CN106501535B

CN106501535B - 一种ans盐复合释放剂与检测血液中皮质醇的试剂盒

Info

Publication number: CN106501535B
Application number: CN201611082658.7A
Authority: CN
Inventors: 平璐; 孙成艳; 何浩会; 王香琪; 阚洪晶; 李娟�
Original assignee: Dirui Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Dirui Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2018-11-09
Anticipated expiration: 2036-11-30
Also published as: CN106501535A

Abstract

本发明公开一种ANS盐复合释放剂与检测血液中皮质醇的试剂盒，试剂盒包括以下组分：包被皮质醇抗体的磁珠、吖啶酯标记的皮质醇BSA复合物、ANS盐复合释放剂和皮质醇校准品。本发明ANS盐复合释放剂将人体血液样本中结合形式的皮质醇转变为游离形式的皮质醇，并通过吖啶酯化学发光检测游离皮质醇的含量。ANS盐复合释放剂可与不同糖皮质类固醇蛋白相结合，能够将血液中结合态的皮质醇充分释放出来。吖啶酯化学发光为闪光型发光，发光用时少，能够完全捕捉反应所产生的光子；吖啶酯为人工合成物质，对样本干扰物质的抗干扰性较高，利用吖啶酯标记检测游离皮质醇的含量非常灵敏，使血液样本中总皮质醇的含量测定更为准确。

Description

一种ANS盐复合释放剂与检测血液中皮质醇的试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种ANS盐复合释放剂与检测血液中皮质醇的试剂盒。

背景技术

皮质醇(Cortisol)又称“氢化可的松”，是肾上腺在应激反应里产生的一种糖皮质激素。当人从食物中摄入胆固醇，在机体产生应激反应的作用下，胆固醇经由肾上腺中的“糖皮质激素***”变成皮质醇，并以游离的形式分泌到血液中。皮质醇具有调节碳水化合物代谢的功能；免疫抑制和抗炎的作用；对下丘脑分泌的促肾上腺皮质激素释放激素和垂体分泌的促肾上腺皮质激素起负反馈调节作用。因此，通过检测皮质醇的含量，可以诊断肾上腺的功能状态，同时可以间接观察垂体的功能状态。

由于人体血液中存在大量的皮质类固醇球蛋白及白蛋白会与血液中游离的皮质醇结合，结合后的皮质醇不能从肾小球滤过，此时皮质醇就失去了生物活性。而仅有少量的皮质醇以游离的形式存在，游离的皮质醇会经过肾小球滤出，进入尿液中。因此想要准确的测定血液样本中皮质醇的含量，如何释放出游离的皮质醇就显得尤为重要。

目前市面上选用的释放剂主要为达那唑，其结构式如下：

达那唑(Danazol)为人工合成的一种甾体杂环化合物，即雄激素17a-乙炔***的衍生物，为白色或乳白色结晶或结晶性粉末。由于不溶于水，必须通过有机溶剂，如DMF(二甲基甲酰胺)、氯仿、丙酮等溶解。然而这些有机溶剂会影响皮质醇释放，从而导致血液中游离皮质醇含量的检测不准确。因此选择既可以溶于水又起到皮质醇释放作用的释放剂显得尤为重要。

当前皮质醇免疫诊断的方法主要有以下几种方法：

1.异鲁米诺及其衍生物标记的直接电化学发光

原理：用异鲁米诺及其衍生物作为发光底物，采用金属离子的催化剂提高反应速度和灵敏度，用NaOH+H₂O₂作发光激发液，闪光型的直接化学发光，使用光子计数器采集整个反应过程发光计数的测量方法。

不足：异鲁米诺及其衍生物的发光为闪光型，其发光强度主要依赖于免疫反应中酶的浓度，如果不使用催化剂或催化剂量不足，发光信号变弱，而催化剂的量很难控制；其次，异鲁米诺受样本中的溶血干扰，影响血液中游离皮质醇含量的测定。

2.电化学发光

原理：ECLI法发光试剂标记物为二价的三联吡啶钌[Ru(bpy)₃]²⁺，另一试剂为三丙胺TPA，在阳极表面以上两种电化学活性物质可同时失去电子而被氧化。氧化的三丙胺失去一个H⁺而成为强还原剂，将氧化型的三联吡啶钌[Ru(bpy)₃]³⁺还原为激发态的[Ru(bpy)₃]²⁺，随即释放光子而恢复基态的发光底物，这一过程在电极表面周而复始地进行，不断发出光子而常保持底物浓度的恒定。

不足：对环境因素和其它非特异性反应过于敏感；对于金属离子、EDTA或其它抗凝剂、防腐剂的金属螯合物过于敏感；反应副产品的沉积也是一个潜在的干扰源；对超出pH为6-7的样本非常敏感；O₂在加入电压条件下，在620nm条件下发光，电化学发光受反应体系中溶解氧的干扰；清洗机构流动池清洗，流动池反复利用，对于清洗要求较高。

3.鲁米诺-HRP体系

原理：用鲁米诺作为发光底物在碱性条件下，形成一个双负离子。此双负离子可被氧气氧化产生一个非常不稳定的有机过氧化物。该过氧化物很不稳定，立即分解出氮气，生成三线态(激发态)的3-氨基邻苯二甲酸。后者恢复至基态时，发射出光子，持续发光约20分钟或更长。

不足：HRP受样本中重金属离子、温度、NaN₃等因素干扰；试剂稳定性受到样本中试剂稳定性受到HRP稳定性制约；标记物为蛋白分子，标记物加入增加了抗原抗体反应位阻。

4.金刚烷-ALP体系

原理：用螺旋金刚烷作为发光底物在碱性磷酸酶作用下发生水解，得到一个中等稳定的中间体AMPD^-(半衰期2～30分钟)。此中间体分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子，当其回到基态时产生470nm的光，并持续几十分钟，属于辉光型酶促化学发光，使用光子计数器截取其一段发光时间进行计数测量。

不足：ALP受样本中重金属离子、温度等因素干扰；试剂稳定性受到样本中试剂稳定性受到ALP稳定性制约；标记物为蛋白分子，标记物加入增加了抗原抗体反应位阻。

由上述可知，目前现有的体外诊断试剂其临床应用均存在弊端。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种ANS盐复合释放剂与检测血液中皮质醇的试剂盒，旨在解决现有的体外诊断试剂存在的上述问题。

本发明的技术方案如下：

一种检测血液中皮质醇的试剂盒，其中，包括以下组分：包被皮质醇抗体的磁珠、吖啶酯标记的皮质醇BSA复合物、ANS盐复合释放剂和皮质醇校准品。

所述的检测血液中皮质醇的试剂盒，其中，还包括发光清洗液A与发光清洗液B。

所述的检测血液中皮质醇的试剂盒，其中，所述磁珠的表面包裹有羧基、环氧基、甲苯黄酰基中的任意一种。

所述的检测血液中皮质醇的试剂盒，其中，吖啶酯与皮质醇BSA复合物标记的摩尔比例介于1:2.5-1:10之间。

所述的检测血液中皮质醇的试剂盒，其中，所述吖啶酯标记的皮质醇BSA复合物为Cortisol-3-BSA复合物。

所述的检测血液中皮质醇的试剂盒，其中，所述皮质醇校准品为去皮质醇激素血清稀释的皮质醇抗原。

所述的检测血液中皮质醇的试剂盒，其中，所述发光清洗液A包括以下组分：50-100g/L的磷酸氢二钠、5-30g/L的磷酸二氢钠、50-200g/L的氯化钠、0.1％-10％的Tween-20、0.1％-10％的液体生物防腐剂Proclin-300、0.5％-5％的过氧化氢及1-2M的硝酸。

所述的检测血液中皮质醇的试剂盒，其中，所述发光清洗液B包括以下组分：50-100g/L的磷酸氢二钠、5-30g/L的磷酸二氢钠、50-200g/L的氯化钠、0.1％-10％的Tween-20、0.1％-10％的液体生物防腐剂Proclin-300、0.01-2.5M的氢氧化钠及0.1％-2％TritonX-100。

一种ANS盐复合释放剂，其中，所述ANS盐复合释放剂包括以下组分：3-15mg/mlANS盐、0.1-0.5％NaN₃、100-200mM NaCl及20-60mM巴比妥钠。

所述的ANS盐复合释放剂，其中，所述ANS盐具有以下结构：

上述R⁺为NH₄ ⁺、K⁺或Na⁺。

有益效果：本发明通过ANS盐复合释放剂将人体血液样本中结合形式的皮质醇转变为游离形式的皮质醇，并通过化学发光的新型技术检测游离皮质醇的含量。选用的ANS盐复合释放剂可与不同糖皮质类固醇蛋白相结合，能够将血液中结合态的皮质醇充分释放出来；所述的化学发光为吖啶酯化学发光，吖啶酯化学发光为闪光型发光，发光用时少，能够完全捕捉反应所产生的光子；吖啶酯为人工合成物质，对样本干扰物质的抗干扰性较高，利用吖啶酯标记检测游离皮质醇的含量非常灵敏，使血液样本中总皮质醇的含量测定更为准确。

附图说明

图1为本发明实施例的理论浓度与实际检测浓度关系示意图。

具体实施方式

本发明提供一种ANS盐复合释放剂与检测血液中皮质醇的试剂盒，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供一种ANS盐复合释放剂，其中，所述ANS盐复合释放剂包括以下组分：3-15mg/ml ANS盐、0.1-0.5％NaN₃、100-200mM NaCl及20-60mM巴比妥钠。

ANS盐(8-苯胺基-1-萘磺酸盐)是一种荧光染料，对蛋白质的疏水表面具有高亲和力。ANS盐会结合到低极性区域的蛋白质表面。这些属性使ANS盐非常适合用于亲和力较大的疏水性配体及其相应的结合蛋白。而皮质醇为小分子类激素，通常在血液中与结合蛋白结合，且结合皮质醇不具有生物活性，采用添加ANS盐释放剂可以使游离皮质醇得到充分的释放；相比于传统的释放剂达那唑，ANS盐不需要在有机溶剂中溶解，可以直接在水中溶解，减少操作流程，降低试剂原材料耗材成本，而ANS盐对游离皮质醇的实际释放效率远大于达那唑对其释放效率，有效提高灵敏度及准确度。

其中，所述巴比妥钠的结构式如下所示，

巴比妥钠(BBTS)是一种化学物质，巴比妥钠和蛋白以静电力相互作用，该过程是一个熵增加、BBTS自由能降低的自发超分子作用过程。对于皮质醇等小分子和蛋白质等生物大分子之间的作用力类型有疏水力、氢键、范德华力和静电力。在一定温度和压力下，蛋白大分子的空间亚结构域以槽口相对的方式形成圆筒状结构，几乎所有的疏水性氨基酸残基都包埋在圆筒内部，构成疏水腔，而BBTS与蛋白之间存在一种静电力作用，使得BBTS分子和蛋白的结合部位处于这个圆筒形的疏水腔内，可使部分结合的皮质醇小分子得以释放。而ANS盐作用于亲和力较大的疏水性配体及其相应的结合蛋白疏水表面。当在ANS盐复合释放剂中加入ANS盐和BBTS，可以使结合蛋白中游离皮质醇得到更充分的释放。

本发明还提供一种检测血液中皮质醇的试剂盒较佳实施例，其中，包括以下组分：包被皮质醇抗体的磁珠、吖啶酯标记的皮质醇BSA复合物、如上所述的ANS盐复合释放剂与皮质醇校准品。优选地，本发明检测血液中皮质醇的试剂盒还包括发光清洗液A与发光清洗液B。

具体地，本发明包被皮质醇抗体的磁珠，其中，所述磁珠的粒径大小为1.5μm-2.8μm。优选地，所述磁珠的内核为四氧化三铁，所述磁珠的表面包裹有羧基、环氧基或甲苯黄酰基中的任意一种。磁珠使用前固相的不完全沉降会影响精确度，因此选择时应选分散性好，长时间放置磁珠抱团个数少，沉降速度慢的磁珠。而以四氧化三铁为内核的磁珠，其表面包裹的不同种类基团亲水性较好，使得磁珠之间可有效的进行分离、洗涤、再悬浮，可大大降低非特异性吸附，在反应真正达到平衡条件时能极大改善精密度。优选地，包被皮质醇抗体的磁珠中，按照1～2％的比例包被皮质醇抗体。

具体地，本发明所述吖啶酯标记的皮质醇BSA复合物，其中，吖啶酯与皮质醇BSA复合物标记的摩尔比例介于1:2.5-1:10之间，优选摩尔比例为1:5。选择亲水性好(非特异性吸附小)的吖啶酯，可以降低游离吖啶酯与固相磁珠间的非特异性吸附，通过化学修饰可以改变吖啶酯的疏水性，达到降低非特异性吸附的目的。优选地，本发明所述吖啶酯标记的皮质醇BSA复合物为Cortisol-3-BSA复合物。

具体地，所述皮质醇校准品为去皮质醇激素血清稀释的皮质醇抗原浓度为0.08μg/L-6μg/L的溶液。

具体地，所述发光清洗液A包括以下组分：50-100g/L的磷酸氢二钠、5-30g/L的磷酸二氢钠、50-200g/L的氯化钠、0.1％-10％的Tween-20、0.1％-10％的液体生物防腐剂Proclin-300、0.5％-5％的过氧化氢及1-2M的硝酸，百分含量为质量百分含量。例如，上述发光清洗液A可以包括以下组分：70g/L的磷酸氢二钠、10g/L的磷酸二氢钠、180g/L的氯化钠、10％的Tween-20、2％的液体生物防腐剂Proclin-300、4％的过氧化氢及1M的硝酸，百分含量为质量百分含量。

具体地，所述发光清洗液B包括以下组分：50-100g/L的磷酸氢二钠、5-30g/L的磷酸二氢钠、50-200g/L的氯化钠、0.1％-10％的Tween-20、0.1％-10％的液体生物防腐剂Proclin-300、0.01-2.5M的氢氧化钠及0.1％-2％TritonX-100，百分含量为质量百分含量。例如，上述发光清洗液B可以包括以下组分：70g/L的磷酸氢二钠、10g/L的磷酸二氢钠、180g/L的氯化钠、10％的Tween-20、2％的液体生物防腐剂Proclin-300、1.5M的氢氧化钠及1％TritonX-100，百分含量为质量百分含量。

下面通过实施例对本发明进行详细说明。

实施例

1、包被皮质醇抗体的磁珠固相试剂制备

1)、将5mg粒径为2.0μm磁珠，用50mM pH为6.0±0.1的MES缓冲液重悬，使用漩涡振荡器混匀，充分震荡后将离心管(注：离心管盖不要有磁珠残留)放置在磁分离架上，直到上清液完全透彻，用微量移液器小心移弃上清，重复操作两次。

2)、用50mM pH为6.0±0.1的MES缓冲液重悬磁珠至目标体积，漩涡振荡器混匀，充分震荡后按照1.5％包被比例加入适量皮质醇抗体，使用漩涡振荡器迅速充分混匀，然后加入50mM pH为6.0±0.1的MES缓冲液及5M硫酸铵缓冲液，使用漩涡振荡器迅速充分混匀，在37℃条件下使用混匀器摇匀包被过夜。

3)、反应结束后，将离心管(离心管盖不要有磁珠残留)放置在磁分离架上，直至上清液透彻后，用微量移液器小心移弃上清，加入1mL封闭液，所述封闭液为含5％(W/V)BSA的50mM pH为6.0±0.1的MES缓冲液，37℃条件使用混匀器摇匀封闭14h。

4)、将离心管(离心管盖不要有磁珠残留)放置在磁分离架上，直到上清液完全透彻后，用微量移液器小心移弃上清，37℃下使用含8％(w/v)BSA的10mmol pH为7.4±0.1的PB缓冲液清洗液清洗磁珠，磁珠浓度1mg/mL，将离心管(离心管盖不要有磁珠残留)放置在磁分离架上，直到上清液变完全透彻后，用微量移液器小心移弃上清，重复清洗3次，每次1小时。

5)、用含0.2％的泊洛沙姆试剂缓冲液重悬磁珠，漩涡振荡器充分混匀，2-8℃保存。

2、吖啶酯标记的皮质醇BSA复合物液相试剂制备

1)、用去离子水配制含2％BSA的20mM PBS吖啶酯纯化缓冲液。

2)、加入50μg的皮质醇BSA复合物，并加入100μL吖啶酯纯化缓冲液。

3)、按照吖啶酯与皮质醇BSA复合物标记的摩尔比例为1:5的比例，加入0.25-1μL吖啶酯(2mg/mL)。

4)、放入暗培养箱中，37℃摇床混匀，暗培养2h。

5)、加入封闭剂封闭1h。

6)、将标记完成的皮质醇BSA复合物纯化。

7)、按质量百分比计，用0.2％的泊洛沙姆试剂缓冲液标记液稀释成0.25-1μg/mL工作液。

3、ANS盐复合释放剂制备

按质量百分比计，用5mg/ml ANS-Na(8-苯胺基-1-萘磺酸钠盐)、0.1％NaN₃、150mMNaCl及40mM巴比妥钠配制ANS盐复合释放剂，调节pH至7.0，每100mL分装为一瓶，置于4℃保存。

4、皮质醇校准品制备

1)、将1000mL的去皮质醇激素血清置于37℃恒温水浴锅中，进行灭活。

2)、按质量百分比计，用150mM NaCl、1％Proclin-300及0.1％NaN₃加入灭火后的去皮质醇激素血清中，每100mL分装为一瓶，置于4℃保存。

3)、将皮质醇抗原纯品用上述配好的去皮质醇激素血清缓冲液倍比稀释:0.093、0.214、0.493、1.134、2.609、6μg/L共6瓶校准品。

5、发光清洗液A、B制备

1)、发光清洗液A：加入70g/L的磷酸氢二钠、10g/L的磷酸二氢钠、180g/L的氯化钠、10％的Tween-20、2％的液体生物防腐剂Proclin-300、4％的过氧化氢及1M的硝酸，将上述物质充分混合，得到发光清洗液A。

2)、发光清洗液B：加入70g/L的磷酸氢二钠、10g/L的磷酸二氢钠、180g/L的氯化钠、10％的Tween-20、2％的液体生物防腐剂Proclin-300、1.5M的氢氧化钠及1％TritonX-100，将上述物质充分混合，得到发光清洗液B。

高效检测血液中游离皮质醇试剂盒由上述包被皮质醇抗体的磁珠固相试剂、吖啶酯标记的皮质醇BSA复合物液相试剂、ANS盐复合释放剂、皮质醇校准品、发光清洗液A、发光清洗液B组成。

项目标准见下表1。

表1、项目标准

检测结果如下：

1、线性范围：

用Logit-log模型拟合，浓度范围为0-6μg/L，对于浓度大于6μg/L的标本应先进行稀释后再进行测定；线性系数：R²≥0.99；如下表2、附图1所示。

表2、浓度检测结果统计表

2.分析灵敏度:

用不含被测物的基质进行检测，重复测定20次，得出20次检测结果的RLΜ值(相对发光值)，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M-2SD所对应的RLΜ值，根据不含被测物的基质和低值校准品之间的浓度-RLΜ值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M-2SD所对应的RLΜ值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为分析灵敏度，其结果应符合≤0.08μg/L，数据如下表3所示。

表3、分析灵敏度检测结果统计表

3、精密度：

1)、分析内精密度：测试试剂盒配套的2个质控品，即低值质控品及高值质控品，在同一分析内，每个质控品重复检测10次，计算10次测量结果的平均值(M)和标准差(SD)，按如下公式(1)计算变异系数(CV)，测试结果变异系数(CV)应≤8.0％，数据如下表4所示。

2)、分析间精密度：用3个批次试剂盒，分别测试同一套试剂盒中的2个质控品，即低值质控品及高值质控品，每个批次试剂盒重复检测各样本10次，计算10次测量结果的平均值(M)和标准差(SD)，按如下公式(1)计算变异系数(CV)，则3个批号试剂盒之间的批间变异系数(CV)≤15.0％，数据如下表5所示。

公式如下：

CV＝SD/M×100％……………………(1)

式中：CV—变异系数；

SD—测量结果的标准差；

M—测量结果的平均值。

表4、分析内精密度检测结果统计表

分析内精密度	质控品低值(μg/L)	质控品高值(μg/L)
			1	0.310	2.903
2	0.309	2.976
			3	0.306	2.900
4	0.301	2.929
			5	0.316	2.826
6	0.312	3.109
			7	0.323	2.853
8	0.302	3.050
			9	0.324	3.020
10	0.310	2.887
			M	0.311	2.950
SD	0.008	0.095
			CV	2.5％	3.2％

表5、分析间精密度检测结果统计表

4、回收率：

将浓度在5μg/L～6μg/L范围内的皮质醇样品A加入到浓度在0.08μg/L～0.2μg/L范围内的样品B中，所加入的样品A与样品B之间的体积比例为1:9，根据如下公式(2)计算回收率R，结果应符合回收率90％-110％，测试数据如下表6所示。

式中：R--回收率；

V--样品A的体积；

V₀—样品B的体积；

c—样品B加入样本A后的检测浓度；

c₀—样品B的检测浓度；

c_s—样品A的浓度。

表6、回收率检测结果统计表

5.临床试验：

本实施例试剂与国外权威试剂(雅培试剂)比较500份临床血清样本检测结果，测试结果总体符合达到99.9％，可见本实施例方法制备的试剂盒与医院测值有较好的一致性。列举其中100份临床测试结果，如下表7所示。

表7、临床测试结果统计表

综上所述，本发明提供的一种ANS盐复合释放剂与检测血液中皮质醇的试剂盒，本发明通过ANS盐复合释放剂将人体血液样本中结合形式的皮质醇转变为游离形式的皮质醇，并通过化学发光的新型技术检测游离皮质醇的含量。选用的ANS盐复合释放剂可与不同糖皮质类固醇蛋白相结合，能够将血液中结合态的皮质醇充分释放出来；所述的化学发光为吖啶酯化学发光，吖啶酯化学发光为闪光型发光，发光用时少，能够完全捕捉反应所产生的光子；吖啶酯为人工合成物质，对样本干扰物质的抗干扰性较高，利用吖啶酯标记检测游离皮质醇的含量非常灵敏，使血液样本中总皮质醇的含量测定更为准确。本发明具有操作简便、灵敏度高、检测率快、费用低廉、便于自动化等优点。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种检测血液中皮质醇的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：包被皮质醇抗体的磁珠、吖啶酯标记的皮质醇BSA复合物、ANS盐复合释放剂和皮质醇校准品；

吖啶酯与皮质醇BSA复合物标记的摩尔比例介于1:2.5-1:10之间；

所述吖啶酯标记的皮质醇BSA复合物为Cortisol-3-BSA复合物；

所述 ANS盐复合释放剂包括以下组分：3-15mg/ml ANS盐、0.1-0.5% NaN₃、100-200mMNaCl及20-60mM巴比妥钠；

所述ANS盐复合释放剂中所述ANS盐具有以下结构：

；

其中R⁺为NH₄ ⁺、K⁺或Na⁺；

所述ANS盐直接在水中溶解。

2.根据权利要求1所述的检测血液中皮质醇的试剂盒，其特征在于，还包括发光清洗液A与发光清洗液B。

3.根据权利要求1所述的检测血液中皮质醇的试剂盒，其特征在于，所述磁珠的表面包裹有羧基、环氧基、甲苯黄酰基中的任意一种。

4.根据权利要求 1所述的检测血液中皮质醇的试剂盒，其特征在于，所述皮质醇校准品为去皮质醇激素血清稀释的皮质醇抗原。

5.根据权利要求 2所述的检测血液中皮质醇的试剂盒，其特征在于，所述发光清洗液A包括以下组分：50-100g/L的磷酸氢二钠、5-30g/L的磷酸二氢钠、50-200g/L的氯化钠、0.1%-10%的Tween-20、0.1%-10%的液体生物防腐剂 Proclin-300、0.5%-5%的过氧化氢及1-2M的硝酸。

6.根据权利要求 2所述的检测血液中皮质醇的试剂盒，其特征在于，所述发光清洗液B包括以下组分： 50-100g/L的磷酸氢二钠、5-30g/L的磷酸二氢钠、50-200g/L的氯化钠、0.1%-10%的Tween-20、0.1%-10%的液体生物防腐剂 Proclin-300、0.01-2.5M的氢氧化钠及0.1%-2% TritonX-100。