CN106555001B - 一种水稻抗稻瘟病基因的分子标记及其应用 - Google Patents

一种水稻抗稻瘟病基因的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种水稻抗稻瘟病基因的分子标记及其应用，属于农作物分子遗传育种学领域。本发明利用植物病理学、分子遗传学和基因组学研究手段，将水稻地方品种闽北籼的抗稻瘟病基因定位于第6号染色体分子标记ID1036和DC1045之间。利用本发明提供的ID1036和DC1045分子标记组合，能够高效筛选抗稻瘟病品种闽北籼的杂交转育群体中携带抗病基因的植株，提高选育含有所述基因抗稻瘟病水稻品种的效率。

Description

一种水稻抗稻瘟病基因的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于属于农作物分子遗传育种学领域，具体涉及一种水稻抗稻瘟病基因的分子标记及其应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，稻瘟病则是危害水稻生产最严重的病害之一。在世界范围内，每年由稻瘟病造成的损失高达水稻产量的10-30%（Dean等，2005）。生产实践表明，利用水稻抗病基因资源，培育和利用抗病水稻品种是防治稻瘟病最经济、有效和环保的策略。
自上世纪60年代日本科学家率先开展水稻抗稻瘟基因遗传研究以来，世界各国科学家已定位了上百个水稻抗稻瘟病基因。稻瘟病抗性基因的克隆，促进了水稻抗稻瘟分子改良的发展。但另一方面，许多已定位或已克隆的抗病基因抗谱不广，或是缺乏高效率的标记应用体系。因此，发掘具有广谱抗病性的新基因资源并建立其分子标记体系，对培育抗稻瘟病水稻新品种具有重要意义。
闽北籼为福建水稻地方品种。本发明人经过广泛研究，鉴定了闽北籼具有广谱抗稻瘟病性状。进一步遗传分析表明，闽北籼抗稻瘟病性状由单基因控制。鉴定闽北籼的抗病基因并建立其分子标记应用体系，能够显著提高利用闽北籼培育水稻抗稻瘟病新品种的效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻抗稻瘟病基因的分子标记及其应用。通过检测与水稻抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记ID1036和DC1045，可以准确筛选携带水稻抗稻瘟病基因的水稻植株，显著提高培育水稻抗稻瘟病新品种的效率。
本发明利用植物病理学，分子遗传学和基因组学研究手段，将水稻地方品种闽北籼的抗稻瘟病基因定位于第6号染色体分子标记ID1036和DC1045之间。
基于上述发现，本发明提供了一种水稻抗稻瘟病基因的分子标记，由引物组合ID1036-F/ID1036-R经PCR扩增获得和由引物组合DC1045-F/DC1045-R经PCR扩增并经MwoI酶切获得。
所述的水稻抗稻瘟病基因上游分子标记ID1036的引物组合ID1036-F/ID1036-R，由如SEQ ID NO.1所示的DNA序列和如SEQ ID NO.2所示的DNA序列组成。
所述的水稻抗稻瘟病基因下游分子标记DC1045的引物组合DC1045-F/DC1045-R，由如SEQ ID NO.3所示的DNA序列和如SEQ ID NO.4所示的DNA序列组成。
本发明还提供了水稻抗稻瘟病基因的分子标记辅助选择方法，包括以下步骤：
1）提取待检水稻样品基因组DNA；
2）利用所述的引物组合ID1036-F/ID1036-R和所述的引物组合DC1045-F/DC1045-R对待检水稻样品基因组DNA进行PCR扩增。如果引物组合ID1036-F/ID1036-R的扩增产物为一条122 bp条带，并且引物组合DC1045-F/DC1045-R扩增产物经MwoI酶切后为一条138 bp条带，则标志着该水稻材料具有所述抗稻瘟病基因。
本发明同时提供了一种选育抗稻瘟病水稻品种的方法，包括以下步骤：
1）以含有所述抗稻瘟病基因的水稻品种闽北籼或其衍生材料为亲本，与其他水稻育种材料杂交或回交并繁衍后代群体；
2）利用所述引物组合ID1036-F/ID1036-R和所述引物组合DC1045-F/DC1045-R对上述所获群体的植株进行PCR检测，筛选能够同时检测到ID1036-F/ID1036-R所扩增的122bp分子标记条带和DC1045-F/DC1045-R扩增产物经MwoI酶切后的138 bp分子标记条带的植株，该植株携带有抗稻瘟病基因。
本发明的优点及有益效果：
1）本发明基于植物病理学、分子遗传学和基因组学研究手段，将水稻地方品种闽北籼的抗稻瘟病基因精细定位于第6号染色体分子标记ID1036和DC1045之间。应用本发明建立的标记方法，能够有效筛选抗稻瘟病品种闽北籼的杂交转育群体中携带所述抗病基因的植株，高效率培育抗稻瘟病水稻品种。与常规育种方法相比较，后者主要是通过鉴定田间抗性表型进行筛选，容易受环境、不同年份间气候条件变化的影响，育种效率低且准确性差。分子标记辅助选择培育抗病水稻品种的方法，则具有选择目标明确、选择效率高以及节约成本的优势。
2）本发明提供的分子标记ID1036和DC1045，分别位于所述抗病基因的上、下游，在遗传上与所述抗病基因抗病性呈共分离，选择效率达到100%。
3）本发明提供的分子标记ID1036和DC1045均为共显示标记，能够区分出抗稻瘟病品种闽北籼杂交转育群体中的纯合体和杂合体，可以快速获得具有纯合所述基因的抗稻瘟病水稻植株。
综上所述，利用本发明提供的一种水稻抗稻瘟病基因的分子标记方法，能够快速、准确筛选水稻育种群体中具有纯合所述基因的植株，显著提高选育抗稻瘟病水稻品种的效率。
附图说明
图1为水稻品种闽北籼×02428的F2群体抗/感稻瘟病极端分离池全基因组SNP平均等位频率（AF）分析结果。分析结果表明，第6号染色体9.6-11.2 Mb区间存在一个主效抗病基因位点。
图2水稻品种闽北籼抗稻瘟病基因定位于第6号染色体分子标记ID1036与DC1045之间89 kb的区间内。
图 3为分子标记ID1036与DC1045检测闽北籼×02428的F2抗病分离群体部分单株的电泳图谱。其中，M：分子量Marker；P1：闽北籼；P2：02428；1-15：闽北籼×02428的F2群体抗病分离植株。所有抗病分离单株均能检测到ID1036的122 bp条带和DC1045的138 bp条带。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步阐述。下述实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。
实施例 1 水稻品种闽北籼稻瘟病抗性性状的遗传分析
闽北籼是来源于福建省的水稻地方品种。利用来自国内外不同稻区的193-1-1,195-2-2, 318-2, 408, 501-3, CHE86, CHL1711, CHL1755, CHL1757, CHL1787,CHL1907, CHL1962, CHNOS, HYG99, IR16, KJ201, KOH, NY90, RB2, RB3, RB4, RB6,RB7, RB9, RB12, RB16, RB18, RB19, RB20, RB22, ROR1-1, ZY838等32个稻瘟菌株接种闽北籼，结果表明，闽北籼对接种菌株的抗谱达到93.8%，说明闽北籼具有广谱抗性。
利用水稻品种02428与闽北籼配制F2遗传群体，以稻瘟菌株KJ201接种F2群体。对627个F2单株进行调查，其中抗性株数为482，感病株数为145，符合3:1遗传分离（表1），表明闽北籼对稻瘟菌KJ201抗性性状由单一显性基因控制。
表1 02428×闽北籼F2遗传分离群体对稻瘟菌KJ201抗感分离比
实施例 2 极端分离池全基因组分析（Bulked Segregant Analysis, BSA-seq）鉴定闽北籼抗稻瘟基因位点
基于上述闽北籼×02428的F2遗传分离群体接种稻瘟菌KJ201的实验，随机选择20个极端抗病株和20个极端感病株，以及10株闽北籼，10株02428，分别提取DNA，等量混合成抗病池、感病池，和抗病亲本池，感病亲本池。利用二代高通量测序技术对DNA池进行测序，并分析全基因组SNP平均等位频率（Avg. AF），结果表明，在第6号染色体9.6-11.2 Mb区间存在一个AF高于阈值线的峰，则该区间存在一个主效抗病基因位点（图1）。
实施例 3 分子标记定位闽北籼抗稻瘟病基因
为进一步确定闽北籼的抗稻瘟病基因位点，本发明根据闽北籼、02428两个亲本的二代测序结果，在第6号染色体10.0-10.8 Mb区间开发了ID1002、ID1011、ID1027、ID1036、ID1081等5个InDel分子标记，以及1个dCAPS标记DC1045。利用这些分子标记对闽北籼×02428的F2群体1051个感病分离单株进行定位分析，最终把闽北籼的抗稻瘟病基因定位于分子标记ID1036和DC1045之间约89 kb的区间内（图2）。
实施例 4 分子标记组合ID1036和DC1045的验证
ID1036是一个InDel分子标记，其对应具有抗稻瘟病基因的闽北籼的扩增片段为122 bp，对应无携带抗稻瘟病基因的日本晴的扩增片段为112 bp。DC1045是一个dCAPS标记，其对应具有抗稻瘟病基因的闽北籼的扩增片段为162 bp并且具有MwoI识别位点，其经MwoI酶切后的片段是138 bp；DC1045标记对应无携带抗稻瘟病基因的日本晴的扩增片段为162 bp但不具有MwoI识别位点。
利用ID1036和DC1045对闽北籼×02428的F2群体部分植株进行检测，筛选了126个同时具有ID1036-122 bp片段和DC1045-138 bp片段的单株（部分单株的电泳图谱见图3）。以稻瘟菌菌株KJ201对上述水稻植株进行人工接种，结果发现，126个植株均表现抗稻瘟病，表明ID1036和DC1045标记组合的选择效率达到100%。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院生物技术研究所
<120> 一种水稻抗稻瘟病基因的分子标记及其应用
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggtctttgct aacccttttc tc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agcatcgttt ccgaagagat g 21
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aattggcgag ttgccttgct aagctc 26
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cacgttgatt catctcaaca caagtgt 27

Claims (4)

1.一种水稻抗稻瘟病基因的分子标记，其特征在于：所述的分子标记编号分别为ID1036和DC1045，其对应的引物为ID1036-F/ID1036-R、DC1045-F/DC1045-R，序列分别如SEQ ID NO.1-4所示。
2.根据权利要求1所述的一种水稻抗稻瘟病基因的分子标记，其特征在于：所述的水稻抗稻瘟病基因定位于第6号染色体分子标记ID1036和DC1045之间89 kb的区间内。
3.一种水稻抗稻瘟病基因的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）提取待检水稻样品基因组DNA；
2）利用权利要求1所述的引物组合ID1036-F/ID1036-R和DC1045-F/DC1045-R对待检水稻样品基因组DNA进行PCR扩增；如果引物组合ID1036-F/ID1036-R的扩增产物为一条122bp条带，并且引物组合DC1045-F/DC1045-R扩增产物经MwoI酶切为一条138 bp条带，则标志着该水稻材料存在抗稻瘟病基因。
4.一种选育抗稻瘟病水稻品种的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）以含有抗稻瘟病基因的水稻品种闽北籼或其衍生材料为亲本，与其他水稻育种材料杂交或回交并繁衍后代群体；
2）利用权利要求1所述引物组合ID1036-F/ID1036-R和DC1045-F/DC1045-R对上述所获群体的植株进行检测，筛选能够同时检测到ID1036-F/ID1036-R所扩增的122 bp分子标记条带和DC1045-F/DC1045-R扩增产物经MwoI酶切后的138 bp分子标记条带的植株，该植株携带有抗稻瘟病基因。
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