CN106525792B - 一种光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品的荧光控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品的荧光控制方法,用激活光激活样品表层的光控荧光蛋白,用激发光激发所述表层的光控荧光蛋白进而发出荧光。通过选择合适的激活光和激发光的波长范围,同时控制合适的激活方向和样品上表面的夹角,实现光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品表层荧光的精确控制,激活方便,激活表层厚度薄;本发明的荧光控制方法激活时只激活生物组织包埋样品表层的荧光,应用于生物组织包埋样品的荧光层析成像时,激发光激发被激活表层而进行荧光成像,样品被激活表层的厚度即为荧光成像的轴向分辨率,轴向分辨率高。
Description
技术领域
本发明属于荧光显微成像领域,具体地,涉及一种光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品的荧光控制方法。
背景技术
某些荧光蛋白的光物理性质能够被光精确控制,这类荧光蛋白叫光控荧光蛋白。它至少包括如下两类,光激活荧光蛋白和光转换荧光蛋白。光激活荧光蛋白在初始状态时不发荧光,经过特定波长激活光激活后,能够被激发出荧光,比如PAGFP。光转换荧光蛋白在初始状态时就可以发荧光,但是经过激活光激活后,可以被激发出另外一种颜色的荧光,比如mEos3.1、mEos3.2等。光控荧光蛋白标记的生物组织和普通荧光蛋白标记的生物组织,成像方法类似,常用普通的宽场成像方法或者用共聚焦、双光子点扫描成像。对于大的生物组织,常常需要包埋剂包埋后进行断层成像。由于缺乏合适的荧光控制方法,导致现有技术采用光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品在成像时有一个巨大的缺陷:快速的宽场成像方法层析能力差,无法实现高分辨;而高分辨的点扫描成像方法,如共聚焦或双光子成像,对于体积大的生物组织包埋样品则成像太慢。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求,本发明提供了一种光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品的荧光控制方法,其目的在于通过对光敏感的光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品使用特定波长的激活光激活样品表层光控荧光蛋白,再通过相应波长的激发光激发样品表层的荧光蛋白,实现光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品的表层荧光的控制,且通过优化荧光控制条件来使其表层激活厚度更薄,并将之应用于荧光层析成像,表层被激活的厚度即为层析成像时的轴向分辨率,由此解决现有技术的荧光蛋白标记生物组织由于缺乏有效的荧光控制方法而在快速宽场荧光成像时由于层析能力差、轴向分辨率低,而高分辨的点扫描成像方法对于体积大的生物组织包埋样品成像太慢的技术问题。
为实现上述目的,按照本发明的一个方面,提供了一种光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品的荧光控制方法,用激活光激活样品表层的光控荧光蛋白,用激发光激发所述表层的光控荧光蛋白进而发出荧光。
优选地,所述光控荧光蛋白为光激活荧光蛋白或光转换荧光蛋白。
优选地,所述表层的厚度为0.5~5微米。
优选地,所述激活光为与所述光控荧光蛋白匹配的特定波长的激活光。
优选地,所述激发光为与所述光控荧光蛋白匹配的特定波长的激发光。
优选地,所述激活光的方向和样品上表面的夹角为0~90°。
优选地,所述激活光的方向和样品上表面的夹角为15°~30°。
优选地,所述生物组织包埋样品的包埋剂优选为树脂。
优选地,所述树脂为丙烯酸树脂。
优选地,所述包埋剂中添加有吸收光的物质。
优选地,所述吸收光的物质为苏丹黑。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,能够取得下列有益效果。
(1)本发明提供的光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品的荧光控制方法,通过选择合适的激活光和激发光的波长范围,同时控制合适的激活方向和样品上表面的夹角,实现光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品表层荧光的精准控制,激活方便,控制效果好;
(2)本发明的荧光控制方法激活时只激活生物组织包埋样品表层的荧光,应用于生物组织包埋样品的荧光层析成像时,激发光激发被激活表层而进行荧光成像,样品被激活表层的厚度即为荧光成像的轴向分辨率,通过优化荧光控制条件,包括优选激活光的波长、控制激活光与样品的夹角以及采用包埋剂中添加吸收光的物质来控制被激活表层的厚度,厚度可以低至1~2微米甚至更低,有望实现高分辨层析成像;
(3)在用激活光激活光控荧光蛋白时,只激活包埋样品的表层,而表层以下没有被激活光激活,因此表层以下组织即使吸收了后续的激发光也无法发出荧光,从而避免了后续宽场成像时组织表层以下非焦面荧光的干扰;
(4)本发明的荧光控制方法应用于生物组织包埋样品的荧光成像时,由于不存在焦面以下荧光的干扰,因此可以用于高通量面成像,即快速宽场成像,另外由于表层激活厚度即轴向分辨率可以达到1~2微米,甚至更薄,因此本发明的荧光控制方法应用于荧光层析成像时,同时具备了宽场成像的高速度以及与点扫描成像近似的高分辨,实现了大体积生物组织包埋样本的快速高分辨成像。
附图说明
图1是光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品荧光控制并成像的示意图,其中①表示激活光,②表示激发光,③表示样品,④表示激发和成像物镜,⑤表示已激活样品表层;
图2是实施例1所用光控荧光蛋白激活激发前后荧光强度对比图;图2(A)为实施例1激活前激发的荧光强度;图2(B)为实施例1激活后激发的荧光强度,其中激活光波长为405nm;
图3是实施例2所用光控荧光蛋白激活激发前后荧光强度对比图;图3(A)为实施例2激活前激发的荧光强度;图3(B)为实施例2激活后激发的荧光强度。
在所有附图中,相同的附图标记用来表示相同的元件或结构,其中图2的比例尺代表20微米。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的光控荧光蛋白标记生物组织的荧光控制方法,并应用于生物组织包埋样品的层析成像时,包括以下步骤:
一、样本包埋
将光控荧光蛋白标记的生物组织用包埋剂包埋,包埋的具体过程参照包埋剂商品说明书或者公开文献资料的一般步骤。
所述生物组织包埋样品的包埋剂优选为树脂,所述树脂优选为丙烯酸树脂,包括HM20(lowicryls丙烯酸盐类树脂)、HM23(lowicryls丙烯酸盐类树脂)、T9100、伦敦白胶(LRwhite)等。
二、不同方向激活激发
图1是光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品荧光控制并成像的示意图,其中①表示激活光,②表示激发光,③表示样品,④表示激发和成像物镜,⑤表示已激活样品表层。
将所述生物组织包埋样品在非成像光路上用激活光激活样品表层的光控荧光蛋白的荧光,然后在成像光路上用对应波长的激发光激发该荧光蛋白的荧光并成像。所述成像光路指接收发射光谱(即荧光信号)的光路,所述非成像光路指成像光路之外的其他光路。
所述“激活”是指,光控荧光蛋白在特定波长激发光的激发下,几乎不发某个波段的荧光,只有经过另外某个波长的“激活光”激活后,开启了荧光蛋白,使之接受特定波长“激发光”激发从而发出荧光。而“激发”是指荧光蛋白吸收某个波长的光发出荧光的过程。
标记生物组织的光控荧光蛋白包括光激活荧光蛋白(Photoactivatable FPs,PAFPs)中的一种或多种,如PAGFP、PAmCherry1等;或者光转换荧光蛋白(photoswitchableFPs,rsFPs)中的一种或多种,如Dendra2、mEos3.1等。
所述激活光为与所述光控荧光蛋白匹配的特定波长的激活光。
所述激发光为与所述光控荧光蛋白匹配的特定波长的激发光。
所述的激活光的方向和所述样品上表面的夹角为0~90°,优选为15~30°。
通过调节激活光与样品上表面(即成像层或已激活样品表层)的夹角,可以控制合适的激活厚度。激活光与样品上表面的夹角可以在0度到90度范围内,15°~30°有利于激活更薄厚度的表层。当激活光与样品上表面的夹角为0°时,激活光平行于样品上表层,此时需要对样品进行透明化处理,采用类似光片照明的方法从侧面激活样品表层。当激活光与样品上表面的夹角为90°时,激活光垂直照射样品上表面,激活厚度相比于夹角15°~30°时的激活深度度更深一些。
本发明的荧光控制方法通过选择与所述光控荧光蛋白向匹配的激活光与激发光的波长,并且通过控制合适的激活光的方向,即激活光与样品上表面的方向,使得在用特定波长的激活光激活光控荧光蛋白时,只有样品表层的荧光蛋白被激活。
激活光只能激活样品的表层,原因有二:一是激活光相对于激发光来说,一般波长更短,其穿透组织的能力差一些,因此激活光只能穿透激活更表层的荧光蛋白;二是激活光的激活可以控制激活光与被激活样品的角度,角度越小,表面反射越强,这样深层的激活光不仅进入的少了,而且进入的能量密度低了。
另外,也可以通过在样品的包埋剂中添加吸收光的物质,这样当激活光激活样品时,即使激活光穿透组织进入深层组织,吸收光的物质会将其吸收而得不到激活,吸收光的物质优选为苏丹黑。在包埋剂中添加苏丹黑,苏丹黑在包埋剂中的质量百分数优选为0.05%~0.5%,优选为0.3%。
每一种光控荧光蛋白有与其相匹配的最优激活波长,选择波长较短的激活光时,需要选择最优激活波长附近的较短波长的激活光,这样同时能够实现高效率和最佳厚度的样品表层激活。
对于光控荧光蛋白PAGFP和mEos3.1,其激活波长都在近紫外区,最优波长都在405nm。当采用这两种荧光蛋白标记生物组织并采用本发明的荧光控制方法激活样品表层时,优选波长都为405nm的激活光。
本发明选择在样品的非成像光路上,用激活光激活样品表层的光控荧光蛋白,然后在成像光路上用对应波长的激发光激发该荧光蛋白并成像,这样来实现样品的表层成像。
对于光激活荧光蛋白,其本身并不发荧光,可以通过控制激活光波长、激活光和样品夹角以及树脂中添加苏丹黑B等吸收光的物质来控制只有表层被激活,因此激发光激发时表层以下也不会发出荧光,这样表层荧光成像时表层以下不存在背景荧光,即焦面以下荧光干扰的问题。
对于光转换荧光蛋白,其本身发出特定波长的荧光,比如mEos3.1发绿色荧光,通过光转换使之显红色,可以通过控制激活光波长、激活光和样品夹角以及树脂中添加苏丹黑B等吸收光的物质,使这种光转换只发生在样品表层,使表层发出红色荧光。当对表层红色的荧光进行成像时,由于表层以下仍显绿色,对于接收红色波段信号来说就不存在背景的绿色荧光干扰的问题。
三、层析成像
将本发明的荧光控制方法应用于层析成像技术时,由于本发明的荧光控制方法可以精确控制样品表层被激活的厚度,被激活的表层经激发光的激发进行表层荧光成像,表层荧光图像得到以后,可以通过切削掉成像过的样品表层,再用激活光激活新的表层,然后再用激发光激发已激活的新的表层荧光并采集发射的荧光信号进行成像,之后再重复“切削”、“激活光激活”、“激发成像”的过程,如此反复断层成像直至获取整个样品的所有二维图像。所获取的二维图像可以通过自动配准等方法叠加从而获取光控荧光蛋白标记生物组织的完整三维图像。
本发明的荧光控制方法激活时只有样品的表层被激活,表层被激活的厚度即为荧光层析成像的轴向分辨率,可以通过控制激活光波长、激活光和样品上表面的夹角以及包埋树脂中添加苏丹黑B等吸收光的物质来实现尽可能薄的表层厚度。本发明的荧光控制方法得到被激活表层的厚度可以低至1~2微米甚至更低,因此本发明的光控荧光蛋白标记的生物组织包埋样品的荧光控制方法应用于样品的层析成像时,可以获得微米级甚至更低的轴向分辨率,另外由于不存在背景干扰的问题,可以采用宽场成像的模式实现高通量的成像,对于大体积的生物样品这种高通量的优势更加凸显,因此解决了现有光学成像技术分辨率低、对于体积大的生物组织树脂包埋样品成像太慢的技术问题。
以下为实施例:
实施例1
mEos3.1是一种常见的光转换荧光蛋白。其光学特性是,未在紫外405nm波长激活之前,只发绿色荧光(激发波长488nm),不发红色荧光;经过紫外405nm波长短时间激活后,在561nm激发光下,发红色荧光(发射光谱在550nm以上)。
大脑皮层注射有Rv-dg-mEos3.1的小鼠全脑的包埋及光片荧光控制方法及荧光层析成像,包括以下步骤:
(1)样本固定
将Rv-dg-mEos3.1感染的小鼠全脑用化学固定手段固定,得到固定的mEos3.1标记的生物组织。具体步骤如下:
在4摄氏度下,将心脏灌流后,解剖出的小鼠全脑经质量分数为4%的PFA溶液浸泡约12小时,PFA溶液用量为20ml每只,然后用PBS溶液漂洗三次,每只每次使用PBS溶液40ml,每次漂洗四小时。
(2)样本脱水
将固定的mEos3.1标记的小鼠全脑用乙醇置换,使得所述生物组织脱水,得到脱水后的mEos3.1标记的小鼠全脑。具体步骤为:
在4摄氏度下,将固定的mEos3.1标记的小鼠全脑依次通过梯度乙醇双蒸水溶液20ml,浸泡2小时,进行脱水。乙醇双蒸水溶液浓度梯度为乙醇按照体积百分比为50%,75%,95%,100%,100%。
(3)包埋剂渗透处理
将脱水后的mEos3.1标记的小鼠全脑进行HM20包埋剂渗透处理,获得HM20包埋剂工作液填充的mEos3.1标记的小鼠全脑。具体步骤为:
在4摄氏度下,将脱水后的mEos3.1标记的小鼠全脑依次通过梯度HM20的二甲苯溶液5ml以上,进行包埋剂渗透。HM20的二甲苯溶液梯度为HM20按照体积百分比为50%,75%,100%,100%,100%,100%,前三个梯度每个梯度浸泡2小时,第四组和第五组各浸泡24小时,第六组浸泡14小时。
(4)包埋剂聚合
使所述HM20包埋剂发生聚合反应,获得mEos3.1标记的生物组织的树脂包埋样品。具体步骤为:
将1.1mL的HM2O包埋剂工作液注入安装在底座上的9mm口径的明胶胶囊,然后将HM20包埋剂工作液填充的mEos3.1标记的小鼠全脑放入胶囊中,调整好位置并盖上胶囊盖子,移入真空干燥箱中进行梯度升温聚合:37摄氏度12小时,42摄氏度3小时,45摄氏度12小时,50摄氏度3小时。
(5)激活激发光控荧光蛋白
将所述树脂包埋小鼠全脑样品的表层切削平整后,用紫外405nm波长激活光激活样品表层,激活表层厚度为3~4um,然后用561nm激发光激发荧光并成像,激活光方向和样品的夹角为30°。
激活光激活处理前和激活处理后分别激发的荧光亮度如图2所示。图2A为没有用405nm激活光激活而采用561nm激发光去激发观察到的荧光信号结果,可以看出如果没有用405nm激活光激活,即使用561nm激发光去激发,也没有任何真荧光信号(散布的亮度只是干扰噪声);图2B为经过405nm激活光激活后,再使用561nm激发光激发得到的荧光信号结果图,可以看出经过405nm激活光激活后,mEos3.1可以被561nm激发光激发出明亮的红色荧光,图2B显示出了一个神经元的胞体形态。
实施例2
过表达PAGFP的Hela细胞包埋后荧光控制方法,包括以下步骤:
(1)样本固定
将过表达PAGFP的Hela细胞用化学固定手段固定,得到固定的PAGFP标记的生物组织。具体步骤如下:
在4摄氏度下,将Hela细胞经质量分数为4%的PFA溶液浸泡约12小时,然后用PBS溶液漂洗3次,每只每次使用PBS溶液40ml,每次漂洗1小时。
(2)样本脱水
将固定的PAGFP标记的Hela细胞用乙醇置换,使得所述样本脱水,得到脱水后的PAGFP标记的细胞样本。具体步骤为:
在4摄氏度下,将固定的PAGFP标记的Hela细胞依次通过梯度乙醇双蒸水溶液20ml,浸泡2小时,进行脱水。乙醇双蒸水溶液浓度梯度为乙醇按照体积百分比为50%,75%,95%,100%,100%。
(3)包埋剂渗透处理
将脱水后的PAGFP标记的小鼠全脑进行HM20包埋剂渗透处理,获得HM20包埋剂工作液填充的PAGFP标记的细胞样本。具体步骤为:
在4摄氏度下,将脱水后的PAGFP标记的Hela细胞依次通过梯度HM20的二甲苯溶液5ml,进行包埋剂渗透。HM20的二甲苯溶液梯度为HM20按照体积百分比为50%,75%,100%,100%,100%,100%,前三个梯度每个梯度浸泡2小时,第四组和第五组各浸泡24小时,第六组浸泡14小时。
(4)包埋剂聚合
使所述HM20包埋剂发生聚合反应,获得PAGFP标记的树脂包埋的细胞样本。具体步骤为:将HM2O包埋剂工作液滴到长有Hela细胞的玻片上面,然后将该玻片盖上盖玻片,移入真空干燥箱中进行梯度升温聚合:37摄氏度12小时,42摄氏度3小时,45摄氏度12小时,50摄氏度3小时。
(5)激活激发光控荧光蛋白
将所述树脂包埋的Hela细胞样品,用激活光405nm激光激活样品表层,然后用激发光504nm激光激发荧光并成像,激活光方向和样品方向夹角为15°。
使用激光器激活激发PAGFP后,荧光亮度增加倍数显著,从几乎没有荧光到所有表达PAGFP的细胞都非常明亮,激活表层的厚度为1~2um。实施例3
过表达PAGFP的Hela细胞包埋后荧光控制方法,包括以下步骤:
(1)样本固定
将过表达PAGFP的Hela细胞用化学固定手段固定,得到固定的PAGFP标记的生物组织。具体步骤如下:
在4摄氏度下,将Hela细胞经质量分数为4%的PFA溶液浸泡约12小时,然后用PBS溶液漂洗3次,每只每次使用PBS溶液40ml,每次漂洗1小时。
(2)样本脱水
将固定的PAGFP标记的Hela细胞用乙醇置换,使得所述样本脱水,得到脱水后的PAGFP标记的细胞样本。具体步骤为:
在4摄氏度下,将固定的PAGFP标记的Hela细胞依次通过梯度乙醇双蒸水溶液20ml,浸泡2小时,进行脱水。乙醇双蒸水溶液浓度梯度为乙醇按照体积百分比为50%,75%,95%,100%,100%。
(3)包埋剂渗透处理
将脱水后的PAGFP标记的小鼠全脑进行HM20包埋剂渗透处理,其中包埋剂中含0.3%质量分数苏丹黑B,获得HM20包埋剂工作液填充的PAGFP标记的细胞样本。具体步骤为:
在4摄氏度下,将脱水后的PAGFP标记的Hela细胞依次通过梯度HM20的二甲苯溶液5ml,进行包埋剂渗透。HM20的二甲苯溶液梯度为HM20按照体积百分比为50%,75%,100%,100%,100%,100%,前三个梯度每个梯度浸泡2小时,第四组和第五组各浸泡24小时,第六组浸泡14小时,其中第三到第六组所用100%HM20溶液均含有质量分数为0.3%的苏丹黑B。
(4)包埋剂聚合
使所述HM20包埋剂发生聚合反应,获得PAGFP标记的树脂包埋的细胞样本。具体步骤为:
将HM2O包埋剂工作液滴到长有Hela细胞的玻片上面,然后将该玻片盖上盖玻片,移入真空干燥箱中进行梯度升温聚合:37摄氏度12小时,42摄氏度3小时,45摄氏度12小时,50摄氏度3小时。
(5)激活激发光控荧光蛋白
将所述树脂包埋的Hela细胞样品,用激活光405nm激光激活样品表层,然后用激发光504nm激光激发荧光并成像,激活光方向和样品方向夹角为15°。
激活光激活处理前和激活处理后分别激发的荧光亮度如图3A和图3B所示。使用激光器激活激发PAGFP后,荧光亮度增加倍数显著,从几乎没有荧光到所有表达PAGFP的细胞都非常明亮,激活表层的厚度为1~2um。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种适用于宽场成像的光控荧光蛋白标记生物组织包埋样品的荧光控制方法,其特征在于,用激活光激活样品表层的光控荧光蛋白,用激发光激发所述表层的光控荧光蛋白进而发出荧光;
所述光控荧光蛋白为光激活荧光蛋白或光转换荧光蛋白;
所述激活光为与所述光控荧光蛋白匹配的特定波长的激活光;所述激发光为与所述光控荧光蛋白匹配的特定波长的激发光;所述激活光的波长短于所述激发光的波长;
所述表层的厚度为0.5~5微米;
所述激活光的方向和样品上表面的夹角为0~90°;
所述生物组织包埋样品的包埋剂中添加有吸收光的物质;
该荧光控制方法中,激活时只激活生物组织包埋样品表层的荧光,应用于生物组织包埋样品的荧光层析成像时,激发光激发被激活表层而进行荧光成像,样品被激活表层的厚度即为荧光成像的轴向分辨率;
在用激活光激活样品表层的光控荧光蛋白时,由于只激活包埋样品的表层,而表层以下没有被激活光激活,因此表层以下组织即使吸收了后续的激发光也无法发出荧光,从而避免了后续宽场成像时组织表层以下非焦面荧光的干扰。
2.如权利要求1所述的荧光控制方法,其特征在于,所述激活光的方向和样品上表面的夹角为15°~30°。
3.如权利要求1所述的荧光控制方法,其特征在于,所述生物组织包埋样品的包埋剂为树脂。
4.如权利要求3所述的荧光控制方法,其特征在于,所述树脂为丙烯酸树脂。
5.如权利要求1所述的荧光控制方法,其特征在于,所述吸收光的物质为苏丹黑。
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