CN106544348A

CN106544348A - 异戊烯基焦磷酸异构酶基因及其应用

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Publication number: CN106544348A
Application number: CN201510613790.5A
Authority: CN
Inventors: 李春; 胡开蕾; 韩莉; 张莎莎; 赖小勤; 刘伟丰; 徐欣怡; 高珊; 陶勇
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2015-09-23
Filing date: 2015-09-23
Publication date: 2017-03-29
Anticipated expiration: 2035-09-23
Also published as: CN106544348B

Abstract

本发明涉及一种异戊烯基焦磷酸异构酶基因及其应用，其解决了利用工程菌合成萜类化合物效率不高的技术问题，本发明提供了一种异戊烯基焦磷酸异构酶基因、其表达的蛋白质、含有异戊烯基焦磷酸异构酶基因的原核表达载体及产萜类化合物工程菌的制备方法及应用。本发明可广泛用于萜类化合物制备领域。

Description

异戊烯基焦磷酸异构酶基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种异戊烯基焦磷酸异构酶基因及其应用。

背景技术

萜类化合物是指具有异戊二烯结构单元(C₅H₈)n通式的化合物及其含氧和不同饱和程度的衍生物，萜类化合物是通过他们的前体异戊烯基焦磷酸(IPP)和其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)缩合而成。

萜类化合物在自然界中广泛存在，高等植物、真菌、微生物、昆虫以及海洋生物，都能合成萜类化合物。番茄红素、虾青素、胡萝卜素、维生素A、辅酶Q10、紫杉醇及青蒿素等都是萜类化合物。萜类化合物有许多的生理活性，如祛痰、止咳、驱风、发汗、驱虫、镇痛等，是中草药中的一类比较重要的有效成分；同时它们也可以作为一类重要的天然香料，是化妆品和食品工业不可缺少的原料；萜类化合物还是重要的工业原料，是汽车工业和飞机工业的重要原料，如异戊二烯长链化合物橡胶。

萜类化合物的传统的生产方法是从诸如植物、微生物和动物中提取，然而产率极低。原因如下：首先，大多数萜类化合物在自然中只有少量的积累；其次，供体生物通常不适合大规模培养，而大规模培养是大规模商业生产萜类化合物所必需的；第三，萜类化合物的提取需要有毒溶剂，这需要特殊的处理步骤，因此萜类化合物的商业生产变得更加复杂。

从n＝1的C₅H₈(异戊二烯)到n＝n的(C₅H₈)_n的天然橡胶，萜类化合物的合成途径都有两个阶段，第一个阶段为异戊二烯单元IPP的生成阶段，第二个阶段为萜类化合物生成及修饰阶段。第一个阶段自然界中存在两种不同的途径，真核生物主要依赖甲羟戊酸(MVA)途径，将乙酰辅酶A(乙酰-CoA)转化为IPP，然后IPP被异戊烯基焦磷酸异构酶(IDI)异构化为DMAPP，原核生物一般依赖脱氧木酮糖-5-磷酸(MEP)途径来生成IPP，再由IDI将IPP异构化为DMAPP,植物则即可以利用MVA途径又可以利用MEP途径(Mendoza-Poudereux I et al.Plant PhysiolBiochem.201595:113-20)。可见无论哪种合成途径，都需要一个相同的酶，即异戊烯基焦磷酸异构酶将IPP异构为DMAPP进入萜类化合物的生成阶段因此，寻找一个高效的异戊烯基焦磷酸异构酶对增强萜类化合物合成途径有巨大的帮助。

据报道，每年植物释放到大气中的异戊二烯达到5Tg，异戊二烯是萜类化合物的合成单元，因此推断植物中有很强的萜类化合物合成途径，选择释放量很高的植物，也许会是个异戊烯基焦磷酸异构酶基因很好来源。

利用基因工程技术开展异戊烯基焦磷酸异构酶基因的研究已取得了一些进展，研究人员分离鉴定得到了少量的异戊烯基焦磷酸异构酶基因，但主要集中在细菌(Hamano Y et al.Biosci Biotechnol Biochem.200165(7):1627-35)、真菌中(Wu FL et al.Int J Med Mushrooms.201315(3):223-32)，而在植物中较少(Tong Y et al.Biotechnol ApplBiochem.2015Aug 2.doi:10.1002/bab.1427)，特别是白杨中并无研究报道，基因库中也没有白杨异戊烯基焦磷酸异构酶基因。

发明内容

本发明就是为了解决利用工程菌合成萜类化合物效率不高的技术问题，提供一种具有较强的萜类化合物合成途径的工程菌及应用。

为达到上述目的，一种异戊烯基焦磷酸异构酶基因，其是如下(a)或(b)的基因：(a)所述基因cDNA的核苷酸序列如序列表的SEQ ID No.1所示；(b)所述基因是编码如下蛋白质的基因：序列表的SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊烯基焦磷酸异构酶活性的由序列表的SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质衍生的蛋白质。

本发明同时提供一种异戊烯基焦磷酸异构酶基因表达的蛋白质，其是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)中的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊烯基焦磷酸异构酶活性的由(a)衍生的蛋白质；序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质是由序列表的序列1所示碱基序列编码。

本发明还提供异戊烯基焦磷酸异构酶基因的原核表达载体。

本发明还提供异戊烯基焦磷酸异构酶基因原核表达载体的产异戊二烯工程菌。

本发明同时提供产异戊二烯工程菌在制备异戊二烯中的应用。

本发明还提供异戊烯基焦磷酸异构酶基因原核表达载体的萜类化合物特别是番茄红素工程菌。

本发明同时提供产番茄红素工程菌在制备番茄红素中的应用。

本发明的有益效果：根据植物在自然界异戊二烯的释放速率，本发明选择了释放量较高的杨树异戊烯基焦磷酸异构酶基因进行了分离鉴定和克隆，成功构建异戊二烯生产菌株及萜类化合物生产菌株，为生物法生产萜类化合物寻找到一个高效的异戊烯基焦磷酸异构酶。本发明利用基因工程手段，克隆得到了银白杨基因Paidi，应用到大肠杆菌中，大肠杆菌生产异戊二烯及番茄红素的能力比原始菌株有显著提高，本发明对于使用微生物进行萜类化合物大规模工业生产提供了一个高效有效的酶。

附图说明

图1是银白杨总RNA的琼脂糖电泳结果；

图2是异戊二烯标准品的气相色谱结果；

图3是银白杨Paidi基因在大肠杆菌异戊二烯工程菌中应用的气相检测结果；

图4是番茄红素标准品的全波长扫描结果；

图5是银白杨Paidi基因在大肠杆菌番茄红素工程菌中转化8h的全波长扫描结果；

图6是银白杨Paidi基因在大肠杆菌番茄红素工程菌中转化24h的全波长扫描结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，大肠杆菌BW25113(Baba T et al.Mol Syst Biol.2006；2:2006.0008.)是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短、容易培养且培养基原料低廉。大肠杆菌BW25113公众可从中国科学院微生物研究所获得，以上所述生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1：基因片段的获得

1.提取白杨叶片总RNA

采集白杨叶片，使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen公司)提取杨树叶片总RNA，按照试剂盒说明方法进行，进行电泳(图1)验证RNA提取质量，可见RNA完整性良好，可以进行后续实验。

2.RACE-Ready cDNA的制备

RACE-Ready cDNA第一链的反转录体系如下：

获得cDNA全长的方法为SMARTer-RACE，使用PCR cDNASynthesis Kit(Clontech公司)进行，以下使用的引物及试剂除GSP均为PCR cDNA Synthesis Kit内提供，按照试剂盒说明方法进行。

RACE-Ready cDNA第一链的反转录体系如下：

3.基因特异性引物的设计：

根据大肠杆菌、酿酒酵母等微生物及胶树、可可树、巴旦木等植物的IDI氨基酸序列的保守区，参考所有已知idi基因的核酸序列设计基因特异性引物(GSP)，RACE-Ready cDNA做模版，GSP及通用引物(Universal Primer Mix，UPM)做引物进行扩增，可以得到3’-RACE cDNA片段及5’-RACE cDNA片段。

共5个GSP序列，如下表：

实施例2：Paidi基因编码区全长的获得

1. 3’-RACE cDNA末端序列的获得

使用银白杨的3’-RACE-Ready cDNA为模版，UPM与GSP为引物进行扩增

反应体系：

反应条件：

3’-RACE的琼脂糖凝胶检测可以看到有一个单一明亮的银白杨DNA扩增条带，连接T载体，转化感受态细胞，挑选阳性克隆Sanger测序，得到3’端cDNA序列。

2. 5’-RACE cDNA末端序列的获得

使用银白杨的5’-RACE-Ready cDNA为模版，UPM与GSP为引物进行扩增.

反应体系：

反应条件：

5’-RACE的琼脂糖凝胶检测得到单一明亮的扩增条带，选择其一连接T载体，转化感受态细胞，挑选阳性克隆Sanger测序，得到5’端cDNA序列。

3.全长序列的获得

根据3’-RACE及5’-RACE测序结果，进行序列比对，得到该基因cDNA全长序列(SEQ ID No.1所示序列)，对DNA、氨基酸序列进行分析：该基因有705bp，编码234个氨基酸，有ATG起始密码子和TGA终止密码子，说明该基因的完整性；利用BLAST软件在NCBI中进行同源比对，结果显示该基因为Nudix_hydrolase superfamily成员，功能区定义为Idi，与胡杨(Populus euphratica)isopentenyl-diphosphateDelta-isomerase I同源性达到98％；与毛果杨(Populus trichocarpa)的IPP isomerase family protein有98％同源性，与橡胶树(Heveabrasiliensis)(Populus trichocarpa)的isopentenyl-diphosphateDelta-isomerase有92％的同源性，说明我们得到的是异戊烯基焦磷酸异构酶基因，简写为Paidi基因，得到了编码PAIDI蛋白的氨基酸序列(SEQID No.2所示序列)。

实施例3：大肠杆菌异戊二烯生产菌株的构建

1.大肠杆菌表达载体p2-0构建

全长引物序列如下：

使用MB-F及MB-R为引物，p2质粒为模版，获得的基因片段MB进行SalI和PstI(TAKARA公司)双酶切，并将pSB1c表达载体(本实验室构建，***糖诱导性启动子，序列如SEQ ID No.3所示序列)进行XhoI和PstI双酶切，MB基因片段连接至pSB1c载体后得到了p2-0，转化至trans5α感受态细胞，选取阳性克隆进行测序，p2-0的核苷酸序列是SEQID No.4。

2.大肠杆菌表达载体p2-paidi构建

全长引物PAFa及PARa序列如下：

PAFa：5'ATCGGctgcagATGGGTGACGCTCCTGATGC 3'

PARa：5'ATCCGctgcagTCAAGTCAGCTTGTGAATCGC 3'

将使用引物PAFa及PARa获得的Paidi基因片段进行PstI(TAKARA公司)单酶切，并将p2-0表达载体PstI单酶切，Paidi基因片段连接至拍-0载体后得到了p2-paidi，转化至trans5α感受态细胞，选取阳性克隆进行测序，p2-paidi的核苷酸序列是SEQ ID No.5。

3.异戊二烯生产菌株MV/paidi的构建

将构建好的p2-paidi与质粒p1及pBAD-SbispS共转化至BW25113宿主得到异戊二烯生产菌株MV/paidi。

并且构建对照菌株MV/ecidi,方法为将p2与质粒p1及pBAD-SbispS共转至BW25113宿主，得到大肠杆菌idi基因对照菌株MV/ecidi。

上述异戊二烯生产菌的构建方法中，p1，p2包含异戊二烯合成途径-甲羟戊酸(MVA)途径基因。其中p1由MvaE(乙酰辅酶A乙酰转移酶)基因、MvaS(HMG-乙酰辅酶A合成酶)基因及MVK(甲羟戊酸激酶)基因组成，所述MvaE基因编码由SEQ ID No.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述MvaS基因编码由SEQ ID No.7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述MVK基因编码由SEQ ID No.8所示的氨基酸序列组成的蛋白质。p2由PMK(磷酸甲羟戊酸激酶)基因、MVD(焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶)基因及idi(异戊二烯焦磷酸异构酶)基因组成，所述PMK基因编码由SEQ IDNo.9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述MVD基因编码由SEQ ID No.10所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述idi基因编码由SEQ ID No.11所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

其中，p1为链霉素抗性***糖诱导型表达载体，p1的核苷酸序列是SEQ ID No.12，包含MVA上游途径基因表达盒，MVA上游途径基因表达盒的核苷酸序列是SEQ ID No.12的第1307-5821位，SEQ ID No.12的第89-964位为***糖启动子，SEQ ID No.12的第5930-6087位为TrrnB终止子，SEQ ID No.12的第1307-3729位是MvaE基因的编码序列，SEQID No.12的第3730-4904位是MvaS基因的编码序列，SEQ ID No.12的第4905-5821位是MVK基因的编码序列。

P2为氯霉素抗性***糖诱导型表达载体，p2的核苷酸序列是SEQID No.13，包含MVA下游途径基因表达盒，MVA下游途径基因表达盒的核苷酸序列是SEQ ID No.13的第1309-4442位，SEQ ID No.13的第89-964位为***糖启动子，SEQ ID No.13的第4569-4726位为TrrnB终止子，SEQ ID No.13的第1309-2661位是PMK基因的编码序列，SEQ ID No.13的第2677-3864位是MVD基因的编码序列，SEQ ID No.13的第3894-4442位是idi基因的编码序列。

pBAD-SbispS为氨苄抗性***糖诱导性表达载体，其序列如SEQ IDNo.20所示，包含垂柳异戊二烯合成酶基因，使大肠杆菌具备生产异戊二烯的能力。

实施例4：Paidi基因在大肠杆菌异戊二烯工程菌中的应用

1、大肠杆菌发酵产物的检测

上述大肠杆菌工程菌MV/paidi及对照菌MV/ecidi发酵，方法如下：将工程菌以百分之一的接种量转接到30mL(500mL三角瓶)含有链霉素、氯霉素及氨苄抗性的***糖自诱导培养基(ZYM)中，30℃，280rpm培养20h后。4℃，4000rpm离心收集菌液，用含有4％葡萄糖的M9培养基重悬至60OD菌体浓度，取1mL重悬菌液置于20mL顶空瓶内，37℃，280rpm震荡培养30h。

含有链霉素、氯霉素及氨苄的自诱导培养基自诱导培养基ZYM配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200μL D+100μL E(以下均为质量百分比浓度)；

A.ZY：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉；

B.50×M：1.25M Na2HPO4，1.25M KH2PO4，2.5M NH4Cl和0.25M Na2SO4；

C.50×5052：25％甘油，2.5％葡萄糖，10％乳糖；

D.1M MgSO4；

E.1000×微量元素：50Mm FeCl3，20mM CaCl2，10mM MnCl2，10mM ZnSO4，CoCl2、NiCl2、Na2Mo4、Na2SeO3和H3BO3各2mM；

链霉素:终浓度50mg/L、氯霉素终浓度34mg/L、氨苄终浓度100mg/L。

M9培养基配方如分子克隆实验指南(科学出版社)第三版1595页所示。

反应结束后，进行气相色谱(GC)分析，使用的气相色谱分析仪为Agilent 7890A GC Sysytem及Agilent7697A headspace Sampler顶空进样器，气相分离柱为HP-5。顶空取样方法如下，Time：GC cycle time 20min，Vial equib time 6min；Temperature(℃)：Oven 51,Loop/Valve 55,Transfer line 60。GC方法如下：流速：2mL/min，0min～4min 50℃，4min～8.5min 50～280℃，8.5min～10.6min 280℃。

此方法下异戊二烯标准品(Sigma公司)出峰时间为1.75min(图2)，大肠杆菌工程菌MV/paidi及阴性对照菌MV/ecidi的GC色谱图(图3)，可见MV/paidi产量比MV/ecidi的产量提升3.71倍，达到了7.8g/L的产量。

实施例5：大肠杆菌番茄红素生产菌株的构建

1.大肠杆菌表达载体pSB1s-paidi的构建

全长引物PAFa及PARa序列如下：

PAFa：5'atCGGctgcagATGGGTGACGCTCCTGATGCT 3'

PARa：5'atCCGctgcagTCAAGTCAGCTTGTGAATCGC 3'

使用引物PAFa及PARa白杨cDNA为模版获得的Paidi基因，将获得的片段进行PstI(TAKARA公司)单酶切，并将pSB1s表达载体进行PstI单酶切，Paidi基因片段连接至pSB1s载体后得到了pSB1s-paidi，转化至trans5α感受态细胞，选取阳性克隆进行测序，pSB1s-paidi的核苷酸序列是SEQ ID No.14。

2.大肠杆菌表达载体pSB1s-ecidi的构建

全长引物ECFa及ECRa序列如下：

ECFa：5'ATCGGCTGCAGAAGGAGATATAATGCAAACGG 3'

ECRa：5'ATCCGCTGCAGTTATTTAAGCTGGGTAAATG 3'

使用ECFa及ECRa为引物，大肠杆菌BW25113菌液为模版，扩增获得的Ecidi基因，将获得的片段进行PstI(TAKARA公司)单酶切，并将pSB1s表达载体进行PstI单酶切，Paidi基因片段连接至pSB1s载体后得到了pSB1s-ecidi，转化至trans5α感受态细胞，选取阳性克隆进行测序，pSB1s-ecidi的核苷酸序列是SEQ ID No.15。

3.番茄红素生产菌株BW/paidi的构建

将构建好的pSB1s-paidi与质粒pL10-2共转化至BW25113宿主得到番茄红素生产菌株BW/paidi10。

并且构建对照菌株BW/ecidi,方法为将pSB1s-ecidi与质粒pL10-2共转至BW25113宿主，得到大肠杆菌idi对照菌株BW/ecidi10。

上述番茄红素生产菌的构建方法中，pL10-2核苷酸序列如SEQ IDNo.19所示。包含番茄红素合成途径的基因。所述番茄红素合成相关基因由crtE(栊牛儿栊牛儿基焦磷酸合成酶)基因、crtI(八氢番茄红素脱氢酶)基因、crtB(八氢番茄红素合成酶)基因组成；所述crtE基因编码由SEQ ID No.16所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述crtI基因编码由SEQ ID No.17所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述crtB基因编码由SEQ ID No.18所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

上述产链孢红素重组菌的构建方法中，所述crtE基因的编码序列是SEQ ID No.19的第1995-2906位；所述crtI基因的编码序列是SEQ IDNo.19的第2924-4402位；所述crtB基因的编码序列是SEQ ID No.19的第4420-5349位。

4.Paidi基因在大肠杆菌番茄红素生产中的应用

(1)产番茄红素工程菌的发酵及转化

上述大肠杆菌工程菌BW/paidi10及对照菌BW/ecidi10发酵，方法如下：将工程菌以百分之一的接种量转接到30mL(500mL三角瓶)含有链霉素及氯霉素的***糖自诱导培养基(配方同上)中，30℃，280rpm培养20h后。4℃，4000rpm离心收集菌液，用含有4％葡萄糖的M9培养基重悬至1OD菌体浓度，取2mL重悬菌液置于20mL三角瓶内，37℃，280rpm震荡培养24h，分别于8h及24h取样。

取样方法如下：取1×10⁸cfu菌体加入1ml丙酮进行萃取，4℃放置3小时，离心取上清液，得到待测样品，进行474nm的波长扫描。实验重复三次，每次每种菌在3个20ml三角瓶中进行上述葡萄糖转化。

(2)产番茄红素工程菌的番茄红素产量的测定

以番茄红素(Sigma公司)为标准品采用标准曲线法(外标法)进行定量分析待测样品中番茄红素的含量。波长扫描后标准品在474nm处出现最高峰(图4)，这两株产番茄红素工程菌样品在474nm处均出现最高峰，图5为转化8h后番茄红素的全波长扫描结果，图6为转化24h后番茄红素的全波长扫描结果。

定量分析大肠杆菌的番茄红素产量，如表1所示，表明BW/paidi10番茄红素的产量明显高于对照菌BW/ecidi10，8小时的产量是对照的3.48倍，24小时的产量是对照的3.06倍。

表1

Claims

1.一种异戊烯基焦磷酸异构酶基因，其特征是如下(a)或(b)的基因：

(a)所述基因cDNA的核苷酸序列如序列表的序列1所示；

(b)所述基因是编码如下蛋白质的基因：序列表的序列2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊烯基焦磷酸异构酶活性的由序列表的序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质衍生的蛋白质。

2.如权利要求1所述的异戊烯基焦磷酸异构酶基因表达的蛋白质，其特征是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)中的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊烯基焦磷酸异构酶活性的由(a)衍生的蛋白质；

所述序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质是由序列表的序列1所示碱基序列编码。

3.一种含有如权利要求1所述异戊烯基焦磷酸异构酶基因的原核表达载体。

4.一种含有如权利要求3所述异戊烯基焦磷酸异构酶基因原核表达载体的产异戊二烯工程菌。

5.一种含有如权利要求3所述异戊烯基焦磷酸异构酶基因原核表达载体的产番茄红素工程菌。

6.如权利要求4所述的产异戊二烯工程菌在制备异戊二烯中的应用。

7.如权利要求5所述的产番茄红素工程菌在制备番茄红素中的应用。