CN106540272A

CN106540272A - Scad基因或scad蛋白的应用

Info

Publication number: CN106540272A
Application number: CN201610976311.0A
Authority: CN
Inventors: 周四桂; 徐立朋; 舒朝辉
Original assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Current assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Priority date: 2016-11-07
Filing date: 2016-11-07
Publication date: 2017-03-29

Abstract

本发明公开了一种SCAD基因或SCAD蛋白的应用，具体公开了SCAD基因、SCAD蛋白、或SCAD蛋白的表达促进剂或激活剂在制备防治心肌纤维化的药物、或抑制心脏成纤维细胞激活并转化为肌成纤维细胞的药物、或抑制心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的药物中的应用。本发明通过动物及细胞模型的构建，首次揭示了SCAD在心肌纤维化和/或心肌成纤维细胞增殖和胶原合成中的重要作用，为心肌纤维化以及心肌成纤维细胞增殖和胶原合成增加相关疾病的新药研发提供理论基础及可行性依据，可用于作为心肌纤维化、以及心肌成纤维细胞增殖和胶原合成增加相关疾病新的药物作用靶点。

Description

SCAD基因或SCAD蛋白的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，更具体地，本发明涉及SCAD基因或蛋白在制备治疗心肌纤维化的药物中的应用，以及在制备抑制心脏成纤维细胞激活并转化为肌成纤维细胞、心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的药物中的应用。

背景技术

心肌纤维化是心肌胶原合成与降解代谢失衡的过程。心脏成纤维细胞激活并转化为肌成纤维细胞是心肌纤维化的起始步骤，心肌间质成纤维细胞增殖，细胞外基质(主要是I型和III型胶原纤维)沉积异常增加，使心肌结构与功能发生重构，进而影响心脏功能，最终导致心力哀竭的发生。心肌纤维化是多种心脏疾病发展的共同结局，可导致心脏收缩功能障碍、心律失常及室颤的发生，最终演变成难以治疗的充血性心力衰竭。因此，防治心肌纤维化的研究具有重要临床意义。

目前认为，心脏能量代谢有望成为治疗心力衰竭的靶点，并且对心脏能量代谢的研究主要集中于心肌细胞。然而，心脏成纤维细胞也是心脏的重要组成部分，参与了心肌纤维化进程。此外，心肌纤维化是心肌肥厚由代偿向失代偿转化的重要病理过程，是引发心力衰竭的核心环节。在心肌肥厚中心肌细胞能量代谢异常已有大量报道，然而，心肌纤维化时心脏成纤维细胞的能量代谢是否发生变化鲜有报道。因此，从心肌能量代谢角度防治心肌纤维化，延缓心力衰竭进程，可能是一条新思路。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术对心肌纤维化研究和治疗技术的不足，本发明提供了SCAD基因或SCAD蛋白的应用。短链酰基辅酶A脱氢酶(short chain acyl-CoAdehydrogenase，SCAD)基因为与心肌纤维化相关的一个基因，为心肌纤维化的分子机制研究提供基础。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

SCAD基因、SCAD蛋白、或SCAD蛋白的表达促进剂或激活剂在制备防治心肌纤维化的药物中的应用。

SCAD基因、SCAD蛋白、或SCAD蛋白的表达促进剂或激活剂在制备抑制心脏成纤维细胞激活并转化为肌成纤维细胞的药物中的应用。

SCAD基因、SCAD蛋白、或SCAD蛋白的表达促进剂或激活剂在制备抑制心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的药物中的应用。

在其中一些实施例中，所述心肌成纤维细胞增殖和胶原合成由血管紧张素II诱导发生。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过动物及细胞模型的构建，首次揭示了SCAD在心肌纤维化和/或心肌成纤维细胞增殖和胶原合成中的重要作用，为心肌纤维化以及心肌成纤维细胞增殖和胶原合成增加相关疾病的新药研发提供理论基础及可行性依据，可用于作为心肌纤维化、以及心肌成纤维细胞增殖和胶原合成增加相关疾病新的药物作用靶点。

附图说明

图1为本发明实施例1中SCAD在20周龄自发性高血压大鼠心肌纤维化组织中的变化；

图2为本发明实施例2中血管紧张素II刺激建立心肌成纤维细胞增殖模型中的时效量效变化；

图3为本发明实施例3中SCAD在血管紧张素II刺激建立心肌成纤维细胞增殖模型中的变化；

图4为本发明实施例4中采用RNA干扰技术，观察SCAD对心肌成纤维细胞增殖的影响，并与刺激因素血管紧张素II的作用相比较；

图5为本发明实施例5中采用RNA干扰技术，观察SCAD对心肌成纤维细胞胶原合成及其表达的影响，并与刺激因素血管紧张素II的作用相比较。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明以下实施例所用的心肌纤维化大鼠为自发性高血压大鼠，所用的WKY大鼠为自发性高血压大鼠的正常对照大鼠。

以下实施例及说明书附图中所用的术语的缩写定义如下：

WKY大鼠：Wistar-Kyoto大鼠；

SHR：自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats)；

SCAD：短链酰基辅酶A脱氢酶(short chain acyl-CoA dehydrogenase)；

α-tubulin：α-微管蛋白；

AngII：血管紧张素II(angiotensin II)；

siRNA：小干扰RNA(small interfering RNA)

Collagen I：I型胶原；

Collagen III：III型胶原。

以下实施例中所使用的实验方法如下：

1、心肌胶原形态及定量分析

19周龄自发性高血压大鼠及其对照WKY大鼠各8只，正常饲养1周后进行实验。腹腔注射3％戊巴比妥钠(45mg/kg)麻醉大鼠，迅速打开胸腔，用预冷的生理盐水充分灌注，取出心脏，滤纸吸干，电子天平称取心脏重量。沿房室环剪去大血管、心房及右室游离壁，将余下的室间隔、左室游离壁作为左室重量。液氮中速冻过夜后，置-80℃冰箱保存备用。用于病理检测的心脏经生理盐水灌注后，继续灌以4％多聚甲醛(pH＝7.4)，并置于4％多聚甲醛中固定。

用4％多聚甲醛固定的组织经流水冲洗、脱水、透明、石蜡包埋、制片，切片厚为6μm，切片经Masson三色法染色，光镜下观察：胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。用计算机图像分析，通过灰度判断区别胶原和非胶原成分。测量心肌胶原容积分数(CVF，％)＝胶原面积/全视野面积×100％。

2、SD大鼠原代心肌成纤维细胞培养

取200-250g雄性大鼠，颈椎脱臼法处死，在无菌条件下取出心脏，采用胶原酶-胰酶-胶原酶循环消化法，得到单细胞悬液，收集细胞后差速贴壁1h去除心肌细胞，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，隔天换液。按照上述分离制备的心脏成纤维细胞，经vimentin抗体的免疫细胞化学染色，纯度可达98％以上。

3、CCK-8法检测细胞增殖

心肌成纤维细胞以每孔5×10³个/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后，给予不同浓度AngII(0.1、1、10、100、1000nM)刺激细胞24h或者浓度100nM的AngII作用于细胞不同时间(6、12、24、36、48h)，每孔加入10μL CCK-8溶液，4h后用酶标仪于450nm波长测定吸光度。

4、台盼蓝染色实验

心肌成纤维细胞以1×10⁴个/孔接种于12孔板，待细胞贴壁后，给予不同浓度AngII(0.1、1、10、100、1000nM)刺激细胞24h或者浓度100nM的AngII作用细胞不同时间(6、12、24、36、48h)，制备单细胞悬液，用浓度为0.1％的台盼蓝染色，三分钟内，用计数板分别计数活细胞和死细胞。镜下观察，死细胞被染成蓝色，而活细胞拒染。

5、SCAD siRNA干扰

SiRNA-1186干扰序列购于上海吉玛生物制药技术有限公司，按照公司提供的说明书进行实验。SCAD siRNA的核酸序列如下：Sense：5’-CCGCAUCACUGAGAUCAUTT-3’；Anti-sense：5’-AUAGAUCUCAGUGAUGCGGTT-3’。

6、实时荧光定量PCR检测SCAD、Collagen I、Collagen III、GAPDH的mRNA表达

按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA。取6μL的总RNA按转录试剂盒说明书逆转录为相应cDNA，PCR扩增SCAD、Collagen I、Collagen III和GAPDH(作为内参照)。SCAD上游引物为5'-CGAGATTGGCGAAGATTACAT-3'，下游引物为5'-AGGCTTTGGTGCCGTTGA-3'。Collagen I上游引物为5'-CCCTGAAGTCAGCTGCAT-3'，下游引物为5'-ATATTCTTCTGGGCAGAA-3'。Collagen III上游引物为5'-CCACGAGGTGACAAAGGTGA-3'，下游引物为5'-GCCAGGGAATCCTCGATGT-3'。GAPDH上游引物为5'-AGGAGTAAGAAACCCTGGAC-3'，下游引物为5'-CTGGGATGGAATTGTGAG-3'。反应体系为10×buffer 5μL，dNTP(10mmol/L)1μL，正反向引物各0.5μL，Taq酶0.5μL，SYBR Green 25μL，DEPC-H2O 19.0μL混匀。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60.4℃退火30s，72℃延伸30s，共反应31个循环。ABI Prism7300SDS软件记录数据并分析，将目的基因的Ct用β-actin的Ct值进行标准化，根据比较法计算基因表达相对量，采用2^－ΔΔCt计算基因表达的相对倍数变化。

7、Western-blot检测SCAD、Collagen I、Collagen III、α-tubulin蛋白的表达

配制12％的SDS-PAGE分离胶和5％的积层胶，每孔加入40μg蛋白样品，置电泳缓冲液中，60V电泳约30min，待样品进入分离胶后，120V电泳至所需时间。将蛋白转印至PVDF膜，用5％脱脂奶粉于室温封闭2h，加相应的一抗。4℃孵育过夜，次日TBST洗膜3次，每次5min，再加相应二抗室温孵育1h，发光剂孵育6min，曝光、显影、定影，结果用Labwork凝胶图像分析***对条带进行分析。

8、SCAD酶活性的检测

按照实验分组处理细胞，收集细胞后置于冰上裂解30min，取上清液用BCA蛋白定量试剂盒定量蛋白。酶活性检测是基于2，6-二氯靛酚钠作为人工电子受体，替代黄素腺嘌呤二核苷酸，在SCAD的作用下，由短链酰基辅酶A提供的电子，经过硫酸甲酯吩嗪的传递，被还原为无色产物，通过分光光度仪的峰值变化(600nm波长)，来定量分析SCAD的活性。严格按照SCAD酶活性检测试剂盒说明书进行。

9、胶原合成的检测

通过测定细胞中羟脯氨酸的含量反映胶原合成情况。严格按照试剂盒说明书采用酶标仪法进行检测。羟脯氨酸含量(μg/mL)＝[(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)]×标准品浓度(5μg/mL)×样品测试前稀释倍数

10、统计分析

所有的数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS13.0统计软件处理，组间比较采用单因素方差分析，并运用Bonferronit检验进行组间的两两比较，以P<0.05为差异具有显著性。

实施例1 20周龄自发性高血压大鼠心肌纤维化组织中的SCAD蛋白、mRNA表达及酶活性变化

1、本实施例测试20周龄自发性高血压大鼠心肌纤维化组织中的SCAD蛋白、mRNA表达及酶活性变化。

2、结果如图1所示，A图代表Masson染色结果，心肌细胞呈玫瑰红色，胶原纤维呈蓝色，20周龄自发性高血压大鼠的心肌间质胶原容积分数明显高于WKY对照组。B图代表在20周龄自发性高血压大鼠心肌纤维化组织中，SCAD的蛋白表达出现明显下调。C图代表在20周龄自发性高血压大鼠心肌纤维化组织中，SCAD的酶活性出现明显下降。D图代表在20周龄自发性高血压大鼠心肌纤维化组织中，SCAD的mRNA表达出现明显下降。

实验结果显示，20周龄自发性高血压大鼠出现了明显心肌纤维化，其心肌组织中SCAD蛋白、mRNA表达及酶活性均出现明显下降。

实施例2AngII刺激心肌成纤维细胞增殖的时效和量效变化关系

1、本实施例测试AngII刺激心肌成纤维细胞增殖的时效和量效变化关系。

2、结果如图2所示，A图代表用100nM AngII处理不同时间(0、6、12、24、36、48h)后，发现心肌成纤维细胞活性增加呈时间依赖性，且AngII处理36h和48h时，二者无显著性差异。B图代表用100nM AngII处理不同时间(0、6、12、24、36、48h)后，发现心肌成纤维细胞活细胞计数增加呈时间依赖性。C图代表用不同浓度AngII(0.1、1、10、100、1000nM)处理36h后，发现心肌成纤维细胞活性增加呈浓度依赖性，且AngII浓度在100和1000nM时，二者无显著性差异。D图代表用不同浓度AngII(0.1、1、10、100、1000nM)处理36h后，发现心肌成纤维细胞活细胞计数增加呈浓度依赖性，且AngII浓度在100和1000nM时，二者无显著性差异。因此，选择浓度为100nM的AngII作用36h作为后续实验的条件。

结果显示，AngII刺激心肌成纤维细胞增殖呈一定的时间和浓度依赖性。

实施例3SCAD的表达在AngII刺激的心肌成纤维细胞增殖模型中的变化

1、本实施例测试SCAD的表达在AngII刺激的心肌成纤维细胞增殖模型中的变化。

2、结果如图3所示，A图代表100nM AngII处理不同时间(24、36、48h)后，心肌成纤维细胞的SCAD mRNA表达明显下调。B图代表100nM AngII处理不同时间(24、36、48h)后，心肌成纤维细胞的SCAD蛋白表达明显下调。C图代表不同浓度AngII(10、100、1000nM)处理36h后，心肌成纤维细胞的SCAD mRNA表达明显下调。D图代表不同浓度AngII(10、100、1000nM)处理36h后，心肌成纤维细胞的SCAD蛋白表达明显下调。

结果显示，在AngII刺激的心肌成纤维细胞增殖模型中，SCAD的蛋白、mRNA表达均出现明显下降，与自发性高血压大鼠心肌纤维化组织中SCAD的变化趋势一致。

实施例4SCAD siRNA对心肌成纤维细胞增殖的影响

1、本实施例为了研究SCAD在心肌纤维化中的作用，使用SCAD siRNA敲低心肌成纤维细胞中SCAD的表达，测试SCAD siRNA对心肌成纤维细胞增殖的影响，并与刺激因素血管紧张素II的作用相比较。

2、结果如图4所示，A图代表采用siRNA-1186和AngII均使SCAD的蛋白表达显著下调。B图代表采用siRNA-1186和AngII均使SCAD的mRNA表达显著下调。C图代表采用siRNA-1186和AngII均使SCAD的酶活性显著下降。D图代表采用siRNA-1186能使心肌成纤维细胞活性明显增加，其程度与刺激因素AngII一致。E图代表采用siRNA-1186能使心肌成纤维细胞活细胞计数明显增加，其程度与刺激因素AngII一致。

结果显示，siRNA 1186这条干扰序列在SCAD的蛋白和mRNA表达水平及酶活性上均有显著降低。siRNA 1186干扰序列通过瞬时转染对SCAD基因表达进行干扰后，心肌成纤维细胞出现明显增殖，其增殖程度与刺激因素AngII趋势一致。

实施例5SCAD siRNA对心肌成纤维细胞胶原合成及表达的影响

1、本实施例为了研究SCAD在心肌纤维化中的作用，使用SCAD siRNA敲低心肌成纤维细胞中SCAD的表达，测试SCAD siRNA对心肌成纤维细胞胶原合成及表达的影响，并与刺激因素血管紧张素II的作用相比较。

2、结果如图5所示，A图代表采用siRNA-1186能使Collagen I和Collagen III的蛋白表达明显上调，其趋势与刺激因素AngII一致。B图代表采用siRNA-1186能使Collagen I和Collagen III的mRNA表达显著上调，其趋势与刺激因素AngII一致。C图代表采用siRNA-1186能使心肌成纤维细胞内羟脯氨酸含量显著增加，其趋势与刺激因素AngII一致。

结果显示，siRNA 1186干扰序列通过瞬时转染对SCAD基因表达进行干扰后，心肌成纤维细胞的胶原合成能力明显增加，胶原表达明显增多，其变化与刺激因素AngII趋势一致。

以上实施例1至实施例5通过几个层次证明了SCAD基因、SCAD蛋白的上述作用：在动物水平采用自发性高血压大鼠和对照大鼠，证实SCAD基因在心肌纤维化模型中的作用；在细胞水平采用血管紧张素II刺激心肌成纤维细胞，证实SCAD基因在心肌成纤维细胞增殖和胶原合成模型中的作用。主要取得的研究成果如下：

(1)20周龄自发性高血压大鼠出现了明显的心肌纤维化，心肌纤维化组织中SCAD蛋白、mRNA表达及酶活性均出现了明显下降；

(2)采用体外培养的心肌成纤维细胞，运用血管紧张素II刺激建立心肌成纤维细胞增殖和胶原合成模型，SCAD的蛋白、mRNA表达及酶活性水平均出现了明显下降；

(3)采用小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)对SCAD进行干扰，观察到心肌成纤维细胞出现了明显的细胞增殖和胶原合成增加；

(4)本发明首次揭示了SCAD基因在心肌纤维化和心肌成纤维细胞增殖和胶原合成中的作用，作为新的药物作用靶点，SCAD基因在制备预防、缓解和/或治疗心肌纤维化和心肌成纤维细胞增殖和胶原合成增加相关疾病的相关药物中的应用，包括通过SCAD基因上下游靶点制备心肌纤维化和心肌成纤维细胞增殖和胶原合成增加相关疾病的相关药物中的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.SCAD基因、SCAD蛋白、或SCAD蛋白的表达促进剂或激活剂在制备防治心肌纤维化的药物中的应用。

2.SCAD基因、SCAD蛋白、或SCAD蛋白的表达促进剂或激活剂在制备抑制心脏成纤维细胞激活并转化为肌成纤维细胞的药物中的应用。

3.SCAD基因、SCAD蛋白、或SCAD蛋白的表达促进剂或激活剂在制备抑制心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述心肌成纤维细胞增殖和胶原合成由血管紧张素II诱导发生。