胎素(DEF)，用于治疗目前被视为各类不治之症性疾病，尤其是各类慢性、疑难性疾病和抗衰老。

DEF的作用原理：DEF可替代人胚胎素，能保持细胞活力，延长工作细胞的寿命；修复损伤细胞，恢复细胞的功能；延长体内干细胞的寿命；激活体内休眠细胞，补充有效的工作细胞；激活自身休眠干细胞，分化不同组织细胞，以替代更新衰老、损伤和死亡的细胞，使组织器官复原，达到源头根治疾病，逆转青春的效果。

鸭是常见的一种家禽，易于获取鸭卵与孵化，通过本发明方法且可获取较高产量的鸭胚胎干细胞。

鸭胚胎干细胞，从鸭受精卵孵化9天的鸭胚中，采用细胞分离技术获得鸭胚胎干细胞。获取鸭胚胎组织以后，袪除各类危险因子与杂质，采用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理使鸭胚胎组织分解出胚胎细胞。

对鸭胚胎干细胞采用物理与化学法进行破膜处理，包括细胞膜与细胞核模，同时可使细菌破膜，而灭活作用。

本发明鸭胚胎素为多能胚胎素。

本发明鸭胚胎素(duck embryo factors，DEF)，由于取9天内鸭胚胎组织，其绝大部分均为万能胚胎和多能胚胎细胞，所以获取的胚胎素均为万能和多能胚胎素，其作用能保持细胞活力，延长工作细胞的寿命；修复损伤细胞，恢复细胞的功能；激活体内休眠细胞，补充有效的工作细胞；保护自身干细胞的衰减和促进干细胞生成；激活自身休眠干细胞分化出各类细胞，替补死亡的细胞，达到复原脏器的作用，用于治疗各类疾病，尤其是慢性或疑难性疾病与抗衰老疗效非常显效，该制品可长期保存、无毒性、无排异反应。

实施例1

本实施例提供一种鸭胚胎素的制备方法，具体步骤如下：

1.获取鸭胚胎组织

1.1精选受精卵：

鸭受精卵的要求：优选来自高产、健康无病、饲养管理正确、配偶比例适当的种鸭群，以此为种蛋的质量要求，确保较高的受精率和孵化率。根据产量要求不同，鸭胚数量各异，可以10、100、500和1000个为一基数，本实施例选择广东农业科学研究所培育的鸭种蛋，根据试验与实验用量以500个鸭胚为一个基数。

1.2正确孵化：

鸭卵表面去污，鸭卵置入孵化箱中常规孵化9天，取出鸭胚胎。

1.3无菌取出鸭胚：

鸭卵表面清水表面去污后，置入消毒液(三氯异氰脲酸钠片配制液)中浸泡10分钟，所述消毒液由三氯异氰脲酸钠片配制，每片三氯异氰脲酸钠片含有效物250mg，按50～100mg/L配备；消毒毛巾擦干，再将鸭卵浸泡75％酒精中5分钟，擦干、去壳，取出鸭胚，蛋清(含鸭胎盘)和卵黄分别收集，置于-18℃冰冻保存，以待他用。收集鸭胚，全程无菌操作。本实施例中通过采用三氯异氰脲酸钠、酒精消毒和全程无菌操作，使消毒更加严格，除菌效果更佳。

1.4鸭胚的收集：

以上获得的鸭胚收集一在起，鸭胚总量约650g左右。正常第9天的鸭胚，胚重约1.28克，即1.28x500＝644g。

1.5清洁鸭胚胎组织：

采用无菌纯水浸泡细胞15min，袪除各类危险因子，如杂质、蛋清、胎盘、血块等，反复冲洗鸭胚胎组织后，置入无菌袋中。本实施例通过无菌纯水浸泡细胞，所述无菌纯水属低渗液，冰冻后可使细胞结构明显改变，可获得高、纯的胚胎素。

1.5鸭胚的冷冻：

将包装的鸭胚胎组织置于－18℃冷冻，每日常温自然化冰1次，连续3天。有利于细胞结构改变，可获取高产量胚胎素。

2.从鸭胚胎组织中获取干细胞

2.1鸭胚胎组织中提取万能与多能干细细作以下处理。

2.1.1鸭胚胎组织的解冻：

取出冷冻的鸭胚胎组织，自然解冻。

2.1.2从鸭胚胎组织中提取万能与多能干细胞：

将鸭胚胎组织切成小块，分别采用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理从鸭胚组织中分解出细胞，为混合细胞，包括大部分为万能、多能干细胞，少部分为单能干细胞和其他组织细胞，待下一步处理。

2.1.3鸭干细胞的鉴定：

本研究釆用碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AKP)、SEA-1、SEA-4、TRA-1-60，同时还要作核型分析以确定所培养细胞的核型正常，以及开展体内、体外的分化实验。

3.从鸭胚胎干细胞中萃取胚胎素

3.1破碎细胞：

目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。破碎方法可归纳为机械法和非机械法两大类。①机械法：包括高压匀浆破碎法(homogenization)、振荡珠击破碎法(Skaking Bead)、高速搅拌珠研磨破碎法(finegrinding)、超声波破碎法(ultrasonication)等。②非机械法：渗透压冲击破碎法(osmoticshock)、冻融破碎法(freezing and thawing)、酶溶破碎法(enzyme lysis)、化学破碎法(chemical treatment)和去垢剂破碎法(detergents)等，根据环境条件，分别选用。本发明将鸭胚胎组织与细胞加入3倍于鸭胚胎体积的无菌纯水(低渗液体)，采用超声波细胞粉碎机将细胞破碎，呈悬浮状液体。

3.2DES细胞液去脂：

采用冷冻法去除细胞溶液中的脂肪。

3.3从DES细胞液中提取胚胎素：

采用离心机在≤50℃，且≥5的温度条件下，3000r/min左右离心15分钟，将液体与沉淀物分离，去除沉淀物，留取上悬浮液。既可去除其他杂质和不破坏多肽结构，又能获得更多的胚胎素，操作也更方便。设定离心机温度在5℃-50℃之间，既可以使提取的胚胎素呈液状，且有较大的限象温度，确保提取的胚胎素不会失活，优选设定离心机温度在5℃-30℃，进一步优选5℃-10℃，本实施例中采用5℃。

3.4悬浮液过滤：

将悬浮液过截留分子量在800000道尔顿以上的超滤柱，得超滤液，即为鸭胚胎素溶液，直接无菌分装保存，不再将超滤液冷冻干燥获得固体胚胎素。待检测。本实施例采用悬浮液保存，优点在于既可保持胚胎素的活性，又可保存时间长，更有利于后继灭菌。

4.鸭胚胎素的检测。

4.1光学显微镜的检测：

采用光学或电子显微镜观察，无杂质、无细胞、见小颗粒混合液体即为本实施例提取制备的鸭胚胎素。

4.2生化的检测：

①蛋白含量的测定：按凯氐氮法采用分光光度计测量法，检测到蛋白质的含量；②分子量的鉴定：采用三氯乙酸氮溶指数(THA-NSI)进行肽含量检测方法对悬浮液内容物进行检测，分子量在180～1000道尔顿以下，为小肽、寡肽和多肽的物质为胚胎素。经生化分析胚胎素主要成分辅酶Q10,氨基酸，EGF(表皮生长因子)，熊果甙，核酸，泛酸，免疫球蛋白，假马齿苋，ERF(表皮修复因子)，SOD(超氧化物歧化酶)等，其他成分需进一步研究。③纯度鉴定：采用区带电泳法鉴定，具体操作见临床生化技术；④免疫活性鉴定：采用双向琼脂扩散试验。

4.3主要成分：

提取到的鸭胚胎素经生物活性的检测，得出本发明方法提取到的胚胎素主要成分包括：辅酶Q10占42％；氨基酸占6％，EGF(表皮生长因子)占5％；熊果甙，核酸，泛酸，免疫球蛋白，假马齿苋，ERF(表皮修复因子)，SOD(超氧化物歧化酶)41％，其他6％，其成分需进一步研究。本提取方法的提取率为40％以上，即每1000g动物胚胎组织可提取动物胚胎素400g以上，且纯度鉴定结果为98％以上。

4.4成分特点：

辅酶Q10：是一种维他命，也是一种脂溶性醌，高效抗氧化剂，能防止心律不齐，过敏症，心绞痛，浮肿，高血压及消灭多余脂肪。它在延缓衰老方面起到非常重要的作用。辅酶Q10和维他命C、E很相似，帮助起中和作用。

泛酸：我们熟知的维他命5，能潜在的控制烦恼、失望、焦虑、头痛、慢性疲劳等，还能帮助改善酒精或烟草引起的性功能障碍。

假马齿苋：研究表明，假马齿苋能支持大脑的学习和记忆部分。假马齿苋有抗氧化性，能保护决定记忆的区域及减少脑部压力。传统应用已表明，假马齿苋对促进大脑功能有直接作用，如加强集中注意力和改善记忆。(已有公开使用技术，但未对鸭胚胎素进行检测为本发明创新点)。

5.DEF的灭菌处理

5.1通过细胞破膜法

破膜时细菌也破膜而失活。

5.2巴斯特灭菌处理(灭菌与灭毒)：

60℃，连续10h。达到彻底灭菌，又可保持胚胎素的活性。通常采用高温度消毒需短时消毒，不超过6个小时。本实施例采用连续长时间较高温度进行消毒，完全彻底的去除病毒，同时确保胚胎素的生物活性，在后续临床试验中可见发挥出了高效的生物活性。

6.DEF的安全性检验

6.1进行动物急性毒性试验、动物过敏性试验、家兔热源试验。

6.2艾滋病病毒、乙、丙肝病毒检测。

6.3细菌培养检验。

7.DEF浓度配制

用生理盐水将胚胎素配制成20％浓度。

8.包装

采用袋软包装、或密封瓶装。

9.DEF的储藏方法

1)放置－18℃～5℃冰箱内可以存放20年。

2)常温下即不超过38℃，60天。

实施例2

DEF治疗动物实验

选用大小白鼠、兔、犬、猴做出不同创伤与不同15种疾病的模型，应用对照与DEF干预先后治疗500只以上不同的动物实验，模型包括以下各***15种代表性疾病：1、犬颅脑损伤模型；2、猴脑缺血模型；3、大小白鼠肿瘤模型；4、犬慢性阻塞性肺疾病模型；5、犬胃、十二指肠溃疡模型；6、犬肝硬变(肝硬化)模型；7、犬高血压病模型；8、犬急性心肌梗死动型；9、犬糖尿病模型；10、犬四肢骨折模型；11、犬再生障碍性贫血模型；12、犬肾功能衰竭模型；13、犬***模型；14、兔动脉硬化性闭塞症模型；15、大小白鼠抗衰老模型。

各***15种代表性疾病疗效见表1。

表1 DEF干预与常规治疗15种疾病疗效比较(X±S)

与对组比*P<0.01

实施例3

DEF的临床应用试验

1.DEF治疗的疾病：

胚胎素治疗适应于各***疾病，包括亚健康、促进儿童正常生长、发育、免疫***缺陷性疾病、传染疾病、肿瘤(各类良恶性肿瘤)、神经***疾病、呼吸***疾病、消化***疾病、心血管***疾病、内分泌***疾病、骨骼及肌肉***疾病、血液***疾病、泌尿***疾病、生殖***疾病、性功能疾病、外周血管疾病、肤疾病，眼、耳、鼻、咽、喉疑难性疾病，抗衰老和美容等。

2.DEF治疗的疾病例数：

各类疾病与抗衰老的治疗方法先后治疗病人2000余例。

3.DEF的治疗方案：

①DEF的选择：根据不同的疾病和严重程度选择不同胚胎素，万能胚胎素、多能胚胎素和单能胚胎素。万能胚胎素疗法(应用万能胚胎素)适应全身性疾病、抗衰老；多能胚胎素适应于***性疾病；单能胚胎素适应于某种疾病(相对应***)。

②疗程方案：短疗程10次；中疗程30次；长程疗程60次。

③疗程方案：短疗程适用于抗衰老；中疗程适用于抗衰老+慢性疾病；长疗程适用于慢性疾病或恶性肿瘤。

4.DEF的治疗方法：

配制药物时，所述鸭胚胎素在制备药物中占单位剂量药物的20％-30％，所述鸭胚胎素为万能胚胎素或定向胚胎素或二者的混合。

本实施例中配制为鸭胚胎素浓度为20％-30％的液体制剂。优选浓度为20％。治疗时，摄入万能胚胎素药剂的单次剂量为0.5ml；摄入定向胚胎素药剂的单次剂量为1ml。

本实施例中所指短疗程为：摄入鸭胚胎素药剂0.5ml，肌肉注射，1次/日，连续10次；所指中疗程为：摄入鸭胚胎素药剂0.5ml，肌肉注射，1次/隔日，连续30次；所指长疗程为：摄入鸭胚胎素药剂0.5ml，肌肉注射，1次/隔日，每年连续60次，连续3年。

5.DEF的治疗效果：

根据本技术治疗2000余例病人统计结果全部有效，见效时间见下列表。

胚胎素治疗后病人变化时间表

抗衰老与美容60岁老龄人可年轻10岁左右，延长寿命估计平均可达到40岁以上(具体多少还需时间观察)。

本发明先后治疗各***不同的各种疾病2000余例，主要各***代表性疾病50种临床治疗观察结果见表2。

表2 DEF干预与常规治疗20种疾病病人疗效比较(X±S)

其他疾病500例以上，有效率均在98％以上。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种鸭胚胎素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)从鸭胚胎中提取鸭胚胎干细胞；

(2)对鸭胚胎干细胞进行细胞破膜处理，依次包括细胞破碎处理、离心处理，得到鸭胚胎素；

其中，鸭胚胎取自孵化9天的鸭卵；

所得胚胎干细胞为全能与多能干细胞，所得鸭胚胎素为鸭多能胚胎素。

2.如权利要求1所述鸭胚胎素的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述细胞破碎处理为在鸭胚胎干细胞中加入3倍于鸭胚胎干细胞体积的无菌纯水，采用超声波将细胞破碎；

所述离心处理为在5℃-50℃的温度条件下，3000r/min，离心15分钟。

3.如权利要求1所述鸭胚胎素的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述鸭胚胎干细胞为采用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理鸭胚胎组织分离得到。

4.如权利要求1所述鸭胚胎素的制备方法，其特征在于，还包括对鸭胚胎素的灭菌处理，60℃温度下10小时。

5.一种鸭胚胎素，其特征在于：采用如权利要求1-4任一所述制备方法得到。

6.一种如权利要求5所述鸭胚胎素，其特征在于，包括42％的辅酶Q10，6％的氨基酸，5％的表皮生长因子，41％的熊果甙、核酸、泛酸、免疫球蛋白、假马齿苋、表皮修复因子和超氧化物歧化酶，所述鸭胚胎素的纯度为98％以上。

7.如权利要求6所述的鸭胚胎素的用途，其特征在于，用于制备治疗心脑血管、糖尿病、恶性肿瘤、胃十二指肠溃疡、肝炎这些慢性疾病以及抗衰老的药物。

8.如权利要求7所述鸭胚胎素的用途，其特征在于，所述鸭胚胎素在制备药物中占单位剂量药物的20％-30％，所述鸭胚胎素为万能胚胎素或定向胚胎素或二者的混合。

9.如权利要求8所述的鸭胚胎素的用途，其特征在于，用量为：鸭胚胎素浓度为20％的液体制剂，每次摄入万能胚胎素0.5ml，或者定向胚胎素1ml，每1-2日1次，连续治疗10-60次。

10.如权利要求7-9任一所述鸭胚胎素的用途，其特征在于，所述药物通过皮下注射、皮内注射、肌肉注射、病部注射、静脉注射、动脉注射、鞘内注射、介入治疗、立体定向、病灶表面喷洒或局部封闭的方式给药。