CN106544280A - 一种高抗性肉鸭饲用酵母菌株及应用 - Google Patents

一种高抗性肉鸭饲用酵母菌株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高抗性肉鸭饲用酵母菌株及应用，其步骤是：A.取肉鸭消化道的内容物进行稀释后，进行平板划线，挑选与常规酿酒酵母菌形态一致的菌落进一步分离。B.将获得的酿酒酵母菌进行耐热性、耐酸性、耐营养饥饿和耐胆盐筛选。C将分离的酵母菌进行生理生化鉴定和26s rDNA分子鉴定。该菌属于酿酒酵母，突出特性为具有较高的耐酸、耐胆盐、耐热和耐营养饥饿的能力。在肉鸭配合饲料中添加以该菌株为主要活性的微生态制剂能显著促进肉鸭的生产性能，可替代抗生素的使用。该酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WHY‑7已在中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC NO：M 2016550。

Description

一种高抗性肉鸭饲用酵母菌株及应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种高抗性肉鸭饲用酵母菌株，同时还涉及一种高抗性肉鸭饲用酵母菌的用途。
背景技术
抗生素滥用已对禽畜业的发展造成了严重的威胁，对动物和人类的健康造成了日益累积的危害。所以人们需要寻找并开发无毒无不良反应的天然生长促进剂，于是益生菌饲料添加剂应运而生。益生菌可通过调节动物胃肠道的微生态平衡来改善动物的生产性能，提高动物的健康水平。作为无毒、无残留和无抗药性的饲料添加剂，益生菌已成为抗生素有效的替代品之一。
酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)作为益生菌已被许多国家和地区允许用于动物养殖。酵母菌是一种典型的兼性厌氧型真菌，能够调节胃肠道功能，抑制病原菌。且酵母在胃肠道内能保持代谢活性，向肠道分泌多种营养代谢产物，如蛋白质、脂肪、糖及B族维生素等，也可以促进小肠吸收氨基酸。酵母细胞壁内层含葡聚糖，这些大分子能激发非特异性和特异性免疫反应，激活T细胞、B细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞。同时酵母菌有耐受细菌类抗生素作用。但酵母菌的菌种、用量及应用环境等诸因素对作用效果有显著影响，所以理想的酵母菌最好来自于动物消化道的原籍菌株。此外酵母菌抗逆性较差，例如不耐高温，酸对其杀伤力很强，不耐饥饿等，阻碍了其在生产实践中的应用。尽管随着机械加工工艺的不断发展，利用造粒，包被及低温干燥技术已经使酵母菌在饲料工业上的应用已成为可能，但是从菌种出发解决酵母的抗逆性问题，提高酵母细胞耐热性、对胃肠道酸性环境的适应性和后肠环境的营养饥饿耐受性是生产酵母源微生态制剂的根本方法。
发明内容
本发明目的在于克服传统饲用酵母菌的缺点，是在于提供了一种高抗性肉鸭饲用酵母菌株，该菌株能够耐受环境温度25～42℃，在42℃培养24小时，生物量为32.5g/L；耐pH值2.5～7.0，在pH 3.0条件下培养24小时，生物量达到37.9g/L；耐胆盐浓度0～0.6％，在0.3％禽胆盐浓度下培养24小时，生物量达到40.6g/L；和耐营养饥饿0～6天，在营养饥饿6天后存活率可达89.6％。因此该菌株能在肉鸭的胃、肠道中存活并充分发挥作用，可以有效替代饲用抗生素。
本发明的另一个目的是在于提供了一种高抗性肉鸭饲用酵母菌株在肉鸭饲料中的应用，在肉鸭基础日粮中添加该酵母菌为主要活性制剂组的肉鸭在生长性能、饲料利用率和死亡率方面显著好于基础饲料组，提高了增长率7％、降低了料重比0.04、死亡率减少了3.1％。而与添加抗生素组无显著差异。表明，该酵母菌可以在肉鸭饲料中替代饲用抗生素的使用。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种高抗性肉鸭饲用酵母菌株的获得方法，其步骤是：
A取肉鸭消化道的内容物进行稀释后，进行平板划线，挑选与常规酿酒酵母菌形态一致的菌落进一步分离。
B将获得的酿酒酵母菌进行耐热性、耐酸性、耐营养饥饿和耐胆盐筛选。
C将分离的酵母菌进行生理生化鉴定和26s rDNA分子鉴定。
本发明中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WHY-7，已于2016年10月10日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号CCTCC NO:M 2016550：地址：中国武汉武汉大学。
本发明中的酵母菌株WHY-7来源于肉鸭消化道，具有典型的酿酒酵母形态特征：所述的酿酒酵母的细胞为圆形，多边芽殖，菌落凸起，光滑，乳白色，边缘整齐等典型的酿酒酵母形态特征，还具有下列特征：能够耐受环境温度25～42℃、pH值2.5～7.0、胆盐浓度0～0.6％和营养饥饿0～6天。
本发明的酿酒酵母WHY-7的理化实验结果见表1(“+”代表可，“-”代表否)。
表1酿酒酵母WHY-7的理化实验结果
该菌株最适生长pH为5.0，但在Ph 2.5-7.0之间均具有良好的活性，pH3.0条件下培养24小时，生物量以菌体湿重计为37.9g/L，明显高于常规酿酒酵母CCTCC AY 92003。一般地，动物胃液的pH在3.0左右，这种酸性环境条件对常规酵母菌具有很强的杀伤作用，而本发明的酵母菌在类似动物胃液条件下，具有很高的活性。
该菌株在0～0.6％禽胆盐浓度下均具有良好的生长活性，在0.3％的禽胆盐浓度下培养24小时，生物量以菌体湿重计为40.6g/L，明显高于常规酿酒酵母CCTCC AY 92003。一般情况下，动物小肠内胆盐浓度在0.03％～0.30％范围内波动。常规酵母菌进入肠道后，小肠中胆盐的高渗透压环境不利于其存活，而本发明的酵母菌在类似动物肠液胆盐浓度的条件下，具有很高的活性。
该菌株最适生长温度30℃，但具有较高的耐热性和广泛的温度适应性，在25-45℃具有良好的生长性能，42℃培养24小时，生物量以菌体湿重计为32.5g/L，明显高于常规酿酒酵母CCTCC AY 92003(购自中国典型培养物保藏中心，CCTCC)在同样条件下的生物量7.2g/L。
该菌株可以耐受0～8d的营养饥饿，在营养饥饿6d后存活率为89.6％，明显高于常规酿酒酵母CCTCC AY 92003。一般来说动物后肠中的营养经常较缺乏，常规酵母菌不易存活，而本发明的酵母菌可以在较长时间的饥饿后，仍然具有很高的活性。
本发明提供的酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)WHY-7保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016550，保藏日期是2016年10月10日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email:[email protected]。
一种高抗性肉鸭饲用酵母菌株(含有酵母菌WHY-7的微生态制剂)在肉鸭饲料中的应用，其过程是：
A、实验选用樱桃谷肉鸭，设对照组、抗生素组和酵母组，每组5个重复，养殖周期为35天。
B、于实验开始和结束进行称重，记录饲料摄食量，记录肉鸭病死率。
C、统计实验结果，进行数据处理。
实验证明：在肉鸭基础日粮中添加含有酵母WHY-7的微生态制剂较对照组可以显著地提高肉鸭的平均日增重，并降低料肉比，同时与添加抗生素组无显著差异。因此，以酵母菌WHY-7为主要活性成分的微生态制剂可以作为有效的饲用抗生素的替代品，对调节肉鸭肠胃微生物群落，维持肠道菌群平衡，提高生产性能等方面具有良好的促进作用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1、本发明提供的酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)WHY-7能够耐受环境温度25～42℃，在42℃培养24小时，生物量为32.5g/L；耐pH值2.5～7.0，在pH 3.0条件下培养24小时，生物量达到37.9g/L；耐胆盐浓度0～0.6％，在0.3％禽胆盐浓度下培养24小时，生物量达到40.6g/L；和耐营养饥饿0～6天，在营养饥饿6天后存活率可达89.6％。因此该菌株能在肉鸭的胃、肠道中存活并充分发挥作用，可以有效替代饲用抗生素。
2、在肉鸭饲料中使用结果证明：添加以本酵母菌为主要活性制剂组的肉鸭在生长性能、饲料利用率和死亡率方面显著好于基础饲料组，可提高增长率7％、降低料重比0.04、死亡率减少3.1％，而与添加抗生素组无显著差异。表明，该酵母菌可以在肉鸭饲料中替代饲用抗生素的使用。
附图说明
图1为一种菌株WHY-7与常规酿酒酵母CCTCC AY 92003在不同pH条件下的生长比较示意图。
其中黑色柱为本发明菌株WHY-7生物量，白色柱为常规酿酒酵母CCTCCAY 92003的生物量。
图2为一种菌株WHY-7与常规酿酒酵母CCTCC AY 92003在不同禽胆盐浓度的生长比较示意图。
其中黑色柱为本发明菌株WHY-7生物量，白色柱为常规酿酒酵母CCTCCAY 92003的生物量。
图3为一种菌株WHY-7与常规酿酒酵母CCTCC AY 92003在温度下的生长比较示意图。
其中黑色柱为本发明菌株WHY-7生物量，白色柱为常规酿酒酵母CCTCCAY 92003的生物量。
图4为一种酵母菌株WHY-7的26s rDNA序列PCR扩增电泳示意图。
其中泳道M为DNA分子量标准，泳道26s是为WHY-7的26s rDNA基因序列PCR扩增产物。
图5为一种酵母菌株WHY-7中26s rDNA序列与GenBank中报道的酿酒酵母的26srDNA序列同源性比较示意图。
其中KM655848.1为GenBank中报道的酿酒酵母26s rDNA序列，WHY-7为本发明菌株WHY-7中的26s rDNA序列。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，所采用实验方法均为常规方法；所用实验试剂和材料均可以通过商业途径获得。
实施例1：
一种高抗性肉鸭饲用酵母菌株Saccharomyces cerevisiae WHY-7的获得方法，其步骤是：
A、菌株的分离和筛选：
(1)解剖采集肉鸭消化道内容物，用无菌生理盐水稀释10倍后，用涂布法在麦芽汁琼脂平板上30℃条件下培养2或3d，挑取与周边菌落有一定距离的单菌落进一步用平板划线法纯化2或3次。之后挑取一环纯化后的菌体接种于YPD(每1000ml培养基中含酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂粉20g)斜面培养基上，在恒温培养箱中30℃培养2或3d。
(2)将固体培养基平板上生长的与常规酿酒酵母菌落类似的表面光滑、乳白色、边缘整齐的单菌落接到YPD斜面，30℃静置培养48小时。显微镜下观察细胞形态及大小，通过与常规酿酒酵母细胞进行比较，获得细胞呈椭圆形、多边出芽、大小与常规酿酒酵母基本一致的单菌落。共获得7株酿酒酵母菌，分别命名WHY-1、WHY-2、WHY-3、WHY-4、WHY-5、WHY-6、和WHY-7。
(3)从YPD斜面分别接一环菌体细胞于2ml液体YPD(不加琼脂粉)中，30℃摇床(200转/分钟)培养18小时，然后按体积百分比为10％的接种量转接到pH为3.0的10ml YPD液体培养基中，30℃摇床(200转/分钟)培养24小时，离心(5000转/分钟，5分钟)收集菌体，菌体细胞用蒸馏水洗一次，如上离心，对细胞沉淀称重，计算细胞生物量(g/L，每升发酵液中湿细胞重)。实验重复三次，同时以常规酿酒酵母CCTCC AY 92003为对照。从上述7株分离到的单菌落中获得三个在pH3.0条件下细胞生物量高于对照酿酒酵母的菌株，分别为WHY-7、WHY-2和WHY-5。
(4)从WHY-7、WHY-2和WHY-5的YPD斜面分别接一环菌体细胞于2ml液体YPD中，30℃摇床(200转/分钟)培养18小时，然后按体积百分比为10％的接种量转接到10ml YPD液体培养基中，在37℃摇床(200转/分钟)培养24小时，离心(5000转/分钟，5分钟)收集菌体，菌体细胞用蒸馏水洗一次，如上离心，对细胞沉淀称重，计算细胞生物量。实验重复三次，同时以常规酿酒酵母CCTCC AY 92003为对照。结果在上述条件下，菌株WHY-7表现出良好的生长性能，细胞生物量明显高于对照酿酒酵母菌株及菌株WHY-2和WHY-5。
B、菌株WHY-7的生理特性：
(1)耐酸性：将菌株WHY-7和作为对照的常规酿酒酵母CCTCC AY 92003分别在5ml液体YPD中30℃摇床(200转/分钟)培养18小时，然后按体积百分比为10％的接种量转接到45ml具有不同pH(2.5-7.0)的YPD液体培养基中，在30℃摇床(200转/分钟)培养24小时。如上离心收集菌体，称重，计算生物量。实验重复三次。结果表明，筛选到的菌株WHY-7最适生长pH为5.0，但在pH 2.5-7.0之间均具有良好的活性，pH 3.0条件下培养24小时，生物量达到37.9g/L，是常规酿酒酵母CCTCC AY 92003生物量的1.9倍(图1)。
(2)胆盐耐受性：将菌株WHY-7和作为对照的常规酿酒酵母CCTCC AY92003分别在5ml液体YPD中30℃摇床(200转/分钟)培养18小时，然后按体积百分比为10％的接种量转接到45ml具有不同浓度禽胆盐的(0％-0.6％)的YPD液体培养基中，在30℃摇床(200转/分钟)培养24小时。如上离心收集菌体，称重，计算生物量。实验重复三次。结果表明，菌株WHY-7在不添加禽胆盐的时候生长最好，但在0％-0.6％禽胆盐浓度下均具有良好的生长活性，在0.3％禽胆盐浓度下培养24小时，生物量达到40.6g/L，明显高于酿酒酵母CCTCC AY 92003(图2)。
(3)耐热性：将菌株WHY-7和作为对照的常规酿酒酵母CCTCC AY 92003分别在5ml液体YPD中30℃摇床(200转/分钟)培养18小时，然后按体积百分比为10％的接种量转接到45ml YPD液体培养基中，分别在30℃、33℃、37℃、40℃、42℃和45℃摇床(200转/分钟)培养24小时。如上离心收集菌体，称重，计算生物量。实验重复三次。图3结果表明筛选到的菌株WHY-7具有与常规酿酒酵母相同的最适生长温度30℃，但菌株WHY-7具有更好的耐热性，42℃培养24小时，生物量为32.5g/L，明显高于常规酿酒酵母CCTCC AY 92003在同样条件下的生物量7.2g/L；45℃培养24小时，菌株WHY-7生物量为18.5g/L，而常规酿酒酵母CCTCC AY92003在45℃完全不能生长。
将菌株WHY-7和常规酿酒酵母CCTCC AY 92003分别在5ml液体YPD中30℃摇床(200转/分钟)培养18小时，5000转/分钟离心5分钟收集菌体，用无菌水洗涤菌体后如上离心，称重，按0.05g/ml湿菌体比例将菌体重新悬浮于无菌水中，取0.5ml菌悬液加入到4.5ml无菌水中，80℃温育处理，每隔10秒取样0.2ml，进行梯度稀释后，涂布在YPD固体平板上，30℃静置培养48小时，计算菌落数。每次设三个重复，实验重复三次。根据不同处理时间的菌落数计算存活率，即：存活率(％)＝〔(不同处理时间的菌落数×稀释倍数)/(处理起始菌落数)×稀释倍数)〕×100。结果表明菌株WHY-7在80℃处理20秒，存活率保持在78.5％、处理30秒存活率能够保持在64.9％，而作为对照的常规酿酒酵母CCTCC AY 92003在80℃处理20秒完全失去活性(表1)。
表1菌株WHY-7和常规酿酒酵母CCTCC AY 92003的耐热性比较
(4)营养饥饿耐受性：将菌株WHY-7和常规酿酒酵母CCTCC AY 92003分别在5ml液体YPD中30℃摇床(200转/分钟)培养18小时，5000转/分钟离心5分钟收集菌体，用无菌水洗涤菌体后如上离心，收集菌体,用无菌去离子水洗涤3次,重新悬浮菌体至50mL无菌去离子水溶液中,使菌体的浓度达到108cell/mL,于200转/分钟摇床上30℃培养,每隔48h取样,适当稀释后涂布YPD平板,30℃培养72h,计算菌落数。以起始时间作为对照,计算细胞存活率,以细胞存活率表征其营养饥饿耐受性。菌体的营养饥饿耐受性能力以存活率表示,存活率(％)＝(Ct/C0)×100％,C0和Ct分别表示培养时间为0和t小时的残余活细胞浓度。表2结果表明，菌株WHY-7在营养饥饿6天后存活率可达89.6％，饥饿10天后的存活率还有51.2％，而常规酿酒酵母CCTCCAY 92003在营养饥饿8天后则全部死亡。
表2菌株WHY-7和常规酿酒酵母CCTCC AY 92003的营养饥饿耐受性比较
C、酵母菌的鉴定：
从YPD斜面上接一环菌株WHY-7细胞于2ml YPD液体培养基中，30℃摇床(200转/分钟)培养18小时。取50μl菌液接于2ml无菌水中，30℃摇床(200转/分钟)培养5小时；各取50μl上述菌悬液，接于装有3.5ml以不同种类糖或醇为碳源的酵母基本培养基(0.67％YNB，2％不同种类的糖或醇，自然pH)中，其中装有倒置的杜氏管用来检测糖发酵产气情况，30℃静置培养，每24小时观察发酵产气情况。结果显示，菌株WHY-7可以发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖和棉子糖，但不能发酵乳糖、水杨苷、纤维二糖、柠檬酸盐、木糖醇和甲醇等。根据菌株对不同碳源的同化和发酵特性，初步判断菌株WHY-7可能属于酿酒酵母。
由于在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中26Sr DNA的D1/D2区段序列为高度保守区，故选取此段序列对菌株WHY-7进行分子水平的鉴定。根据GenBank中报道的26SrDNA的D1/D2区段序列(KM655848)设计和合成引物如下:
上游引物NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'
下游引物NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'
提取WHY-7菌株的基因组DNA，以此为模板，使用PCR方法对获得酵母菌的26S rDNAD1/D2区段片段进行扩增和测序。PCR反应体系为50μL，每管加入10×Taq Buffer 5.0μL，2.5mol/L dNTP 4.0μL，20μmol/L上下游引物各1.0μL，模板DNA 10μL，2.5U/μL Taq 1.0μL，无菌水28.0μL。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性45s；55℃退火60s；72℃延伸70s，共进行30个PCR循环，最后再72℃继续延伸10min，4℃保藏。琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，发现以菌株WHY-7基因组DNA为模板能够扩增出约650bp的DNA片段，与预期大小一致(图4)。对菌株WHY-7的PCR扩增产物(约650bp)进行序列分析和比对，发现与Gen Bank中报道的酿酒酵母(Saccharomyces carevisiae)的26S rDNA D1/D2区段片段序列一致性为99.68％(图5)。
上述实验结果表明，菌株WHY-7应鉴定为酿酒酵母。
本发明筛选到的菌株WHY-7已于2016年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武汉大学校内)，分类名称为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏号为CCTCC NO:M 2016550。
该菌株具有典型的酿酒酵母形态特征：细胞为椭圆形，多边芽殖；菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐；具有典型的酿酒酵母生理生化特征，发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖和棉子糖，但不能发酵乳糖、水杨苷、纤维二糖、柠檬酸盐、木糖醇和甲醇等。但比常规酿酒酵母表现出更高的耐热、耐酸、耐胆盐和耐饥饿的性能。
实施例2：
一种高抗性肉鸭饲用酵母菌株(含有酵母菌WHY-7的微生态制剂)在肉鸭饲料中的应用，其步骤是：
A、选1日龄樱桃谷肉鸭450羽，随机分成3组，每组5个重复，每重复30羽。
B、试验鸭于室内同一环境下散养。每个重复1栏，24h光照，自由采食和饮水，以重复为单位每天记录饲料投放量和剩余量，每天清洗饮水器和料槽1次。
C、免疫接种及疾病预防、消毒按常规方法进行。实验分为对照组(基础饲料)、抗生素组(基础饲料+4mg黄霉素)、酵母组(每kg基础饲料+1×109个酵母细胞)。试验期为35d。实验地点为武汉市永生鸭业公司养殖场。于试验第1天和第35天分别对樱桃谷肉鸭进行空腹称重，计算均重、平均日增重和料重比。
实验结果表明饲料中添加酵母较对照组，能显著提高樱桃谷肉鸭的增重率、降低料重比和病死率，但和抗生素组无显著差异。因此，本菌种可以替代抗生素在肉鸭饲料中使用。
表3饲料中添加酵母对樱桃谷肉鸭生产性能的影响
组别 平均日增重(g) 料重比 病死率(％)
对照组 57.49 2.17 4.5
抗生素组 61.38 2.13 2.5
酵母组 61.52 2.13 1.4

Claims (3)

1.一种高抗性肉鸭饲用酵母菌株，其特征在于：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)WHY-7，CCTCC NO：M 2016550。
2.根据权利要求1所述的一种高抗性肉鸭饲用酵母菌株，其特征在于：所述的酿酒酵母的细胞为圆形，多边芽殖，菌落凸起，光滑，乳白色，边缘整齐；耐受环境温度25～42℃、pH值2.5～7.0、胆盐浓度0～0.6％和营养饥饿0～6天。
3.权利要求1所述的一种酿酒酵母在肉鸭饲料中的应用。
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