CN106526154A - 一种红细胞剪切模量的测量方法及血液输氧能力测量方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种红细胞剪切模量的测量方法和血液输氧能力测量方法，涉及生物技术领域。红细胞剪切模量测量方法包括：将孵化溶液加入样品池，孵化溶液中含有红细胞和电介质微球，电介质微球包括粘附于红细胞相对两侧的第一电介质微球以及未与红细胞粘附的第二电介质微球。使用扫描光镊捕捉第二电介质微球，对扫描光镊的光阱刚度进行标定。使用扫描光镊捕获红细胞任意一侧的第一电介质微球，得到红细胞的相对伸长量与光阱力的关系曲线，将曲线斜率代入红细胞剪切模量的计算式得到红细胞的剪切模量。该测量方法简单、操作步骤少，极大缩短测量时间，测量效率高，测量结果准确度高。通过测量待测血液的红细胞剪切模量，得到血液的输氧能力大小。

Description

一种红细胞剪切模量的测量方法及血液输氧能力测量方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，且特别涉及一种红细胞剪切模量的测量方法和血液输氧能力测量方法。

背景技术

红细胞主要功能是为生物组织和器官输送氧气，同时研究表明红细胞具有免疫功能，红细胞在人体生理机能的正常运转中发挥着重要作用。在循环***中，红细胞需通过直径小于自身尺寸的毛细血管，因此变形能力对于红细胞具有重要意义，成为生物学、医学考察血液输氧能力的重要指标。现有的测量红细胞膜弹性的技术包括激光衍射法、粘度法以及微孔滤筛法，这些方法仅可用于表征群体细胞的弹性，可实现单个细胞操纵的微吸管法则因为操作难度大而不具有实用性。对于单细胞的弹性模量的测量一直无法实现。目前对于单个细胞膜弹性的测量一般采用光镊技术，但使用光镊测量红细胞膜弹性模量的操作过程较为繁琐。在样品的预处理上，对于手柄微球的修饰一直受到研究者们的青睐。

发明人研究发现，功能化试剂修饰手柄微球对测量的影响未知，而且微球修饰耗时较多、费用较高；在测量操作上，已有的光镊测量方法为测量单个红细胞的拉伸曲线，需要多次以不同的力拉伸红细胞，频繁地移动样品台；以上的缺点都严重影响了红细胞膜弹性模量的测量效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种红细胞剪切模量的测量方法，此测量方法测量过程操作简单、测量效率高且测量精度高。

本发明的另一目的在于提供一种血液输氧能力的测量方法，通过测量血液中红细胞的剪切模量，得到血液的输氧能力，应用价值大。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提出一种红细胞剪切模量的测量方法，其包括：

添加步骤：将孵化溶液加入样品池，孵化溶液中含有红细胞和电介质微球，电介质微球包括粘附于红细胞相对两侧的第一电介质微球以及未与红细胞粘附的第二电介质微球；

光阱刚度标定步骤：使用扫描光镊捕捉第二电介质微球，对扫描光镊的光阱刚度进行标定；

拉伸步骤：使用扫描光镊捕获红细胞任意一侧的第一电介质微球，拟合得到红细胞的相对伸长量与光阱力的关系曲线，关系曲线的斜率为k，其中，相对伸长量为红细胞被拉伸后的伸长长度与红细胞的直径的比值，关系曲线的斜率k为相对伸长量与光阱力的比值；

计算步骤：计算红细胞的剪切模量，计算公式如下：

其中，H为红细胞的剪切模量，k为关系曲线的斜率，d为红细胞的直径，B为扭曲剪切模量，B＝2×10^-19Nm。

本发明提出一种血液输氧能力测量方法，其包括利用上述红细胞剪切模量的测量方法测量待测血液的红细胞剪切模量。

本发明的有益效果是：

使用扫描光镊技术，对红细胞进行连续拉伸操作，不需要多次对红细胞进行拉伸操作，频繁移动操作台，可以简化操作步骤，极大地缩短实验操作的时间。标定扫描光镊的光阱刚度，再通过对红细胞的连续拉伸得到红细胞的相对伸长量与光阱力的关系曲线，根据关系曲线的斜率k值即可计算得到红细胞的剪切模量。该红细胞剪切模量的测量方法测量过程简单、易于操作，测量的效率高，且测量结果的精度高。

同时，利用上述测量方法可简单、快速测量出待测血液红细胞的剪切模量，与健康血液的红细胞剪切模量进行比对分析，剪切模量越大，待测血液红细胞的变形能力越小，红细胞通过毛细血管进行输氧的能力越低。通过待测血液红细胞的剪切模量即可得到待测血液输氧能力的大小。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例的AOD扫描光镊***的示意图；

图2为本发明实施例的测量方法的示意图，其中图2(a)为红细胞拉伸前的示意图；图2(b)为红细胞拉伸后的示意图；

图3为本发明实施例的光阱刚度标定过程图；

图4为本发明实施例的红细胞相对伸长量和光阱力的关系曲线。

图标：11-激光源；12-声光偏转器；13-透镜；14-分色镜；15-倒置显微镜；16-CMOS摄像器；17-光阱移动；18-样品；19-照明光；1-二氧化硅微球；2-红细胞；3-光镊；4-样品池底部。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的红细胞剪切模量的测量方法进行具体说明。

本发明实施例提供的一种红细胞剪切模量的测量方法。

实验前，使用真空采血管采集健康捐赠者的血液和电介质微球作为实验样品，电介质微球优选为直径2～4μm的二氧化硅微球。

进一步地，选用直径为4μm的二氧化硅微球，实验结果表明，该直径下的二氧化硅微球，其粒径的均一性较高，与红细胞的粘附几率更大。且当采用热运动分析方法标定光阱刚度时，用光镊捕获该粒径的二氧化硅微球，二氧化硅微球偏离光阱中心的位移较小，光阱力和位移值的线性关系良好，标定得到的光阱刚度精度高。

使用二氧化硅微球作为手柄微球，二氧化硅微球能够以非特异性结合力粘附到红细胞上，不需要使用修饰剂进行修饰，避免因为修饰剂对试验结果产生影响。同时简化操作步骤，节约操作费用。

样品清洗：

分别对二氧化硅微球、红细胞进行清洗。具体为：二氧化硅微球溶液和血液样品分别使用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，二氧化硅微球采用超声清洗10～20min，6000～8000rpm离心10～15min收集，重复2～3次；红细胞采用搅动分散、2000～3000rpm离心10～15min收集，重复2～3次。

孵化步骤：

将清洗过的二氧化硅微球、红细胞重新分散在PBS中，调整红细胞的浓度为1×10⁵～2×10⁵个/μl，且调整二氧化硅微球和红细胞的质量浓度比为2～4:1，将二者等比例混合均匀。在1～5℃环境静置孵化30～60min得到孵化溶液。此时，孵化溶液中含有相对两侧均粘附有二氧化硅微球的红细胞和未与红细胞粘附的二氧化硅微球。红细胞相对两侧粘附的二氧化硅微球即为第一电介质微球，未与红细胞粘附的二氧化硅微球即为第二电介质微球。进一步地，二氧化硅微球和红细胞的质量浓度比为2:1，该质量浓度比下，红细胞两侧对称粘附两个二氧化硅微球的概率增大，保证较优的实验条件，满足测量需求。

在本发明较佳的实施例中，孵化温度优选为4℃，孵化时间优选为40min。4℃环境下，保证红细胞的形态不发生改变，同时该孵化时间下，保证二氧化硅微球和红细胞的充分粘附。

样品池处理步骤：

在样品池底部形成干血清蛋白层，优选为：盖玻片和载玻片使用1～2％的牛血清蛋白溶液浸泡15～30min晾干，形成底部涂覆有少量牛血清蛋白的样品池。在样品池底部形成干血清蛋白层，能够减少二氧化硅微球与样品池底部的非特异性粘附力，利于控制红细胞上的二氧化硅微球的两种粘附到样品池底部的状态，减少测量的影响因素，保证测量的准确性。

在本发明较佳的实施例中，在无尘的环境中晾干样品池，避免杂质污染样品池。样品池晾干后，使用50～100μm厚塑料片垫在盖玻片和载玻片之间形成样品室。

添加步骤：

稀释孵化溶液至红细胞的浓度为1×10³～2×10³个/μl，然后滴加入样品室后密封样品池。优选地，采用加拿大树胶对样品池进行封闭，减少气流对测量的影响，保证测量的准确性和精密度。

光阱刚度标定步骤：使用不同光功率下的扫描光镊捕捉未粘附在红细胞上的二氧化硅微球，对扫描光镊的光阱刚度进行标定。

光镊在对微小粒子进行捕获时，微小粒子受到一个指向光阱中心的力的作用，这一捕获力即为光阱力。光阱力与微小粒子偏离光阱中心的位移成正比，即

F＝-k_x·Δx， (1)

式中，F为光阱力，k_x为光阱刚度，Δx为微小粒子偏离光阱中心的位移。

因此，光阱刚度的标定是测量光阱力的基础。光阱刚度的标定方法包括功率谱分析法、流体力学方法、热运动分析法、外加周期力法等。在本发明较佳的实施例中，采用热运动分析法标定扫描光镊对二氧化硅微球的光阱刚度。

热运动分析法的标定原理为：用光阱捕获一个微小粒子时，从显微镜中可明显观察到，此微小粒子做受限的布朗运动。微小粒子的运动范围基本上都在光阱的简谐范围内，且目标微粒在光阱中的布朗运动满足Boltzmann(玻尔兹曼)分布。样品池中的温度不是很高，光阱的轴向深度不是很浅的时候，光阱中微小粒子布朗运动不会跃出光阱的简谐范围，光阱中心附近的势场为简谐势场E(x)，E(x)的计算公式如下：

假设光阱捕获住的微小粒子的偏离光阱中心的偏离量为x，此时微小粒子的势能为E(x)，根据微小粒子在光阱中的位置分布满足Boltzmann分布，则此处微小粒子处在该处的几率p(x)如下：

式中，p(x)为微小粒子的概率，k_B为玻尔兹曼常数，a是归一化常数，T是开氏温度。

通过实验大量测量光阱中二氧化硅小球的位置，统计二氧化硅微球的位置分布机率，利用公式(3)得到E(x)值，既而得到扫描光镊的光阱刚度。采用不同光功率的扫描光镊对二氧化硅微粒进行捕获，得到光功率和光阱刚度的关系曲线。结果表明，光功率和光阱刚度的线性关系良好，与理论结果相一致，因此该标定方法简单可行，测量结果准确。

拉伸步骤：

使用扫描光镊捕获红细胞任意一侧的二氧化硅微球，连续拉伸红细胞，拟合得到红细胞的相对伸长量与光阱力的关系曲线，该关系曲线的斜率为k。其中，红细胞的相对伸长量为红细胞被拉伸后的伸长长度与红细胞的直径的比值，关系曲线的斜率k为相对伸长量与光阱力的比值。

计算步骤：

计算红细胞的剪切模量，计算公式如下：

其中，H为红细胞的剪切模量，k为红细胞的相对伸长量与光阱力的关系曲线的斜率，d为红细胞的直径，B为扭曲剪切模量，B＝2×10^-19Nm。

在本发明较佳的实施例中，采用声光偏转器扫描光镊，即AOD扫描光镊进行光阱刚度的标记和红细胞的拉伸。扫描光镊的核心部件是光束偏转器，通常使用扫描振镜、声光偏转器(AOD)、电光偏转器等器件。

本发明实施例采用AOD扫描光镊，AOD扫描光镊***如图1所示。激光源11发射的激光束通过声光偏转器2调制光的传播路径，经过透镜13、二色镜14，在倒置显微镜15的像平面上快速扫描，通过计算机20控制光阱移动17，使激光束在几个固定点之间快速切换。其在样品池18内中形成阵列光镊，可以捕获微粒或是进行动态操作，通过控制光镊的扫描速度，可以使被捕获的粒子沿光束的扫描轨迹运动。相比于单光镊和双光镊的操作，使用AOD扫描光镊可以极大地简化操作步骤，对提高操作的效率和操作的精准度。

如图2所示为红细胞的拉伸过程，在孵化后，两个二氧化硅微球1粘附在红细胞2沿直径方向的两侧，其中红细胞2一侧的二氧化硅微球1非特异性地粘附在样品池底部4，采用AOD扫描光镊3捕获另一侧的二氧化硅微球1，将其从样品池的底部拉离，连续拉伸红细胞2。优选地，沿两个二氧化硅微球1连线的方向连续拉伸红细胞2。进一步优选地，计算机操作红细胞2的拉伸速率小于或等于0.02μm/s，在此拉伸速率下，二氧化硅微球1与样品池的粘附力可忽略不计，此时，红细胞2受到的拉力大小与光阱力相等，使得测量的结果更为精确。

每个红细胞2的连续拉伸过程都被摄像器记录和保存下来。拉伸过程中，光阱力，即施加到红细胞2上的拉力不断增大，通过二氧化硅微球1中心和光阱中心的位移值Δx，结合标定得到的光阱刚度，可以得到拉伸过程的实时光阱力。

通过图像分析软件分析拉伸视频，得到红细胞2的相对伸长量与光阱力的关系曲线，对该关系曲线进行拟合，得到关系曲线的斜率k，代入公式(4)中，计算得到红细胞2的剪切模量。

在本发明较佳的实施例中，使用CMOS镜头记录红细胞2的拉伸过程。CMOS全称为Complementary Metal-Oxide-Semicondoctor，中文学名为互补金属氧化物半导体，用其制成的CMOS镜头能够快速处理不断变化的影像，其灵敏度更高，能够实现对纳米粒子图像的更精确测定，是测量结果更为精准可靠。

本发明实施例还提供一种血液输氧能力测量方法，其包括利用上述红细胞剪切模量的测量方法测量得到待测血液的红细胞剪切模量。测量得到的红细胞剪切模量越大，红细胞的变形能力越小，血液的输氧能力越差。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例

本实施例提供的一种红细胞剪切模量的测量方法。

S1：样品池的处理

盖玻片和载波片使用1％的牛血清蛋白溶液浸泡20min晾干，使用100μm厚塑料片垫在盖玻片和载玻片之间形成样品室。

S2：样品清洗

实验用二氧化硅微球溶液原浓度为2.5％w/v，使用真空采血管采集健康捐赠者的血液作为测量样品，分别取100μl二氧化硅微球和10μl血样进行清洗。二氧化硅微球溶液和血液样品分别使用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，二氧化硅微球采用超声清洗15min，7000rpm离心10min收集，重复3次；红细胞采用搅动分散、2500rpm离心10min收集，重复2次。

S3：孵化

将清洗过的二氧化硅微球重新分散在0.1ml PBS中、红细胞重新分散在2.5ml PBS中，配得质量浓度比为2:1的溶液，等比例混合均匀，在4℃环境静置40min得到孵化溶液。

S4：添加样品

将孵化溶液稀释100倍滴加入样品室后密封样品池。

S5：标定光阱刚度

使用光镊捕获未粘附于红细胞的二氧化硅微球，此时二氧化硅小球仅受光阱力而无任何外力。采用热运动分析法标定不同光功率下的光镊光阱刚度。

如图3所示为光阱刚度的标定过程。采用激光功率P为200mW的光镊捕获悬浮的二氧化硅微球，受捕获的二氧化硅微球在光阱中的运动轨迹如图3(a)所示，二氧化硅微球的位置分布概率如图3(b)所示，拟合得到光阱势能，如图3(c)所示，即可得到光阱刚度。热运动分析法标定不同光功率下的光镊光阱刚度，结果如图3(d)所示，结果表明，光镊光阱刚度和激光功率成良好的线性关系。该结果与理论计算结果相一致，表明上述标定方法准确可行。通过线性拟合可以得到不同光功率下的光镊光阱刚度。

S5：拉伸红细胞

使用光镊捕获粘附到红细胞上的两个二氧化硅微球之一，如图2所示，用较大的力把二氧化硅微球拉离样品池底部，沿着两个二氧化硅微球的连线方向连续拉伸红细胞，并用CMOS镜头记录拉伸过程；使用图像分析软件分析实验视频。得到光阱力和红细胞的相对伸长量之间的关系曲线；通过对关系曲线的线性拟合可以得到曲线斜率k，利用斜率k带入计算公式(4)可得出红细胞膜的剪切剪切模量。

如图4所示，选取直径为7.70μm、6.87μm、7.07μm、7.25μm和7.18μm的红细胞作为重复测量对象，分别用光镊对上述红细胞进行连续拉伸，得到五条红细胞相对伸长量和光阱力关系曲线。对上述关系曲线进行拟合，得到图4中的关系曲线斜率k分别为0.0448、0.0433、0.03、0.036和0.031。

将斜率k代入公式(4)计算得到红细胞剪切模量分别为7.61μN/m、8.48μN/m、14.48μN/m、10.86μN/m和13.43μN/m。因此，通过重复测量多个红细胞，得到它们的平均剪切模量为H＝10.95±2.67μN/m。该方法测得的红细胞剪切模量与其他文献公布的同类细胞的测量结果基本一致。

综上所述，本发明实施例提供的红细胞剪切模量的测量方法，可以实现红细胞受力面积均一化，减少修饰试剂对测量结果的影响。使用扫描光镊技术对红细胞进行连续拉伸，不需要频繁移动样品台。采用热运动分析法分析光阱刚度并计出红细胞拉伸过程中施加于细胞上的拉力，操作步骤少，操作方法简单，可操作性强，能够极大地缩短红细胞剪切模量的测量时间。同时，该测量方法的费用低、效率高、测量结果的精度高，具有良好的应用前景。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种红细胞剪切模量的测量方法，其特征在于，其包括：

添加步骤：将孵化溶液加入样品池，所述孵化溶液中含有红细胞和电介质微球，所述电介质微球包括粘附于所述红细胞相对两侧的第一电介质微球以及未与所述红细胞粘附的第二电介质微球；

光阱刚度标定步骤：使用扫描光镊捕捉所述第二电介质微球，对所述扫描光镊的光阱刚度进行标定；

拉伸步骤：使用所述扫描光镊捕获所述红细胞任意一侧的所述第一电介质微球，连续拉伸所述红细胞，拟合得到所述红细胞的相对伸长量与光阱力的关系曲线，所述关系曲线的斜率为k，其中，所述相对伸长量为所述红细胞被拉伸后的伸长长度与所述红细胞的直径的比值，所述关系曲线的斜率k为所述相对伸长量与所述光阱力的比值；

计算步骤：计算所述红细胞的剪切模量，计算公式如下：

$H=\sqrt{\frac{1}{125k^3\·d\·B}}$

其中，H为所述红细胞的剪切模量，k为所述关系曲线的斜率，d为所述红细胞的直径，B为扭曲剪切模量，B＝2×10^-19Nm。

2.根据权利要求1所述的测量方法，其特征在于，所述扫描光镊为声光偏转器扫描光镊。

3.根据权利要求1所述的测量方法，其特征在于，所述光阱刚度标定步骤中，所述光阱刚度的标定方法为热运动分析法。

4.根据权利要求1所述的测量方法，其特征在于，所述拉伸步骤中，所述相对伸长量通过图像分析法测得，使用摄像器记录所述红细胞的拉伸过程，通过图像分析软件得到所述关系曲线。

5.根据权利要求1所述的测量方法，其特征在于，所述拉伸步骤中，沿所述红细胞相对两侧的两个所述第一电介质微球连线的方向拉伸所述红细胞。

6.根据权利要求1所述的测量方法，其特征在于，所述拉伸步骤中，所述红细胞的拉伸速率小于或等于0.02μm/s。

7.根据权利要求1所述的测量方法，其特征在于，所述电介质微球为直径为3～5μm的二氧化硅微球。

8.根据权利要求7所述的测量方法，其特征在于，将清洗过的所述二氧化硅微球和所述红细胞配制得到质量浓度比为2:1的混合溶液，孵化所述混合溶液得到所述孵化溶液。

9.根据权利要求1所述的测量方法，其特征在于，所述样品池的底部具有干血清蛋白层。

10.一种血液输氧能力测量方法，其特征在于，其包括利用如权利要求1～9任意一项所述的红细胞剪切模量的测量方法测量得到待测血液的红细胞剪切模量。