CN106536551B - 大肠杆菌特异性抗体序列 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种与大肠杆菌菌株O25b抗原特异性结合的分离抗体，包括至少一个抗体重链可变区(VH)，所述抗体重链可变区(VH)包括图1所列CDR1至CDR3序列中的任一个序列，及任选进一步包括抗体轻链可变区(VL)，所述抗体轻链可变区(VL)包括图1所列CDR4至CDR6序列中的任一个序列，或包括前述CDR1‑6序列中任一个序列的功能活性CDR变体。

Description

大肠杆菌特异性抗体序列
技术领域
本发明涉及一种与大肠杆菌(E.coli)菌株O25b抗原特异性结合、并以特异性CDR序列为特征的分离抗体。
背景技术
脂多糖(LPS)是肠道细菌病原体表面最丰富的抗原。一般说来，LPS具有三个结构部分：i)脂质A(亦称为内毒素)，ii)核心寡糖，及iii)O-抗原。后者由3-6个糖的重复亚单位组成(取决于血清型)。脂质A和核心OS在一种单一的肠道细菌菌种中非常保守，但是，它们对抗体的接近性受到限制。另一方面，O-抗原高度可接近，但是，其结构非常多样(在大肠杆菌中，有～180种不同的O-型)。
针对O-抗原的抗体能够与大肠杆菌表面结合，因此，它们被用于诊断(如流行病学研究的O-分型)以及作为治疗措施。但是，鉴于庞大的结构变化性，利用O-抗原特异性抗体进行广泛的保护非常麻烦。
大肠杆菌引起的肠外感染很常见，发病率和死亡率都很高。最近出现的大肠杆菌多重耐药性(MDR)菌株导致的感染占大肠杆菌感染的很大一部分。
由于这些MDR菌株已经演变出对大多数类别的临床相关抗生素具有抗性，因此，针对这些MDR菌株的治疗选择非常有限。因此，替代的治疗选择，如单克隆抗体(mAb)被动免疫法将来会具有巨大的潜力。
过去数年来，出现了定义明确的MDR大肠杆菌无性系ST131-O25b:H4，其导致的感染占所有肠外大肠杆菌感染的大约10％，并占MDR大肠杆菌感染的大约一半(Peirano etal.Int J Antimicrob Agents 2010Apr；35(4):316-21；Rogers et al.J AntimicrobChemother 2011Jan；66(1):1-14；Woodford et al.FEMS Microbiol Rev 2011Sep；35(5):736-55)。属于此系的菌株表现出有限的异质性，因此，可视为在抗原库方面非常类似。属于这一簇的大多数菌株表达O25b抗原，因此，编码合成此抗原的酶的特定基因(LPS合成基因座内)被用于鉴定此克隆(Clermont et al.J Antimicrob Chemother 2008May；61(5):1024-8)。或者，尽管正如基因差异所揭示，此系的O抗原与经典O25抗原不同(因此，被称为O25b)，但是，可以利用O25分型血清的凝集作用。但是，O25分型血清无法区分大多数非-MDRO25克隆和MDR O25b克隆。
Rogers等人(J Antimicrob Chemother 2011Jan；66(1):1-14)描述了通过三个主要特征来检测大肠杆菌O25b-ST131菌株，即其血清组(O25b)、其***发育组(B2)和其ST(ST131)。这些特征中的每一个均被公开用于辅助检测。各种分子技术被描述，即MLST、基于PCR的快速检测法、重复序列PCR和PFGE。包括各种免疫球蛋白的多克隆抗血清(针对O25a菌株而建立)已被用于确定O25抗原，而不是区分亚型。
Jadhav等人(PLOS ONE 2011；6(3):e18063)描述了对与B2-O25b-ST131-CTX-M-15毒力/多重耐药型连接的O25b亚组呈阳性的菌株的毒性特点和基因亲和力。对人类临床分离物进行分析，将它们划分为各种血清型，并得到了毒性标记谱。采用抗O-抗原_——O1至O173的多克隆抗血清进行血清分型，对O25阳性菌株进行了鉴定。通过靶向rfbO25b亚组基因座的等位基因特异性PCR，对O25阳性菌株进一步开展基因分型。
Mora等人(Int.J.Antimicrobial Agents 2011；37(1):16-21)描述了产CTX-M-14大肠杆菌临床分离物中的某些克隆组的出现，其中有O25b：H4-B2-ST131。O分型用特异性O抗血清(多克隆)完成。
Clermont等人(J Antimicrob Chemother 2008May；61(5):1024-8)公开了针对O25b ST131大肠杆菌的等位基因特异性pabB PCR试验。
Szijarto等人(FEMS Microbiol Lett 2012；332:131-6)以LPS分子的核心结构为基础，描述了大肠杆菌菌株分离物的分子分型。利用靶向核心操纵子中的基因和分别对R1-4和K-12核心类型具有特异性的引物，采用PCR确定分离物的核心类型。
发明内容
本发明的目的是提供特异性改善的针对大肠杆菌特别是MDR菌株的抗体，以用于预防或治疗由LPS O25b携带菌株引起的大肠杆菌感染。本发明进一步的目的是提供能够快速、可靠地诊断大肠杆菌(如MDR菌株)的手段和方法。
本发明的目的通过本发明的主题实现。
本发明提供一种与大肠杆菌菌株的O25b抗原特异性结合的分离抗体，包括至少一个抗体重链可变区(VH)，所述抗体重链可变区(VH)包括图1所列CDR1至CDR3序列中的任一个序列，或其功能活性CDR变体。
本发明提供一种与大肠杆菌菌株的O25b抗原特异性结合的分离抗体，包括至少一个抗体重链可变区(VH)，所述抗体重链可变区(VH)包括按照Kabat编号***命名的表1所列CDR1至CDR3序列中的任一个序列，或包括按照IMGT编号***命名的表2所列CDR1至CDR3序列中的任一个序列，或包括它们的功能活性CDR变体。
特别是，大肠杆菌菌株是MDR菌株。
在下文中，除非另外说明，本发明涉及的是按照Kabat编号，即按照Kabat命名法确定(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,U.S.Department of Health and Human Services.(1991))的CDR序列，特别是表1列出的那些CDR序列(SEQ ID 1-97)。很好理解的是，本发明及权利要求的范围还包括CDR区编号和命名不同的相同抗体和CDR，例如，按照IMGT***(Theinternational ImMunoGeneTics,Lefranc et al.,1999,Nucleic Acids Res.27:209-212)定义的表2所列CDR区(SEQ ID 98-183，及SEQ ID 39)。
特别是，抗体是
A)
选自由组员i)至xiv)组成的组，其中
i)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 1组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 2组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 3组成的CDR3；
ii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 7组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 8组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 9组成的CDR3；
iii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 11组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 12组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 13组成的CDR3；
iv)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 17组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 18组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 19组成的CDR3；
v)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 23组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 24组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 25组成的CDR3；
vi)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 29组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 30组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 31组成的CDR3；
vii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 34组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 35组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 36组成的CDR3；
viii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 29组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 40组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 41组成的CDR3；
ix)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 44组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 45组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 46组成的CDR3；
x)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 50组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 51组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 52组成的CDR3；
xi)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 50组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 55组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 56组成的CDR3；
xii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 57组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 58组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 59组成的CDR3；
xiii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 61组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 62组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 63组成的CDR3；
xiv)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 66组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 67组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 68组成的CDR3；
或
B)一抗体，其是亲本抗体的功能活性变体，包括亲本抗体CDR1、CDR2或CDR3中任一个的至少一个功能活性CDR变体，所述亲本抗体是A的任一组员。
特别是，所述功能活性变体是亲本CDR序列中包含至少一个点突变的功能活性CDR变体，包括与亲本CDR序列具有至少60％序列一致性，优选至少70％、至少80％、至少90％序列一致性的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成。
根据一个具体方面，本发明的抗体包括：
a)选自图2所示任一VH序列的VH氨基酸序列，优选是抗体重链(HC)氨基酸序列的VH序列，所述抗体重链(HC)氨基酸序列是SEQ ID 184至SEQ ID 231中的任一序列或SEQ ID312至SEQ ID 315中的任一序列；
b)抗体重链(HC)氨基酸序列，所述序列是SEQ ID 184至SEQ ID 231中的任一序列或SEQ ID 312至SEQ ID 315中的任一序列；或
c)抗体重链(HC)氨基酸序列，所述序列是SEQ ID 184至SEQ ID 231中的任一序列或SEQ ID 312至SEQ ID 315中的任一序列，而且进一步包括C-端氨基酸删除与/或Q1E点突变，如果VH序列的第一个氨基酸是Q的话。
例如，这样的亲本抗体的功能活性变体是仅与O25b抗原特异性结合的O25b特异性抗体。示例亲本抗体如图1组1所列抗体，例如，如图2所列8A1、3E9或2A7亲本抗体的人源化变体。特别是，这样的变体的VH或HC序列可分别被另一个变体的VH和HC序列取代，特别是其中另一变体是同一亲本抗体的任何其它变体。根据一个具体的方面，本发明的抗体任选进一步包括抗体轻链可变区(VL)，其包括按照Kabat编号***命名的表1所列CDR4至CDR6序列中的任一个序列，或按照IMGT编号***命名的表2所列CDR4至CDR6序列中的任一个序列，或它们的功能活性CDR变体。
特别是，所述抗体是
A)
选自由组员i)至xiv)组成的组，其中
i)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 4组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 5组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 6组成的CDR6；
ii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 10组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 5组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 6组成的CDR6；
iii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 14组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 15组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 16组成的CDR6；
iv)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 20组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 21组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 22组成的CDR6；
v)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 26组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 27组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 28组成的CDR6；
vi)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 20组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 32组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 33组成的CDR6；
vii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 37组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 27组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 38组成的CDR6；
viii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 42组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 32组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 43组成的CDR6；
ix)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 47组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 48组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 49组成的CDR6；
x)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 53组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 32组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 54组成的CDR6；
xi)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 57组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 32组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 54组成的CDR6；
xii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 26组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 27组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 60组成的CDR6；
xiii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 64组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 65组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 38组成的CDR6；
xiv)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 69组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 70组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 71组成的CDR6；
或
B)一抗体，所述抗体是亲本抗体的功能活性变体，包括亲本抗体CDR4、CDR5或CDR6中任一个的至少一个功能活性CDR变体，所述亲本抗体是A的任一组员。
特别是，所述抗体包括选自图2所示任一VL序列的VL氨基酸序列，优选是抗体轻链(LC)氨基酸序列的VL序列，所述抗体轻链(LC)氨基酸序列是SEQ ID 248至SEQ ID 295中的任一序列或SEQ ID 316至SEQ ID 319中的任一序列，或包括抗体轻链(LC)氨基酸序列，所述抗体轻链(LC)氨基酸序列是SEQ ID 248至SEQ ID 295中的任一序列或SEQ ID 316至SEQID 319中的任一序列。
根据本发明的一个具体方面，本发明的抗体与O25a和O25b抗原共享的表位交叉特异性结合，例如，具有相等、大于相等、类似或不同的亲和力。
特别是，本发明抗体与O25b和O25a抗原交叉特异性结合与/或相对大肠杆菌的O25a抗原，优先与O25b抗原结合，优选采用免疫测定法确定时，与针对O25(现在已知并在此称为O25a)大肠杆菌菌株建立的多克隆血清结合O25b抗原相比，与针对O25a菌株建立的多克隆分型血清相比，具有较高的亲和力，如采用免疫测定法所确定，优选采用免疫印迹法、ELISA或其它免疫学方法确定，优选其中所述抗体对O25b和O25a抗原两者具有至少相等的亲和力。
除非称为“交叉特异性”，否则本发明的抗体在本发明中理解为O25b特异性抗体，即所述抗体仅特异性识别O25b抗原，例如，表1组1的任何抗体，或为交叉特异性抗体，即特异性识别O25b和O25a抗原共享的表位的抗体，例如，表1组2的任何抗体。因此，词语“本发明的抗体”包括O25b特异性抗体和O25b/O25a交叉特异性抗体这两类抗体。特别是，本发明的抗体的进一步特征在于，其不与任何其它大肠杆菌抗原交叉反应，与/或所述抗体与任何其它大肠杆菌抗原结合的亲和力较低，例如，其中相对于与其它大肠杆菌抗原(O25b和O25a抗原以外的抗原)结合，优先与O25b抗原结合的Kd差异是至少2log，优选至少3log。
特别是，所述交叉特异性抗体是
A)
选自由组员i)至vii)组成的组，其中
i)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 72组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 73组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 74组成的CDR3；
ii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 77组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 78组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 79组成的CDR3；
iii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 81组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 82组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 83组成的CDR3；
iv)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 84组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 85组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 86组成的CDR3；
v)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 77组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 89组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 90组成的CDR3；
vi)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 92组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 93组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 94组成的CDR3；
vii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 95组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 96组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 97组成的CDR3；
或
B)一抗体，所述抗体是亲本抗体的功能活性变体，包括亲本抗体CDR1、CDR2或CDR3中任一个的至少一个功能活性CDR变体，所述亲本抗体是A的任一组员。
特别是，所述抗体包括
a)选自图2所示任一VH序列的VH氨基酸序列，优选是抗体重链(HC)氨基酸序列的VH序列，所述抗体重链(HC)氨基酸序列是SEQ ID 232至SEQ ID 247中的任一序列或SEQ ID312至SEQ ID 315中的任一序列；
b)抗体重链(HC)氨基酸序列，所述序列是SEQ ID 232至SEQ ID 247中的任一序列或SEQ ID 312至SEQ ID 315中的任一序列；或
c)抗体重链(HC)氨基酸序列，所述序列是SEQ ID至SEQ ID 247中的任一序列或SEQ ID 312至SEQ ID 315中的任一序列，而且其进一步包括C-端氨基酸删除与/或Q1E点突变，如果VH序列的第一个氨基酸是Q的话。
例如，这样的亲本抗体的功能活性变体是交叉特异性抗体。示例亲本抗体如图1组2所列抗体，例如，如图2所列4D5亲本抗体的人源化变体。特别是，这样的变体的VH或HC序列可分别被另一种变体的VH和HC序列取代，特别是其中另一变体是同一亲本抗体的任何其它变体。
根据一个具体的方面，本发明的交叉特异性抗体任选进一步包括抗体轻链可变区(VL)，其包括按照Kabat编号***命名的表1所列CDR4至CDR6序列中的任一个序列，或包括按照IMGT编号***命名的表2所列CDR4至CDR6序列中的任一个序列，或它们的功能活性CDR变体，特别是包括任何交叉特异性抗体的CDR序列。
特别是，所述交叉特异性抗体是
A)
选自由组员i)至vi)组成的组，其中
i)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 75组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 32组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 76组成的CDR6；
ii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 75组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 32组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 80组成的CDR6；
iii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 69组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 70组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 71组成的CDR6；
iv)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 42组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 87组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 88组成的CDR6；
v)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 37组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 27组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 91组成的CDR6；
vi)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 42组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 32组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 88组成的CDR6；
或
B)一抗体，所述抗体是亲本抗体的功能活性变体，包括亲本抗体CDR4、CDR5或CDR6中任一个的至少一个功能活性CDR变体，所述亲本抗体是A的任一组员。
特别是，所述功能活性变体是亲本CDR序列中包括至少一个点突变的功能活性CDR变体，包括与亲本CDR序列具有至少60％序列一致性，优选至少70％、至少80％、至少90％序列一致性的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成。
根据一个具体方面，本发明交叉特异性抗体包括VL氨基酸序列，其选自图2所示任一VL序列，优选是抗体轻链(LC)氨基酸序列的VL序列，所述抗体轻链(LC)氨基酸序列是SEQID 296至SEQ ID 311中的任一序列或SEQ ID 316至SEQ ID 319中的任一序列，或包括抗体轻链(LC)氨基酸序列，所述抗体轻链(LC)氨基酸序列是SEQ ID 296至SEQ ID 311中的任一序列或SEQ ID 316至SEQ ID 319中的任一序列。
根据一个具体实施例，本发明的抗体特别包括：
a)表1所列任何抗体的CDR1-CDR6序列；或
b)图2所示任何抗体的VH和VL序列；或
c)图2所示任何抗体的HC和LC序列；或
d)以a)-c)序列为特征的亲本抗体的功能活性变体，
优选其中
i.所述功能活性变体包括亲本抗体CDR1-CDR6中任一个的至少一个功能活性CDR变体；与/或
ii.所述功能活性变体包括在亲本抗体的VH和VL序列与/或HC和LC序列中的任何序列的框架区包含至少一个点突变，如果VH框架区(VH FR1)的第一个氨基酸是Q，任选包括Q1E点突变；
以及进一步其中
iii.所述功能活性变体与亲本抗体具有结合相同表位的特异性；与/或
iv.所述功能活性变体是亲本抗体的人变体、人源化变体、嵌合变体或鼠源变体与/或亲和力成熟变体。
根据一个具体方面，本发明的抗体包括表1所列CDR组合，只要所述抗体仍然具有功能活性。
特别是，本发明抗体包括表1所列任何抗体的CDR1-6。但是，根据一个替代实施例，所述抗体可能包括不同的CDR组合，例如，其中表1所列抗体包括一个抗体的至少一个CDR序列，如1、2、3、4、5或6个CDR序列及表1所列任一不同抗体的至少一个其它CDR序列。根据一特定实例，所述抗体包括1、2、3、4、5或6个CDR序列，其中所述CDR序列是1个以上抗体，例如，2、3、4、5或6个不同抗体的CDR组合。例如，CDR序列可以组合，以优选包括表1所列任一抗体的CDR1-3中的1、2或全部3个CDR，及表1所列相同或任何其它抗体的CDR4-6中的1、2或全部3个CDR。
此处特别应该理解的是，编号为CDR1、2和3的CDR代表的是VH域的结合区，而CDR4、5和6代表的是VL域的结合区。
根据一个具体方面，本发明的抗体包括图2所示任何HC和LC氨基酸序列组合，或由这样的HC和LC氨基酸序列组合形成的结合位点。或者，可以采用两种不同抗体的免疫球蛋白链组合，只要所述抗体仍然具有功能活性即可。例如，一个抗体的HC序列可以与另一个抗体的LC序列组合。根据另一个具体实施例，图2提供的任何框架区可作为此处描述的任何CDR序列与/或VH/VL组合的框架。
应该理解的是，本发明的抗体任选包括图2这样的氨基酸序列，其带或不带各信号序列，或带替代信号序列或前导序列。
根据一个具体方面，图2每个序列的恒定区可以末端延长或删除，例如，删除一个或多个或C-端氨基酸。
特别是，图2包括C-端赖氨酸残基的每个HC序列优选使用时删除这样的C-端赖氨酸残基。
图2示出了不同的HC序列和不同的LC序列，并支持任何HC/LC组合，从而支持每个亲本抗体的一系列不同的HC/LC组合。因此，每个亲本抗体的特异性变体可包括源自同一亲本抗体的图2所示每个变体抗体的任何HC/LC组合。
特别是，图2示出了四种不同的HC序列和四种不同的LC序列，它们是仅特异性识别O25b抗原的组1抗体的每个亲本抗体8A1、3E9(1G8)或2A7的变体，及与O25b抗原和O25a抗原交叉特异性结合的组2抗体的亲本抗体4D5的变体。每个亲本抗体示出了16种不同的HC/LC组合。
此外，图2示出了另外两种不同的HC序列和另外两种不同的LC序列，它们是仅特异性识别O25b抗原的组1抗体的亲本抗体3E9(1G8)的变体。
此外，图2示出了另外两种不同的HC序列和另外两种不同的LC序列，它们是与O25b抗原和O25a抗原交叉特异性结合的组2抗体的亲本抗体4D5的变体。
CDR序列与图1所列的各CDR序列相同：亲本8A1、1G8、2A7或4D5抗体的CDR序列与图1的8A1-1G8、3E9-G11、2A7-F1和4D5-D4抗体的那些CDR序列分别相同。
特别是，SEQ ID 184-SEQ ID 247和SEQ ID 312-SEQ ID 315表明HC序列包括图2所示的VH氨基酸序列，每个HC序列的N-端可能通过信号序列延长。应该理解的是，具体的抗体包括带或不带各信号序列，或带替代信号序列或前导序列的VH或HC氨基酸序列。
特别是，SEQ ID 248-SEQ ID 311和SEQ ID 316-SEQ ID 319表明LC序列包括图2所示的VL氨基酸序列，每个LC序列的N-端可能通过信号序列延长。应该理解的是，特异性抗体包括带或不带各信号序列，或带替代信号序列或前导序列的VL或LC氨基酸序列。本发明进一步提供一种产生亲本抗体的功能活性抗体变体的方法，所述亲本抗体是本发明任何抗体，例如，表1列出的抗体，或包括图2所示任何HC和LC氨基酸序列组合，或包括由这样的HC和LC氨基酸序列组合形成的结合位点，所述方法包括在任一个框架区(FR)或恒定区，或互补决定区(CDR1至CDR6)中制造至少一个点突变，从而得到变体抗体，并确定变体抗体的功能活性，特别是与O25b结合的亲和力Kd小于10-6M，优选小于10-7M，或小于10-8M，或小于10- 9M，甚至小于10-10M，或小于10-11M，例如，亲和力处于皮摩尔范围。在确定功能活性之后，选择出功能活性变体，将其用于进一步的用途和任选用于通过重组制备方法进行制备。
优选的CDR变体包括易糖基化或脱酰氨基的基序突变。例如，在任一个CDR序列的N-连接糖基化基序NXS/T中，其中X是任何氨基酸，此基序中的“N”可突变为任何其它不同氨基酸，优选“Q”、“S”或“D”，以消除糖基化潜力。其它实例涉及任一CDR序列中的氨基酸基序NG或NN，这些基序容易发生天门冬酰胺脱酰氨基而成为天门冬氨酸。其它基序内的天门冬酰胺较不容易发生脱酰氨基。
例如，4D5的VL CDR1(CDR4)中的氨基酸基序SNG容易发生天门冬酰胺脱酰氨基而成为天门冬氨酸。因此，mAb 4D5的VL CDR1中SNG基序中“N”的“精整(polishing)”突变将突变为任何其它不同的氨基酸，优选“Q”、“S”或“D”，以消除可能的脱酰氨基位点。
根据一个具体方面，变体抗体结合的表位与亲本抗体的相同。
根据另一个具体方面，变体抗体包括的结合位点与亲本抗体的相同。
功能活性变体抗体在VH或VL序列方面可能不同，或者拥有共同的VH和VL序列，但相应的FR包含修饰。可以采用本领域熟悉的方法使亲本抗体产生突变而得到变体抗体。
示例亲本抗体在下面的实例部分及图1(表1)和图2中进行描述。特别是，所述抗体是表1所列亲本抗体的功能活性衍生物。可以制造具有一个或多个修饰的CDR序列，与/或一个或多个修饰的FR序列(如FR1、FR2、FR3或FR4的序列)，或修饰的恒定域序列的变体。例如，功能活性变体根据本发明提供并列于图2中，其源自表1所列亲本抗体，并且已通过突变得到，特别是通过亲和力成熟与/或人源化得到。虽然图2的变体抗体仍然具有与各亲本抗体共同的VH和VL序列，但是，产生具有功能活性的变体VH和VL链(例如，各FR或CDR序列中有修饰)也是可行的。
亲本抗体的示例变体抗体在任何CDR1-CDR6中包括至少一个点突变，与/或在FR区中包括至少一个点突变，优选其中所述抗体特异性结合的表位与亲本抗体的相同。
在某些方面，本发明提供这样的功能活性变体抗体，优选单克隆抗体，最优选人抗体，其包括重链和轻链，其中任何轻链或VL可变区或各CDR包括源于名为8D5-1G10或4D5-D4的亲本抗体或表1或图2所列的任何其它亲本抗体、至少一个FR或CDR序列经修饰的氨基酸序列。
结果是，表1所列名为4D5-D4的抗体包括与抗体8D10-C8(其特征在于下文所述的保藏材料)相同的CDR序列，甚至相同的VH/VL序列，但是，它们的恒定区或恒定域不同，即任意恒定区包括至少一处修饰。
根据一个特定实施例，本发明的抗体是除命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体以外的任何其它抗体。这样的抗体特别理解为仅由可变域VH/VL中的一个或两个组成，由本文进一步描述的保藏的VH/VL材料定义。但是，命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体的特异性变体特别包括在本发明权利要求的主题中，包括但不限于CDR变体、FR变体、鼠源变体、嵌合变体、人源化变体或人变体，或任何抗体域组合，该组合不是由VH/VL组合中的一个或两个组成的组合，包括不同类型的全长抗体、Fab、scFv等。特定实施例涉及4D5-D4(4D5)或8A1-1G8(8A1)抗体，其特征在于图1提到及图2进一步规定的各抗体的CDR序列和可变域，所述抗体包括可变域和恒定域，例如，全长抗体，及鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
但是，命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体可作为亲本抗体，用于制造其功能活性变体。特别是，命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体或其任何功能活性变体可以通过重组方法，采用此处提供的序列产生，任选具有进一步的免疫球蛋白序列，例如，用于产生IgG抗体。特别是，命名为8D5-1G10或8D10-C8的这样的抗体的功能活性变体可通过修饰至少一个FR或CDR序列而产生。
根据本发明一个具体方面，本发明提供一种与多重耐药性(MDR)大肠杆菌菌株的O25b抗原特异性结合的分离单克隆抗体，其包括抗体8D5-1G10的抗原-结合位点，或源自抗体8D5-1G10，或是抗体8D5-1G10的功能活性变体，优选其中抗体8D5-1G10具有以下特点：
a)以保藏号DSM 26763保藏的宿主细胞产生的抗体轻链可变区；
b)以保藏号DSM 26762保藏的宿主细胞产生的抗体重链可变区；
c)或采用(a)与/或(b)的功能活性变体。
特别是，命名为8D5-1G10的抗体由抗体轻链和抗体重链组成，抗体轻链包括以保藏号DSM 26763保藏的大肠杆菌宿主细胞中包含的质粒的编码序列编码的可变区，抗体重链包括以保藏号DSM 26762保藏的大肠杆菌宿主细胞中包含的质粒的编码序列编码的可变区。根据本发明的另一个具体方面，本发明提供与O25a和O25b抗原共享的表位交叉特异性结合的分离单克隆抗体，所述抗体包括抗体8D10-C8的抗原结合位点，或源自抗体8D10-C8，或是抗体8D10-C8的功能活性变体，优选其中抗体8D10-C8的特征是：
a)以保藏号DSM 28171保藏的宿主细胞产生的抗体轻链可变区；与/或
b)以保藏号DSM 28172保藏的宿主细胞产生的抗体重链可变区；
c)或采用(a)与/或(b)的功能活性变体。
特别是，命名为抗体由抗体轻链和抗体重链组成，抗体轻链包括以DSM 28171保藏的大肠杆菌宿主细胞中包含的质粒的编码序列编码的可变区，抗体重链包括以DSM 28172保藏的大肠杆菌宿主细胞中包含的质粒的编码序列编码的可变区。
特别是，所述抗体包括表1所列任一CDR序列的功能活性CDR变体，其中所述功能活性CDR变体包括以下中的至少一项：
a)亲本CDR序列中有1、2或3个点突变；与/或
b)亲本CDR序列的四个C-端或四个N-端或四个中心氨基酸位置中的任一个有1或2个点突变；与/或
c)与亲本CDR序列具有至少60％序列一致性。
特别是，所述功能活性变体抗体包括至少一个本发明的功能活性CDR变体。特别是，包括一个或多个功能活性CDR变体的功能活性变体抗体具有结合与亲本抗体相同表位的特异性。
特别地说，功能活性变体是CDR变体，例如，该变体包括CDR，更特别地是包括CDR环序列，含序列一致性至少60％，优选至少70％、80％或90％的氨基酸序列。
根据一个具体方面，至少一个点突变是氨基酸取代、删除与/或***一个或多个氨基酸。
特别地说，功能活性变体不同于亲本抗体的地方在于其氨基酸序列中，优选CDR中至少有一个点突变，其中每个CDR氨基酸序列中点突变的数量是0、1、2或3。
特别是，抗体源自这样的抗体，采用各CDR序列，或CDR突变体，包括功能活性CDR变体，例如，在一个CDR环中，例如，在5-18个氨基酸的CDR长度内，例如，在5-15个氨基酸或5-10个氨基酸的CDR区内，有1、2或3个点突变。或者，在一个CDR环中，例如，在小于5个氨基酸的CDR长度内，有1至2个点突变，从而提供包括功能活性CDR变体的抗体。具体的CDR序列可以是短的，例如，CDR2或CDR5序列。根据具体实施例，功能活性CDR变体在由4或5个以下氨基酸组成的任何CDR序列中包括1或2个点突变。
根据一个具体方面，本发明的抗体包括CDR序列和框架序列，其中CDR序列和框架序列中的至少一个序列包括人、人源化、嵌合、鼠源或亲和力成熟的序列，优选其中框架序列是IgG抗体的框架序列，例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型的框架序列，或IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体的框架序列。
特异性抗体以框架突变抗体提供，例如，以改善亲本抗体的可制造性或耐受性，例如，从而提供一种免疫原性潜能低的改进(突变)抗体，例如，与亲本抗体相比，任一CDR序列与/或框架序列中存在突变的人源化抗体。
进一步的特异性抗体是以CDR突变抗体提供，例如，从而改善抗体的亲和力与/或靶向与亲本抗体的相同的表位或靶向亲本抗体靶向表位附近的表位(表位漂移(epitopeshift))。
因此，表1或图2所列任何抗体可以作为制造改进抗体的亲本抗体。
根据一个具体方面，本发明的抗体结合O25b抗原的亲和力Kd小于10-6M，优选小于10-7M或小于10-8M。亲和力成熟变体结合O25b抗原的亲和力Kd通常小于10-8M。
特别是，相对大肠杆菌的O25a抗原，本发明的抗体优先与O25b抗原结合，或与这两种抗原结合的亲和力至少相同。
根据本发明的一个具体实施例，抗体与O25b抗原结合的亲和力比与O25a抗原结合的亲和力大至少2倍，特别是结合O25b或O25a抗原时，两者的差异，例如亲和力和/或亲合力的差异为相差至少两倍，或至少三倍、至少四倍、至少5倍，或甚至至少10倍。
根据本发明的一个具体方面，与O25b特异性结合的特征在于，如采用免疫测定法所确定，优选免疫印迹法、ELISA或其它免疫学方法测定时，与针对抗O25或O25a大肠杆菌菌株建立的多克隆血清结合O25b抗原的亲和力相比，本发明抗体结合O25b抗原的亲和力较大。结合亲和力较高，特别是相差至少两倍，或至少三倍、至少四倍、至少5倍，或甚至至少10倍。
特别是，本发明抗体靶向的O25b抗原在一种或多种，及特别是在大多数ST131菌株中普遍存在。
特别是，抗体识别的表位存在于有夹膜和无夹膜的ST131-O25b:H4菌株的表面上，如突变株的表面上。
根据本发明另一个具体方面，抗体在包含活的野生型MDR大肠杆菌菌株的血清样品中显示体外杀菌效力。
根据本发明另一个具体方面，抗体在体外刺激吞噬细胞摄入活的野生型MDR大肠杆菌菌株。
根据另一个具体方面，抗体体外中和特异性LPS分子的内毒素作用。
特别是，所述抗体是全长单克隆抗体、其抗体片段或融合蛋白，所述抗体片段包括至少一个含抗原结合位点的抗体域，所述融合蛋白包括至少一个含抗原结合位点的抗体域。优选所述抗体选自鼠源、嵌合、人源化或人抗体、重链抗体、Fab、Fd、scFv和单域抗体，如VH、VHH或VL，优选人IgG1抗体。
根据本发明另一个具体方面，所述抗体具有全长单克隆抗体的结合位点或其抗体片段，所述抗体片段包括至少一个含结合位点的抗体域，所述抗体优选选自鼠科动物、美洲驼马、兔子、山羊、牛的抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体、重链抗体、Fab、Fd、scFv和单域抗体，如VH、VHH或VL，优选是人IgG抗体或鼠源性IgG抗体。
根据本发明，本发明的抗体特别提供用于医疗、诊断或分析用途。
根据一个具体方面，本发明的抗体提供用于处理承受大肠杆菌感染特别是MDR大肠杆菌菌株感染风险的主体或遭受大肠杆菌感染特别是MDR大肠杆菌菌株感染的主体的用途，包括给予主体有效量的抗体，以限制主体的感染或使所述感染引起的疾病状况好转，优选用于治疗或预防肾盂肾炎、第二次菌血症、脓毒病、腹膜炎、脑膜炎和呼吸机相关性肺炎。
因此，本发明特别提供一种处理方法，其中通过给予主体有效量的抗体，处理承受大肠杆菌感染风险或遭受大肠杆菌感染的主体。
特别是，提供所述抗体用于杀菌性杀灭MDR大肠杆菌，优选ST131-O25b:H4菌株，而不管菌株是否表达荚膜多糖。
根据一个具体方面，采用本发明抗体的免疫疗法可以有效防范活细菌攻击(challenge)，如各种动物模型中所确定的。
所述抗体可以特异性中和致命的内毒素血症。这种功能活性可以在合适的体内模型中确定(采用纯化的LPS攻击)。
所述抗体通过补体介导的杀灭，对MDR大肠杆菌特别有效，例如，如体外血清杀菌试验(SBA)所确定，例如，杀菌比对照样品(不加入抗体或加入不相关对照mAb)高至少20％。
所述抗体通过抗体介导的吞噬作用，对MDR大肠杆菌特别有效，例如，如体外调理吞噬杀灭试验(OPK)所确定的，例如，吸收至少20％输入细菌，或最终CFU计数比对照样品(不加入抗体或加入不相关对照mAb)低20％。
所述抗体通过中和内毒素功能，对MDR大肠杆菌特别有效，例如，如体外LAL试验所确定的，或toll–样受体4(TLR4)报告子试验所确定的，与对照样品(不加入抗体或加入不相关对照mAb)相比，内毒素活性下降至少20％。本发明进一步提供包括本发明抗体的药物制剂(preparation)，优选包括肠胃外或粘膜配方(formulation)，任选包含药学上可接受的载体或赋形剂。
这样的药物组合物可以包含所述抗体，所述抗体作为唯一的活性物质，或与其它活性物质组合，或与活性物质的混合物组合，如至少两种或三种不同抗体的组合或混合。
根据一个具体方面，本发明的抗体提供用于诊断用途，以确定大肠杆菌菌株在主体中引起的大肠杆菌感染或菌血症，特别是表达LPS O25b的MDR菌株导致的感染，如上下***，包括膀胱炎或尿道炎、上行性或血源性肾盂肾炎，特别是糖尿病患者的，以及菌血症、脓毒病(sepsis)、腹膜炎或肠道定植。
特别是，所述抗体提供用于本发明的用途，其中通过将主体的体液样本与所述抗体接触，在活体外确定所述主体的全身性MDR大肠杆菌感染，其中抗体的特异性免疫反应确定感染。
特别是，测试体液样本的特异性免疫反应，所述样本选自尿液、血液、血液分离物或血液培养物、抽出物、唾液、插管患者灌洗液和大便。
特别是，本发明的诊断用途指的是从临床标本中回收的纯大肠杆菌培养物，体外确定大肠杆菌的血清型。
根据另一个方面，本发明提供本发明抗体的诊断制剂，任选包含带标记的抗体与/或其它带标记的诊断试剂，如特异性识别抗体的试剂或抗体与各靶抗原的免疫复合物，与/或固定抗体和诊断试剂中至少其中一个的固相。
本发明进一步提供包括本发明抗体的诊断制剂，在组合物或各部分组成的试剂盒中包括抗体和其它诊断制剂，包含组分：
a)抗体；与
b)其它诊断试剂；
c)及任选固相，以固定所述抗体和诊断试剂中的至少一个。
本发明进一步提供一种诊断大肠杆菌菌株在主体中引起的大肠杆菌感染或菌血症的方法，包括：
a)提供本发明的抗体，及
b)检测所述抗体是否与主体生物样本(例如，待测血液或血清)中的O25b抗原发生特异性免疫反应，例如，仅与O25b抗原发生免疫反应或与O25b和O25a发生交叉反应性免疫反应，优选通过凝集测试进行检测，从而诊断MDR大肠杆菌感染或菌血症。
主体的合适的生物样本可特别选自血液、血清、血液分离物或血液培养物、尿、抽出物、唾液、插管主体的灌洗液和大便。
本发明优选的诊断试验包括固定在固相上例如，乳胶珠粒、金颗粒等上面的本发明的抗体，例如，以测试从待测样本得到的表达O25b抗原的细菌或游离(或分离)O25b抗原的抗体凝集作用。
有些诊断试验可能包括以不同特异性与/或亲和力与O25b与/或O25a结合的两种不同抗体，这样，可能区分O25b抗原和O25a抗原。
根据本发明的一个具体方面，本发明提供伴随诊断，以利用本发明的诊断或诊断方法，确定主体是否感染大肠杆菌，特别是MDR大肠杆菌，以提供用治疗剂治疗这种感染的基础，例如，采用免疫疗法，如采用本发明的抗体治疗。
根据本发明的一个具体方面，本发明提供一种灵敏的床边诊断，通过确定游离LPS，例如，从活细菌数量有限的临床标本，诊断主体是否感染大肠杆菌，特别是MDR大肠杆菌。这种试验的灵敏度特别是低于100ng LPS，优选低于10ng LPS。
本发明进一步提供一种编码本发明抗体的分离核酸。
本发明进一步提供包含编码序列的表达盒或质粒，用于表达：
a)本发明抗体的VH与/或VL；或
b)或本发明抗体的HC与/或LC。
本发明进一步提供包含本发明表达盒或质粒的宿主细胞。
特别是，不包括其材料以DSM 26763或DSM 26762保藏的质粒和宿主细胞。这样的保藏是用质粒转化的大肠杆菌宿主细胞，其中以DSM 26763保藏的宿主细胞采用包含编码命名为8D5-1G10-LC的抗体轻链的核苷酸序列的质粒转化；以DSM 26762保藏的宿主细胞采用包含编码命名为8D5-1G10-HC的抗体重链的核苷酸序列的质粒转化。
特别是，进一步不包括其材料以DSM 28171或DSM 28172保藏的质粒和宿主细胞。这样的保藏是用质粒转化的大肠杆菌宿主细胞，其中以DSM 28171保藏的宿主细胞采用包含编码命名为8D10-C8-LC的抗体轻链的核苷酸序列的质粒转化；以DSM 28172保藏的宿主细胞采用包含编码命名为8D10-C8-HC的抗体重链的核苷酸序列的质粒转化。
本发明进一步提供一种产生本发明抗体的方法，其中将本发明的宿主细胞在一定条件下培养或维持，以产生所述抗体。
根据本发明的另一个方面，本发明提供一种产生本发明抗体的方法，包括：
a)采用大肠杆菌的O25b抗原免疫接种非人类动物并分离产生抗体的B-细胞；
b)从分离的B-细胞形成永生化细胞系；
c)筛选细胞系，以鉴定产生单克隆抗体的细胞系，所述单克隆抗体与O25b抗原及任选与O25a抗原特异性结合，例如其中相对O25a抗原，确定优先与O25b抗原结合；及
d)产生所述单克隆抗体，或该抗体的人源化或人形式，或其与所述单克隆抗体具有相同表位结合特异性的衍生物。
附图说明
图1：表1包括O25b特异性抗体(仅与O25b结合的组1抗体)的CDR序列，及O25b/O25a交叉特异性抗体(组2抗体)的CDR序列，CDR区按照Kabat***确定；表2列出了CDR区按照IMGT***命名的相同抗体。表1和表2采用的命名应具有下述含义：
VH CDR1＝CDR1
VH CDR2＝CDR2
VH CDR3＝CDR3
VL CDR1＝CDR4
VL CDR2＝CDR5
VL CDR3＝CDR6
图2：组1(图1)O25b特异性抗体即亲本抗体8A1、3E9和2A7的人源化变体的HC和LC序列信息，其中所述变体编为亲本抗体8A1的1-16号变体，亲本抗体3E9的1-18号变体，及亲本抗体2A7的1-16号变体；组2(图1)O25b和O25a交叉特异性抗体(亲本抗体4D5)的人源化变体的HC和LC序列信息，其中所述变体编号为1-18。
图3：
图3i)：免疫印迹试验中不同O25b-特异性(与O25a抗原具有或不具有交叉反应性)mAb以及对照LPS核心-特异性(即与所有大肠杆菌LPS分子交叉反应)mAb WN1与纯化的O25a、O25b和O55LPS分子的反应性。
图3ii)：O25-特异性mAb的免疫印迹法情况。O25a、O25b和O55类型的分离纯化的LPS与嵌合或人源化O25b-特异性mAb反应，采用LPS-核心特异性(即交叉反应)WN-1鼠源mAb作为对照。
图4：
图4i)：采用与链霉亲和素尖端结合的生物素化抗原O25b PS抗原，通过ForteBio评价，测定不同O25b mAb的亲和力。
图4ii)：生物层干涉(BLI)测量。ForteBio中测定的以亲和力、缔合常数和离解常数表示的O25b mAb与O25b多糖的结合。
图5：
图5i)：O25b-特异性(具有或不具有O25a抗原交叉-反应性)mAb对表达O25b、O25a或O2抗原的不同大肠杆菌菌株的表面染色情况。
图5ii)：采用浓度0.025-40μg/ml的O25b-特异性mAb对LB(A)或人血清(B)内生长的ST131:O25b菌株3O染色。此外，测定浓度40μg/ml的三种O25b特异性mAb对属于不同脉冲型的一组ST131菌株的表面染色情况。
图6：针对细菌攻击的保护。在鼠类菌血症模型中，测定了O25b-反应性嵌合(i)或人源化(ii)mAb以及同种型匹配的对照mAb的预防性保护效果。在静脉内给予ST131菌株81009进行致死性攻击之前24小时，腹腔内注射100μg mAb。每天对致死率进行监测。
图7：
图7i)：血清杀菌试验。培养3小时后，相对初始细菌数量，以CFU的减少，评价O25b特异性mAb介导的补体依赖性杀菌情况。
图7ii)：血清杀菌试验。将两种不同的ST131:O25b菌株在LB(面板A、B和D)中培养到对数中期。继洗涤之后，采用2.5μg/ml人源化(A和B)或嵌合(D)mAb将细菌培养3小时。或者，将菌株81009在人血清中生长，并采用10ug/ml mAb培养5小时(面板C)。通过铺板法，确定存活细菌的数量。杀菌活性表示为相对对照(无抗体)培养的杀灭百分数。
图8：内毒素血症模型中的保护。将各组5只小鼠腹腔注射(i.p.)100μg(面板A和B)或25μg(面板C)mAb开展被动免疫。第二天，小鼠用20mg/每只小鼠的D-GaIN(i.p.)敏化，同时，用致死剂量的纯化O25b LPS攻击(i.v.)。每天对存活率进行监测。
图9：体外内毒素中和试验。在HEK-Blue试验中对纯化的O25b LPS的TLR-4信号传导进行评价(面板A)。与多粘菌素B(面板B)对比，示出了代表性O25b-特异性mAb的剂量依赖性中和潜力。中和能力以此设定中确定的几种人源化和嵌合O25b-特异性mAb的IC50浓度表示，并总结在面板C中。
图10：(a)：大肠杆菌O25b抗原重复单元的结构，(b)：大肠杆菌O25a重复单元的结构(Kenne L,Lindberg B,Madden JK,Lindberg AA,Gemski P Jr.Structural studies ofthe Escherichia coli O-antigen 25.Carbohydr Res.28；122(2):249-56,1983)。
具体实施方式
本发明中使用的词语“抗体”指的是由抗体域组成或包括抗体域的多肽或蛋白质，抗体域理解为具有或不具有连接序列的免疫球蛋白的重链与/或轻链的恒定域与/或可变域。如果多肽包含β-桶状结构，所述β-桶状结构由环序列连接的抗体域结构的至少两个β-条带组成，则多肽理解为抗体域。抗体域可能是天然结构或经突变或衍生修饰，例如，以改变抗原的结合性质或其它任何性质，如稳定性或功能性，例如，与Fc受体FcRn与/或Fcγ受体结合的性质。
本发明抗体具有与一个或多个抗原结合或与这样的抗原的一个或多个表位结合的特异性结合位点，特别是包括单一可变抗体域的CDR结合位点，如VH、VL或VHH，或可变抗体域对的结合位点，如VL/VH对，包含VL/VH域对和恒定抗体域的抗体如Fab、F(ab')、(Fab)2、scFv、Fv或全长抗体。
本发明使用的词语“抗体”特别指的是包含单一可变抗体域或由单一可变抗体域组成的抗体形式，如VH、VL或VHH，或可变与/或恒定抗体域的组合，带或不带连接序列或铰链区，包括可变抗体域对，如VL/VH对，包含VL/VH域对和恒定抗体域或由VL/VH域对和恒定抗体域组成的抗体，如重链抗体、Fab、F(ab')、(Fab)2、scFv、Fd、Fv或全长抗体，例如IgG型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。词语“全长抗体”可用于指任何包括至少大部分Fc域及其它天然抗体单体中通常发现的其它域的任何抗体分子。本发明使用此词组来强调具体的抗体分子并非抗体片段。
词语“抗体”应特别包括分离形式的抗体，其基本上不含其它抗不同靶抗原的抗体或包含抗体域的不同结构安排。但是，分离抗体可以包含在组合制剂中，该组合制剂含分离抗体，例如，与至少一种其它抗体，如具有不同特异性的单克隆抗体或抗体片段的组合。
词语“抗体”应适用于包括人类的动物来源(如哺乳动物，包括人类、鼠科动物、兔子、山羊、美洲驼马、牛和马，或鸟类，如母鸡)抗体，这一词语应特别包括基于动物来源序列如人序列的重组抗体。
词语“抗体”进一步适用于具有不同物种来源序列(如鼠科和人类来源的序列)的嵌合抗体。
谈到抗体时使用的词语“嵌合”指的是抗体的重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分与源自特定物种的抗体或属于特定类别的抗体中的对应序列同源，而链的其余片段与另一物种或类别的对应序列同源。一般说来，轻链和重链的可变区模拟源自一种哺乳动物的抗体的可变区，而恒定部分与源自另一种动物的抗体序列同源。例如，可变区利用容易获得的B-细胞或来自非人类宿主生物体的杂交瘤，从目前已知的来源获得，而恒定区源自，例如，人类细胞制剂。
词语“抗体”进一步适用于人源化抗体。
谈及抗体时的词语“人源化”指的是具有抗原结合位点的分子，所述抗原结合位点基本上源自非人类物种的免疫球蛋白，其中所述分子的其余免疫球蛋白结构是基于人类免疫球蛋白的结构与/或序列。抗原结合位点可以包括融合到恒定域上的完整可变域或仅仅是接枝到可变域合适框架区的互补决定区(CDR)。抗原-结合位点可以是野生-型或修饰型，例如，被一个或多个氨基酸替换，优选经修饰后更接近人类免疫球蛋白。人源化抗体的某些形式保留了所有CDR序列(例如，包含小鼠抗体全部六个CDR的人源化小鼠抗体。)其它形式相对原抗体有一个或多个CDR被更改。
词语“抗体”进一步适用于人抗体。
谈及抗体时使用的词语“人”理解为包括具有源自人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。本发明的人抗体可包括不被人生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点突变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如，在CDR中。人抗体包括从人免疫球蛋白文库中分离的抗体或包括从动物转基因得到的一个或多个人免疫球蛋白分离的抗体。
词语“抗体”特别适用于任何类别或子类别的抗体。根据重链恒定域的氨基酸序列，抗体可以分为抗体IgA、IgD、IgE、IgG和IgM主类，这些主类中的几个类别可以进一步分为几个子类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和lgA2。
该词语进一步适用于单克隆或多克隆抗体，特别是重组抗体，重组抗体包括通过重组手段制备、表达、创造或分离的所有抗体和抗体结构，例如，源自动物(如包括人类的哺乳动物)的抗体，这些抗体包括来自不同来源的基因或序列，例如，鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或杂交瘤衍生抗体。进一步的实例涉及从经转化用于表达抗体的宿主细胞分离的抗体，或从重组体、抗体组合文库或抗体域分离的抗体，或通过任何其它将抗体基因序列剪接到其它DNA序列上的方法制备、表达、创造或分离的抗体。
词语“抗体”还应理解为指的是抗体的衍生物，尤其是功能活性衍生物。抗体衍生物理解为一种或多种抗体域或抗体的任何组合与/或融合蛋白，其中抗体的任何域可在一种或多种其它蛋白(如其它抗体)的任何位置融合，如包含CDR环、受体多肽，还有配体、支架蛋白、酶、毒素等的结合结构。可采用各种化学方法，如共价偶联、静电相互作用、二硫键连接等将抗体与其它物质缔合或结合而得到抗体的衍生物。与抗体结合的其它物质可以是脂质、糖类、核酸、有机和无机分子或它们的任何组合(例如PEG、药物前体或药物)。在具体实施例中，抗体是包含与生物学上接受的化合物特异性相互作用的附加标签的衍生物。本发明可以使用的标签并没有特别的限制，只要其对抗体与其靶标的结合没有不良影响或不良影响可以忍受即可。合适的标签实例包括His-标签、Myc-标签、FLAG-标签、Strep-标签、钙调蛋白-标签、GST-标签、MBP-标签和S-标签。在本发明的另一个具体实施例中，抗体是包含标记的衍生物。此处使用的词语“标记”指的是可以检测到的化合物或组合物，其与抗体直接或间接缀合，从而产生“标记的”抗体。标记可以是本身可以被检测的标记，例如，放射性同位素标记或荧光标记，或者，在酶标记的情况下，可催化可以检测到的底物化合物或组合物发生化学变化。
本发明所描述的优选衍生物在抗原结合方面是功能活性的，优选具有抗MDR大肠杆菌及其内毒素的效力，例如，正如SBA、OPK或LAL试验中确定的那样，或者防范细菌攻击或中和致死性的内毒素血症。
特别是，源自本发明抗体的抗体可以包括至少一个或多个CDR区或其CDR变体，所述CDR变体在与O25b抗原区别性结合方面具有功能活性，例如，与O25b抗原特异性或选择性结合。
源自亲本抗体或抗体序列的抗体，例如亲本CDR或FR序列，在本发明中尤其理解为例如，通过计算机模拟(in silico)或重组工程或化学衍生或合成得到的突变体或变体。
应该理解的是，词语“抗体”还指的是抗体的变体，包括具有亲本CDR序列的功能活性CDR变体的抗体，及亲本抗体的功能活性变体抗体。
特别是，源自本发明抗体的抗体可以包括至少一个或多个CDR区或其CDR变体，例如，重链可变区的至少3个CDR与/或轻链可变区的至少3个CDR，在至少一个CDR或FR区，或在HC或LC的恒定区中有至少一个点突变，是功能活性的，例如，与O25b抗原特异性结合及任选与O25a抗原交叉特异性结合。
词语“变体”应尤其指的是，例如通过突变方法而得到的抗体，如突变抗体或抗体片段，特别是删除、交换、将***物引入到特定抗体氨基酸序列或区中或化学衍生氨基酸序列，例如在恒定域中，以改造抗体稳定性、效应子功能或半衰期，或在可变域中，例如采用本领域可用的亲和力成熟技术，以改善抗原结合性质。可以采用本领域已知的任何突变方法，包括期望位置处的点突变，例如，采用随机化技术得到。在某些情况下，随机选择位置，例如，采用任何可能的氨基酸或选择优选的氨基酸来随机化抗体序列。词语“突变”指的是本技术领域认可的改变多核苷酸或多肽序列的任何技术。优选的突变类型包括易错PCR突变、饱和突变或其它定点突变。
词语“变体”应特别包括功能活性变体。
本文使用的词语CDR序列的“功能活性变体”理解为“功能活性CDR变体”，本文使用的抗体的“功能活性变体”理解为“功能活性抗体变体”。功能活性变体指的是通过***、删除或替换一个或多个氨基酸，或化学衍化氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，或核苷酸序列内的核苷酸，或序列的任一个或两个远端，例如，CDR序列中的N-端与/或C-端的1、2、3或4个氨基酸，与/或中心1、2、3或4个氨基酸(即在CDR序列中间)，对此序列(亲本抗体或亲本序列)进行修饰，且这种修饰并不会影响此序列的活性，特别是不会损害此序列活性而得到的序列。在结合位点对选定靶抗原具有特异性的情况下，抗体的功能活性变体将仍然具有预定的结合特异性，虽然这可以被改变，例如，以改变对特定表位的精细特异性、亲和力、亲合力、Kon或Koff率等。例如，亲和力成熟抗体特别理解为功能活性变体抗体。因此，亲和力成熟抗体中的修饰CDR序列理解为功能活性CDR变体。
特别是，本发明抗体的功能活性变体具有结合O25b抗原的效力及相对大肠杆菌其它抗原优先结合O25b抗原的特异性或选择性，例如，与大肠杆菌的O25b结合而不与O25a抗原结合，或者不显著与O25a抗原结合，或与O25b和O25a两种抗原交叉特异性结合，但不与大肠杆菌的其它抗原结合。
功能活性变体可以例如通过改变亲本抗体的序列得到，例如，抗体包含的结合位点与表1和图2所列任何抗体的结合位点相同，但除结合位点之外，抗体区内有修饰，或源自这样的亲本抗体，结合位点内有修饰，但不损害抗原结合，优选功能活性变化与亲本抗体具有基本上相同，或甚至改善的生物活性，包括特异性或选择性结合O25b抗原的能力，例如，与大肠杆菌的O25b抗原结合而不与O25a抗原结合，或者不与O25a抗原显著结合，或与O25b和O25a两种抗原交叉特异性结合，但不与大肠杆菌的其它抗原结合。任选所述功能活性变体可以进一步包括SBA试验中的补体介导杀灭效力，与/或任选进一步包括OPK试验中的抗体介导吞噬作用的效力，与/或任选进一步包括LAL试验中的内毒素中和功能，例如，具有基本上相同的生物活性，如采用靶向(MDR)大肠杆菌的特异性结合试验或功能测试所确定。
此处所用的词语“基本上相同的生物活性”指的是基本相同活性所表明的活性是对比抗体或亲本抗体所确定的活性的至少20％，至少50％，至少75％，至少90％，例如，至少100％，或至少125％，或至少150％，或至少175％，或者例如高达200％。本发明所描述的优选变体或衍生物在抗原结合方面是功能活性的，优选具有与大肠杆菌O25b抗原结合而不与大肠杆菌其它抗原结合的效力，例如，与大肠杆菌的O25b抗原结合而不与大肠杆菌的O25a抗原结合，或者不与O25a抗原显著结合，或与O25b和O25a两种抗原交叉特异性结合，例如，相对O25a，优先与O25b抗原结合，或与目前针对O25(O25a)菌株建立的多克隆分型血清相比，与O25b结合的亲和力较高。优选的变体不与大肠杆菌的其它抗原结合，Kd值相差至少2个log，优选相差至少3个log，及任选进一步包括SBA试验中的补体介导杀灭效力，例如，与不含该抗体的对照样本相比，显著降低细菌数，与/或任选进一步包括OPK试验中的抗体介导吞噬效力，例如，与不含该抗体的对照样本相比，显著降低细菌数，与/或任选进一步包括LAL或TLR4信号传导试验中的内毒素中和功能，例如，与不含该抗体的对照样本相比，显著降低游离LPS，例如，具有基本上相同的生物活性，如采用针对靶向MDR大肠杆菌的特异性结合试验或功能测试所确定。各种试验中分析物显著减少通常指的是减少至少50％，优选减少至少60％、70％、80％、90％、95％或98％至完全减少大约100％(+/-1％)。
在优选的实施例中，亲本抗体的功能活性变体是：
a)抗体的生物活性片段，所述片段包括分子序列的至少50％，优选至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，或至少95％，及最优选至少97％、98％或99％；
b)通过至少一个氨基酸替换、加入与/或删除，衍生自该抗体，其中功能活性变体与该分子或分子的一部分具有序列一致性，如抗体的序列一致性至少50％，优选至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，及最优选至少97％、98％或99％；与/或
c)由抗体或其功能活性变体及与该多肽或核苷酸序列异源的额外至少一个氨基酸或核苷酸组成。
在本发明一个优选的实施例中，本发明抗体的功能活性变体基本上与上面描述的变体相同，但是，其多肽或核苷酸序列分别不同，不同之处在于其源自不同种属的同源序列。这些都称为天然变体或类似物。
词语“功能活性变体”还包括天然等位变体，以及突变体或任何其它非天然变体。正如本技术领域已知的那样，等位变体是(多)肽的替代形式，其特征在于替换、删除或加入一个或多个氨基酸，基本上不改变该多肽的生物功能。
功能活性变体可通过多肽或核苷酸序列中的序列改变得到，例如，通过一个或多个点突变，其中，当与本发明一起使用时，所述序列改变保留或改善了未改变多肽或核苷酸序列的功能。此种序列改变包括但不限于(保守)替换、加入、删除、突变和***。
具体的功能活性变体有CDR变体。CDR变体包括CDR区中被至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，其中所述修饰可以是氨基酸序列的化学或部分改造，所述修饰使变体保留未修饰序列的生物学特性。CDR氨基酸序列的部分改造可以是删除或替换一个至几个氨基酸，例如，1、2、3、4或5个氨基酸，或加入或***一个至几个氨基酸，例如1、2、3、4或5个氨基酸，或化学衍生一个至几个氨基酸，例如，1、2、3、4或5个氨基酸，或它们的组合。氨基酸残基的替换可以是保守替换，例如，将一个疏水氨基酸替换成另一疏水氨基酸。
保守替换是在其侧链和化学性质相关的氨基酸家族内发生的替换。这样的氨基酸家族的实例有带碱性侧链的氨基酸、带酸性侧链的氨基酸、带非极性脂肪族侧链的氨基酸、带非极性芳香族铡链的氨基酸、带不带电极性侧链的氨基酸、带小侧链的氨基酸及带大侧链的氨基酸等。点突变尤其理解为多核苷酸改造，其导致氨基酸序列的表达，所述氨基酸序列与非改造氨基酸序列的不同之处在于一个或多个单(非连续)或双氨基酸替换或交换、删除或***成不同的氨基酸。
优选的点突变指的是相同极性与/或电荷的氨基酸的交换。在这方面，氨基酸指的是由六十四个三联体密码子编码的20种天然氨基酸。这20种氨基酸可以分成带中性电荷、正电荷和负电荷的氨基酸：
下面给出了“中性”氨基酸及其各自的三-字母和单字母的代码和极性：
丙氨酸：(Ala，A)非极性，中性；
天冬酰胺：(Asn，N)极性，中性；
半胱氨酸：(Cys，C)非极性，中性；
谷氨酰胺：(Gln，Q)极性，中性；
甘氨酸：(Gly，G)非极性，中性；
异亮氨酸：(lle，I)非极性，中性；
亮氨酸：(Leu，L)非极性，中性；
蛋氨酸：(Met，M)非极性，中性；
苯丙氨酸：(Phe，F)非极性，中性；
脯氨酸：(Pro，P)非极性，中性；
丝氨酸：(Ser，S)极性，中性；
苏氨酸：(Thr，T)极性，中性；
色氨酸：(Trp，W)非极性，中性；
酪氨酸：(Tyr，Y)极性，中性；
缬氨酸：(Val，V)非极性，中性；及
组氨酸：(His，H)极性，带正电荷(10％)，中性(90％)。
带“正”电荷的氨基酸有：
精氨酸：(Arg，R)极性，带正电荷；及
赖氨酸：(Lys，K)极性，带正电荷。
带“负”电荷的氨基酸有：
天冬氨酸：(Asp，D)极性，带负电荷；及
谷氨酸：(Glu，E)极性，带负电荷。
本文描述抗体序列和同系物的“氨基酸序列一致性的百分数(％)”定义为必要时，为了得到最大的序列一致性百分数，在比对序列和引入缺口后，候选序列中与特定多肽序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基百分数，任何保守替换并不视为序列一致性的一部分。本领域的技术人员能够确定测量比对的合适参数，包括待比较序列全长实现最大比对所需的任何算法。
抗体变体特别理解为包括同系物、类似物、片段、具有特定糖基化模式(例如，通过糖工程产生的)的修饰或变体，它们具有功能性及可以作为功能等同物，例如，与特定靶标结合和具有功能性质。
本发明的抗体可以具有或不具有Fc效应子功能。虽然作用模式主要通过中和抗体调节，并不需要Fc效应子功能，但是，Fc可以募集补体，并通过形成免疫复合物，帮助从循环内消除靶抗原(如毒素)。
特异性抗体可以没有活性Fc部分，因此，由不含抗体Fc部分或不包含Fcγ受体结合位点的抗体域组成，或包括缺乏Fc效应子功能的抗体域，例如，通过修饰以减少Fc效应子功能，特别是，消除或降低ADCC与/或CDC活性。可以改造替代抗体，以掺入修饰，来增加Fc效应子功能，尤其是增强ADCC与/或CDC活性。
这种修饰可通过突变引起，例如，Fcγ受体结合位点中的突变，或通过衍生物或试剂引起，以干扰抗体形式的ADCC与/或CDC活性，从而减少或增加Fc效应子功能。
Fc效应子功能显著降低通常理解为指的是以ADCC与/或CDC活性测量的Fc效应子功能低于未修饰(野生型)形式的10％，优选低于5％。Fc效应子功能显著增加通常理解为指的是以ADCC与/或CDC活性测量的Fc效应子功能的增加是未修饰(野生型)形式的至少10％，优选至少是20％、30％、40％或50％。
谈及抗体序列时使用的词语“糖基化改造的”变体指的是因糖基化改造而具有改进的免疫原性或免疫调节(例如，抗炎)特性、ADCC与/或CDC的糖基化变体。所有抗体在重链恒定区的保守位置含有糖类结构，每个同种型具有N-连接糖类结构的独特排列，不同程度地影响蛋白质的组装、分泌或功能活性。IgG1型抗体是每个CH2域中Asn297处具有保守的N-连接糖基化位点的糖蛋白。与Asn297连接的两个复合双天线低聚糖掩埋在CH2域之间，与多肽骨架形成广泛的接触，它们的存在对抗体介导效应子功能，例如，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)是必不可少的。通过例如使N297突变，例如，突变成A，脱除N297处的N-聚糖，或T299，通常得到ADCC下降的无糖基化抗体形式。特别是，本发明的抗体可以是糖基化或糖基化改造的或无糖基化的抗体。
抗体糖基化的主要区别存在于细胞系之间，甚至在不同培养条件下生长的给定细胞系也会出现小的区别。菌细胞的表达通常提供无糖基化抗体。据报道，具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)(催化平分型GlcNAc形成的糖基转移酶)的四环素调控表达的CHO细胞，其ADCC活性得到改善(Umana et al.,1999,Nature Biotech.17:176-180)。除宿主细胞的选择之外，影响抗体重组产生期间糖基化的因素包括生长模式、基质配方、培养密度、氧合作用、pH、纯化方案等。
词语“抗原结合位点”或“结合位点”指的是抗体参与抗原结合的部分。抗原结合位点是由重链(“H”)与/或轻链(“L”)N-端可变(“V”)区或其可变域的氨基酸残基形成的。重链和轻链V区内的三个高度变异(divergent)的延伸，称为“高变区”，插在更保守的侧翼延伸(称为框架区)之间。抗原结合位点提供与结合的表位或抗原的三维表面互补的表面，高变区被称为“互补－决定区”或“CDR”。包含在CDR中的结合位点在本发明中亦称为“CDR结合位点”。
本发明所用词语“抗原”可与词语“靶标”或“靶抗原”互换，指的是抗体结合位点识别的整个靶分子或这种分子的片段。特别是，抗原的子结构，例如，多肽或糖类结构，通常称为“表位”，例如，B-细胞表位或T-细胞表位，这些表位与免疫有关，可由这样的结合位点识别。O25b或O25a等特异性抗原是以分离抗原的形式提供，或者是以大肠杆菌细胞或细胞碎片的形式提供。
本发明使用的词语“表位”应特别指的是可完全构成抗体结合位点的特异性结合伴侣或特异性结合伴侣一部分的分子结构。表位可由糖类、肽结构、脂肪酸、有机物质、生化物质或无机物质或它们的衍生物和它们的任何组合组成。如果表位包括在肽结构，如肽、多肽或蛋白质中，则其通常包括至少3个氨基酸，优选5至40个氨基酸，更优选大约10-20个氨基酸。表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由多肽或糖链的一级序列的单片段组成。线性表位可以是连续的或重叠的。
构象表位由将多肽折叠形成三级结构而汇集在一起的氨基酸或糖类组成，并且在线性序列中，氨基酸不必彼此相邻。特别是，对于多肽抗原，构象或非连续表位的特征在于存在两个或多个在一级序列中被分开的离散氨基酸残基，但是，当多肽折叠成天然蛋白质/抗原时，它们在分子表面上组装形成一致的结构。
此处词语“表位”应尤其指的是抗体识别的单一表位，或包括表位变体的表位混合物，每个表位被交叉反应性抗体识别。
词语“表达”应按下述方式理解。含所需的表达产物(如本发明所描述的抗体)的编码序列和控制序列(如可操作连接中的启动子)的核酸分子可用于表达目的。这些序列转化或转染的宿主能够产生编码的蛋白质。为了使转化发生，表达***可以包括在载体中；但是，相关DNA也可以整合到宿主染色体内。特别是，该词语指的是合适条件下的宿主细胞和相容的载体，例如，通过载体携带且引入到宿主细胞内的外来DNA，表达编码的蛋白质。
编码DNA是一种DNA序列，其对特定多肽或蛋白质(如抗体)的特定氨基酸序列进行编码。启动子DNA是引发、调节或介导或控制编码DNA表达的DNA序列。启动子DNA和编码DNA可以来自同一基因或不同基因，可以来自同一有机体或不同有机体。重组克隆载体通常包括一种或多种用于克隆或表达的复制***、一种或多种用于在宿主中选择的标记(例如，抗生素抗性)，及一种或多种表达盒。
此处使用的词语“载体”定义为在合适的宿主有机体中克隆重组核苷酸序列转录，即重组基因转录及其mRNA翻译所需的DNA序列。
“表达盒”指的是编码在规定限制位点处***到载体内的表达产物的DNA编码序列或DNA片段。表达盒限制位点设计用于确保表达盒插在合适的阅读框内。通常，外来DNA在载体DNA的一个或多个限制位点处***，然后，由载体随同可转移载体DNA一起携带到宿主细胞内。具有***的或增加的DNA的DNA片段或序列(如表达载体)也可以称为“DNA构建体”。
表达载体包括表达盒和额外地通常包括宿主细胞的自主复制的起始点或基因组整合位点、一个或多个可选择标记(例如，氨基酸合成基因或抗生素抗性基因，如zeocin(博来霉素)、卡那霉素、G418或潮霉素)、多个限制性酶切位点、合适的启动子序列及转录终止子，这些组分可操作地连接在一起。此处使用的词语“载体”包括自主复制核苷酸序列以及基因组整合核苷酸序列。载体的常见类型是“质粒”，质粒通常是容易接受额外的(外来)DNA和容易被引入到合适的宿主细胞内的双链DNA的自包含分子。质粒载体通常包含编码DNA和启动子DNA，并具有一个或多个适合外来DNA***的限制位点。特别是，词语“载体”或“质粒”指的是一种媒介体，DNA或RNA序列(例如，外来基因)通过该媒介体可以被引入到宿主细胞内，从而转化宿主并并促进引入序列的表达(例如，转录和翻译)。
此处使用的词语“宿主细胞”应指的是经转化以产生特定重组蛋白质(如本发明所述的抗体及其任何子代)的原代主体细胞。应该理解的是，并非所有子代都与亲本细胞完全相同(由于有意或无意的突变或环境差异)，但是，只要子代保留了与原转化细胞相同的功能性，这些词语即包括这类改变的子代。词语“宿主细胞系”指的是用于表达重组基因以产生重组多肽(如重组抗体)的宿主细胞的细胞系。此处使用的词语“细胞系”指的是已经获得了长期增殖能力的特定细胞类型的已建立的克隆。这样的宿主细胞或宿主细胞系可以在细胞培养中维持与/或经培养以产生重组多肽。
此处谈到核酸、抗体或其它化合物时使用的词语“分离的”或“分离”应指的是，这样的化合物已经与其自然相关的环境充分分离，从而以“基本上纯”的形式存在。“分离的”并不一定排除与其它化合物或材料的人工或合成混合物，或并不排除不干扰基本活性的杂质的存在，及并不排除，例如，因不完全纯化而可能存在的杂质。特别是，本发明的分离核酸分子还包括非天然存在的核酸，例如，密码子优化的核酸或cDNA，或化学合成的核酸。
同样，本发明的分离抗体特别是非天然存在的抗体，例如，抗体是在与另一种抗体或活性剂的组合制剂中提供，所述组合并非天然存在，或者是天然存在抗体的优化或亲和力-成熟变体，或者抗体具有经改造的框架区以改善抗体的可制造性。
谈及本发明的核酸时，有时采用词语“分离核酸”。应用于DNA时，该词语指的是与起源有机体天然基因组紧邻序列分离的DNA分子。例如，“分离核酸”可包括***到载体(如质粒或病毒载体)内的DNA分子，或整合到原核或真核细胞或宿主有机体的基因组DNA内的DNA分子。当应用于RNA时，词语“分离核酸”主要指的是由上文定义的分离DNA分子编码的RNA分子。或者，该词语指的是跟其自然状态下(即在细胞中或组织中)与其缔合的其它核酸充分分离的RNA分子。“分离核酸”(DNA或RNA)可进一步指的是采用生物或合成手段直接产生并与其产生期间存在的其它组分分离的分子。
谈到多肽或蛋白质，如本发明的分离抗体或表位时，词语“分离”特别指的是化合物不含或基本不含其自然相关的材料，如在其自然环境中，或其制备环境(如细胞培养物)中发现的其它化合物，所述制备是采用重组DNA技术在体外或体内进行。分离化合物可以采用稀释剂或佐剂配制，但对于实际用途来说仍然是分离的–例如，用于诊断或治疗时，多肽或多核苷酸可以与药学上可接受的载体或赋形剂混合。特别是，本发明的分离抗体与针对O25(a)菌株建立的多克隆血清制剂不同，因为本发明的分离抗体是以分离、纯化的形式提供，优选以包含分离抗体作为唯一活性物质的制剂提供。但是，这并不排除以包括数量有限的其它明确的(分离)抗体的组合产品形式提供分离抗体。分离抗体也可以在固体、半液体或液体载体上提供，如珠粒。
此处所用词语“中和”或“中和作用”指的是广义，指的是不考虑实现中和的机制，抑制病原体的任何分子，如抑制MDR大肠杆菌感染主体，或抑制病原体通过产生有效的蛋白质毒素促进感染，或抑制毒素损害主体的靶细胞。中和可以例如通过抗体抑制MDR大肠杆菌内毒素与其靶细胞上的同源受体结合与/或相互作用(例如，与TLR4受体结合)而实现。中和可以进一步通过利用Fc介导功能从循环中消除内毒素分子而实现。
中和效力通常采用标准试验确定，如LAL测试，其中，例如，采用比色法测定内毒素的生物活性抑制。
词语“MDR大肠杆菌”应按下述方式理解：多重耐药性大肠杆菌感染占ST131-O25b:H4无性系引起的感染的很大一部分，ST131-O25b:H4无性系仅在近十年才出现，并成为覆盖全球的主要抗性克隆。多重抗性大肠杆菌尤其理解为那些对三类或更多类抗生素显示出抗性的菌株，例如下述试剂/组：盘尼西林、头孢菌素、碳青霉烯、氨基糖苷、四环素、氟喹诺酮、硝基呋喃妥英、三甲氧苄二氨嘧啶(及其组合)、磷霉素、多粘菌素、氯霉素、氨曲南、替加环素(tigecycline)。
酸性荚膜多糖(CPS)是一种环绕大多数病原体大肠杆菌的类似粘液的厚多糖层。因此，本发明抗体识别的特异性表位对有夹膜和无夹膜MDR大肠杆菌菌株都可以特异性接近，这一点出人意料。
对抗或中和MDR大肠杆菌的抗体干扰病原体和病原反应，从而能够限制或预防感染与/或改善这种感染引起的疾病状况，或者抑制MDR大肠杆菌发病，尤其是抑制MDR大肠杆菌传播到宿主的无菌体区隔(compartment)/位点内或在宿主的无菌体区隔/位点内复制。在此方面“保护性抗体”理解为主动或被动免疫中负责对观察的感染源免疫的抗体。特别是，本发明所描述的保护性抗体可用于治疗性目的，例如，用于预防或治疗，从而防止、改善、治疗或至少部分抑制病原体引起的疾病症状、副作用或进程。特别是，保护性抗体能够在治疗性应用后(即，施用在已建立的感染上)，通过，例如，诱导血清杀菌或调理吞噬活性杀灭或阻止活大肠杆菌的复制，或从无菌***点清除全部菌细胞或其LPS分子。或者，预防性施用的保护性抗体通过上面提到的其中一种机制或其它机制抑制感染的建立(即大肠杆菌从非无菌位点扩散到无菌体区隔)。此处的词语“O25b抗原”理解为结构如图8(a)所示的LPS O-抗原。其结构与O25(a)抗原虽类似但不同。此处的O25b理解为与O25a类似但不同的血清型。
此处的词语“O25a抗原”理解为由Kenne等人描述的戊多糖重复单元组成的抗原。在鉴定O25b抗原之前，词语O25代表此处所描述的O25a(参见图8(b))。
此处使用的词语“重组”应指的是“基因工程制备的或基因工程导致的”。重组宿主特别包括表达载体或克隆载体，或其已经通过基因改造以包含重组核酸序列，尤其是采用对宿主来说是外来的核苷酸序列。重组蛋白通过表达宿主相应的重组核酸而产生。此处使用的词语“重组抗体”包括采用重组手段制备、表达、创造或分离的抗体，如(a)从转基因或染色体转移得到人免疫球蛋白基因的动物(如小鼠)或从其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞(如从转染瘤)分离的抗体，(c)从重组、组合性人抗体文库分离的抗体，及(d)采用涉及剪接人免疫球蛋白基因序列到其它DNA序列的任何其它手段制备、表达、创造或分离的抗体。这样的重组抗体包括经改造而包含例如抗体成熟期间发生重排和突变的抗体。
此处使用的词语“特异性”或“特异性结合”指的是在异质分子群中目标同源配体的决定性结合反应。因此，在指定条件下(例如，免疫试验条件下)，抗体与其特定靶标特异性结合，并且不以显著数量与样本中存在的其它分子结合。特异性结合指的是就靶标身份而言，结合是选择性的，根据选择，具有高、中或低的结合亲和力或亲合力。如果与另一抗原相比，结合常数或结合动力学相差至少10倍(理解为相差至少1log)，优选相差至少100倍(理解为相差至少2log)，更优选相差至少1000倍(理解为相差至少3log)，通常实现了选择性结合。
此处使用的词语“特异性”或“特异性结合”指的是在异质分子群中目标同源配体的决定性结合反应。因此，在指定条件下(例如，免疫试验条件下)，抗体与其特定靶标特异性结合，并且不以显著数量与样品中存在的其它分子结合。特异性结合指的是就靶表身份而言，结合是选择性的，根据选择，具有高、中或低的结合亲和力或亲合力。如果结合常数或结合动力学相差至少10倍(理解为相差至少1log)，优选相差至少100倍(理解为相差至少2log)，更优选相差至少1000倍(理解为相差至少3log)，通常实现了选择性结合。词语“特异性”或“特异性结合”还理解为适用于与一个或多个分子结合的结合物，如交叉-特异性结合物。
本发明的抗体特别在仅结合O25b抗原方面具有选择性，或相对于O25a抗原，优先结合O25b抗原，或与针对O25a菌株建立的多克隆血清相比，与O25b结合的亲和力更高，所述血清与O25b抗原结合的亲和力低。因此，本发明的抗体可理解为与那些抗原差异性结合，例如，至少具有相同的亲和力，或亲和力更大，如亲和力不同，Kd相差至少1log，优选相差至少2log，更优选相差至少3log。相对O25a抗原，与O25b抗原选择性结合的这类抗体优选用于诊断或治疗目的。对于某些诊断目的，特别使用以可检测的方式仅与O25b抗原结合的抗体。
相对其它大肠杆菌抗原，例如除O25抗原以外的任何糖类抗原或任何核心抗原，优先与O25b抗原结合的差异性结合亲和力优选高至少10-倍，即Kd相差至少10，优选高至少100-倍，更优选高至少1000倍。
与商业分型血清，如来自Statens Serum Institut的高滴度大肠杆菌O25抗血清(#81369)相比，优先与O25b抗原结合的差异性结合亲和力特别是高至少5倍，或高至少6-倍，或高至少7-倍，或高至少8-倍，或高至少9-倍，或高至少10-倍。
相对O25a抗原，优先与O25b抗原结合的差异性结合亲和力特别是至少相等或大于相等，例如，高至少1.5倍或至少2-倍，或至少3-倍，或至少4-倍，或至少5倍，或至少6-倍，或至少7-倍，或至少8-倍，或至少9-倍，或至少10-倍。
本发明的优选抗体与任何所述单个抗原特别是O25b抗原结合具有高亲和力，特别是具有高的结合速率与/或低的解离速率，或高的结合亲合力。抗体的结合亲和力通常以抗体的浓度表征，即一半的抗原结合位点被占据时的抗体浓度被称为解离常数(Kd或KD)。通常，Kd<10-7M的结合物被视为高亲和力结合物，在一些情况下，例如，以较高亲和力用于治疗目的，例如，Kd<10-8M，优选Kd<10-9M，甚至更优选Kd<10-10M。
然而，在特别优选的实施例中，单个抗原的结合亲和力是中等亲和力，例如，当与至少两个抗原结合时，Kd小于10-6M和不超过10-8M。
本发明可以提供中等亲和力的结合物，必要时，优选同时提供亲和力成熟过程。
亲和力成熟是抗体对靶抗原的亲和力增加的过程。根据此处公开的本发明的各种实施例，为了产生亲和力成熟的抗体，可以采用本领域的任何一种或多种制备与/或利用亲和力成熟文库的方法。示例性的这样的亲和力成熟方法和用途，如随机突变、细菌增变株传代、定点-突变、突变热点靶向、简约突变、抗体改组、轻链改组、重链改组、CDR1与/或CDR1突变，及适合实施本发明此处公开的各种实施例的方法和用途的亲和力成熟文库的的产生和利用方法，包括，例如，Prassleret al.(2009)；Immunotherapy,Vol.1(4),pp.571-583；Sheedy et al.(2007),Biotechnol.Adv.,Vol.25(4),pp.333-352；WO2012/009568；WO2009/036379；WO2010/105256；US2002/0177170；WO2003/074679公开的那些。
随着抗体结构的变化，包括氨基酸突变或作为免疫球蛋白基因片段体细胞突变的结果，产生和选择出亲和力较大的抗原结合位点变体。亲和力成熟的抗体的亲和力比亲本抗体大几个log。单种亲本抗体可以经历亲和力成熟。或者，与靶抗原具有类似结
合亲和力的抗体池可以视为亲本结构，这些亲本结构经过变化得到亲和力成熟的单种抗体或亲和力成熟的抗体池。
本发明优选的亲和力成熟的抗体变体，其结合亲和力增加至少2倍，优选增加至少5倍，优选增加至少10倍，优选增加至少50倍，或优选增加至少100倍。在采用各亲本分子库的筛选活动中，可以采用具有中等亲和力的抗体，通过亲和力成熟，得到本发明具有特异性靶结合性质、结合亲和力Kd<10-8M的抗体。或者，可以通过本发明抗体的亲和力成熟，甚至进一步提高亲和力，得到高值，对应的Kd小于10-9M，优选小于10-10M，或甚至小于10-11M，最优选处于皮摩尔范围。
在某些实施例中，结合亲和力通过亲和力ELISA试验确定。在一些实施例中，结合亲和力通过BIAcore、ForteBio或MSD试验确定。在一些实施例中，结合亲和力通过动力学方法确定。在一些实施例中，结合亲和力通过平衡/溶液法确定。
词语“具有相同的特异性”、“具有相同的结合位点”或“结合相同的表位”指的是相当的单克隆抗体表现出相同的或基本相同的，即类似的免疫反应(结合)特点，与预先选择的靶标结合序列竞争结合。特定靶标的抗体分子的相对特异性可以通过竞争试验相对确定，例如，如Harlow,et al.,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988)所描述的。
此处使用的词语“主体”应指的是温血哺乳动物，特别应指的是人类。特别是，本发明的医疗用途或各处理方法适用于需要预防或治疗与MDR大肠杆菌感染有关的疾病状况或患有疾病包括早期或晚期疾病的主体。词语“患者”包括接受预防或治疗的人类和其它哺乳动物主体。因此，词语“处理”包括预防性和治疗性处理。对主体例如进行处理，以预防或治疗MDR大肠杆菌疾病状况。特别是，对处于感染风险或发展出此类疾病或疾病复发的主体，或患有此类感染与/或与此类感染有关疾病的主体进行处理。
特别是，此处所描述的处理、预防或延迟主体疾病状况的方法是通过干扰作为该状况病因的MDR大肠杆菌的发病实现的。
特别是，词语“预防”指的是包括防止发病的防止措施或降低发病风险的防止措施。
例如，本发明的抗体可预防性用于抑制MDR大肠杆菌感染发作，或治疗性地用于处理MDR大肠杆菌感染，特别是已知难治的MDR大肠杆菌感染，或在特定主体时，已证实用其它传统抗生素疗法难治的MDR大肠杆菌感染。
本文使用的词语“基本上纯”或“纯化的”应指的是包含至少50％(w/w)，优选至少60％、70％、80％、90％或95％化合物(如核酸分子或抗体)的制剂。纯度采用适合所述化合物的方法测定(例如，色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、HPLC分析等)。
本发明谈到化合物，例如本发明的抗体时使用的词语“治疗有效量”与词语“有效量”或“足量”可以互换，它们是施用于主体时足以产生有益结果或达到要求结果(包括临床结果)的量或活性，因此，有效量或其同义词取决于应用的语境。
有效量指的是足以治疗、预防或抑制这类疾病或紊乱的化合物的量。在疾病语境中，此处所描述的抗体的治疗有效量特别用以治疗、调节、减弱、逆转或影响疾病或状况，受益于抑制(MDR)大肠杆菌发病(例如，粘附和定植在粘膜表面，在无菌***点内不受控的复制，及细菌产物对宿主细胞的毒性)。
与这种有效量对应的化合物的量将根据各种因素而变化，如给定药物或化合物、药物配方、给药途径、疾病或紊乱类型、待处理主体或宿主身份等，但是，这些都是熟悉本领域的技术人员可例行确定的。
此处所描述的抗体的治疗有效量，如提供给需要处理的人类患者的有效量，可以特别是0.5-50mg/kg，优选是5-40mg/kg，甚至更优选是不超过20mg/kg，不超过10mg/kg，不超过5mg/kg，不过，例如治疗急性疾病状况时，可能需要较高的剂量。
此外，采用治疗有效量的本发明抗体治疗或防止主体的方案可由单次施用组成或包括一系列施用。例如，抗体可以至少每年施用一次、至少半年施用一次或至少一个月施用一次。但是，在另一个实施例中，对于给定处理，主体从大约每周施用一次抗体至大约每天施用一次抗体。处理期长短取决于各种因素，例如，疾病的严重程度、是急性还是慢性疾病、患者的年龄、抗体形式的浓度和活性。还应该理解的是，在特定治疗或预防方案期间，用于治疗或预防的有效剂量可以增加或减少。采用本领域熟知的标准诊断试验，剂量的变化变得显而易见。在某些情况下，需要长期施用。
根据一个具体方面，本发明提供此处附图中详细列出的示例抗体，及进一步提供抗体变体，特别是包括结合的表位与亲本抗体结合的表位基本相同的变体，亲本抗体的特征在于图2的VH和VL氨基酸序列，或HC和LC氨基酸序列形成的特异性结合位点，或这样的VH/VL域形成的结合位点。这样的抗体可以是，例如，通过修饰亲本抗体的各CDR或抗体序列得到的功能活性变体抗体。很好理解的是，此处所描述的任何抗体序列被视为“亲本”序列，所述“亲本”序列可，例如，通过点突变改变。
下文实例及图1和图2描述了示例亲本抗体。图2的抗体是源自表1亲本抗体(即以2A7、8A1、4D5和3E9命名的抗体)的变体抗体，是通过人源化和任选亲和力成熟得到的，各变体具有不同的HC/LC组合。这些变体抗体与靶抗原结合，因此，被视为具有功能活性。此外，使用，例如，各FR或CDR序列中存在修饰，且具有功能活性(例如，与亲本抗体具有相同的表位结合或包括与亲本抗体相同的结合位点或与亲本抗体具有相同的结合特点)的变体VH或VL域或变体HC或LC链也是可行的。此处所描述的抗体的某些FR或CDR序列可与其它抗体的FR或CDR序列互换，例如，与图1或图2所列抗体的FR或CDR序列互换，这也是可行的。
如果抗体交叉竞争，从而在给定时间点，仅一种抗体可与表位结合，即一种抗体防止另一种抗体的结合或调节效应，则称抗体为“与相同表位结合”或“包括相同结合位点”或具有“基本上相同的结合”特点。
此处谈及抗体时使用的词语“竞争”或“交叉竞争”指的是第一抗体或其抗原-结合部分结合表位的方式与第二抗体或其抗原-结合部分的结合方式足够类似，从而与不存在第二抗体时第一抗体的结合相比，第二抗体存在时第一抗体与其同源表位的结合减少，这种减少是可以检测的。或者，其中在第一抗体存在时，第二抗体与其表位的结合也减少，这种减少是可以检测的，可以是这种情况，但是，并不要求一定如此。也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，而第二抗体并不抑制第一抗体与其相应表位的结合。但是，若每种抗体可检测地抑制其它抗体与其同源表位的结合，不管其程度是相同、更大或更少，都称抗体彼此“交叉竞争”与它们的相应表位结合。竞争和交叉竞争抗体均包括在本发明之内。
此处的竞争指的是采用竞争性ELISA试验或ForteBio分析确定的相对抑制大于大约30％。在特定的环境中，例如，在竞争分析被用于选择或筛选设计具有结合抗原的意图功能的新抗体时，可能希望设定较高的相对抑制阈值作为合适的竞争水平的标准。因此，例如，可以设定竞争性结合的标准，其中检测到至少40％相对抑制，或至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或甚至至少100％相对抑制时，抗体被视为充分竞争。
正如本发明所描述，一方面，本发明提供抗体分子，所述抗体分子的特征在于，例如，与图1或图2所列任何抗体竞争结合O25b抗原的能力。
对O25b具有高度特异性的单克隆抗体(mAb)具有很大的潜力作为诊断剂用于鉴定属于ST131系的MDR菌株。此外，特别是在人源化以后，这些mAb适合用于预防(例如，用于高风险群体)和治疗ST131-O25b:H4菌株导致的大肠杆菌感染。
根据抗O25的免疫血清经常用于表达O25b抗原的大肠杆菌菌株的诊断鉴定这一事实，O25b和O25a糖类抗原被认为是相同的或非常类似。ST131菌株中O-抗原合成的遗传背景未被充分阐明，但是，rfb簇内的特定基因(编码O-抗原合成)构成了基于PCR的O25b菌株鉴定的基础。此外，迄今为止，没有结构数据支持O25a和O25b抗原之间的任何差异。
因此，本发明的抗体能够与O25b抗原特异性结合是出人意料的。
为了证实表达O25b抗原和O25a抗原的大肠杆菌菌株之间的遗传差异，采用以对保守的侧翼基因gnd和galF具有特异性的寡核苷酸开始的引物步移法，从ST131-O25b:H4菌株81009的临床分离物对编码O-抗原合成的rfb簇进行测序(Szijarto et al,FEMSMicrobiol Lett,2012,332:131-6)。得到的rfb操纵子的重叠群是11,300bp长，与编码O25抗原合成酶的重叠群(NCBI登录号GU014554)仅部分同源。结果表明，O25b rfb操纵子3'端长2043bp的片段与O25rfb操纵子的对应区不同源，其中此片段被编码岩藻糖合成和运输的6267bp长序列代替。对纯化部分(fraction)中从大肠杆菌ST131分离的LPS中存在的O-特异性PS生物学重复单元(RU)的结构进行了详细分析，该纯化部分由以一个重复单元(RU)替换的核心OS组成。LPS ST131的RU是结构如图8(a)所示的O-乙酰化戊多糖。
实际上，据Kenne等人(图8(b))报道，ST131O-PS的RU结构与LPS O25RU不同，据我们所知，它是大肠杆菌脂多糖的一种新的O-血清型(Stenutz et al.FEMS MicrobiolRev.2006May；30(3):382-403.Review)。此外，分离自LPS ST131的核心寡糖的MALDI-TOF质谱法和组合物分析的初步结果支持K-12型，这是以前SzijártóV.等人在遗传分析的基础上报道的(Szijarto et al,FEMS Microbiol Lett,2012,332:131-6)。已经证明，LPS ST131由两种主要的核心寡糖(OS)糖型组成。糖型的类型取决于存在或不存在O-特异性多糖(PS)。未取代核心OS的主要糖型是截短型的K-12核心寡糖，缺乏7)-α-Hepp-(1→6)-α-Glcp二糖。该二糖的存在是O-PS取代的核心OS和未取代核心OS之间的区别。
一个具体方面涉及本发明的抗体，其特征在于特异性抗菌功能活性，如补体介导的杀菌和调理吞噬摄入和杀灭。
根据一个具体实施例，本发明的抗体在免疫效应细胞存在下具有标准SBA或OPK试验测定的细胞毒活性。如果与对照相比，细菌杀灭百分数显著增加的话，则可以表明本发明抗体具有如SBA或OPK试验所确定的细胞毒活性。与SBA或OPK相关的杀菌活性优选以绝对百分数增加衡量，优选高于5％，更优选高于10％，甚至更优选高于20％、30％、40％或50％。
吞噬效应细胞可以通过采用补体活化的另一种途径活化。与微生物表面抗原结合的抗体利用它们的Fc区吸引补体级联的第一成分，启动“经典”的补体***的活化。这导致刺激吞噬效应细胞，通过补体依赖性细胞毒性(CDC)，吞噬效应细胞最终杀灭靶标。
根据一个具体实施例，采用标准ADCC或CDC试验测定，本发明抗体在免疫效应细胞存在下具有细胞毒活性。如果与对照相比，细菌溶解百分数显著增加的话，表明本发明抗体具有如ADCC或CDC试验确定的细胞毒活性。与ADCC或CDC相关的细胞毒活性优选以绝对百分数增加来衡量，优选高于5％，更优选高于10％，甚至更优选高于20％。补体固定可能是特别相关的，这种机制可以通过移除形成的免疫复合物来清除感染部位或血液中的毒素。
根据一个具体实施例，本发明抗体具有IgG的Fc部分产生的免疫调节功能。改变的糖基化作用增加例如末端半乳糖残基上唾液酸的含量，可能通过DC-SIGN信号传导而具有消炎作用。相对于Ia、IIa和III Fcγ受体，优先与Fcγ受体IIb的结合(抑制)，可能提供了消炎作用。
本发明的抗体可以采用杂交瘤方法鉴定或获得。在这样的方法中，小鼠或其它合适的宿主动物，如仓鼠，经免疫以引起淋巴细胞产生或能够产生与免疫用蛋白质特异性结合的抗体。或者，淋巴细胞可以体外免疫。然后，采用合适的融合剂(如聚乙二醇)，将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞。
对杂交瘤在其中生长的培养基进行试验，测定针对抗原的单克隆抗体的产生。优选通过免疫沉淀法或通过体外结合试验如放射免疫法(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)对杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性进行确定。
例如，本发明的抗体可以通过源(亲本)抗体得到，例如，以编码卡那霉素抗性的盒代替kps簇(编码夹膜合成)，利用代表性ST131-O25b:H4菌株81009(如81009△kps::kan)的无夹膜突变体免疫小鼠得到。然后，分析从小鼠得到的血清样品，显示抗O25b抗原的最高IgG滴度(ELISA和蛋白质印迹法)的小鼠脾脏可用于产生杂交瘤。在亚克隆之后，可以选择杂交瘤克隆，其分泌的抗体对O25b抗原具有特异性及与表达O25b抗原的活的野生型大肠杆菌表面结合。然后，这些mAb可以从杂交瘤上层清液纯化，用于进一步测试其与O25b抗原的特异性结合，及可能测试其相对O25a抗原优先结合O25b抗原的差异结合亲和力，和改造抗体，例如，用于不同诊断或治疗目的。
在某些情况下，差异结合抗体，此处亦称为选择性抗体，通过针对单一抗原进行筛选而得到。为了增加分离差异结合克隆的可能性，人们会采用多重选择性压力，针对不同的抗原开展逐步筛选。特殊的mAb选择策略以交替的方式采用O25b和O25a组分或其它大肠杆菌抗原。
鉴定具有所需选择性结合性质的抗体的筛选方法可以通过展示技术实现(使用噬菌体、细菌、酵母或哺乳动物细胞)。反应性可以根据ELISA、蛋白质印迹法或流式细胞术表面染色法，例如，采用标准试验进行评价。
例如，重组抗原可用于从抗体文库，例如，酵母展示抗体文库选择抗体。
例如，本发明特别提供O25b特异性抗体，所述抗体是通过鉴定抗体的O25b抗原结合特异性的方法得到的，例如，通过特异性发现选择方案得到的。因此，对于与靶标的反应性，可以选择包括与O25b靶标具有反应性的抗体的抗体文库。
本发明进一步特别提供交叉特异性抗体，所述抗体是通过鉴定抗体与两种靶标(例如O25b和O25a抗原)结合的特异性的方法(例如，采用交叉反应性发现选择方案)得到的。因此，对于包括与两种靶标(靶标A和靶标B)具有反应性的抗体的抗体文库，可以首先根据与其中一种靶标，例如，靶A的反应性进行选择，然后，根据与另一种靶标，如靶标B的反应性进行选择。每轮相继的选择都增强了所得池对两种靶标的反应强度。因此，此方法在鉴定对两种不同的靶标具有交叉反应性的抗体，及交叉中和病原体的潜力方面尤其有用。该方法可通过增加对其它靶标的富集的轮数，延伸用于鉴定对其它靶标具有反应性的抗体。
在任一事件中，可采用本领域熟悉的抗体优化方法，进一步改善选择性结合。例如，此处所描述的免疫球蛋白链可变区的某些区域可以采用一种或多种优化策略，包括轻链改组、目标突变、CDR合并及选定CDR与/或框架区的定向突变。
一旦鉴定出具有所要求性质的差异结合抗体，即可以确定抗体识别的优势表位。表位定位的方法是本领域熟知的并公开在，例如，Epitope Mapping:A PracticalApproach,Westwood and Hay,eds.,Oxford University Press,2001中。
表位定位涉及抗体结合的表位的鉴定。对于本领域的技术人员来说，有许多种确定蛋白质上表位位置的方法，包括抗体-抗原复合物的结晶学分析、竞争试验、基因片段表达试验和基于合成肽的试验。谈到抗体时所称“结合相同表位”的抗体在此处按下述方式理解。当两种抗体识别相同或空间上重叠的表位时，抗体被称为结合相同或基本上相同或大体上相同的表位。确定两种抗体是否结合相同或空间上重叠的表位的常用方法是竞争试验，该试验采用标记抗原或标记抗体，可以配置所有数量的不同形式。通常，抗原固定在96-孔板上，采用放射性或酶标记测定未标记抗体阻断标记抗体结合的能力。
一旦鉴定出具有所要求结合性质的抗体，就可以采用本领域熟悉的方法，包括，例如，杂交瘤技术或重组DNA技术来产生这样的抗体，包括抗体片段。
例如，可以采用熟知的重组表达载体，例如，本发明的质粒或包括编码抗体序列的核苷酸序列的表达盒，通过分离编码所要求抗体链的DNA和利用用于表达的编码序列转染重组宿主细胞，产生重组单克隆抗体。重组宿主细胞可以是原核细胞和真核细胞，如前文所描述的那些细胞。
根据一个具体方面，核苷酸序列可用于基因操作，以对抗体进行人源化或改善抗体的亲和力或抗体的其它特点。例如，恒定区可以改造成与人类恒定区更类似，从而避免免疫反应，如果抗体在临床试验中使用和治疗人类时。基因操作抗体序列，使其与靶标O25b的亲和力更大及针对MDR大肠杆菌的功效更大，是理想的。显然，对于本领域的技术人员来说，可以对抗体进行一种或多种多核苷酸改变，却仍然保持其对靶标O25b的结合能力。
采用各种方法产生抗体分子通常是人们熟悉的。例如，美国专利6331415(Cabilly等人)描述了一种重组产生抗体的方法，其中重链和轻链从单一载体或从单一细胞中两个独立的载体同时表达。Wibbenmeyer et al.,(1999,Biochim Biophys Acta 1430(2):191-202)和Lee and Kwak(2003,J.Biotechnology 101:189-198)描述了采用独立的大肠杆菌培养基表达的质粒，从独立产生的重链和轻链产生单克隆抗体。与抗体产生有关的其它各种技术在，例如，Harlow,et al.,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988)中提供。
如果需要的话，可对本发明的抗体，例如，图1或图2的任一个抗体进行测序，然后，将多核苷酸序列克隆到载体内用于表达或增殖。编码抗体的序列可以保持在宿主细胞的载体内，然后，宿主细胞可以扩增和冷冻供将来之用。细胞培养中重组单克隆抗体的产生可以采用本领域已知的方法通过B细胞抗体基因克隆进行。
另一方面，本发明提供一种分离核酸，所述分离核酸包括编码产生本发明重组抗体的序列。
编码抗体的核酸可以具有任何合适的特点和包括任何合适的特征或其组合。因此，例如，编码抗体的核酸可以是DNA、RNA或它们的混合物的形式，可以包括非天然碱、修饰骨架，例如，促进核酸稳定性的硫代磷酸酯骨架，或它们两者。该核酸有利地可掺入到本发明的表达盒、载体或质粒内，包括促进目标宿主细胞中所需的表达、复制与/或选择的特点。这样的特点的实例包括复制起始点组件、选择基因组件、启动子组件、增强子元件组件、多腺苷酸化序列组件、终止组件等，其中许多合适的实例是已知的。
本发明进一步提供包含本文所描述的一种或多种核苷酸序列的重组DNA构建体。这些重组构建体与载体(例如，质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体)一起使用，在载体内***编码任何公开的抗体的DNA分子。
利用通过培养基中的连续细胞系产生抗体分子的任何方法产生单克隆抗体。制备单克隆抗体的合适方法的实例包括Kohler等人(1975,Nature 256:495-497)的杂交瘤方法和人B-细胞杂交瘤方法(Kozbor,1984,J.Immunol.133:3001；和Brodeur et al.,1987,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,(Marcel Dekker,Inc.,New York),pp 51-63)。
此外，本发明提供药物组合物，其包括本发明所描述的抗体及药学上可接受的载体或赋形剂。这些药物组合物可以按照本发明以推注或输注或持续输注的方式施用。适合辅助这样的施用手段的药物载体是本领域熟知的。
药学上可接受的载体通常包括与本发明提供的抗体或相关组合物或组合生理上相容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的进一步实例包括无菌水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的任何组合。在一个这样的方面，抗体可与适合所要求给药途径的一种或多种载体组合，抗体可以，例如，与任何乳糖、蔗糖、淀粉、链烷酸的纤维素酯、硬脂酸、滑石粉、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、***树胶、明胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidine)、聚乙烯醇和任选进一步的片剂化或胶囊化用于传统给药。或者，抗体可以溶于盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧基甲基纤维素胶体溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉籽油、麻油、黄蓍胶与/或各种缓冲溶液。其它载体、佐剂和给药方式是药学领域熟悉的。载体可以仅包括控释材料或时间延迟材料(如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯)或与蜡或本领域熟悉的其它材料一起使用。
其它药学上可接受的载体是本领域已知的，并在例如，REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES中进行了描述。液体制剂可以是溶液、乳液或悬浮液，并可以包括赋形剂，如悬浮剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂和螯合剂。
本发明还提供配制本发明的抗体及一种或多种治疗活性剂的药物组合物。将具有所要求纯度的所述免疫球蛋白与任选药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，配制本发明抗体的稳定制剂，以冻干制剂或水溶液的形式贮存。体内施用制剂特别是无菌的，优选是无菌水溶液形式。通过无菌过滤膜过滤或其它方法，很容易实现这一点。本发明公开的抗体和其它治疗活性剂还可以配制为免疫脂质体，与/或装在微胶囊中。
包含本发明抗体的药物组合物的给药可以采用各种方式，包括口服、皮下、静脉、鼻内、囊内(intraotically)、经皮、粘膜、局部给药，例如，凝胶、软膏、洗液、乳膏等，腹膜内、肌肉内、肺内给药，例如，采用可吸入技术或肺部递送***、***、肠胃外、直肠或眼内给药。肠胃外给药所用示例性制剂包括那些适合皮下、肌肉内或静脉注射的制剂，例如，无菌溶液、乳液或悬浮液。
在一个实施例中，本发明的抗体是给主体施用的唯一的治疗活性剂，例如，作为疾病改善或预防单一疗法。
在另一个实施例中，本发明的抗体在混合物中与其它抗体组合成，例如，在混合物或各部分组成的试剂盒中组合，以靶向大肠杆菌，从而该混合物包含不止一种向主体施用的治疗活性剂，例如，作为疾病改善或预防用联合疗法。
此外，本发明的抗体可与一种或多种其它治疗或预防剂组合给药，包括但不限于标准处理，例如，抗生素、炎症的类固醇和非类固醇抑制剂，与/或其它基于抗体的疗法，如采用抗菌剂或消炎剂。
一种组合疗法特别采用标准方案，例如，用作治疗MDR大肠杆菌感染。这可能包括抗生素，例如替加环素(tygecycline)、利奈唑胺、甲氧西林与/或万古霉素。
在一种组合疗法中，抗体作为混合物施用，或与一种或多种其它治疗方案伴随施用，例如，在伴随疗法之前、同时或之后使用。
本发明抗体或相应药物制剂的生物学特性可以在活体外细胞、组织和整个有机体实验中进行表征。正如本领域已知的那样，为了测量药物治疗疾病或疾病模型的效力，或测量药物的药代动力学、药效动力学、毒性和其它特性，通常在动物体内对药物进行测试，这些动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、猪和猴子。动物可称为疾病模型。治疗剂通常在小鼠中测试，包括但不限于裸鼠、SCID小鼠、异种移植小鼠和转基因小鼠(包括敲入和敲除)。这种实验可以提供确定抗体作为治疗或预防剂潜力的有意义的数据，包括合适的半衰期、效应子功能、(交叉-)中和活性与/或主动或被动免疫疗法时的免疫反应。测试可采用任何有机体，优选哺乳动物。例如，由于与人类的遗传相似性，灵长类动物、猴子可以是合适的治疗模型，因此，可用于测试主题试剂或组合物的功效、毒性、药代动力学、药效动力学、半衰期或其它特性。作为药物要获得批准，最终需要在人体内进行测试，因此，当然需要设计这些实验。因此，本发明的抗体和相应的药物组合物可以在人体内测试，以确定它们的治疗效果或预防效果、毒性、免疫原性、药代动力学与/或其它临床特性。
本发明还提供本发明的主题抗体用于诊断目的，例如，在检测和定量确定生物液体样本中细菌负荷或作为免疫试剂的抗体或靶标的浓度的方法中使用。
本发明还提供检测生物样本中脓毒症或MDR大肠杆菌感染程度的方法，例如，样本如体液中MDR大肠杆菌的负荷，包括将该样本与本发明的抗体接触的步骤。本发明的抗体可以在任何已知的试验方法，如竞争结合试验、直接或间接夹心试验、免疫沉淀试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)中使用。
优选的诊断试验执行如下。将靶抗原特异性抗体固定在采用体液中存在或从体液中分离的细菌孵育的乳胶珠粒上。在细菌表面上表达的对应同源抗原存在的情况下，由于阳性反应时(可能是有色的)乳胶珠粒聚集，裸眼即可检测出来。
本发明使用的体液包括主体的生物样本，如组织提取物、尿、血、血清、大便和痰。
在一个实施例中，该方法包括在允许抗体附着到固体支持物表面的条件下，采用过量的与靶标特异性形成复合物的某种类型的抗体片段接触固体支持物。得到抗体附在其上面的固体支持物，然后，用生物液体样本接触固体支持物，从而生物液体中的靶标与抗体结合，形成靶标-抗体复合物。所述复合物可以采用可检测标记进行标记。或者，靶标或抗体可以在形成复合物之前进行标记。例如，可检测标记(标签)可以与抗体缀合。然后，可以检测和定量确定所述复合物，从而检测和定量确定生物液体样本中靶标的浓度。
针对特定应用，本发明的抗体与标记或报告分子缀合，标记或报告分子选自有机分子、酶标记、放射性标记、有色标记、荧光标记、发色标记、发光标记、半抗原、地高辛、生物素、金属络合物、金属、胶体金以及它们的混合物。与标记或报告分子缀合的抗体可用于，例如，试验***中或诊断方法中，例如，以诊断大肠杆菌感染或与其有关的疾病状况。
本发明的抗体可以与其它分子缀合，使得可以在，例如，结合试验(如ELISA)和结合研究中简单检测出所述缀合。
本发明的另一个方面提供一种包括抗体的试剂盒，除一种或多种抗体之外，所述试剂盒还可以包括各种诊断剂或治疗剂。试剂盒还可以包括诊断方法或治疗方法的说明书。这样的说明书可以，例如，提供在试剂盒中包含的器械(例如，工具或器械)上，用于制备诊断用生物样本，如在确定MDR大肠杆菌负荷以诊断疾病之前分离出含细胞与/或蛋白质的部分。有利地，这种试剂盒包括抗体和诊断剂或可在本发明所描述的一种或多种诊断方法中使用的试剂。在另一个优选的实施例中，试剂盒包括抗体，例如，冻干形式的抗体，任选包括说明书和重建冻干物的介质与/或与药学上可接受的载体组合，可在使用之前将它们混合，以形成近期给药的注射组合物。
命名为8D5-1G10和8D10-C8的抗体，特别是任何抗体轻链与/或重链，进一步通过保藏在DSMZ(德国微生物菌种保藏中心)-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen,Mascheroder Weg 1b/Inhoffenstraβe 7B,38124Braunschweig(DE)中的生物材料表征。
保藏物涉及经转化的大肠杆菌培养物，每种培养物包含***目标基因的克隆质粒。目标基因是小鼠单克隆抗体8D5-1G10(IgG3)的重链和轻链的可变域，及小鼠单克隆抗体8D10-C8(IgG2b)的重链和轻链的可变域。
DSM 26763是采用含8D5-1G10轻链(8D5-1G10-LC)可变域编码序列的质粒转化的大肠杆菌宿主细胞。大肠杆菌8D5-1G10-VL＝DSM 26763，保藏日期：2013年1月15日；保***：Arsanis Biosciences GmbH,Vienna,Austria(奥地利维也纳阿尔萨尼斯生物科学有限责任公司)。
DSM 26762是采用含8D5-1G10重链(8D5-1G10-HC)可变域编码序列的质粒转化的大肠杆菌宿主细胞。大肠杆菌8D5-1G10-VH＝DSM 26762，保藏日期：2013年1月15日；保***：Arsanis Biosciences GmbH,Vienna,Austria(奥地利维也纳阿尔萨尼斯生物科学有限责任公司)。
DSM 28171是采用含8D10-C8轻链(8D10-C8-LC)可变域编码序列的质粒转化的大肠杆菌宿主细胞。大肠杆菌8D10-C8-VL＝DSM 28171，保藏日期：2013年12月11日；保***：Arsanis Biosciences GmbH,Vienna,Austria(奥地利维也纳阿尔萨尼斯生物科学有限责任公司)。
DSM 28172是采用含8D10-C8重链(8D10-C8-HC)可变域编码序列的质粒转化的大肠杆菌宿主细胞。大肠杆菌8D10-C8-VH＝DSM 28172，保藏日期：2013年12月11日；保***：Arsanis Biosciences GmbH,Vienna,Austria(奥地利维也纳阿尔萨尼斯生物科学有限责任公司)。
下述定义的主题被视为是本发明的实施例：
1.一种与大肠杆菌菌株的O25b抗原特异性结合的分离抗体，包括至少一个抗体重链可变区(VH)，所述抗体重链可变区(VH)包括按照Kabat编号***命名的表1所列CDR1至CDR3序列中的任一个序列，或按照IMGT编号***命名的表2所列CDR1至CDR3序列中的任一个序列，或它们的功能活性CDR变体。
2.定义1所述的抗体，其是
A)
选自由组员i)至xiv)组成的组，其中
i)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 1组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 2组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 3组成的CDR3；
ii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 7组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 8组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 9组成的CDR3；
iii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 11组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 12组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 13组成的CDR3；
iv)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 17组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 18组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 19组成的CDR3；
v)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 23组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 24组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 25组成的CDR3；
vi)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 29组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 30组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 31组成的CDR3；
vii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 34组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 35组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 36组成的CDR3；
viii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 29组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 40组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 41组成的CDR3；
ix)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 44组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 45组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 46组成的CDR3；
x)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 50组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 51组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 52组成的CDR3；
xi)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 50组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 55组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 56组成的CDR3；
xii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 57组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 58组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 59组成的CDR3；
xiii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 61组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 62组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 63组成的CDR3；
xiv)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 66组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 67组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 68组成的CDR3；
或
B)一抗体，所述抗体是亲本抗体的功能活性变体，所述抗体包括亲本抗体CDR1、CDR2或CDR3中任一个的至少一个功能活性CDR变体，所述亲本抗体是A的任一组员。
3.定义1或2所述的抗体，包括
a)选自图2所示任一VH序列的VH氨基酸序列，优选是抗体重链(HC)氨基酸序列的VH序列，所述抗体重链(HC)氨基酸序列是SEQ ID 184至SEQ ID 231中的任一序列或SEQ ID312至SEQ ID 315中的任一序列；
b)抗体重链(HC)氨基酸序列，其是SEQ ID 184至SEQ ID 231中的任一序列或SEQID 312至SEQ ID 315中的任一序列；或
c)抗体重链(HC)氨基酸序列，其是SEQ ID 184至SEQ ID 231中的任一序列或SEQID 312至SEQ ID 315中的任一序列，而且进一步包括C-端氨基酸删除与/或Q1E点突变，如果VH序列的第一个氨基酸是Q的话。
4.定义1至3任一项所述的抗体，进一步包括抗体轻链可变区(VL)，所述抗体轻链可变区包括按照Kabat编号***命名的表1所列CDR4至CDR6序列中的任一个序列，或按照IMGT编号***命名的表2所列CDR4至CDR6序列中的任一个序列，或它们的功能活性CDR变体。
5.定义4所述的抗体，其是
A)
选自由组员i)至xiv)组成的组，其中
i)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 4组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 5组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 6组成的CDR6；
ii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 10组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 5组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 6组成的CDR6；
iii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 14组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 15组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 16组成的CDR6；
iv)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 20组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 21组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 22组成的CDR6；
v)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 26组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 27组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 28组成的CDR6；
vi)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 20组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 32组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 33组成的CDR6；
vii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 37组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 27组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 38组成的CDR6；
viii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 42组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 32组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 43组成的CDR6；
ix)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 47组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 48组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 49组成的CDR6；
x)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 53组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 32组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 54组成的CDR6；
xi)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 57组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 32组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 54组成的CDR6；
xii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 26组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 27组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 60组成的CDR6；
xiii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 64组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 65组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 38组成的CDR6；
xiv)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 69组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 70组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 71组成的CDR6；
或
B)一抗体，所述抗体是亲本抗体的功能活性变体，所述抗体包括亲本抗体CDR4、CDR5或CDR6中任一个的至少一个功能活性CDR变体，所述亲本抗体是A的任一组员。
6.定义4或5所述的抗体，包括选自图2所示任一VL序列的VL氨基酸序列，优选是抗体轻链(LC)氨基酸序列的VL序列，所述抗体轻链(LC)氨基酸序列是SEQ ID 248至SEQ ID295中的任一序列或SEQ ID 316至SEQ ID 319中的任一序列，或包括抗体轻链(LC)氨基酸序列SEQ ID 248至SEQ ID 295中的任一序列或SEQ ID 316至SEQ ID 319中的任一序列。
7.定义1所述的抗体，其与O25a抗原和O25b抗原共享的表位交叉特异性结合。
8.定义7所述的抗体，其是
A)
选自由组员i)至vii)组成的组，其中
i)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 72组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 73组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 74组成的CDR3；
ii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 77组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 78组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 79组成的CDR3；
iii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 81组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 82组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 83组成的CDR3；
iv)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 84组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 85组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 86组成的CDR3；
v)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 77组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 89组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 90组成的CDR3；
vi)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 92组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 93组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 94组成的CDR3；
vii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 95组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 96组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 97组成的CDR3；
或
B)一抗体，其是亲本抗体的功能活性变体，包括亲本抗体CDR1、CDR2或CDR3中任一个的至少一个功能活性CDR变体，所述亲本抗体是A的任一组员。
9.定义7或8所述的抗体，包括
a)选自图2所示任一VH序列的VH氨基酸序列，优选是抗体重链(HC)氨基酸序列的VH序列，所述抗体重链(HC)氨基酸序列是SEQ ID 232至SEQ ID 247中的任一序列或SEQ ID312至SEQ ID 315中的任一序列；
b)抗体重链(HC)氨基酸序列，其是SEQ ID 232至SEQ ID 247中的任一序列或SEQID 312至SEQ ID 315中的任一序列；或
c)抗体重链(HC)氨基酸序列，其是SEQ ID 232至SEQ ID 247中的任一序列或SEQID 312至SEQ ID 315中的任一序列，而且进一步包括C-端氨基酸删除与/或Q1E点突变，如果VH序列的第一个氨基酸是Q的话。
10.定义7至9任一项所述的抗体，其进一步包括抗体轻链可变区(VL)，所述抗体轻链可变区(VL)包括按照Kabat编号***命名的表1所列CDR4至CDR6序列中的任一个序列，或按照IMGT编号***命名的表2所列CDR4至CDR6序列中的任一个序列，或它们的功能活性CDR变体。
11.定义10所述的抗体，其是
A)
选自由组员i)至vi)组成的组，其中
i)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 75组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 32组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 76组成的CDR6；
ii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 75组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 32组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 80组成的CDR6；
iii)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 69组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 70组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 71组成的CDR6；
iv)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 42组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 87组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 88组成的CDR6；
v)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 37组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 27组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 91组成的CDR6；
vi)
是一抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 42组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 32组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 88组成的CDR6；
或
B)一抗体，其是亲本抗体的功能活性变体，包括亲本抗体CDR4、CDR5或CDR6中任一个的至少一个功能活性CDR变体，所述亲本抗体是A的任一组员。
12.定义10或11所述的抗体，包括选自图2所示任一VL序列的VL氨基酸序列，优选是抗体轻链(LC)氨基酸序列的VL序列，所述抗体轻链(LC)氨基酸序列是SEQ ID 296至SEQID 311中的任一序列或SEQ ID 316至SEQ ID 319中的任一序列，或包括抗体轻链(LC)氨基酸序列SEQ ID 296至SEQ ID 311中的任一序列或SEQ ID 316至SEQ ID 319中的任一序列。
13.定义1至12任一项所述的抗体，其包括
a)表1所列任何抗体的CDR1-CDR6序列；或
b)图2所示任何抗体的VH和VL序列；或
c)图2所列任何抗体的HC和LC序列；或
d)以a)-c)序列为特征的亲本抗体的功能活性变体，
优选其中
i.所述功能活性变体包括亲本抗体CDR1-CDR6中任一个的至少一个功能活性CDR变体；与/或
ii.所述功能活性变体在亲本抗体的VH和VL序列与/或HC和LC序列中的任何序列的框架区包含至少一个点突变，任选包括Q1E点突变，如果VH框架区(VH FR1)的第一个氨基酸是Q；
以及进一步，其中
iii.所述功能活性变体与亲本抗体具有结合相同表位的特异性；与/或
iv.所述功能活性变体是亲本抗体的人变体、人源化变体、嵌合变体或鼠源变体与/或亲和力成熟变体。
14.定义13所述的抗体，其是命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体的功能活性衍生物，在CDR1-CDR6中的任一个中包括至少一个点突变，优选其中所述抗体分别与命名为8D5-1G10和8D10-C8的抗体具有结合相同表位的特异性。
a)15.定义1至14任一项所述的抗体，包括表1所列任一CDR序列的功能活性CDR变体，其中所述功能活性CDR变体包括以下中的至少一种：亲本CDR序列中有1、2或3个点突变；与/或
b)亲本CDR序列的任何四个C-端或四个N-端或四个中心氨基酸位置有1或2个点突变；与/或
c)与亲本CDR序列具有至少60％序列一致性。
16.定义15所述的抗体，其中所述功能活性CDR变体在由4或5个以下氨基酸组成的任何CDR序列中包括1或2个点突变。
17.定义1至16任一项所述的抗体，其包括CDR序列和框架序列，其中CDR序列和框架序列中的至少一个序列包括人、人源化、嵌合、鼠源或亲和力成熟的序列，优选其中框架序列是IgG抗体的框架序列。
18.定义1至17任一项所述的抗体，其具有结合O25b抗原的亲和力，Kd小于10-6M，优选小于10-7M或小于10-8M。
19.定义1至18任一项所述的抗体，相对大肠杆菌的O25a抗原，所述抗体优先与O25b抗原结合，或与这种两种抗原结合的亲和力至少相等。
20.定义1至19任一项所述的抗体，所述抗体是全长单克隆抗体、其抗体片段或融合蛋白，所述抗体片段包括至少一个含所述抗原结合位点的抗体域，所述融合蛋白包括至少一个含所述抗原结合位点的抗体域。
21.定义1至19任一项所述的抗体，用于处理承受大肠杆菌感染风险或遭受大肠杆菌感染的主体，包括给予主体有效量的抗体，以限制主体的感染或使所述感染引起的疾病状况好转，优选用于治疗或预防肾盂肾炎、第二次菌血症、脓毒病、腹膜炎、脑膜炎和呼吸机相关性肺炎。
22.一种包含定义1至20任一项所述抗体的药物制剂，优选包含肠胃外或粘膜配方，任选包含药学上可接受的载体或赋形剂。
23.定义1至20任一项所述抗体，用于诊断用途，以确定大肠杆菌菌株在主体中引起的大肠杆菌感染或菌血症，如上下***，包括膀胱炎或尿道炎，上行性或血源性肾盂肾炎，特别是糖尿病患者的，以及菌血症、脓毒病、腹膜炎或肠道定植。
24.定义1至20任一项所述抗体的诊断制剂，在组合物或由各部分组成的试剂盒中包括所述抗体及其它诊断试剂，包含以下组分：
a)所述抗体；与
b)其它诊断试剂；
c)及任选固相，用于固定所述抗体和诊断试剂中的至少一个。
25.诊断大肠杆菌感染或主体中由大肠杆菌菌株引起的菌血症的方法，包括
a)提供定义1至20任一项所述的抗体，及
b)检测所述抗体是否与主体生物样本中的O25b抗原发生特异性免疫反应，优选通过凝集测试检测，从而诊断MDR大肠杆菌感染或菌血症。
26.编码定义1至20任一项所述抗体的分离核酸。
27.包含编码序列的表达盒或质粒，用于表达
a)定义1至20任一项所述抗体的VH与/或VL；或
b)或定义1至20任一项所述抗体的HC与/或LC。
28.包括定义27的表达盒或质粒的宿主细胞。
29.产生定义1至20任一项所述抗体的方法，其中在一定条件下培养或维持定义28所述的宿主细胞，以产生所述抗体。
参照下述实例将更充分地理解前述说明。但是，这些实例仅仅只是实施本发明一个或多个实施例的方法代表，不应视为限制本发明的范围。
实例
实例1：O25b-特异性抗体的产生
用编码卡那霉素抗性的盒代替kps簇(编码夹膜合成)，产生了代表性ST131-O25b:H4菌株81009(81009△kps::kan,[Szijarto et al,FEMS Microbiol Lett,2012])的无夹膜突变体。将亚致死剂量的这种突变体的活细胞或甲醛-灭活细胞以及亚致死剂量的亲本野生型菌株给小鼠以两周的间隔免疫4次。然后，对获自小鼠的血清样本进行分析，将抗O25b抗原的IgG滴度最高的小鼠脾脏(ELISA、免疫蛋白印迹法和表面染色)用于产生杂交瘤。在亚克隆之后，选择几个杂交瘤克隆，所述杂交瘤克隆分泌对纯化O25b抗原具有特异性且与表达O25b抗原的活的野生型大肠杆菌菌株表面结合的抗体。产生的小鼠抗体涵盖所有可能的鼠源同种型，即IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。采用RT-PCR，以及变性的重链和轻链引物，从杂交瘤克隆扩增O25b-特异性mAb的重链的可变域(VH)和轻链的可变域(VL)并测序。采用Ig数据库BLAST以及IMGT/V-QUEST对序列进行分析，根据Kabat命名法对CDR区进行定义(图1，表1)。
选择出的杂交瘤克隆被表达为嵌合mAb，(即小鼠可变区被融合到人IgG1恒定域及κ轻链)。此外，通过将高变(CDR)小鼠序列接枝到经计算机模拟预测的与原小鼠框架最相容的人框架序列中，产生人源化mAb。嵌合和人源化mAb由哺乳细胞表达，并通过蛋白A柱纯化，用于后续实例所示的试验中(参见下文)。
实例2：结合特性
采用纯化的LPS，通过免疫印迹分析，证实了嵌合mAb和人源化mAb的特异性(图3)。所有mAb都识别含O25b抗原的ST131菌株的LPS分子，但是，它们对O25a LPS抗原的交叉反应潜力不同。虽然有些mAb仅与O25b抗原反应，但是，其它mAb(源自4D5系-图4ii；中间面板)与O25a交叉反应。没有mAb与携带不相关O-抗原的LPS分子(例如O55)反应。采用生物层干涉法(BLI)，对抗体的结合特性开展了进一步的研究。(嵌合和人源化)O25b mAb与生物素化O25b多糖的结合按照以下方法开展：将生物素化抗原固定在链霉亲和素传感器(ForteBio,PallLife Sciences)上，并置于含1％BSA的PBS中10分钟，监测mAb(8-10ug/mL)和预加载传感器的缔合，然后，监测在同一缓冲溶液中的解离(5分钟)。采用Data Analysis 7软件(ForteBio,Pall Life Sciences)，确定Kd、kon和koff。在此设置中，调查的所有mAb显示出的强烈结合亲和力均在9.5-211nM之间(图4)。
采用流式细胞术测定mAb与细菌表面天然抗原的结合。所有抗体与确定是ST131-025b:H4菌株的几种不同临床分离物结合。在与表达O25a抗原的菌株结合方面，鉴定出两种mAb类型。一组mAb不与O25a菌株表面结合，而另一组mAb与表达相关O25a菌株的菌株交叉反应。但是，没有mAb可与表达不相关O-型抗原的任何大肠杆菌菌株结合(图5i)。流式细胞术测定(图5i)和免疫印迹法(图3)显示的交叉反应性结果之间存在良好的相关性。
为了更详细地研究表面结合，在LB(即普通实验室生长培养基)或灭活人血清(为了模拟类似体内的生长条件)中培养ST131菌株3O(Novais A.et al,Antimicrob AgentsChemother 2012 56(5):2763-6)，直到对数生长中期，在洗涤之后，采用稀释范围0.025-40ug/ml的纯化O25b-反应性mAb进行染色。洗涤后，施用浓度4ug/mL Alexa 488标记的抗-人IgG，采用流式细胞仪(BD Accuri C6Flow Cytometer)测定荧光强度。图5ii)A所示代表性实验证明，测试的所有mAb都能够与研究的菌株的表面以剂量依赖性形式结合。在血清(相对于LB)中培养细菌时，结合强度在某种程度上有所降低，但是，对于测试的所有mAb仍然非常显著(图5ii)B)。为了证明表面结合与ST131-O25b菌株的基因差异无关，对包含不同脉冲型的良好表征的ST131菌株组进行了研究(Peirano et al,Antimicrob.AgentsChemother.2014,58(7):3762)。图5ii)C总结的数据证明，除据报道实际上属于ST131:O16系的脉冲型“O”之外，研究的所有三种mAb均对所有代表性菌株的表面存在强烈染色。因此，流式细胞术实验可以证明整个ST131:O25b系广泛的结合范围，当细菌在人血清(即在类似体内条件下)中培养时，这种结合得到保持。
实例3：O25b特异性mAb的抗菌作用
在致命的鼠类菌血症模型中对选择出的O25b-特异性嵌合mAb和人源化mAb(对O25a具有或不具有交叉反应性)的潜在保护效果进行了测试。各组5只小鼠腹腔注射100ug在PBS中的纯化mAb。24小时后，小鼠用致死剂量(之前在预试验中确定的)的表达O25b抗原的大肠杆菌菌株ST131 81009([Szijarto et al,(FEMS Microbiol Lett 2012；332:131-6))进行静脉内攻击。24小时后，小鼠用致死剂量(之前预试验中确定为108CFU)的经证明表达O25b抗原的大肠杆菌菌株ST131 81009进行静脉内攻击(Szijarto et al.FEMSMicrobiol Lett 2012；332:131-6)。每天对小鼠的致死率进行监测。图6i)表明，在监测的感染后14天的期间，采用100ug具有不相关特异性的对照mAb免疫的小鼠100％出现感染，而测试的全部O25b特异性mAb的存活率呈统计学上(时序检验)的显著增加。
为了确证此体内数据，还对纯化mAb的杀菌作用进行了体外测试。在LuriaBertani(LB)肉汤或加热灭活的正常人血清中将细菌培养到对数生长中期。将2ml细菌培养基在PBS中洗涤2次。在用补充钙和镁的DPBS稀释的50％耗损(depleted)人血清池中开展血清杀菌试验(SBA)。反应混合物包含来自LB-或血清对数中期细菌悬浮液的～5×103CFU及分别包含2.5或10ug/ml mAb。采用不包含任何抗体及包含同种型匹配的不相关mAb的混合物作为对照。在37℃、410RPM振动条件下培养3小时(LB中培养细菌时)或5小时(血清中培养细菌时)后，通过平板接种合适的稀释物，对细菌进行计数(enumerate)。特异性mAb介导的杀灭以相对于接种物(初始CFU)的百分数(图7i)表示，或：
Figure BDA0001115880440000581
如图7i)所示，在3小时研究期内，测试的全部mAb都能够显著降低CFU。与此相反，与不相关mAb混合或无抗体的细菌在此培养基中圴呈现增长。若血清样本中补体被灭活(56℃培养30分钟)，任何mAb都未观察到细菌杀灭(数据未示出)。这些结果证明，O25b-特异性mAb(对O25a具有或不具有交叉反应性)可以触发补体介导的杀菌作用。
其它实验证明了这种活性(图7ii)。虽然同种型-匹配的不相关mAb不能引发杀菌活性，但是，在3小时的针对测试的两种ST131-O25b菌株的研究期间，所有抗-O25b mAb都能够显著降低CFU(图7iiA、B和D)。在血清样本中补体被加热失活时(在56℃培养30分钟，数据未示出)，任何mAb都未观察到细菌杀灭。这些结果证明，O25b-特异性mAb(对O25a具有或不具有交叉反应性)可以触发补体介导的杀菌作用。为了证明这种作用模式可能与观察到的体内保护有关(参见上文)，我们采用人血清中培养的细菌(与细菌培养基即LB对照)开展了同样的试验。在“类似体内”的条件下培养细菌的重要性在于，当在不同的条件下培养时，由于表面细菌组分的表达重整，细菌表面和从而抗原接近性可能非常不同。如图7iiC所示，即使在人血清中预处理(即培养)细菌，O25b-特异性人源化mAb也能够引导显著的细菌杀灭。但是，要实现最大的杀菌效果，需要采用较高的mAb剂量(10ug/ml)及更长的培养时间(5小时)。
实例4.O25b特异性mAb的内毒素中和潜力
由于LPS具有内毒素性潜力，我们认为，测定与LPS分子内O25b抗原结合的mAb的潜在中和能力是重要的。
虽然，从遗传上来说，小鼠比人类更能抵抗内毒素，但是，通过施用肝毒性糖类D-GaIN，可使小鼠对微量的纯化LPS变得敏感(Galanos C et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 76:5939-5943,1979)。在同时对每只小鼠腹腔(i.p.)注射20mg D-GaIN使其敏化和静脉注射(i.v.)致死剂量(1ng)的O25b LPS之前24小时，采用100或25ug的mAb对小鼠开展预防性免疫。图8表明，人源化mAb的代表性实验显示出对致死内毒素血症的显著和剂量依赖性保护。
为了对这种作用模式进一步进行阐明，在体外中和试验中对人源化O25b特异性mAb进行了研究。LPS通过负责体内引发脓毒性休克的toll样受体-4(TLR-4)/MD2受体复合物传导信号。为了对通过TLR-4复合物传导信号的LPS的中和进行评价，我们采用商业HEK-Blue***(InvivoGen)。该试验利用转化的HEK细胞表达人TLR-4复合物。通过该受体的信号传导诱发酶的分泌，通过生色底物对酶进行定量。图9A表明，在此试验中，纯化的O25b LPS具有剂量依赖性活性。中和mAb能够以剂量依赖性方式抑制标准浓度内毒素引发的信号(图9B)。IC50值(中和最高效果的50％时mAb的浓度)可用于对各种mAb的中和潜力进行对比。图9C总结了代表性人O25b-反应性mAb的中和效力。

Claims (18)

1.一种与大肠杆菌菌株的O25b抗原特异性结合的分离的抗体，包括至少抗体重链可变区VH和抗体轻链可变区VL，所述抗体重链可变区VH包括VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列，所述抗体轻链可变区VL包括VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列，
其中，所述抗体包括：
a) 如SEQ ID NO: 17所示的VH-CDR1；
b) 如SEQ ID NO: 18所示的VH-CDR2；
c) 如SEQ ID NO: 19所示的VH-CDR3；
d) 如SEQ ID NO: 20所示的VL-CDR1；
e) 如SEQ ID NO: 21所示的VL-CDR2；和
f) 如SEQ ID NO: 22所示的VL-CDR3。
2. 根据权利要求1所述的抗体，包括选自下组的成对的重链序列和轻链序列：
a) 如SEQ ID NO: 200所示的重链HC序列，和如SEQ ID NO: 264所示的轻链LC序列；或
b) 如SEQ ID NO: 201所示的HC序列，和如SEQ ID NO: 265所示的LC序列；或
c) 如SEQ ID NO: 202所示的HC序列，和如SEQ ID NO: 266所示的LC序列；或
d) 如SEQ ID NO: 203所示的HC序列，和如SEQ ID NO: 267所示的LC序列；或
e) 如SEQ ID NO:204所示的HC序列，和如SEQ ID NO: 268所示的LC序列；或
f) 如SEQ ID NO: 205所示的HC序列，和如SEQ ID NO: 269所示的LC序列；或
g) 如SEQ ID NO: 206所示的HC序列，和如SEQ ID NO: 270所示的LC序列；或
h) 如SEQ ID NO:207所示的HC序列，和如SEQ ID NO: 271所示的LC序列；或
i) 如SEQ ID NO: 208所示的HC序列，和如SEQ ID NO: 272所示的LC序列；或
j) 如SEQ ID NO: 209所示的HC序列，和如SEQ ID NO: 273所示的LC序列；或
k) 如SEQ ID NO: 210所示的HC序列，和如SEQ ID NO: 274所示的LC序列；或
l) 如SEQ ID NO: 211所示的HC序列，和如SEQ ID NO:275所示的LC序列；或
m) 如SEQ ID NO:212所示的HC序列，和如SEQ ID NO: 276所示的LC序列；或
n) 如SEQ ID NO:213所示的HC序列，和如SEQ ID NO: 277所示的LC序列；或
o) 如SEQ ID NO:214所示的HC序列，和如SEQ ID NO:278所示的LC序列；或
p) 如SEQ ID NO:215所示的HC序列，和如SEQ ID NO:279所示的LC序列；或
q) 如SEQ ID NO:314所示的HC序列，和如SEQ ID NO:318所示的LC序列；或
r) 如SEQ ID NO:315所示的HC序列，和如SEQ ID NO:319所示的LC序列。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
4.根据权利要求1或2所述的抗体，所述抗体是全长单克隆抗体，全长单克隆抗体的含抗原结合位点的抗体片段，或全长单克隆抗体的含抗原结合位点的融合蛋白。
5.根据权利要求1或2所述的抗体，所述抗体是全长单克隆抗体、其抗体片段或融合蛋白，其中所述抗体片段包括至少一个含抗原结合位点的抗体域，所述融合蛋白包括至少一个含抗原结合位点的抗体域。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体在制备用于处理承受大肠杆菌感染风险或遭受大肠杆菌感染的主体的药物中的应用，所述处理承受大肠杆菌感染风险或遭受大肠杆菌感染的主体包括给予主体有效量的抗体，以限制主体的感染或使所述感染引起的疾病状况好转，或用于治疗或预防肾盂肾炎、第二次菌血症、脓毒病、腹膜炎、脑膜炎和呼吸机相关性肺炎。
7.一种包含如权利要求1至5中任一项所述的抗体的药物制剂，所述药物制剂包括肠胃外或粘膜配方，含药学上可接受的载体或赋形剂。
8.如权利要求1至5中任一项所述的抗体在制造诊断制剂中的用途，所述诊断制剂用于诊断确定大肠杆菌菌株在主体中引起的大肠杆菌感染或菌血症。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述诊断制剂用于诊断确定上下***，包括膀胱炎或尿道炎，上行性或血源性肾盂肾炎，以及菌血症、脓毒病、腹膜炎或肠道定植。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述诊断制剂用于糖尿病患者。
11.一种如权利要求1至5中任一项所述的抗体的诊断制剂，包括在组合物或各部分组成的试剂盒中的所述抗体及其它诊断试剂，包含以下组分：
a) 所述抗体；与
b) 其它诊断试剂。
12.根据权利要求11所述的诊断制剂，进一步包括固相，以固定所述抗体和所述诊断试剂中的至少一个。
13.如权利要求1至5中任一项所述的抗体在制造诊断制剂中的用途，所述诊断制剂用于诊断大肠杆菌菌株在主体中引起的大肠杆菌感染或菌血症的方法，所述方法包括：
a) 提供权利要求1至5中任一项所述的抗体，及
b) 检测所述抗体是否与主体生物样本中的O25b抗原发生特异性免疫反应，从而诊断MDR大肠杆菌感染或菌血症。
14.根据权利要求13所述的用途，其中步骤b）中的所述检测通过凝集测试进行。
15.一种编码如权利要求1至5中任一项所述的抗体的分离的核酸。
16.一种包含编码序列的表达盒或质粒，以表达
a) 如权利要求1至5中任一项所述抗体的VH和VL；或
b) 如权利要求2至5中任一项所述抗体的HC和LC。
17.一种包括如权利要求16所述的表达盒或质粒的宿主细胞。
18.一种产生如权利要求1至5中任一项所述抗体的方法，其中将如权利要求17所述的宿主细胞在一定条件下培养或维持，以产生所述抗体。
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