CN106518925B - 靶向线粒体苝酐荧光探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向线粒体苝酐荧光探针及其应用，本发明提供的靶向线粒体苝酐荧光探针的分子式为C104H108Br2N4O18P2，摩尔质量为1923.74。本发明提供的靶向线粒体苝酐荧光探针是在荧光基团苝酰亚胺两侧与两条水溶性的PEO链相连，极大地提高了该探针的亲水性；由于连接基团的存在，使得整个共轭平面增大，探针的荧光性能得到提高；在连接基团位置引入了三苯基膦阳离子，作为靶向基团，能够特异性结合到线粒体上；本发明还提供了靶向线粒体苝酐荧光探针在活细胞成像上的应用；并且还提供了靶向线粒体苝酐荧光探针的使用方法。本申请人通过实验证实，该荧光探针易于进入细胞内，细胞上载率很高，细胞通透性很好，并没有产生细胞毒性。
Description
技术领域
本发明涉及功能高分子技术、分析化学和生物分析化学技术领域，特别涉及一种靶向线粒体苝酐荧光探针及其应用。
背景技术
荧光成像是一种非常有用的检测手段，它具有非离子低能量辐射、高敏感性、连续实时监测、无创性或微创性等优势，能够满足生物医学研究和临床治疗上的需求，在生物组织成像方面发展迅猛。尽管有时可以利用细胞内源分子的荧光进行荧光成像，但是仅仅依靠蛋白质的内源荧光还不能满足研究的需要，因此需要选择合适的荧光探针进行标记。荧光成像的核心问题是荧光分子探针的选择与优化。荧光探针的选择主要考虑以下几个方面：水溶性、荧光性、光学稳定性、毒性和pH适用范围、特异性和标记条件等[1]。
苝酐因具有较大的平面共轭结构，本身就是一种性能优良的红色染料。两个萘单元通过两个sp2杂化的C-C单键相连而形成的一个大的共轭平面芳香体系，这种共轭大π键电子结构赋予了苝酐优异的光电性质和化学稳定性，使苝酐具有光化学稳定性强，荧光量子产率高等特点。不过，同时也使苝酐分子的溶解性变得很差，不利于苝酐的在现实应用中的推广。经过化学修饰，苝酐类化合物的溶解性和荧光量子产率均能够得到很大程度的提高。苝酐核的化学修饰位置可以有两种方式：第一种是在苝酐环上的1,6,7,12位(即bay区域)引入取代基(如卤素等)。此位置取代基的引入，使得苝类衍生物的荧光性能发生显著的变化，同时它的溶解性能也会得到相应的改善。第二种是在酐的O原子上引入不同的取代基。这是一种有效改善苝酐溶解性的手段。此位置取代基的引入并没有使得苝酐化合物的光电性能发生明显改变。研究发现，苝酐衍生物的溶解性，主要取决于酐位取代基的影响。大尺寸取代基团(如燕尾取代基)的引入可以减弱苝酐分子间的π-π堆积。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种靶向线粒体苝酐荧光探针，其在荧光基团苝酰亚胺两侧与两条水溶性的PEO链相连，极大地提高了该探针的亲水性；由于连接基团的存在，使得整个共轭平面增大，探针的荧光性能得到提高；在连接基团位置引入了三苯基膦阳离子，作为靶向基团，能够特异性结合到线粒体上；
本发明还有一个目的是提供一种靶向线粒体苝酐荧光探针在荧光成像中的应用，保证了很高的细胞上载率，易于检测完整细胞形态；
本发明还有一个目的是提供一种靶向线粒体苝酐荧光探针的使用方法，在合适的荧光探针浓度和处理时间的情况下，其能够保证该荧光探针的细胞上载率接近100％，并且不会产生细胞毒性。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种靶向线粒体苝酐荧光探针，其结构式为：
所述靶向线粒体苝酐荧光探针的分子式为C104H108Br2N4O18P2，摩尔质量为1923.74。
一种靶向线粒体苝酐荧光探针在活细胞荧光成像中的应用，其中，所述靶向线粒体苝酐荧光探针与线粒体结合。
一种靶向线粒体苝酐荧光探针的使用方法，包括以下步骤：将活细胞加入到含有探针浓度n≥1μg/mL的探针溶液中处理一定时间。
优选的是，将活细胞加入到含有探针浓度n≥10μg/mL的探针溶液中处理至少60min。
优选的是，将活细胞加入到含有探针浓度n≥10μg/mL的探针溶液中处理60-120min。
优选的是，所述探针溶液中探针浓度为10μg/mL≤n≤100μg/mL。
优选的是，所述探针溶液中探针浓度为n＝20μg/mL。
本发明至少包括以下有益效果：
PEO链是药物输运时应用最广泛的侧基，它可以降低药物输运载体与血细胞的反应，提高荧光探针的水溶性和生物相容性。本申请在荧光基团苝酰亚胺两侧与两条水溶性的PEO链相连，极大地提高了该探针的亲水性；由于连接基团的存在，使得整个共轭平面增大，探针的荧光性能得到提高；在连接基团位置引入了三苯基膦阳离子，作为靶向基团，能够特异性结合到线粒体上；在合适的荧光探针浓度和处理时间的情况下，本发明提供的荧光探针的细胞上载率接近100％，说明本发明提供的荧光探针很容易进入细胞内，并与线粒体的内膜结合，细胞上载率很高，细胞通透性很好，并且没有产生细胞毒性，适用于对活细胞进行显微成像。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的TMAFP探针在不同浓度下对HeLa细胞活性的影响的柱形图；
图2为实施例2中空白样的共聚焦检测成像照片：其中，图2a为合图，图2b为荧光照片和图2c明场照片；
图3为实施例2中荧光探针浓度为0.5μg/ml的共聚焦检测成像照片：其中，图3a为合图，图3b为荧光照片和图3c明场照片；
图4为实施例2中荧光探针浓度为1μg/ml的共聚焦检测成像照片；B为荧光谱图；其中，图4a为合图，图4b为荧光照片和图4c明场照片；
图5为实施例2中荧光探针浓度为10μg/ml的共聚焦检测成像照片；B为荧光谱图；其中，图5a为合图，图5b为荧光照片和图5c明场照片；
图6为实施例2中荧光探针浓度为20μg/ml的共聚焦检测成像照片；其中，图6a为合图，图6b为荧光照片和图6c明场照片；
图7为实施例2中荧光探针浓度为50μg/ml的共聚焦检测成像照片；其中，图7a为合图，图7b为荧光照片和图7c明场照片；
图8为实施例2中在HeLa细胞内的共聚焦检测成像照片：其中，8A、明场，8B、TMAFP探针，8C、商用染料Mitotracker Red，8D、ABC合图，8E、BC合图，8F、HeLa细胞TMAFP探针和Mitotracker Red的选定研究区域(E中白线)的强度空间分布图；
图9为实施例3中探针浓度为0、1、10、20、50、100μg/mL时得到流式细胞分析图，其中，a、b、c、d、e和f分别对应六个荧光探针浓度为0、0.01、0.1、0.2、0.5和1.0μg/mL；
图10为实施例3中探针浓度为0、0.01、0.1、0.2、0.5、1.0μg/mL时得到的直方图，其中，a、b、c、d、e和f分别对应六个荧光探针浓度为0、0.01、0.1、0.2、0.5和1.0μg/mL。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
一种靶向线粒体苝酐荧光探针，其特征在于，其结构式为：
所述靶向线粒体苝酐荧光探针的分子式为C104H108Br2N4O18P2，摩尔质量为1923.74。
实施例2
如上述实施例1的靶向线粒体苝酐荧光探针在活细胞荧光成像中的应用。
本发明申请人应用本探针对活细胞标记并进行了细胞毒性和成像分析，具体实验方法如下：
2.1试剂如下表1所示：
表1试剂
2.2仪器如下表2所示：
表2仪器
2.3细胞培养
(1)将人***细胞(HeLa)接种在含10％胎牛血清、100U/mL的链霉素、100U/mL的青霉素的高糖DMEM培养基上；
(2)在37℃，5％CO2的孵育箱中进行培养，每24个小时更替一次培养基；
(3)当细胞生长到80％后，用0.25％胰蛋白酶消化传代。
2.4细胞毒性实验及结果分析：
2.4.1本实验采用CCK-8细胞试剂盒来测定细胞生存率，步骤如下：
(1)收集细胞，加细胞悬液100ul到96孔板，并设置了一组空白组和三组对照组；
(2)放置在5％的CO2饱和湿度培养箱中，在37℃下孵育过夜，倒置显微镜下观察；
(3)每孔加入10ul浓度为0.1、1、5、20、100μg/mL的探针溶液，37℃孵育时间为24h、48h、72h；
(4)每孔加入10ulCCK-8溶液，37℃孵育时间为3h后，利用CCK-8比色法，使用酶标仪测定在波长为450nm处吸光度(OD值)，根据如下公式对HeLa细胞的生存率进行计算。
细胞生存率/％＝(ODtreated/ODcontrol)×100％
2.4.2细胞毒性实验分析
CCK-8Cell Counting kit基于WST-8，广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测。WST-8与MTT类似，在电子耦合试剂存在情况下，可以被细胞里线粒体内的脱氢酶还原为高度水溶性的黄色甲染料(Formazan dye)，且生成的黄色甲化合物的数量与活细胞的数量是正比关系。因此，根据这一原理能够直接进行细胞的毒性分析。实验数据如下表3、表4和表5所示：
表3 24h CCK-8
表4 42h CCK-8
表5 72h CCK-8
我们根据实验数据进行简单计算，检测结果如图1所示:
空白组实验没有加入探针的HeLa细胞的活力认为是100％，加入探针TMAFP后，探针最终的浓度为0.1、1.0、5.0、25、100μg/mL，孵育时间为24h、48h、72h，每个浓度做了三个平行试验，最后测得的生存率取平均值。从图观察得知，孵育时间为24h，最低的生存率为91％，说明对细胞没有毒性。孵育时间48h、72h，细胞生存率的生存率同样在90％以上。细胞的生存率基本上没有变化，维持在一个相对稳定的状态，说明对细胞没有毒性。综上所述，这个探针在浓度达到100μg/mL以下时，不会对细胞产生毒性，能够满足实验要求。
2.5细胞成像及结果分析
2.5.1为了研究探针在活细胞中荧光成像的具体情况，我们选择了激光扫描共聚焦显微镜这一先进的工具，具体的实验过程为：
(1)选择处于对数生长期的HeLa细胞，对细胞悬液密度进行调整，然后在直径为2cm的玻底培养皿中进行接种，接种的密度为1.5×104个/mL，每个培养皿要接种2mL，将其置于CO2恒温培养箱中，培养24h，细胞贴壁生长。
(2)加入超纯水溶液使探针的测试浓度为0.5、1、10、20、50μg/ml，不加任何化合物组为空白样，培养箱中孵育30min。
(3)终止培养，使用PBS缓冲溶液洗涤三次，最后再加入1mL的PBS缓冲溶液，利用激光共聚焦显微镜扫描成像。
2.5.2细胞内荧光成像分析
利用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus FV1000)，设置采集图像所用的激发波长为448nm，主要收集500-600nm区域之间发射的荧光，每个样品测定分合图、荧光和明场三种方式，结果如图2-图7所示。
通过对比这一系列的荧光场，我们可以发现随着探针浓度的增加，荧光强度显著增加，说明我们的探针能够进入细胞并荧光成像；通过观察如图2-图7所示的合图2a-图7a，我们发现荧光图2b-图7b的发光区域基本与明场2c-7c上的细胞分布部位重合，并且发光区域呈现出短棒状或圆球状，很可能是定位在线粒体结构中。
2.5.3细胞内荧光定位分析
为了证实本探针定位在线粒体中，我们用探针TMAFP与已知的线粒体定位试剂(Mitotracker Red染料)做细胞定位实验。将探针TMAFP与商用染料Mitotracker Red共同对HeLa细胞进行培养，用PBS平衡盐缓冲溶液洗涤三次，在共聚焦显微镜下观察荧光成像情况，结果如图8所示：从图8E上可以观察到，我们发现商用染料Mitotracker Red与TMAFP探针在细胞内的荧光成图像基本重叠，皮尔逊系数为0.758，该结果说明了TMAFP探针可以定位到活细胞线粒体上。此外，从图8F可以观察到TMAFP探针和染料Mitotracker Red的强度空间分布是相似的，这结果进一步说明了TMAFP探针能够定位在线粒体，并实现线粒体成像。
实施例3
一种靶向线粒体苝酐荧光探针的使用方法，包括以下步骤：将活细胞加入到含有探针浓度n≥1μg/mL的探针溶液中处理一定时间。
在一个优选方案中，将活细胞加入到含有探针浓度n≥10μg/mL的探针溶液中处理至少60min。
在一个优选方案中，将活细胞加入到含有探针浓度n≥10μg/mL的探针溶液中处理60-120min。
在一个优选方案中，所述探针溶液中探针浓度为10μg/mL≤n≤100μg/mL。
在一个优选方案中，所述探针溶液中探针浓度为n＝20μg/mL。
3.1针对上述方法，本发明申请人对荧光探针对活细胞的上载率做了如下具体实验和分析：
3.1.1细胞上载率实验
用对数期的HeLa细胞，调整细胞悬液的密度，接种在孔培养板中，接种密度是2.5×104个/mL，每孔接种2mL。⑵待细胞生长到90％后，加入三种化合物的超纯水溶液使每孔测试终浓度为0、1.0、10、20、50、100μg/mL，每个浓度做3个平行试验，不加任何化合物的孔内细胞作对照，然后在培养箱中孵育1h。⑶取出6孔培养板，用PBS溶液冲洗孔板2遍，用0.05％的胰蛋白酶分别消化细胞，然后收集在4mLEP管中。⑷转入离心机中以转速1000r/min离心4min，倒掉上清液，再用0.5mLPBS缓冲溶液重悬细胞，根据该探针的性质我们选择流式细胞仪在激发光波长为488nm处，FL2通道收取细胞进行实验，检测细胞的上载率。
3.1.2实验结果分析
分析得知当探针浓度为1μg/mL时，发光细胞数占细胞总数的百分比为26.48％，当探针浓度为10μg/mL时，发光细胞数占细胞总数的百分比为99.69％，当探针浓度为20μg/mL时，发光细胞数占细胞总数的百分比为99.88％，当探针浓度为50μg/mL时，发光细胞数占细胞总数的百分比为99.98％，当探针浓度为100μg/mL时，发光细胞数占细胞总数的百分比为99.99％。具体实验数据见下表6：
表6发光细胞数百分比
如图9并结合上表6可知，当探针浓度不断增加时，发光细胞数量占细胞总数的百分比很快接近100％，当探针浓度为10μg/mL时，发光细胞数量占细胞总数的百分比为99.69％，绝大多数探针已经进入细胞内，随着探针浓度的继续增加，发光细胞数占细胞总数的百分比依然非常高。说明该探针很容易进入细胞内，细胞上载率很高，细胞通透性很好，并且并没有产生细胞毒性(坏死细胞、细胞碎片等不会发光，探针进入细胞后，生长正常的细胞才会发光)。
3.2针对上述方法，本发明申请人对荧光探针灵敏度的实验结果与分析
通过上一部分的实验我们发现探针能够很好的进入细胞，因此我们利用流式细胞仪实验对探针在细胞内发光灵敏度进行分析，得到如下结果：
3.2.1探针灵敏度的检测
探针灵敏度的检测与上述步骤相同，只是将终浓度变为0、0.01、0.1、0.2、0.5、1.0μg/mL，每个终浓度做3个平行试验。
3.2.2实验结果分析
分析得知当探针浓度为0.01μg/mL时，发光细胞数占细胞总数的百分比为1.3％，当探针浓度为0.1μg/mL后，发光细胞数占细胞总数的百分比为1.58％，当探针浓度为0.2μg/mL后，发光细胞数占细胞总数的百分比为1.68％，当探针浓度为0.5μg/mL后，发光细胞数占细胞总数的百分比为3.13％，当探针浓度为1μg/mL后，发光细胞数占细胞总数的百分比为4.88％。详细数据见下表7：
表7发光细胞数百分比
根据上表7中数据可知：随荧光探针浓度的增加，发光细胞的数量也随之增加，而且我们可以看出荧光探针浓度的一个微小的变化都会使发光细胞数占细胞总数的百分比产生较大的变化，所以可以说明本发明提供的荧光探针的灵敏度很高。
3.3针对上述方法，本发明申请人对荧光探针对细胞周期影响实验结果与分析
3.3.1对细胞周期影响实验
实验证明本实验室合成的靶向线粒体的苝酐探针不仅有很好的灵敏度而且对细胞几乎没有毒性，为了进一步验证试验结果我们利用流式细胞仪研究样品对细胞周期的影响。细胞周期实验与上述步骤也相同，只将终浓度变为0、0.5、1.0、10、20、50μg/mL，每个终浓度做3个平行实验。
3.3.2实验结果分析
探针浓度为0(空白)、0.5、1、10、20、50μg/mL时的HeLa细胞周期分析结果如图10所示：试验组分为5个剂量组，0.5、1.0、10、20、50μg/mL，利用流式细胞仪检测该细胞周期分布的变化。详细数据见下表11：
表8各时期细胞数量百分比
相对于正常对照组G1期细胞比率(60.79％)，5个试验组的G1期细胞基本趋于稳定。同样，相对于对照组S期(31.75％)、G2期(7.46％)细胞比率，5个试验组的S期、G2期细胞也基本趋于稳定。G1、G2、S期的细胞比例基本稳定，上下波动并不大，说明在当探针作用到细胞后该探针的加入并不会影响细胞各个周期的DNA含量，即不会影响细胞周期。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (1)
1.一种靶向线粒体苝酐荧光探针，其特征在于，其结构式为：
所述靶向线粒体苝酐荧光探针的分子式为C104H108Br2N4O18P2，摩尔质量为1923.74。
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