CN106501225B - 凝集素组识别的糖链在区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了凝集素组识别的糖链在区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤中的应用。本发明公开的凝集素组识别的糖链为由WGA、BPL、STL、DBA、PTL‑I和MAL‑I组成的凝集素组识别的糖基化蛋白中糖链，这些糖链在黏液性囊性肿瘤和浆液性囊性肿瘤患者的胰腺囊液中不同，STL、WGA、BPL和DBA识别的糖链在MCN患者胰腺囊液中的含量显著高于SCN患者，且PTL‑I和MAL‑I识别的糖链在MCN患者胰腺囊液中的含量显著低于SCN患者，在利用WGA与BPL联合区分SCN患者与MCN患者时的灵敏度为0.714，特异度为1。表明本发明的凝集素组可用于区分SCN患者与MCN患者。

Description

凝集素组识别的糖链在区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液 性囊性肿瘤中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，凝集素组识别的糖链在区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤中的应用。
背景技术
随着影像学技术的进步及广泛应用，胰腺囊性病变(pancreatic cyst lesion，PCL)检出率逐年提高。美国最近的研究统计PCL总患病率为2.5％，胰腺囊性病变是由一组拥有常见临床症状的不同病理类型的病变组成的异质性病变，主要包括单纯的胰腺假性囊肿(PPs)和胰腺囊性肿瘤(pancreatic cystic neoplasms，PCNs)。PCNs属隐匿性发病早期无明显体征，其以腺管或腺泡上皮增生、分泌物潴留形成囊肿为主要特征，在所有原发性胰腺肿瘤中约占1％～5％。2010版WHO肿瘤分类将胰腺囊性肿瘤细分为黏液性肿瘤：黏液性囊性肿瘤(Mucinous cystic neoplasm，MCN)、导管内***状瘤(Intraductal papillarymucinous neoplasm，IPMN)和非黏液性肿瘤：浆液性囊性肿瘤(Serous cystic neoplasm，SCN)、实性假***状瘤(Solid pseudopaillary neoplasm，SPN。其中，恶性胰腺囊性病变包括黏液性囊性肿瘤(MCN)和导管内***状黏液瘤(IPMN)以及黏液性囊腺癌(Mucinouscystic adenocarcinoma，MCA)；而浆液性囊性肿瘤(SCN)则多为良性病变。不同病理类型其治疗方法不同，但是单从临床症状和影像学表现很难区分其良恶性，囊性病变通常由CT发现，但是CT对于诊断恶性肿瘤的敏感性低于70％，而特异性则在87％-98％之间，MRI的T2WI相能够提供更好的软组织对比，因而更常用于囊肿良恶性的鉴别诊断，但是其准确度依然停留于20％-80％的较低区间内。单从影像学鉴别囊性病变良恶的准确性仍较低，同时常用的血清学肿瘤标志物：CEA；CA19-9；CA72-4以及CA153等，在鉴别癌前病变方面特异性、敏感性较低。病理组织学检查仍是目前临床诊断的金标准，但鉴于组织学检查固有的缺陷如损伤性检查、不能动态检测等，寻求微创性的早期诊断方法是防控疾病恶变的关键.超声内镜下细针穿刺活检(endoscopic ultrasonography-guided fine needle aspiration，EUS-FNA)能够为胰腺囊性肿瘤的诊断提供直观的第一手资料。
蛋白质糖基化是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质，和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。研究表明，70％人类蛋白包含一个或多个糖链，1％的人类基因组参与了糖链的合成和修饰。哺乳动物中蛋白质的糖基化类型可分为三种：N-糖基化、O-糖基化和GPI糖基磷脂酰肌醇锚。大多数糖蛋白质只含有一种糖基化类型，但是有些蛋白多肽同时连有N-糖链、O-糖链或糖氨聚糖。
凝集素由于其可特异性识别不同糖链结构并可以多价形式与糖链高亲和性结合的特性被广泛用于糖组学的研究，凝集素芯片通过固定于芯片上的凝集素探针与样品中糖蛋白糖链特异性结合，可以高通量地检测出样品中糖蛋白糖链结构和连接方式的变化，是研究糖蛋白糖链结构变化最有效的分析工具之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测凝集素组识别的糖链的物质在下述A1)或A2)中的应用：
A1)制备区分或辅助区分胰腺黏液性囊性肿瘤(Mucinous cystic neoplasm，MCN)患者和胰腺浆液性囊性肿瘤(Serous cystic neoplasm，SCN)患者产品；
A2)区分或辅助区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤；
所述凝集素组包括b1)或b2)：
b1)WGA和/或BPL；
b2)由b1)与STL、DBA、PTL-I和MAL-I中的全部或部分组成的组合物。
上述应用中，所述凝集素组还可包括三十一种凝集素中的至少一种；所述三十一种凝集素为Jacalin、ECA、HHL、WFA、GSL-Ⅱ、MAL-Ⅱ、PHA-E、SJA、PNA、EEL、AAL、LTL、MPL、LEL、GSL-Ⅰ、LCA、RCA120、BS-Ⅰ、ConA、PTL-Ⅱ、DSA、SBA、VVA、NPL、PSA、ACA、UEA-Ⅰ、PWM、GNA、PHA-E+L和SNA。
其中，所述凝集素组中各凝集素识别的糖链如实施例中表2或/和表4所示。
上述应用中，所述凝集素组可仅为b1)或b2)，还可为由b1)或b2)与所述三十一种凝集素中的至少一种组成的组合物。
上述应用中，所述凝集素组识别的糖链含量可为所述凝集素组识别的糖链在胰腺囊液中的含量。
上述应用中，所述检测所述凝集素组识别的糖链含量的物质可包括也可仅为检测所述凝集素组识别的糖链含量所需的试剂和/或仪器。所述检测所述凝集素组识别的糖链含量的物质具体可包括或可为所述凝集素组或含有所述凝集素组的芯片。
所述检测所述凝集素组识别的糖链含量的试剂可包括所述凝集素组、荧光染料、封闭缓冲液、孵育缓冲液、PBST和/或PBS。所述检测所述凝集素组识别的糖链含量的试剂也可仅由所述凝集素组、所述荧光染料、所述封闭缓冲液、所述孵育缓冲液、PBST和/或PBS组成。所述荧光物质可为Cy3(美国Amerhsma公司)。所述封闭缓冲液可为向PBS中加入BSA、甘氨酸和Tween-20得到的溶液，所述封闭缓冲液中BSA、甘氨酸和Tween-20的浓度分别为2％(质量百分比浓度)、500mmol/L和0.1％(质量百分比浓度)。所述孵育缓冲液可为向PBS中加入BSA、甘氨酸和Tween-20得到的溶液，所述孵育缓冲液中BSA、甘氨酸和Tween-20的浓度分别为2％(质量百分比浓度)、500mmol/L和0.1％(质量百分比浓度)。PBST为向PBS加入Tween-20得到的Tween-20质量百分比浓度为0.1％的溶液。甘氨酸可为美国Sigma-Aldrich公司产品。Tween-20可为美国Sigma-Aldrich公司产品。上文中的PBS的pH均可为7.4。
所述检测所述凝集素组识别的糖链含量的仪器可包括所述芯片和/或GenPix4000B芯片扫描仪。所述检测所述凝集素组识别的糖链含量的也可仅为所述芯片和/或GenPix 4000B芯片扫描仪。GenPix 4000B芯片扫描仪为美国Axon公司产品。
所述检测所述凝集素组识别的糖链含量的物质还可由检测所述凝集素组识别的糖链含量所需的试剂和/或仪器与数据处理装置组成，所述数据处理装置用于将来自待测对象的所述凝集素组识别的糖链的含量转换为所述待测对象的诊断值，根据所述待测对象的诊断值确定所述待测对象为MCN患者或SCN患者。所述数据处理装置可为软件和/或模块。所述软件可为GenePix 3.0软件。
在本发明的一个实施例中，阐述了用所述凝集素组中的WGA和BPL区分MCN患者和SCN患者的方法，所述方法包括：将来自待测对象的反应WGA和BPL识别的糖链的含量的荧光归一化数值代入公式1得到所述待测对象的诊断值；
公式1中，WGA表示利用WGA检测所述待测样本时的荧光信号归一化数值；BPL表示利用BPL检测所述待测样本时的荧光信号归一化数值，Y表示所述待测样本的诊断值。公式1中的WGA具体为利用WGA检测所述待测样本时的荧光信号与利用WGA、BPL、STL、DBA、PTL-I、MAL-I、Jacalin、ECA、HHL、WFA、GSL-Ⅱ、MAL-Ⅱ、PHA-E、SJA、PNA、EEL、AAL、LTL、MPL、LEL、GSL-Ⅰ、LCA、RCA120、BS-Ⅰ、ConA、PTL-Ⅱ、DSA、SBA、VVA、NPL、PSA、ACA、UEA-Ⅰ、PWM、GNA、PHA-E+L和SNA检测所述待测样本时的荧光信号之和的比值，BPL具体为利用BPL检测所述待测样本时的荧光信号与利用WGA、BPL、STL、DBA、PTL-I、MAL-I、Jacalin、ECA、HHL、WFA、GSL-Ⅱ、MAL-Ⅱ、PHA-E、SJA、PNA、EEL、AAL、LTL、MPL、LEL、GSL-Ⅰ、LCA、RCA120、BS-Ⅰ、ConA、PTL-Ⅱ、DSA、SBA、VVA、NPL、PSA、ACA、UEA-Ⅰ、PWM、GNA、PHA-E+L和SNA检测所述待测样本时的荧光信号之和的比值。
利用公式1以未知MCN患者和SCN患者的胰腺囊性肿瘤患者为待测对象对MCN患者和SCN患者进行区分时，如Y大于0.70，所述待测对象为或候选为MCN患者，如Y小于或等于0.70，所述待测对象为或候选为SCN患者。
在实际应用中，利用所述凝集素组识别的糖链的含量区分MCN患者和SCN患者时，可根据实际情况从所述凝集素组中选择合适的凝集素及相应的模型区分MCN患者和SCN患者，只要是可以利用本发明的凝集素组识别的糖链的含量对MCN患者和SCN患者进行区分，均属于本发明的保护范围。
所述凝集素芯片为将所述凝集素组中各凝集素固定于支持物上得到的芯片。所述支持物可为环氧化合物片基。所述环氧化合物片基为利用环氧化合物制备的支持物。所述凝集素芯片可含有阴性质控点和/或位置标记。所述凝集素芯片的阴性质控点可为BSA。所述凝集素芯的位置标记可为所述荧光染料标记的BSA。将凝集素固定于支持物上可利用博奥晶芯SmartArrayer48点样仪器(北京博奥生物集团有限公司)进行。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述凝集素组识别的糖链含量在下述A1)或A2)中的应用：
A1)制备区分或辅助区分胰腺黏液性囊性肿瘤(Mucinous cystic neoplasm，MCN)患者和胰腺浆液性囊性肿瘤(Serous cystic neoplasm，SCN)患者产品；
A2)区分或辅助区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述凝集素组识别的糖链作为区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤标志物在区分或辅助区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤中的应用。
为解决上述技术问题，本发明还提供了以所述凝集素组识别的糖链作为区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤标志物的区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤的物质在下述A1)或A2)中的应用；
A1)制备区分或辅助区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤产品；
A2)区分或辅助区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤。
为解决上述技术问题，本发明还提供了区分或辅助区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤产品，为检测所述凝集素组识别的糖链含量的物质。
上述产品中，所述产品可包括所述凝集素组或含有所述凝集素组的芯片。
上述产品中所述芯片可为上述应用中所述芯片。
上述产品中，所述凝集素组中的各凝集素均可由荧光物质标记。所述荧光物质可为Cy3。
所述检测所述凝集素组识别的糖链含量的物质可为上文所述检测所述凝集素组识别的糖链含量的物质。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述产品在下述A1)或A2)中的应用；
A1)制备区分或辅助区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤产品；
A2)区分或辅助区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤。
为解决上述技术问题，本发明还提供了构建区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤的方法。
本发明所提供的构建区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤的方法，包括：分别对胰腺黏液性囊性肿瘤组和胰腺浆液性囊性肿瘤组胰腺囊液中的糖链进行定量分析，根据分析结果获得胰腺囊性肿瘤糖链特征谱；所述胰腺囊性肿瘤糖链特征谱由所述凝集素组识别的糖链组成。
上述方法中，所述胰腺黏液性囊性肿瘤组可包括至少一个胰腺黏液性囊性肿瘤患者。所述胰腺浆液性囊性肿瘤组可包括至少一个胰腺浆液性囊性肿瘤患者。
上述方法中，对胰腺囊液中的糖链进行定量分析，可利用所述凝集素组进行。所述凝集素组中的各凝集素均可由荧光物质标记。所述荧光物质可为Cy3。
上述方法中，对胰腺囊液中的糖链进行定量分析可包括利用含有所述凝集素组的芯片分别对胰腺黏液性囊性肿瘤组和胰腺浆液性囊性肿瘤组胰腺囊液中的糖链进行定量分析。具体可包括：将待测样品中的蛋白质用所述荧光物质标记后与所述芯片孵育，确定所述待测样品中所述凝集素组识别的糖链的含量。
所述胰腺囊性肿瘤糖链特征谱可为公式1。
利用胰腺囊性肿瘤糖链特征谱可区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤。
在本发明的另一个实施例中，对胰腺囊液中的糖链进行定量分析包括利用所述凝集素组分别对胰腺黏液性囊性肿瘤组和胰腺浆液性囊性肿瘤组胰腺囊液中的糖链进行定量分析。
本发明中，所述糖链为糖基化蛋白中糖链。
本发明通过比较SCN患者与MCN患者的不同凝集素识别的糖蛋白糖链含量的差异，并通过相关性分析，发现用于区分SCN患者与MCN患者的六种凝集素识别的糖链，这六种凝集素分别为STL、WGA、BPL、DBA、PTL-I和MAL-I，STL、WGA、BPL和DBA这四种凝集素每种凝集素识别糖链在MCN患者胰腺囊液中的含量显著高于SCN患者，且PTL-I和MAL-I这两种凝集素每种凝集素识别糖链在MCN患者胰腺囊液中的含量显著低于SCN患者，在利用WGA与BPL联合区分SCN患者与MCN患者时的灵敏度为0.714，特异度为1。表明本发明的凝集素组识别的糖链可以作为生物分子标识，用于区分SCN患者与MCN患者，可以利用本发明的凝集素组及其识别的糖链区分SCN患者与MCN患者。
附图说明
图1为凝集素芯片点样阵列图及应用于糖蛋白糖链的荧光检测图，图中A为凝集素芯片点样阵列图，B为胰腺黏液性囊腺瘤(MCN)、胰腺浆液性囊腺瘤(SCN)患者胰腺囊性肿瘤囊液糖蛋白糖链荧光检测结果图；
图2为GenePix3.0软件分析芯片扫描图，其中横坐标表示荧光强度。
图3为ROC曲线分析结果。
图4为以STL与BPL为例的验证图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的封闭缓冲液为向PBS中加入BSA、甘氨酸和Tween-20得到的溶液，封闭缓冲液中BSA、甘氨酸和Tween-20的浓度分别为2％(质量百分比浓度)、500mmol/L和0.1％(质量百分比浓度)。孵育缓冲液为向PBS中加入BSA、甘氨酸和Tween-20得到的溶液，孵育缓冲液中BSA、甘氨酸和Tween-20的浓度分别为2％(质量百分比浓度)、500mmol/L和0.1％(质量百分比浓度)。PBST为向PBS加入Tween-20得到的Tween-20质量百分比浓度为0.1％的溶液。甘氨酸可为美国Sigma-Aldrich公司产品。Tween-20可为美国Sigma-Aldrich公司产品。上文中的PBS的pH均为7.4。
实施例1、用于区别MCN患者与SCN患者的糖基化蛋白糖链
(1)研究对象及样本采集
研究对象：经医院伦理委员会通过(伦理号：S2014-108-01)，排除恶性肿瘤病史；严重心肺功能不全；出凝血功能障碍；前期经影像学诊断明确，中国人民解放军总医院消化内科联合肿瘤外科病区收治PCNs患者，其中确诊的MCN患者17例(入组MCN组)，SCN患者18例(入组SCN组)。
囊液采集至少0.2ml并立即置于冰上，加入蛋白酶抑制剂(每0.1毫升囊液加入1μL)防止蛋白降解。
(2)胰腺囊性肿瘤囊液蛋白处理和荧光标记
35例囊液样本各取相应体积(内含100μg总蛋白)与100μL 0.1M Na2CO3(pH 9.3)缓冲液混匀，混合液与Cy3荧光染料室温孵育3h，用Sephadex G-25柱分离纯化Cy3标记的蛋白质，并用分光光度计测定收集液中被标记蛋白质的浓度。
(3)凝集素芯片和数据分析
凝集素芯片上固定有37种凝集素组成的凝集素组，凝集素的点样阵列如图1中A所示，各凝集素的详细信息如表1所示。
将表1中的37种凝集素分别按照各凝集素厂家提供的使用说明配成1mg/mL的点样液。其中Cy3标记的和非标记的BSA分别为位置标记和阴性质控点。按博奥晶芯SmartArrayer48点样仪器(北京博奥生物集团有限公司)48点样***设置参数每种凝集素重复点样三次，其点样矩阵为4×10的阵列重复点制4个区，点制于环氧化合物片基上。点样完毕将芯片置于湿度为50％的环境中孵育过夜，然后在37℃真空干燥箱中干燥3h，便于凝集素与片基有效的结合，备用。封闭前，点制好的芯片用pH7.4的1×PBST和1×PBS各清洗芯片2次，每次5min，甩干，得到凝集素芯片。
表1、凝集素芯片凝集素信息
在芯片杂交盒中，于封闭缓冲液中4rpm匀速旋转25℃封闭1h，用PBST，pH7.4的PBS各洗2次，每次5min，甩干；MCN组和SCN组个例样本各取5μg标记后蛋白质，分别与孵育缓冲液混合后，与芯片室温孵育3h，用10mmol/L PBST与10mmol/L PBS各洗2次，每次5min，甩干；GenPix 4000B芯片扫描仪(美国Axon公司)扫描芯片。然后用GenePix 3.0软件从扫描结果图中获取荧光信号强度值和背景值等信息进行分析，可获得MCN组和SCN组凝集素芯片上每个点的荧光信号值，该款芯片中每种凝集素对应3个重复点，即实际每种凝集素重复检测3次，均获得3个信号数据，抽取中值，即每个凝集素对应一个中值。计算每个凝集素的中值所占37种凝集素中值之和的比例完成数据归一化。每个样本做三次重复。凝集素归一化荧光强度表示为三次重复的均值±标准偏差值。计算每个凝集素荧光强度在MCN组归一化数值与SCN组归一化数值的比值(即ratio值)来比较糖基化蛋白质的相对变化。数据同时利用SPSS19进行t检验分析。
一个MCN组样本和一个SCN组样本的GenPix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的结果如图1中B所示。GenePix3.0软件分析芯片扫描图如图2所示。结果表明，(1)MCN组和SCN组中，糖基化蛋白中，Jacalin，LEL，LCA，ConA以及ACA的信号强度均值均大于0.05，表明其特异性识别的糖基化蛋白的糖链以高甘露糖和核心岩藻糖糖链结构为主，LEL和ConA识别的高甘露糖型N-糖链，Jacalin识别的Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr(T)和GalNAcα-Ser/Thr(Tn)，ACA识别的Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr(T antigen),在两类囊腺瘤囊液中含量均较高；(2)凝集素WFA识别的terminating in GalNAcα/β1-3/6Gal结构,STL识别的trimers andtetramers of GlcNAc和core(GlcNAc)的N-糖链结构只在MCN组样本中具有较高含量.(3)而凝集素PTL-I识别的GalNAc,GalNAcα-1,3Gal,GalNAcα-1,3Galβ-1,3/4Glc,凝集素MAL-I识别的Galβ-1,4GlcNAc结构只在SCN组样本中含量升高。
MCN、SCN囊液糖蛋白糖链谱的变化：
利用凝集素芯片分别对MCN组与SCN组囊液样本进行检测，通过软件获取芯片数据并归一化处理后，计算ratio值(表2、表3与表4)，归一化数据如图2所示。
表2、MCN及SCN囊液中差异表达的糖蛋白糖链结构及特异识别的糖链结构的凝集素
表3、各样本荧光信号归一化数值
表4、其余凝集素的Ratio值
根据统计学理论，Ratio值介于0.5与2之间，则样本中相同糖蛋白糖链含量在MCN组与SCN组两组样本间无差异；Ratio值≥2，则MCN组样本中的糖蛋白糖链含量显著高于SCN组中相同糖蛋白糖链含量；Ratio值≤0.5，则MCN组样本中的糖蛋白糖链含量显著低于SCN组中相同糖蛋白糖链的含量。
结果发现，6种凝集素识别的糖基化蛋白糖链含量在MCN组与SCN组囊液中有显著差异。糖蛋白糖链中，STL识别的trimers and tetramers of GlcNAc和core(GlcNAc)的N-糖链结构、WGA识别的多价唾液酸结构、BPL识别的Galβ1-3GalNAc与Terminal GalNAc、DBA识别的αGalNAc、Tn antigen、GalNAcα1-3((Fucα1-2))Gal(blood group A antigen)在MCN组中含量明显增加。PTL-I和MAL-I这两种凝集素识别的糖链结构在SCN组中含量显著增加(R<0.5，p<0.05)。表明可以利用这6种凝集素及含有其识别的糖蛋白糖链区分MCN患者与SCN患者。
为区分MCN患者与SCN患者，以WGA与BPL为例构建了利用多因素Logistic回归构建了区分MCN患者与SCN患者的数学模型，见公式1。
公式1中，WGA表示利用WGA进行检测时样本荧光信号归一化数值，BPL表示利用BPL进行检测时样本荧光信号归一化数值，Y表示样本的诊断值。
利用公式1以未知MCN患者和SCN患者的胰腺囊性肿瘤患者为待测对象时进行ROC曲线分析(图3)，曲线下面积AUC＝0.853，灵敏度为0.714，特异度为1，该方法判定为胰腺癌患者的阈值为0.70，即当Y大于0.70时，待测对象疑似为MCN患者，当Y小于或等于0.70时，待测对象为SCN患者。
(4)凝集素印迹
为进一步验证凝集素芯片的结果，以凝集素STL和BPL为例，将Cy3荧光标记的凝集素与转膜后的胰腺囊性肿瘤囊液蛋白孵育，经扫描仪扫描和Genepix 3.0软件分析，确定含有STL和BPL识别的糖链的糖基化蛋白在MCN组与SCN组囊液中的含量情况。具体操作步骤如下：
将30μg蛋白样本先经SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后，取出凝胶，在转膜缓冲液中漂洗数秒。PVDF膜使用前先用无水甲醇预处理5min后转至转膜缓冲液中平衡好后使用。取出凝胶使用TE 70PWR半干转膜仪按照每平方厘米PVDF膜电流0.8mA，恒流转膜1.5h。转膜完毕后，立即把PVDF膜放置到预先准备好的TBST中清洗两次，每次10min洗去膜上残留的转膜缓冲液.然后转入Carbo-free封闭液中，在摇床上轻摇1h封闭。封闭结束后，直接将Cy3荧光标记的凝集素按终浓度2μg/mL加入Carbo-free封闭液中，在摇床上轻摇4℃避光过夜。TBST清洗膜3次，每次10min，然后在Storm840凝胶成像***中设置PMT为800，红色荧光通道(635nm激发波长/650LP发射波长)下扫描图像，用Image J软件读取蛋白条带灰度值。
结果(图4)显示，STL和BPL在18例MCN患者的囊液样本中的荧光强度明显高于在17例SCN患者囊液样本中的荧光强度，表明，糖基化蛋白中，STL和BPL结合的糖链在MCN患者囊液中的含量高于在SCN患者囊液中的含量。在60kDa和50kDa的两条蛋白条带(白框勾勒)处，STL作为探针在MCN患者中的荧光强度显著高于在SCN患者中的荧光强度(P<0.05)；在120kDa的蛋白条带(白框勾勒)处，BPL作为探针在MCN患者中的荧光强度显著高于在SCN患者中的荧光强度(P<0.05)。结果显示与凝集素芯片结果一致。证明这些凝集素可以作为探针通过对胰腺囊性肿瘤囊液中的糖蛋白糖链的检测区别SCN患者与MCN患者。

Claims (7)

1.检测凝集素组识别的糖链含量的物质在制备区分或辅助区分胰腺黏液性囊性肿瘤患者和胰腺浆液性囊性肿瘤患者产品中的应用：
所述凝集素组包括WGA、BPL、STL、DBA、PTL-I和MAL-I。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述凝集素组还包括Jacalin、ECA、HHL、WFA、GSL-Ⅱ、MAL-Ⅱ、PHA-E、SJA、PNA、EEL、AAL、LTL、MPL、LEL、GSL-Ⅰ、LCA、RCA120、BS-Ⅰ、ConA、PTL-Ⅱ、DSA、SBA、VVA、NPL、PSA、ACA、UEA-Ⅰ、PWM、GNA、PHA-E+L和SNA中的全部或部分。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述凝集素组识别的糖链含量为所述凝集素组识别的糖链在胰腺囊液中的含量。
4.以权利要求1或2中所述凝集素组识别的糖链作为区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤标志物的区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤的物质在制备区分或辅助区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤产品中的应用。
5.区分或辅助区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤产品，为检测权利要求1或2中所述凝集素组识别的糖链含量的物质。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：所述产品包括权利要求1或2中所述凝集素组或含有权利要求1或2中所述凝集素组的芯片。
7.权利要求5或6中所述产品在制备区分或辅助区分胰腺黏液性囊性肿瘤和胰腺浆液性囊性肿瘤产品中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN109752546B (zh) * 2017-11-03 2022-03-11 上海交通大学 血清免疫球蛋白g糖链修饰在肺部磨玻璃结节早期诊断中的用途
CN110045125B (zh) * 2019-04-03 2022-08-09 中国医学科学院北京协和医院 一种用于诊断腹膜后纤维化的生物标志物及其用途
CN110045126B (zh) * 2019-04-03 2022-08-09 中国医学科学院北京协和医院 一种用于诊断自身免疫性胰腺炎的生物标志物及其用途
CN111220804B (zh) * 2020-01-19 2023-04-28 深圳格道糖生物技术有限公司 基于血清糖蛋白糖型评估乳腺癌化疗效果的标志物及其应用
CN111551723A (zh) * 2020-06-01 2020-08-18 深圳格道糖生物技术有限公司 特定凝集素在基于唾液糖蛋白糖链结构鉴别胰腺癌方面的应用及相关产品
CN112067822B (zh) * 2020-08-31 2023-04-18 西北大学 一种凝集素探针组合在基于尿蛋白糖型鉴别黑叶猴性别方面的应用
CN113702637B (zh) * 2021-08-09 2023-04-07 西北大学 乳腺癌新辅助化疗疗效预测的凝集素测试载体和试剂盒以及预测模型

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lectin Histochemistry in Mucinous and Serous Ovarian Neoplasms;Hironobu Sasano等;《International Journal of Gynecological Pathology》;19911231;第252-259页
凝集素标记与妇科肿瘤;唐建武;《国外医学.妇产科学分册》;19930829;全文
囊液分析鉴别诊断胰腺囊性病变的进展;张伟 等;《中华胃肠内镜电子杂志》;20160229;全文

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