CN106546674A

CN106546674A - 用少量样品快速富集、分离、鉴定和定量内源转录因子及其复合物的方法及其专用装置

Info

Publication number: CN106546674A
Application number: CN201610917464.8A
Authority: CN
Inventors: 秦钧; 贺福初; 丁琛; 石文昊; 李恺
Original assignee: BEIJING PROTEOME RESEARCH CENTER
Current assignee: Beijing Proteome Research Center; Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2016-10-20
Filing date: 2016-10-20
Publication date: 2017-03-29

Abstract

本发明公开了一种用少量样品快速富集、分离、鉴定和定量内源转录因子及其复合物的方法及其专用装置。该方法利用转录因子及其复合物可与序列特异性DNA元件结合的特点，将从生物样本中提取的核蛋白或全蛋白在专用装置TOT柱中与结合有转录因子串联结合序列(TFRE DNA，DNA诱饵)的磁珠进行微量体积的孵育，从核蛋白或全蛋白中高效富集、分离内源转录因子及其复合物，后续进一步进行转录因子及其复合物的鉴定、定量。本发明的方法快速、稳定、高效、可重复，可广泛应用于生物研究、医学检验、药物筛选等方面，本发明的专用装置应用简便、可储存、体积小，可将其制备成试剂盒，应用于临床检测、科学研究等领域中，应用前景广阔。

Description

用少量样品快速富集、分离、鉴定和定量内源转录因子及其复合物的方法及其专用装置

技术领域

本发明属于生物技术领域中目的蛋白的富集分离方法，特别是涉及一种仅需少量样品即可快速富集、分离、鉴定和定量内源转录因子及其复合物的方法及其专用装置与应用。

背景技术

人类基因组中约含有1500个转录因子编码基因，是人类基因组编码的第二大类蛋白，根据结合域的不同可以分为50个家族。转录因子几乎参与所有生物过程的调控，包括发育、分化和信号转导等。因此，对转录因子及其复合物的研究一直受到极大关注。

转录因子在细胞内的表达丰度极低(仅占细胞总蛋白的0.01-0.001％)，用传统方法在蛋白质组水平上分析转录因子表达谱非常困难。通过传统色谱方法进行转录因子的纯化通常需要抽提成百升细胞培养物，通过10,000-100,000倍的富集得到的蛋白也仅够用于化学和功能的分析。采用特异性抗体进行亲和纯化是分离纯化转录因子复合物的有效手段，但是一方面抗体成本太高，另一方面，目前仅少量的转录因子及其调节分子存在抗体，这大大限制了抗体亲和纯化方法的应用，也就是说这种策略仅能对个别转录因子进行分析，难以实现对所有转录因子的大规模富集分离和鉴定。

此外，可利用转录因子串联结合序列(concatenated transcription factorresponse elements，catTFRE)实现对转录因子的有效富集，并结合质谱技术对转录因子进行鉴定和定量。该转录因子串联结合序列已经申请专利(专利公开号：ZL 201110457108.X)，序列由2800个碱基组成，包含100个转录因子的双拷贝核心结合元件，每个转录因子的双拷贝核心结合元件间隔3个碱基对(3个碱基对的核苷酸序列是任意的)。该方法可以获得转录因子和DNA的结合活性，对转录因子表达谱研究十分有效，但是该方法需要毫克级细胞核蛋白提取物进行富集，时间至少需要两天，而且不能够进行高通量操作,从而限制了应用范围和检测效率。

因此，在蛋白质组的层次上对转录因子和DNA的结合活性进行***研究，需要一种利用少量样品即可对转录因子及其复合物进行快速分离、纯化和鉴定的高通量、高准确性、高灵敏度和可重复性的实验方法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种仅需少量样品即可快速富集、分离、鉴定和定量内源转录因子及其复合物的方法。

本发明所提供的用少量样品快速富集、分离、鉴定和定量内源转录因子及其复合物的方法，是先从生物样本中提取核蛋白或全蛋白，然后将生物素标记的转录因子串联结合序列(TFRE DNA，DNA诱饵)与生物素亲和素包被的磁珠混合，再将提取的核蛋白或全蛋白与结合有转录因子串联结合序列的磁珠进行孵育，得到与转录因子串联结合序列特异结合的蛋白(即内源转录因子及其复合物)，再将内源转录因子及其复合物从磁珠上洗脱下来，然后对内源转录因子及其复合物进行LC-MS(液相色谱-质谱联用)检测，并用生物信息学工具和方法确定内源转录因子及其复合物的种类、名称及其含量。

所述转录因子串联结合序列(concatenated transcription factor responseelements，catTFRE)是指由3-5bp的接头序列(Linker)串联的转录因子AP1、AR、BRCA1、CEBPA、CREB1、E2F1、ELK1、ELK4、ESR1、ETS1、EWSR1-FLI1、FEV、FOXA1、FOXC1、FOXD1、FOXF2、FOXI1、FOXL1、FOXO3、Fra-1、GATA2、GATA3、GR、HIF1A::ARNT、HLF、HNF1B、HNF4A、HOXA5、INSM1、IRF1、IRF2、JunB、JunD、MAX、MEF2A、MIZF、MYC::MAX、Myf、MZF1_1-4、MZF1_5-13、NF-kappaB、NFATC2、NFE2L2、NFIC、NFIL3、NFKB1、NFYA、NHLH1、NKX3-1、NR1H2::RXRA、NR2F1、NR3C1、NR4A2、Pax6、PBX1、PDX1、PLAG1、PPARG、PR、PXR-1:RXR-alpha、RAR-alpha、RAR-alpha:RXR-gam、RAR-beta:RXR-alpha、REL、RELA、REST、RFX1、RFX2、RFX3、RFX5:RFXAP:RFXANK、RORA_1、RORA_2、RREB1、RXR::RAR_DR5、RXRA::VDR、SOX10、SOX9、SP1、SPI1、SPIB、SRF、SRY、STAT1、STAT5A、T3R-beta1、TAL1::TCF3、TBP、TEAD1、TFAP2A、TLX1::NFIC、TP53、USF1、WT1-del2、WT1-KTS、WT1I、WT1I-del2、WT1I-KTS、XBP-1、YY1和ZNF354C DNA结合元件中的两个或多个后得到的人工合成的DNA序列。本发明实施例中使用的通用的内源转录因子及其复合物的转录因子串联结合序列如序列表中序列1所示，该序列没有细胞特异性，适用于人源和鼠源的所有生物样本。序列1由2800个碱基组成，包含上述100种转录因子的双拷贝核心结合元件，每个转录因子的双拷贝核心结合元件间隔3个碱基对(3个碱基对的核苷酸序列是任意的)。转录因子串联结合序列也可参考中国专利ZL201110457108X中介绍的。该序列可以和内源转录因子及其复合物结合，从而对生物样品中的转录因子及其复合物进行富集。

可用常规方法对转录因子串联结合序列用生物素进行标记，对磁珠用生物素亲和素进行包被，生物素和生物素亲和素可特异结合，从而可以将转录因子串联结合序列结合到磁珠上。将提取的核蛋白或全蛋白与结合有转录因子串联结合序列的磁珠进行孵育后，核蛋白或全蛋白中的转录因子及其复合物与转录因子串联结合序列特异结合。除去未特异结合的蛋白(杂蛋白)，得到与转录因子串联结合序列特异结合的蛋白(即内源转录因子及其复合物)，达到富集内源转录因子的目的。再将与转录因子串联结合序列特异结合的蛋白从磁珠上洗脱下来，达到分离内源转录因子及其复合物的目的。然后对与转录因子串联结合序列特异结合的蛋白进行LC-MS(液相色谱-质谱联用)检测，用生物信息学工具和方法确定与转录因子串联结合序列特异结合的蛋白(即内源转录因子及其复合物)的种类、名称及其含量，从而达到鉴定和定量的目的。

所述生物样品是指提取的核蛋白或全蛋白，少量是指用量仅为1-250μg。用少量样品进行检测的优点是节省实验材料和实验时间，提高效率，将可检测的生物样品范围扩大。

生物素标记的转录因子串联结合序列的用量为0.5-1pmol。

生物素亲和素包被的磁珠的用量为20μL(商品化磁珠，直接量取所需体积，约含有1.2-1.4×10⁷个磁珠)。

所述核蛋白或全蛋白与结合有转录因子串联结合序列的磁珠可在专用装置TOT柱中进行孵育、清洗、分离等操作。因此，本发明的第二个目的是提供一种用于快速富集、分离、鉴定和定量内源转录因子及其复合物的专用装置TOT柱。

本发明所提供的TOT柱(英文TFRE on tips的缩写，富集反应柱)，由吸头、用于固定吸头的套管和离心管组成，所述吸头内部尾端设膜结构封闭，内装结合有转录因子串联结合序列的磁珠；使用时套管放入离心管中，吸头***套管中使吸头、套管和离心管固定。

所述吸头内部尾端的膜结构优选为47mm的C18膜。

本发明的第三个目的是提供一种用上述专用装置TOT柱和少量样品快速富集、分离、鉴定和定量内源转录因子及其复合物的方法。

具体方法，可包括以下步骤：

1)将生物素标记的转录因子串联结合序列(TFRE DNA，DNA诱饵)与生物素亲和素包被的磁珠混合；

2)将结合有转录因子串联结合序列的磁珠加入TOT柱的吸头内；

3)将从生物样本中提取的核蛋白或全蛋白样品加入TOT柱的吸头内，孵育使样品中内源转录因子及其复合物与转录因子串联结合序列特异结合；

4)清洗磁珠，去除未特异结合的蛋白(杂蛋白)；

5)加入胰酶酶解，目的是利用胰酶将与转录因子串联结合序列特异结合的蛋白(内源转录因子及其复合物)切成长度为5-25个氨基酸不等的短肽段，这些肽段的分子量即为该蛋白的肽指纹图谱，可通过LC-MS(反相液相色谱-质谱联用)进行鉴定；

6)将酶解后的与转录因子串联结合序列特异结合的蛋白(肽段)与磁珠分离；

7)对与转录因子串联结合序列特异结合的蛋白(肽段)进行LC-MS(反相液相色谱-质谱联用)检测获得谱图，并用生物信息学工具和方法解读谱图确定与转录因子串联结合序列特异结合的蛋白(即内源转录因子及其复合物)的种类、名称及其含量。

在上述方法中，所述步骤1)需要利用PCR技术和带有生物素标记的引物先合成生物素标记的转录因子串联结合序列，所述磁珠优选为生物素亲和素包被的M280磁珠，生物素标记的转录因子串联结合序列的用量为0.5-1pmol，生物素亲和素包被的磁珠的用量为20μL(1.2-1.4×10⁷个磁珠)，将生物素标记的转录因子串联结合序列和生物素亲和素包被的M280磁珠在4℃垂直混匀30min，生物素亲合素可以和生物素结合，从而将转录因子串联结合序列结合到磁珠上。

所述步骤2)结合有转录因子串联结合序列的磁珠的用量为20μL。

所述步骤3)核蛋白或全蛋白用量为1-200μg。

所述步骤4)用NETN溶液和PBS溶液依次清洗磁珠。

所述步骤5)用胰蛋白酶酶解。

所述步骤6)分离方式可用乙腈萃取获得内源转录因子及其复合物肽段；也可用不同浓度(体积浓度依次为6％、9％、12％、15％、18％、21％、25％、30％、35％的乙腈溶液洗脱，将9个乙腈浓度洗脱的肽段合并为6个组分肽段(依次为6％+25％、9％+30％、12％+35％、15％、18％、21％)，步骤7)中对各组分肽段分别检测，可获得深度覆盖的蛋白质组数据。

所述步骤7)中的LC-MS(液相色谱-质谱联用)检测方法为：将抽干的肽段检测样用含有0.1％的甲酸溶液复溶并上样。使用Easy-nLC 1000nano-HPLC system(Thermo FisherScientific公司)和Orbitrap Fusion质谱仪(Thermo Fisher Scientific公司)进行检测。液相使用自制的nano-HPLC C18柱(预柱：3μm，2cm×100μm ID；分析柱：1.9μm，10cm×100μm ID)对肽段进行分离，流速400nl/min，梯度时间75min，B液(含有0.1％甲酸的乙腈溶液)比例从5％升至30％。离子源使用2000V电压和320℃温度。一级使用Orbi扫描，母离子扫描范围300-1400m/z，分辨率120,000(m/z 200),AGC 5e5，最大注入时间50ms。二级采用线性离子阱，碎裂能32％。所述生物信息学工具和方法是将获得的谱图通过搜库软件Proteome Discoverer 2.0(Thermo Fisher Scientific)中的Mascot 2.3(MatrixScience Inc)进行搜库，检索数据库为人源National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)RefSeq蛋白质数据库(updated on 04-07-2013,32015proteinentries)，参数设置为：母离子质量偏差20ppm，子离子质量偏差0.5Da；允许两个漏切位点；动态修饰包括phosphor(Y，中文：酪氨酸残基磷酸化修饰)、phosphor(ST，中文：丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化修饰)、acetyl(protein N-term，中文：N末端乙酰化修饰)和oxidation(M，中文：甲硫氨酸残基氧化修饰)；肽段水平FDR(错误发现率)允许1％。

所述步骤2)-步骤6)可以用离心的方法使反应物置于TOT柱的吸头内部底端。

本发明的第四个目的是提供一种用少量样品快速富集、分离、鉴定和定量内源转录因子及其复合物的试剂盒。

本发明所提供的试剂盒，包括结合有转录因子串联结合序列(TFRE DNA，DNA诱饵)的磁珠和专用装置TOT柱。

所述结合有转录因子串联结合序列的磁珠可置于TOT柱的吸头内部底端，用封口膜封装，置于4℃保存。使用时直接取用(加入核蛋白或者全蛋白即可进行检测)，在三个月的保质期内不会有柱效降低现象。

本发明提供了一种仅需少量样品即可快速富集、分离、鉴定和定量内源转录因子及其复合物的方法及其专用装置TOT柱。该方法利用转录因子及其复合物可与序列特异性DNA元件结合的特点，将提取的核蛋白或全蛋白(样品)在专用装置TOT柱中与结合有转录因子串联结合序列(TFRE DNA，DNA诱饵)的磁珠进行微量体积的孵育，从核蛋白或全蛋白中高效富集、分离内源转录因子及其复合物，后续进一步进行转录因子及其复合物的鉴定及定量。

本发明具有以下优点：

1)样品量小：仅需很少量的核蛋白或全蛋白样品即可进行检测，并可得到理想的检测效果，使得用于检测的生物样本量大大降低，扩展了基于转录因子串联结合序列(TFREDNA，DNA诱饵)的内源性转录因子及其复合物的富集、分离、鉴定和定量方法的应用范围，如96孔板培养的细胞、胃镜取样的胃粘膜样本等都可以进行转录因子表达谱的检测和研究。

2)检测时间短：得到核蛋白后仅需3个小时即可获得检测结果。转录因子富集的过程操作简便，步骤少，仅需要1个小时的酶解时间，进一步缩短了整个流程的用时。与传统TFRE方法需要至少两天的试验周期相比，该方法仅需要几个小时，因此是一种快速富集、分离、鉴定和定量内源转录因子及其复合物的方法。

3)方法具有可扩展性：将结合了转录因子的磁珠直接放于微型反相色谱柱上酶解，然后用不同浓度乙腈溶液洗脱，将肽段分为6个组分，分别检测，可获得深度覆盖的蛋白质组数据。

4)应用空间广阔：除了实验室的研究应用外，该方法还有广阔应用空间。转录因子特别是其中的核受体家族是目前药物设计的热门靶点，现有的药物也往往通过激活/抑制转录因子来发挥其药效。全景式扫描转录因子动态变化在药物机理和副作用研究中格外重要。本发明利用极少量生物样本(如96孔板培养的细胞等)来提取核蛋白或全蛋白作为样品，即可完成高通量鉴定和定量在药物刺激下细胞内源性转录因子动态变化，这极大提高了药物研究的效率和准确性。本发明实施例1中用96孔板单个孔收集的293T细胞检测到超过200种内源转录因子。

综上所述，本发明的方法快速、稳定、高效、可重复，可广泛应用于生物研究、医学检验、药物筛选等方面，本发明的专用装置应用简便、可储存、体积小，可将其制备成试剂盒，应用于临床检测、科学研究等领域中，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明快速富集、分离、鉴定和定量内源转录因子及其复合物的方法的流程图；

图2显示本发明的专用装置TOT柱：图2A为吸头结构；图2B为组装前的TOT柱；图2C为组装前后的TOT柱；

图3A组装后单个TOT柱的照片；图3B为多个TOT柱在离心机中的照片；

图4为三段短肽的XIC图。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、293T细胞内源转录因子及其复合物的快速富集、分离、鉴定和定量

如图1所示，本发明快速富集、分离、鉴定和定量内源转录因子及其复合物的方法包括以下步骤：

一、获得生物素标记的转录因子串联结合序列

以携带转录因子串联结合序列的质粒载体(质粒载体可为pUC57、pET24a+、pGEX4T-2、pGEX4T-1、pCMV-Myc、pGH或pcDNA-Myc等)为模板，在上游引物：5'-CATTCAGGCTGCGCAACTGTTG-3'和下游引物：5'-GTGAGTTAGCTCACTCATTAGG-3'(引物带有生物素标记)的引导下PCR扩增转录因子串联结合序列。100μL PCR扩增体系为：10×ExTaqBuffer 10μL，dNTPs(2.5mM/dNTP)10μL，pUC57-sdTF 1μL(约50ng)，上、下游引物各1μL(1nmol)，ExTaq 0.5μL，H₂O 87.5μL。PCR扩增条件为：先94℃2min，然后94℃45s，60℃45s，72℃2min，共35个循环，再72℃7min，最后4℃30min。PCR扩增结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收2800bp的目的片段，测序，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，结果获得了序列正确的高纯度生物素标记的转录因子串联结合序列(TFRE DNA，DNA诱饵)。该转录因子串联结合序列中包含了100种转录因子特异结合的DNA序列。

二、将生物素标记的转录因子串联结合序列与生物素亲和素包被的磁珠进行连接

1)取20μL M280磁珠( M-280streptavodin链霉亲和素磁珠，购自Invitrogen公司，1.2-1.4×10⁷个磁珠)到每一个干净的EP管(eppendorf管，离心管，1.5mL)内，多个管置于磁力Ep管架(是指单侧壁具有磁性的Ep管架，购自Promega公司)上吸附磁珠(是指将M280磁珠靠磁力吸附到具有磁性的Ep管架一侧，保证移走上清时不对M280磁珠造成损失)，然后移走上清；

这里，选择M280磁珠的原因是该磁珠是商业应用的具有生物素亲和素包被的磁珠，并且具有磁性，直径280um。

2)用50μL 1×DNA Binding Buffer(DNA结合缓冲液，配方：10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，2M NaCl)洗涤磁珠；

3)加入0.5pmol TFRE DNA，用2×DNA Binding Buffer将结合体系调节到1×DNABinding Buffer；

4)4℃垂直混匀30分钟；

5)用BC200溶液(每100mL含有：甘油20mL，3M KCl 6.7mL，0.5M EDTA 40μL，1MTris(pH7.3)2mL)洗涤2次，吸走所有上清。

洗涤的目的是为转录因子和DNA的结合提供环境，选择BC200作为洗涤剂的原因是BC200溶液盐浓度是200mM，与体内环境一致。

三、制备TOT柱(英文TFRE on tips的缩写，富集反应柱)

TOT柱由吸头、套管(吸头固定装置)和离心管(1.5mL)组成，参见图2A-图2C。吸头1呈长锥形结构，尾端内部使用C18膜31进行封闭(该膜可以阻止磁珠漏下，但是允许液体通过)，可使用47mm的C18膜，见图2A；吸头1用于装填磁珠32和各液体，为完成转录因子串联结合序列-磁珠连接、转录因子及其复合物的富集和分离提供空间。套管2用于固定吸头1，吸头1可***套管2底部的圆孔22中固定，套管2上部台阶21用于与离心管3固定，参见图2B和图2C；离心管3配合离心机设计，使用时套管2放入离心管3中，吸头1***套管2中从而使吸头和离心管固定，多个离心管能装入离心机以对其中吸头内的反应物进行离心操作，参见图3A和图3B。

结合图1和图2所示，进行以下操作：

1)剪取47mm的C18膜(购自3M公司)，置于吸头(pipet tip，200μL，购自Axygen公司)内部的尾端(参见图2之A幅)；

将C18膜置于吸头尾端的目的是截留磁珠的同时保证液体能够流出。

2)向吸头中加入100μL乙腈，1000rpm离心1min，重复1次；

加入乙腈的目的是清洗吸头及C18膜，离心的目的是去除吸头中的乙腈。

3)向吸头中加入100μL BC200溶液，1400rpm离心1min，重复1次；

使用BC200溶液的目的是进一步去除吸头中的乙腈，保证吸头内部环境与连接有转录因子串联结合序列的生物素亲和素包被的磁珠所处的环境一致；离心的目的是去除吸头内部液体，方便控制后续操作中吸头内溶液体积。

4)将步骤二中已连接有转录因子串联结合序列的磁珠用20μL BC200溶液重悬，加入TOT柱中；

5)用封口膜包好TOT柱后，可置于4℃保存。

使用时将多个TOT柱放入离心机，如图3所示。

四、提取293T细胞的核蛋白

可以用市场上成熟的nuclear and cytoplasmic extraction reagents(Thermo78835)试剂盒或Dignam方法(参考文献：Dignam et al.1983.Dignam J D,Lebovitz R M,Roeder R G.Accurate transcription initiation by RNA polymeraseII in a soluble extract from isolated mammalian nuclei[J].Nucleic acidsresearch,1983,11(5):1475-1489.Zerivitz and Akusjarvi，1989，Kenn Zerivitz, An imporved nuclear extract preparation method,Gene AnalysisTechniques,Volume 6,Issue 5,1989,Pages 101-109)提取核蛋白，本实施例用Dignam方法提取293T细胞的核蛋白，具体过程如下：

1)取正常培养的293T细胞(15cm细胞培养皿培养)，4℃、1000rpm离心10分钟收集细胞，用1×PBS重悬细胞沉淀，再次4℃、1000rpm离心10分钟收集细胞；

2)用10倍沉淀体积的低渗溶液(10mM Tris·HCl pH 7.3，1.5mM MgCl₂，10mMKCl，使用前加入10mMβ-ME和1mM PMSF)重悬细胞沉淀，置冰上20分钟后，用匀浆器匀浆15下，4℃、4000rpm离心15分钟，弃上清；

3)用1/2沉淀体积的低盐溶液(20mM Tris·HCl pH 7.3，1.5mM MgCl₂，20mM KCl，0.2mM EDTA，25％glycerol，使用前加入10mMβ-ME和1mM PMSF)重悬沉淀，并逐滴加入1/2细胞体积的高盐溶液(20mM Tris·HCl pH 7.3，1.5mM MgCl₂，1.2M KCl，0.2mM EDTA，25％glycerol，使用前加入10mMβ-mercaptoethanol，0.5×Protein inhibitors)，混匀后4℃垂直混匀30分钟，4℃、25,000rpm离心20分钟；

4)上清用BC0溶液(20mM Tris·HCl pH 7.3，0.2mM EDTA，20％glycerol，使用前加入10mMβ-ME，1mM PMSF)等体积稀释，得到核蛋白，分装后用液氮速冻，于-80℃存储备用。

不同生物样本，以及同一生物样本所处的不同条件，都会对检测结果产生影响。应使用标准化提取核蛋白的方案，例如本例将293T细胞作为样本，以进行标准化操作后得到的结果为准。当标准核蛋白样品的检测结果在理论参考范围内，则代表样本检测的整个实验方案和实验操作过程行之有效。对于不同的生物样本，如A549细胞，小鼠组织等，也可应用已知的标准方法提取核蛋白或全蛋白，不一一赘述。

五、转录因子及其复合物的富集和分离

1)取50μg 293T细胞的核蛋白(步骤四提取的)，加入步骤三内装磁珠的TOT柱中，将核蛋白样品和TOT柱中的磁珠混匀后，冰上静置孵育10min，2300rpm离心5分钟，离心去除上清；

2)对离心后的核蛋白重复步骤1)中孵育、离心的操作；

两步离心的目的是去除TOT柱中液体，并增加核蛋白中转录因子的富集效率。

3)向TOT柱中加入100μL 50mM NETN溶液(每100mL含有：1M Tris-HCl(pH8.0)1mL，5M NaCl 1mL，0.5M EDTA 200μL，NP40乙基苯基聚乙二醇250μL)，将磁珠混匀后，500rpm离心5min，去除上清；

重复一次步骤3)。该步使用NETN溶液的目的是去除与转录因子串联结合序列非特异结合的蛋白，即除杂蛋白。

4)向TOT柱中加入100μL PBS溶液(磷酸缓冲盐溶液，配方：137mM NaCl，2.7mMKCl，10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄)，将磁珠混匀后，用500rpm离心5min，去除上清；

重复一次步骤4)。该步PBS溶液的作用是去除TOT柱中残留的NETN溶液。

5)向TOT柱中加入10μL 50mM碳酸氢铵溶液，并加入0.2μg胰酶，37℃静置1小时；

该步中碳酸氢铵溶液的作用是确保TOT柱内为胰酶反应的最适环境，胰酶的作用是对蛋白的一级结构进行特异性酶切，从而得到长度为8-25个氨基酸不等的短肽段。

6)用100μL含有0.1％(V/V)甲酸的50％(V/V)乙腈萃取，取萃取液；重复萃取一次，合并两次萃取液并热干得到用于后续LC-MS检测的蛋白检测样。

该步中甲酸的作用是终止胰酶的反应，乙腈的作用是对酶切产物进行萃取，去除多余的杂质。萃取液中含有希望得到的5-25个氨基酸的短肽段。热干的目的是去除萃取液，方便对质谱检测时的检测样所处溶液体系的控制。

步骤6)短肽段与磁珠的分离方式有两种选择，在快速检测情况下只需要用50％体积分数的乙腈溶液萃取即可；本例使用该方式，得到众多短肽段混合的蛋白检测样(用于后续LC-MS检测)。

当实验需要深度覆盖的蛋白质组数据时，还可用不同浓度梯度的乙腈溶液，利用sRP(小型反相色谱柱)分别洗脱分离，如可用不同浓度(浓度依次为6％、9％、12％、15％、18％、21％、25％、30％、35％)的乙腈溶液洗脱，将9个浓度洗脱的肽段合并为6个组分蛋白检测样(依次为6％+25％、9％+30％、12％+35％、15％、18％、21％)用于后续进行各组分蛋白检测样的分别检测，可获得深度覆盖的蛋白质组数据，见实施例4。该梯度洗脱分离的方式这体现了本发明方法良好的扩展性。

六、转录因子及其复合物的鉴定和定量

1)LC-MS(液相色谱-质谱联用)鉴定

用LC-MS(液相色谱-质谱联用)对293T细胞的内源转录因子及其复合物进行鉴定。LC-MS的检测原理是利用反相高效液相色谱对不同物质进行分离，质谱实时检测并鉴定不同物质的质荷比，可用于检测并鉴定复杂化合物的结构，具有高效、高准确度、高灵敏度和宽动态范围的优点。

检测仪器：Easy-nLC 1000 nano-HPLC system(Thermo Fisher Scientific公司)和Orbitrap Fusion质谱仪(Thermo Fisher Scientific公司)；

液相色谱条件：预柱：C18，3μm，2cm×100μmID；

色谱柱:C18，1.9μm，10cm×100μm ID；

流动相：A水+0.2％甲酸，B乙腈+0.2％甲酸；

流速：400nl/min；洗脱梯度从5％B液至30％B液，梯度时间75min。

质谱条件：

数据采集时间：75min；

喷雾电压(spray voltage)2KV；

碰撞能量(normalized collision energy)32％；

采集质量范围：300-1400Da。

LC-MS检测过程为：将步骤五热干的肽段(蛋白检测样)用含有0.1％的甲酸溶液复溶并上样。液相使用nano-HPLC C18柱(预柱：3μm，2cm×100μm ID；分析柱：1.9μm，10cm×100μm ID)对肽段进行分离，流速400nl/min，梯度时间75min，B液(含有0.1％甲酸的乙腈溶液)比例从5％升至30％。离子源使用2000V电压和320℃温度。一级采用Orbi扫描，母离子扫描范围300–1400m/z，分辨率120,000(m/z 200),AGC 5e5，最大注入时间50ms。二级采用线性离子阱，碎裂能32％。用LC-MS(液相色谱-质谱联用)获得293T细胞的内源转录因子及其复合物的谱图。

2)搜库和定量

利用生物信息学工具和方法将步骤1)获得的谱图进行搜库。数据库搜索的目的是对质谱产出的数据进行分析，确定质谱产出的数据中包含的蛋白。其过程是通过对质谱产出的数据中的母离子的二级谱图进行分析，在一定的质量偏差范围内对碎片离子的强度分布情况与理论强度进行对比，通过未超出质量偏差范围的碎片离子情况对母离子进行评分从而得到母离子(短肽段)的鉴定结果。再将短肽段与已知的蛋白质氨基酸序列库进行匹配，确定所检测到的短肽段所属的蛋白信息，得到蛋白的鉴定结果。

生物信息学工具和方法是将获得的谱图通过搜库软件Proteome Discoverer 2.0(Thermo Fisher Scientific)中的Mascot 2.3(Matrix Science Inc)进行搜库，所使用的检索数据库为人源National Center for Biotechnology Information(NCBI)RefSeq蛋白质数据库(updated on 04-07-2013,32015 protein entries)，参数设置为：母离子质量偏差20ppm，子离子质量偏差0.5Da；允许两个漏切位点；动态修饰包括phosphor(Y)、phosphor(ST)、、acetyl(protein N-term)和oxidation(M)；肽段水平FDR允许1％。

将搜库确定的肽段进一步进行定量。定量的方法为非标定量方法。通过数据库搜索产生的肽段匹配图谱信息对原始数据中的一级谱图进行计算，得到所有短肽段的一级定量结果的比值。批量计算的程序可使用已有的《基于高解析度质谱数据肽段交叉回归的蛋白丰度定量软件[简称：PQPCR]》V 1.0(中华人民共和国国家版权局计算机软件著作权登记书号：软著登字第0451332号，登记号2012SR083269，登记日期2012年09月04日，著作权人：北京蛋白质组研究中心)。

七、检测结果验证

为了验证本发明方法的可行性和检测能力，用上述方法使用293T细胞进行了3次重复实验(实施例1之#1-#3)，得到约7万多张谱图，据此分别鉴定到285、310、304种内源转录因子如表1所列，表明细胞核蛋白中大量的内源转录因子及其复合物被TOT柱所富集，而核蛋白单次实验只用了50μg。当仅用1μg核蛋白进行试验时，可检测到158种转录因子(实施例1之#4)。

本发明使用含有100种转录因子的序列却能鉴定到超过100种转录因子，这是因为，虽然转录因子结合序列只有100种转录因子，但是多种转录因子可以和同一类结合序列相结合，也就是说转录因子和结合序列并非一一对应关系。人体基因组中包含1500个左右的转录因子编码基因，这些转录因子可以分为50个家族，分类依据是转录因子结合域不同，每个家族的转录因子倾向于结合一种特定序列。因此本发明选择每个家族的代表性结合序列构建转录因子特异性结合序列即可(不需要把每一种转录因子的结合序列都放在这条人工序列中)。试验中转录因子结合序列DNA是有很多，0.5pmol即是3.01x10¹¹条DNA，因此可以结合很多转录因子。

表1：293T细胞中内源转录因子及其复合物的鉴定

以转录因子HOXB9为例说明定量分析。HOXB9(homeobox protein Hox-B9)经质谱分析测得3条短肽序列，分别是GEAAPGQGQAAVK、QGTPEYSLETSAGR、TWLEPAPR，根据鉴定结果的RT(色谱保留时间)和m/z(质荷比)，可以提取其XIC(Extracted Ion Chromatogram提取离子流色谱峰图)，见图4，其XIC大小即代表了短肽的定量值大小。使用《基于高解析度质谱数据肽段交叉回归的蛋白丰度定量软件[简称：PQPCR]》对短肽进行XIC峰面积的计算，计算结果如表2“XIC Area”列所示，从而获得短肽的定量结果。

表2：对转录因子HOXB9短肽定量分析结果

Sequence	RT(s)	m/z(Da)	XIC Area
				GEAAPGQGQAAVK	748.76	592.3066	7232321
QGTPEYSLETSAGR	1890.16	748.3543	15005210
				TWLEPAPR	2204.84	485.2606	9507436

使用同样方法可以对各转录因子短肽进行定量，不再一一赘述。基于表1的鉴定结果再配合定量分析数据，可以全景式反映样本中转录因子的种类和含量，为科学研究、药物筛选提供了依据。

本实施例可见，本发明可广泛应用于样品中大规模转录因子及其复合物的鉴定、特定转录因子确证和定量，特别是样本量较少时优势更加明显，原因是操作步骤少，操作过程中样本损失少，高浓度反应体系提高酶切效果。

实施例2、胃粘膜内源转录因子及其复合物的富集、分离、鉴定和定量

将本发明方法应用于临床生物样本中内源转录因子的鉴定和定量。

生物样本为用胃镜检查中获取的胃粘膜样本，使用两例胃粘膜样本，湿重分别为7.2mg和8.3mg，直接提取胃粘膜组织中的核蛋白然后进行富集，按实施例1的步骤进行实验。参照实施例1步骤四分别提取了73μg(实施例2-1)和106μg(实施例2-2)核蛋白，利用TOT柱对核蛋白样品中转录因子及其复合物进行富集，结果分别鉴定到接近150种转录因子，见表1。定量方法同实施例1，不再赘述。

本实施例表明本发明对内源转录因子及其复合物的富集、分离、鉴定和定量的方法不仅能应用于生物研究，还将应用于医学检验、药物筛选等方面。且该方法检测时间短，转录因子富集的过程操作简便，步骤少，仅需要1个小时的酶解时间，得到核蛋白后仅需3个小时即可获得检测结果，是一种快速富集、分离、鉴定和定量内源转录因子及其复合物的方法。

实施例3、内源转录因子及其复合物的快速富集、分离、鉴定和定量试剂盒

本发明的内源转录因子及其复合物的富集、分离、鉴定和定量试剂盒包括检测试剂和TOT柱；

其中，检测试剂包括：NETN和PBS溶液，配方详见实施例1。每个TOT柱配相应溶液各200μL。

试剂盒使用方法参见实施例1。

实施例4、TOT和sRP(小型反相色谱柱)分离实验

本实施例除特别说明外，其它步骤均与实施例1一致。

特别之处为实施例步骤五的6)使用梯度洗脱分离的方式，具体操作为：使用NETN和PBS溶液清洗磁珠，去除非特异性结合的蛋白之后，将TOT柱中的磁珠利用50mM NH₄HCO₃溶液转移至含有1-2mg C18填料(3M公司)的小型反相色谱柱中，加入胰酶，37℃酶解1小时。之后用9个不同体积浓度(6％、9％、12％、15％、18％、21％、25％、30％、35％)的乙腈溶液依次洗脱，并合并为6个质谱检测组分。乙腈浓度梯度及合并方式为6％+25％、9％+30％、12％+35％、15％、18％和21％。

使用250μg 293T细胞提取的核蛋白进行TOT富集，最终通过6个组分蛋白检测样的检测，合计可鉴定715种转录因子，结果见表1，可见本实施例可获得深度覆盖的蛋白质组数据。

附表：表1所列转录因子

Claims

1.用少量样品快速富集、分离、鉴定和定量内源转录因子及其复合物的方法，包括以下步骤：从生物样本中提取核蛋白或全蛋白样品，将生物素标记的转录因子串联结合序列(TFRE DNA，DNA诱饵)与生物素亲和素包被的磁珠混合，将提取的核蛋白或全蛋白与结合有转录因子串联结合序列的磁珠混合进行孵育，取得与转录因子串联结合序列特异结合的蛋白(即内源转录因子及其复合物短肽)，将内源转录因子及其复合物短肽与磁珠分离，对分离的内源转录因子及其复合物短肽进行LC-MS(液相色谱-质谱联用)检测，并用生物信息学工具和方法确定内源转录因子及其复合物的种类、名称及其含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述转录因子串联结合序列是指由3-5bp的接头序列(Linker)串联的转录因子AP1、AR、BRCA1、CEBPA、CREB1、E2F1、ELK1、ELK4、ESR1、ETS1、EWSR1-FLI1、FEV、FOXA1、FOXC1、FOXD1、FOXF2、FOXI1、FOXL1、FOXO3、Fra-1、GATA2、GATA3、GR、HIF1A::ARNT、HLF、HNF1B、HNF4A、HOXA5、INSM1、IRF1、IRF2、JunB、JunD、MAX、MEF2A、MIZF、MYC::MAX、Myf、MZF1_1-4、MZF1_5-13、NF-kappaB、NFATC2、NFE2L2、NFIC、NFIL3、NFKB1、NFYA、NHLH1、NKX3-1、NR1H2::RXRA、NR2F1、NR3C1、NR4A2、Pax6、PBX1、PDX1、PLAG1、PPARG、PR、PXR-1:RXR-alpha、RAR-alpha、RAR-alpha:RXR-gam、RAR-beta:RXR-alpha、REL、RELA、REST、RFX1、RFX2、RFX3、RFX5:RFXAP:RFXANK、RORA_1、RORA_2、RREB1、RXR::RAR_DR5、RXRA::VDR、SOX10、SOX9、SP1、SPI1、SPIB、SRF、SRY、STAT1、STAT5A、T3R-beta1、TAL1::TCF3、TBP、TEAD1、TFAP2A、TLX1::NFIC、TP53、USF1、WT1-del2、WT1-KTS、WT1I、WT1I-del2、WT1I-KTS、XBP-1、YY1和ZNF354C DNA结合元件中的两个或多个后得到的人工合成的DNA序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述转录因子串联结合序列如序列表中序列1所示。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述样品是指从生物样本中提取的核蛋白或全蛋白，少量是指用量仅为1-250μg；生物素标记的转录因子串联结合序列的用量为0.5pmol；生物素亲和素包被的磁珠的用量为20μL(含1.2-1.4×10⁷个磁珠)。

5.用于权利要求1至4任一所述快速富集、分离、鉴定和定量内源转录因子及其复合物方法中使用的专用装置TOT柱，由吸头、用于固定吸头的套管和离心管组成，所述吸头内部尾端设膜结构封闭，内装结合有转录因子串联结合序列的磁珠；使用时套管放入离心管中，吸头***套管中使吸头、套管和离心管固定。

6.根据权利要求5所述的专用装置TOT柱，其特征在于：所述吸头内部尾端的膜结构为47mm的C18膜。

7.一种用权利要求5或6所述的专用装置TOT柱和少量样品快速富集、分离、鉴定和定量内源转录因子及其复合物的方法，包括以下步骤：

1)将生物素标记的转录因子串联结合序列(TFRE DNA，DNA诱饵)与生物素亲和素包被的磁珠混合得到结合有转录因子串联结合序列的磁珠；

3)将从生物样本中提取的核蛋白或全蛋白样品加入TOT柱的吸头内，孵育使样品中内源转录因子及其复合物蛋白与磁珠特异结合；

4)清洗磁珠，去除未特异结合的蛋白(杂蛋白)；

5)加入胰酶酶解，将内源转录因子及其复合物蛋白切成长度为5-25个氨基酸不等的短肽段；

6)萃取将肽段与磁珠分离；

7)对肽段进行LC-MS(液相色谱-质谱联用)检测获得谱图，并用生物信息学工具和方法解读谱图，确定与转录因子串联结合序列特异结合的蛋白(即内源转录因子及其复合物)的种类、名称及其含量。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

步骤1)所述转录因子串联结合序列为权利要求2或3中提到的序列；利用PCR技术和带有生物素标记的引物合成生物素标记的转录因子串联结合序列；所述磁珠为生物素亲和素包被的M280磁珠；混合中生物素标记的转录因子串联结合序列的用量为0.5pmol，生物素亲和素包被的磁珠的用量为20μL(含1.2-1.4×10⁷个磁珠)，混合方式为4℃垂直混匀30min。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：

步骤2)结合有转录因子串联结合序列的磁珠的用量为20μL；步骤3)核蛋白或全蛋白用量为1-250μg；

步骤4)用NETN溶液和PBS溶液依次清洗；

步骤6)分离的方式为用乙腈萃取获得内源转录因子及其复合物肽段；或用不同体积浓度(浓度依次为6％、9％、12％、15％、18％、21％、25％、30％、35％)的乙腈溶液洗脱，并将9个浓度洗脱的肽段合并为6个组分肽段(依次为6％+25％、9％+30％、12％+35％、15％、18％、21％)，步骤7)中对各组分肽段分别检测，可获得深度覆盖的蛋白质组数据；

步骤7)所述生物信息学工具和方法是将获得的谱图通过搜库软件在蛋白质数据库中进行搜库确定内源转录因子及其复合物的种类、名称，利用蛋白丰度定量软件将已确定的内源转录因子及其复合物进行定量。

10.一种用少量样品快速富集、分离、鉴定和定量内源转录因子及其复合物的试剂盒，至少包括前述权利要求中提及的所述结合有转录因子串联结合序列的磁珠和专用装置TOT柱，该磁珠封装于TOT柱的吸头内；还可以包括前述权利要求中提及的NETN溶液、PBS溶液和/或胰酶等。