CN106511997A - 一种稳定的蛋白制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种稳定的抗VEGF单克隆抗体制剂组合物，其包含25mg/ml至150mg/ml抗VEGF单克隆抗体、糖、缓冲液、表面活性剂，以及聚乙烯吡咯烷酮。本发明的制剂可有效减少高浓度抗体蛋白分子的聚集。

Description

一种稳定的蛋白制剂

技术领域

本发明属于生物制药领域，更具体地，本发明涉及一种抗血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体的稳定制剂。

背景技术

有研究表明，肿瘤血管形成是肿瘤生长、转移的基础(Folkman J.N Engl J Med，1971，285(21)：1182)。肿瘤新生血管的形成是肿瘤生长、浸润、转移的重要条件。大多数实体恶性肿瘤能分泌多种促血管生长因子，诱导血管生成，支持肿瘤生长(Folkman J，Science，1987，235(4787)：442)。在迄今发现的20多种多肽类血管生长因子中，血管内皮生长因子(VEGF)是针对内皮细胞特异性最高，促血管生长作用最强的关键调节因子(Ferrara N.Endocr Rev，1997，18(1)：4)，在多种原发性恶性肿瘤组织中均呈高表达(Brown L F等Human Pathol，1995，26(1)：86)。Takahashi(Cancer Res，1995，55(18)：3964)发现VEGF高表达与结肠癌转移的发生、发展有密切联系，提示VEGF在原位肿瘤的形成和生长及转移瘤的形成中均起着举足轻重的作用。已经证实其它多种血管生长因子是通过直接或间接诱导、刺激VEGF表达而发挥作用的，如TGF-α、bFGF、TGF-β、TNF-α、KGF等均可上调VEGF的表达(Li J，Hampton T等，J Clin Invest，1997，100(1)：18；Brown L F等，Detmar M，Claffey K，et al.Vascular permeabilityfactor/vascular endothelial growth factor：a multifunctional angiogenic cytokine.Exs，1997，79：233)。因此，VEGF是阻断肿瘤血供的理想靶点。

目前已经有相关的抗VEGF单克隆抗体应用于临床，并显示出了良好的抗肿瘤效果。贝伐单抗(bevacizumab，Avastin，阿瓦斯汀)是2004年获美国FDA批准的第一个人源化抗VEGF单克隆抗体，成为晚期转移结直肠癌患者的一线治疗药物。贝伐单抗是第一个获批上市的血管生成抑制剂。贝伐单抗通过抑制新生血管的形成，减少肿瘤的血供、氧供和其他营养物质而抑制肿瘤生长。研究显示，贝伐单抗与标准IFL方案(依立替康+5-氟尿嘧啶+亚叶酸钙)联用，可显著延长结直肠癌患者的生存期。

中国专利申请201410850230.7公开了一种重组抗VEGF单克隆抗体及其应用，申请人构建了一种具有高亲和力的重组抗VEGF单克隆抗体，其比现有的抗VEGF抗体具有更高的亲和力，能够更加有效的识别VEGF靶点。

重组抗VEGF单克隆抗体是一类大分子蛋白质。通常，蛋白质具有非常短的半衰期，并且在暴露于各种因素(如不适宜温度、水-气界面、高压、物理/机械应力、有机溶剂和微生物污染)之后经历变性(如聚集、解离和吸附在容器表面等)。因此，变性蛋白失去内在的理化性质和生理活性。蛋白质的变性通常是不可逆的，因此蛋白质一旦变性，它们的天然性质可能不会恢复到初始状态。

在生物制药行业中，使用基因重组技术制备的蛋白质在水性制剂中的长期储存通常是一项困难的任务。为了克服水性制剂中的蛋白质的稳定性问题，通过冻干(冷冻干燥)制备了更加稳定的治疗性蛋白产品。但是，冻干产品通常伴随有用于复原的无菌水性介质。在复原之后，这些制剂典型地具有短的有效贮存寿命，即使在低温(例如，5℃)下保存时也是如此。

针对治疗用途，蛋白质药物如单克隆抗体以高浓度使用，可以通过静脉内输注递送至患者，也可以优选配制该蛋白质治疗药用于皮下注射。然而，用于皮下注射的药物溶液的体积比静脉内输注体积小得多，从而蛋白质必然以更高的浓度存在。在每毫升数十毫克的高的治疗性蛋白质浓度上，维持治疗性蛋白质稳定溶解持续延长的时间段是重要的。高浓度的蛋白质溶液增加了有利于聚集的蛋白质-蛋白质相互作用的可能性。聚集造成许多问题，包括活性蛋白的生物利用率减少，药物代谢动力学改变和不想要的免疫原性(Frokjaer，S.和Otzen，D.Ε.，Nat.Rev.Drug.Discov.4:298_306(2005)；Jiskoot,W.和Crommelin，D.J.A.，EJHP Practice 12：20-21(2006))。因此，防止聚集已经变成蛋白质药物配制的重要事项。

目前防止聚集常见策略之一是通过添加赋形剂至蛋白质溶液，常使用的稳定剂包括糖、盐、游离氨基酸、多元醇、聚乙二醇(PEG)和可以减少蛋白质-蛋白质相互作用的其他聚合物，如聚山梨酯(polysorbates)或泊洛沙姆(Nema,S.^A,PDAJournal of Pharmaceutical Science and Technology 51:166-171(1997))。或者通过加入适当的赋形剂(包括冻干保护剂)低压冻干来防止蛋白质聚集。

聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)简称PVP，是一种非离子型高分子化合物，是N-乙烯基酰胺类聚合物中最具特色，且被研究得最深、最广泛的精细化学品品种。已发展成为非离子、阳离子、阴离子3大类，工业级、医药级、食品级3种规格，相对分子质量从数千至一百万以上的均聚物、共聚物和交联聚合物系列产品，并以其优异独特的性能获得广泛应用。其中分子量低于30000道尔顿的PVP通过肾小球滤过作用从体循环中移除。

目前，PVP已经在制药工业中广泛用作片剂包衣助剂并且在眼用和局部用制品中用作增黏剂。PVP也已经最初作为血浆增容剂用于肠胃外施用并且随后在可注射制剂(例如，抗生素、激素、镇痛药)中用来产生黏度。这些制剂限于通常小于500道尔顿的小分子化合物或小蛋白如激素。含有PVP的当前可用药品包括Bicillin C-R^TM(Wyeth),Wycillin^TM(Wyeth)和PfiZerpen^TM(PfiZer)，它们均含有小分子青霉素G，以及非常低浓度(≥0.6％)的PVP。Depo-SubQ Provera104^TM(Pharmacia and Upjohn)含有5％PVP连同小分子醋酸甲羟孕酮。Bexxar^TM(Glaxo Smith Kline)含有放射性标记的抗CD20抗体连同4.4-6.6％PVP。在Bexxar的例子中，PVP特异地用作放射防护剂以减少放射性标记的抗体因所附着放射性同位素而自辐射分解(美国专利号5，961，955和美国专利号6，338，835)。

贝伐单抗公开的液体制剂配方为：bevacizumab 25mg/ml，D-海藻糖60mg/ml，一水磷酸二氢钠5.8mg/ml，无水磷酸氢二钠1.2mg/ml，聚山梨醇酯200.4mg/ml，PH值为6.2。目前，尚未看到蛋白浓度高于25mg/ml的抗VEGF单克隆抗体的稳定制剂组合物。如果开发更高浓度的抗VEGF单克隆抗体制剂，需要克服稳定性问题，尤其要有效防止蛋白分子的聚集，以及保持制剂组合物具有较长的贮存寿命。

发明内容

本发明研发人员经过大量的实验，研究出一种稳定的高浓度抗VEGF单克隆抗体制剂，该制剂包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，该制剂可有效减少高浓度抗VEGF单克隆抗体制剂中蛋白分子的聚集。

在一些实施方案中，所述稳定的高浓度抗VEGF单克隆抗体制剂，优选包含25mg/ml至150mg/ml浓度范围的抗VEGF单克隆抗体和1％至20％具有2000至54000道尔顿分子量范围的PVP，更优选1％至10％具有7000至11000道尔顿分子量范围的PVP。优选地，抗VEGF单克隆抗体浓度是50mg/ml至100mg/ml，更优选50mg/ml。

在一些实施方案中，所述稳定的高浓度抗VEGF单克隆抗体制剂，所述制剂其还包含糖，至少一种缓冲剂，和无菌注射用水，其中所述制剂的PH范围为6-8。所述糖可选自蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和海藻糖及其混合物，优选海藻糖，更优选为60mg/ml至240mg/ml含量的海藻糖。缓冲剂可选自：包括但不限于，磷酸盐缓冲剂、碳酸氢盐缓冲剂、丁二酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、氨基酸类、以及Tris缓冲剂，它们单独地或者以适当的组合而使用，提供所希望的6-8范围的pH值。优选磷酸盐缓冲剂，可以是二氢盐和一氢盐的混合物。

在一些优选实施方案中，所述稳定的高浓度抗VEGF单克隆抗体制剂，其进一步包含表面活性剂，表面活性剂可选自：包括但不限于聚山梨酯(例如聚山梨酯20或80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；山梨坦酯及其衍生物；Triton；十二烷基硫酸钠；辛基糖苷钠；十二烷基、十四烷基、亚油酰-或硬脂酰-磺基甜菜碱；十二烷基、十四烷基、亚油酰或硬脂酰-肌氨酸；亚油酰、十四烷基或十六烷基-甜菜碱；月桂酰胺丙基、椰油酰胺丙基、亚油酰胺丙基、肉豆蘧酰胺丙基、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蘧酰胺丙基、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油酰基牛磺酸钠或甲基油酰基牛横酸二钠；和M0NAQUAT^TM系列(Mona Industries,Inc.，Paterson,N.J.)；聚乙二醇、聚丙醇以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，Pluronics,PF68等)。

在一些实施方案中，其中所述抗VEGF单克隆抗体可以是贝伐单抗(中国专利号98805914.2)或是其生物类似药(Biosimilars)，也可以是相关改良抗体(Biobetters)，如中国专利申请201410850230.7中公开的抗VEGF单克隆抗体。

本发明的制剂可有效防止抗VEGF单克隆抗体在长期储存过程中发生聚集，为我们提供了一种具有更好稳定性的抗VEGF单克隆抗体制剂，即使在常温下也能具有较好的稳定性，保证制剂合理的保质期。

本发明的制剂可作为注射用水性溶液而被使用，可以根据需要稀释成一定浓度的水性溶液静脉注射使用，或者优选的充装在预充式注射器中通过皮下注射使用。本发明的制剂可用于治疗人类的肿瘤疾病，尤其是结直肠癌患者。

具体实施方式

下面的实施例是为了举例说明本发明并帮助本领域技术人员进行和使用本发明。这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

以下实施例中，抗VEGF单克隆抗体(以下简写Anti-VEGF)参照中国专利号98805914.2中公开的方法制备得到。

以下实施例中，PVP购自上海举微国际贸易有限公司，除特别注明外，PVP的含量％均为质量体积百分比浓度(w/v)，其中：

BASF Kollidon 30(重均分子量44K-54K道尔顿)

BASF Kollidon 17PF(重均分子量7K-11K道尔顿)

BASF Kollidon 12PF(重均分子量2K-3K道尔顿)

BASF Kollidon 90F(重均分子量1M-1.5M道尔顿)。

其它未标注来源的其它材料均是通过公开的商业途径购买得到。

以下实施例中，稳定性试验，相关生物学检验按照中国药典的规范进行。

SDS PAGE【聚集(非还原)和片段化(还原)】

SDS-PAGE被用作一种分析技术，可以根据分子量从天然蛋白质中分离出游离的和高分子量的种类。由于在高浓度的大分子蛋白的情况下具有高的聚集倾向，非还原SDS-PAGE被用来评定共价聚集体。由于抗体结构轻重链之间，包括铰链区存在许多二硫键，在还原SDS-PAGE下检查蛋白质的片段化。

SE-HPLC(聚集和片段化)

用尺寸排阻色谱法分离蛋白质及其有关杂质(基于它们的尺寸)，上述技术对于检测单克隆抗体的聚集和片段化是有用的。

差示扫描量热法(DSC)

DSC是一种用来测定蛋白质的热力学稳定性的技术。单克隆抗体具有三个过渡区，Tm 1相对于Fab部分，Tm 2相对于Fc部分的CH2结构域，Tm 3相对于Fc部分的CH3结构域(较高的Tm决定了较高的稳定性)。

任何本领域的普通技术人员将会理解的是，将被包括在组合物中的各种组分的组合可以以任何适当的顺序来完成，即，可以首先添加、在中间添加或在最后添加缓冲剂，并且也以可首先添加、在中间添加或在最后添加表面活性剂等。同样，本领域的普通技术人员将会理解的是，在某些组合中这些化学物质中的一些是不相容的，并且因此，它们可以容易地被具有相似性质但在有关混合物中是相容的不同的化学物质取代。

实施例1 PVP分子量对抗VEGF单克隆抗体蛋白制剂的影响

研究25℃下含有不同分子量PVP的抗VEGF单克隆抗体蛋白制剂的稳定性。所述制剂除PVP外还含有其它如表1所列的赋形剂。

表1：含不同分子量PVP的抗VEGF单克隆抗体蛋白制剂

上述样品制剂在25℃下孵育一个月，然后通过SDS-PAGE进行分析。SDS-PAGE分析结果显示，与F1、F2和F3制剂相比，F4具有更多的聚集和降解，但是F1、F2和F3的聚集体和片段没有太多差异。

由于F1、F2和F3在25℃温度下没有观察到显著性差异，因此我们在50℃的温度下进一步研究这三个制剂的聚集情况。

为了在F1、F2和F3之间找出最佳的聚集抑制剂，使这三个制剂均在50℃下带电3天。然后通过SE-HPLC和差示扫描量热法(DSC)进行分析。

表2：不同分子量水平的PVP对制剂稳定性的影响

(备注：F0^*表示不含有PVP，但含有其他如表1所列赋形剂的抗体制剂)

结果表明，低分子量PVP抑制蛋白的聚集和片段化。所用PVP的分子量是重要的。高分子量PVP(重均MW 1.2百万道尔顿)的添加导致聚集的增加。分子量范围2000至54000道尔顿的低分子量PVP能抑制蛋白质的聚集，因而可改善其溶解度。更优选的低分子量PVP范围为7000至11000道尔顿。

实施例2 PVP含量对抗VEGF单克隆抗体蛋白制剂的影响

研究了含有不同含量低分子量PVP的蛋白制剂。所述制剂除PVP外还含有其它如表3所列的赋形剂。

表3：制剂成分表

如表3中各制剂在50℃下带电3天，然后通过SE-HPLC和差示扫描量热法(DSC)进行分析。

表4：不同含量的低分子量PVP对制剂稳定性的影响

结果表明，添加1％至20％的低分子量PVP可以更好抑制高浓度蛋白的聚集和片段化。优选的低分子量PVP含量范围为1％至10％，更优选的含量范围为1％至5％。

实施例3 糖对抗VEGF单克隆抗体蛋白制剂的影响

评价不同水平的糖对抗VEGF单克隆抗体蛋白制剂稳定性的影响。我们将样品放置于-20℃、8℃和25℃，60％湿度的条件下并在不同时间点通过SE-HPLC方法检测制剂中蛋白质的聚集化情况。

表5：抗VEGF单克隆抗体蛋白制剂配方表

Anti-VEGF	150mg/ml
		聚山梨酯20	1mg/ml
一水磷酸二氢钠	8.7mg/ml
		无水磷酸氢二钠	1.8mg/ml
Kollidon 17PF	10％
		海藻糖	具体见表6
PH	6-8

表6：糖对抗VEGF单克隆抗体蛋白制剂稳定性的影响

由表6可知，糖对抗VEGF单克隆抗体蛋白制剂稳定性有很大影响。当海藻糖为60mg/ml至240mg/ml时，4℃贮存一年，蛋白纯度仍可达到98％以上，保持制剂合理的贮存寿命。

实施例4 抗VEGF单克隆抗体制剂的配制及稳定性试验

表7：抗VEGF单克隆抗体溶液制剂配方

Anti-VEGF

50mg/ml

海藻糖	60mg/ml
		一水磷酸二氢钠	5.8mg/ml
无水磷酸氢二钠	1.2mg/ml
		Kollidon 17PF	5％
帕洛沙姆188	8mg/ml
		PH	6-7

先按表7中除抗体蛋白以外的赋形剂浓度配置溶液，使各赋形剂组分充分溶解在80％-90％的水溶液中；然后加入纯化后的抗体蛋白原液，调整浓度至50mg/ml，并定容至100％。

按上述方法配制表7所述配方的溶液制剂。然后在-20℃、5±3℃和25±2℃下储存抗VEGF单克隆抗体溶液制剂，在储存零时间、1个月、3个月以及6个月之后，通过SE-HPLC分析该溶液制剂的稳定性。结果见表8。

表8：溶液制剂稳定性试验结果(-20℃、5±3℃、25±2℃)

(备注：每个温度测定3组平行制剂取平均值)

另外，我们还将配制好的表7所述配方的抗VEGF单克隆抗体溶液制剂在空气层流下用0.2μm过滤器灭菌并在45℃下储存。通过SE-HPLC分析该制剂在储存零时间、7天、15天、21天之后的稳定性。结果见表9。

表9：溶液制剂稳定性试验结果(45℃)

测定a	零时间	7天	15天	21天	30天
						SE-HPLC测定的聚集化％	0.05	1.20	1.80	2.80	4.50
SE-HPLC测定的片段化％	0	0.10	0.20	0.40	1.20

(备注：每个温度测定3组平行制剂取平均值)

由上述表8-表9可知，本发明的抗VEGF单克隆抗体溶液制剂稳定性较好，即使在常温或更高温度的情况下仍具有较好的稳定性。

上述实施例中的F1-F3、F5-F8，以及表5-表6中的各制剂，按照实施例4所述方法进行配制并开展稳定性试验，结果均显示出蛋白聚集受到抑制以及良好的稳定性。

Claims (10)

1.一种稳定的抗VEGF单克隆抗体制剂组合物，其具有25mg/ml至150mg/ml抗VEGF单克隆抗体、糖、缓冲液、表面活性剂，以及聚乙烯吡咯烷酮。

2.根据权利要求1所述的制剂组合物，其中抗VEGF单克隆抗体含量为50mg/ml至150mg/ml，优选50mg/ml至100mg/ml，更优选50mg/ml。

3.根据权利要求1-2所述的制剂组合物，其中聚乙烯吡咯烷酮分子量范围为2000至54000道尔顿，优选7000至11000道尔顿，聚乙烯吡咯烷酮含量为1％至20％，优选1％至10％，更优选1％至5％。

4.根据权利要求1-3任一所述的制剂组合物，其中糖为海藻糖，含量为60mg/ml至240mg/ml，优选60mg/ml至120mg/ml，更优选60mg/ml。

5.根据权利要求1-4任一所述的制剂组合物，其中缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述制剂的PH范围为6-8。

6.根据权利要求1-5任一所述的制剂组合物，其中表面活性剂为帕洛沙姆或聚山梨醇酯，优选聚山梨醇酯20或帕洛沙姆188。

7.根据权利要求1-6任一所述的制剂组合物，具有25mg/ml至150mg/ml抗VEGF单克隆抗体，60mg/ml至240mg/ml海藻糖，磷酸盐缓冲液，表面活性剂，1％-20％分子量范围为2000至54000道尔顿的聚乙烯吡咯烷酮，PH范围为6-8。

8.根据权利要求7所述的制剂组合物，具有50mg/ml至150mg/ml抗VEGF单克隆抗体，60mg/ml至240mg/ml海藻糖，磷酸盐缓冲液，表面活性剂，1％-10％分子量范围为2000至11000道尔顿的聚乙烯吡咯烷酮，PH范围为6-8。

9.根据权利要求1-8任一所述的制剂组合物，其中所述抗VEGF单克隆抗体是贝伐单抗。

10.权利要求1-9任一所述的制剂组合物在制备治疗结直肠癌药物中的应用。