CN106478795A - 一种海蛇改造体抗菌肽hc3-5及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体的说是一种青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽QHA改造体抗菌肽HC3‑5及其制备方法和应用。改造体抗菌肽为青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)体内抗菌肽QHA的改造体HC3‑5，为直链多肽，含有17个氨基酸残基，C末端酰胺化，分子量2150.75Da，等电点12.32。本发明涉及改造体抗菌肽HC3‑5具有广谱高效的抗菌活性，此外具有分子量小、结构简单、溶血活性低、稳定性高、制备方法简单等有益特点。

Description

一种海蛇改造体抗菌肽HC3-5及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体的是一种青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽QHA改造体抗菌肽HC3-5及其制备方法和应用。
背景技术
近年来传统抗生素的大规模滥用导致越来越严重的病原微生物耐药问题，给人类健康带来巨大的威胁。临床上应对耐药微生物感染的措施是使用对耐药微生物尚未使用过的新的或者替代性的抗生素，因此这就需要持续开发新的抗微生物药物。
抗菌肽是生物体基因编码的一种天然小分子多肽，是生物体免疫***的一种重要分子，对细菌、真菌、病毒甚至原虫均具有直接的杀灭作用。抗菌肽具有分子量小、结构简单、抗菌活性强、杀菌机制独特、毒性低和不易引起耐药性等优点，因此自发现之日起就被认为是具有极大开发潜力的新一代抗生素。到目前为止，已从不同生物体中发现超过1500多种不同的抗菌肽，而且其数目还在增加。
虽然抗菌肽数量增加，但活性好且稳定性高的抗菌肽数量并不多，以天然抗菌肽为模板进行改造，是发现新型理想抗菌肽最为快速高效的方法。抗菌肽的改造可以从氨基酸顺序、替换、增减、构型等改变方式入手，对于合成抗菌肽而言，序列短、活性强、稳定性高、毒性低是抗菌肽改造的最终目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽QHA改造体抗菌肽HC3-5及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种改造体抗菌肽，改造体抗菌肽为青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽QHA改造体HC3-5，其是直链多肽，含有17个氨基酸残基，其C末端酰胺化，分子量2150.75Da，等电点12.32。
所述改造体抗菌肽氨基酸序列为：Lys1Phe2Phe3(D-型)Lys4Arg5Leu6(D-型)Leu7Lys8Ser9Val10Arg11Arg12Ala13Val14Lys15Lys16Phe17-NH2。
改造体抗菌肽的应用，所述改造体抗菌肽用于制备抗菌药物、防感染药物、防腐剂、动物饲料或化妆品前体的用途。
本发明的有益效果在于：本发明根据青环海蛇抗菌肽QHA的氨基酸序列，利用分子改造方法设计改造体HC3-5，该改造体具有广谱高效的抗菌活性，此外具有分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简单等有益特点，且D型构型的改变增加了抗菌肽的稳定性，为抗菌肽改造及药物研发提供参考。
附图说明
图1 Hc3-5热处理后HPLC图谱
具体实施方式:
下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1
海蛇改造体抗菌肽HC3-5的化学合成
青环海蛇抗菌肽QHA是基因编码的一种直链多肽，含有30个氨基酸残基，分子量3628.5Da，等电点12.61。青环海蛇抗菌肽QHA全序列为：Lys1Phe2Phe3Lys4Arg5Leu6Leu7Lys8Ser9Val10Arg11Arg12Ala13Val14Lys15Lys16Phe17Arg18Lys19Lys20Pro21Arg22Leu23Ile24Gly25Leu26Ser27Thr28Leu29Leu30。根据青环海蛇抗菌肽QHA的氨基酸序列，利用分子改造方法设计获得了改造体HC3-5，并利用多肽固相合成的方法对其进行了化学合成，具体制备方法如下：
Ⅰ、HC3-5的制备方法：根据上述HC3-5的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成其全序列，利用HPLC反相柱层析脱盐。
Ⅱ、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。
Ⅲ、纯化的HC3-5用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
测定结果为：
HC3-5是青环海蛇抗菌肽QHA的一种改造体。HC3-5是一种直链多肽，含有17个氨基酸残基，其C末端酰胺化，分子量2150.75Da，等电点12.32。HC3-5全序列为：Lys1Phe2Phe3(D-型)Lys4Arg5Leu6(D-型)Leu7Lys8Ser9Val10Arg11Arg12Ala13Val14Lys15Lys16Phe17-NH2。
实施例2
HC3-5药理实验：
1. HC3-5抗菌活性测定：
(1)分别挑取保存于斜面上的试验菌株均匀涂布于MH固体培养基(购自青岛海博生物技术 有限公司)平板上，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加溶解于灭菌去离子水的2mg/ml的抗菌肽HC3-5样品溶液10μl，于37℃倒置培养18－20小时，观察抑菌圈形成与否。若样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明样品抗菌活性越强。
(2)抗菌肽HC3-5最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration)测定(2倍稀释法)：
选择上步实验中具有抑菌圈的菌株进行MIC测定实验。试验菌株接种到MH液体培养基(青岛海博生物技术有限公司)中，37℃振荡培养到对数生长期，而后用新鲜MH液体培养基将培养至对数生长期的培养液稀释到2×105cfu/ml待用。
在无菌96孔板各孔中预先加入100μl MH液体培养基，然后在第一孔中加入100μl用MH液体培养基稀释到一定浓度的经0.22μm孔滤膜过滤的的抗菌肽HC3-5样品溶液，混匀后取100μl加入第2孔，依次倍比稀释(参见表1)，自第9孔吸出100μl弃去，第10孔系对照管。
表1稀释方法
将上述各管混匀后放置37℃缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。结果如表2所示。
由表2可见，抗菌肽HC3-5对***、革兰氏阴性细菌和真菌均表现出很强的抗菌活性，其中包括大量临床分离致病菌，MIC值处于2.34-150μg/ml的范围。
表2抗菌肽HC3-5抗菌活性
MIC：最小抑菌浓度，以上结果为三次独立重复实验平均值；实验菌株数字1/2等代表临床分离的不同致病微生物。
2. HC3-5溶血活性测定：
将采集的兔血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成107-108cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的HC3-5样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％＝A样品-A阴性对照/A阳性对照×100％。
表3抗菌肽HC3-5溶血活性
样品浓度(μg/ml) 溶血活性(％)
200 6.88
100 5.80
50 5.43
25 4.35
12.5 2.17
6.25 2.54
结果表明样品浓度为100μg/ml，HC3-5的溶血百分比为5.80％，在浓度为200μg/ml时，HC3-5的溶血百分比为6.88％，说明HC3-5具有较低的溶血活性，不易引起哺乳动物红细胞破裂溶解。
实施例3
HC3-5稳定性实验：
人血清稳定性实验
用注射器抽取健康人血5ml，分装到灭菌的离心管中，室温放置2h，然后置于4℃冰箱过夜。2000rpm离心10min，淡黄色上清液即为人血清。用移液器吸出血清，分装到灭菌离心管中，-20℃冰箱保存。
将Hc3-5抗菌肽样品与人血清按一定比例混合，使Hc3-5抗菌肽样品的浓度为200μg/ml，血清浓度为25％，阴性对照为样品溶解液水与血清混合物。将混合物置于37℃培养箱孵育，于0-6h，按照实施例1中最小抑菌浓度测定方法，检测血清处理后Hc3-5抗菌肽对大肠杆菌1的抗菌活性。
表4抗菌肽HC3-5血清稳定性
热稳定性实验
Hc3-5抗菌肽样品水溶液(1mg/ml)沸水浴3h，室温过夜，Hc3-5抗菌肽样品粉末配置为1.2mg/ml水溶液，使用Agilent 1260进行高效液相检测(0.1％TFA乙腈：0.1％TFA水＝20:80，25min)，记录色谱图。
结果发现，如图1所示，高温处理3h后没有出现降解峰，抗菌肽Hc3-5具有较好的热稳定性。

Claims (3)

1.一种改造体抗菌肽，其特征在于：改造体抗菌肽为青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽QHA改造体HC3-5，其是直链多肽，含有17个氨基酸残基，其C末端酰胺化，分子量2150.75Da，等电点12.32。
2.根据权利要求1所述的改造体抗菌肽，其特征在于：所述改造体抗菌肽氨基酸序列为：Lys1Phe2Phe3(D-型)Lys4Arg5Leu6(D-型)Leu7Lys8Ser9Val10Arg11Arg12Ala13Val14Lys15Lys16Phe17-NH2。
3.一种权利要求1所述的改造体抗菌肽的应用，其特征在于：所述改造体抗菌肽用于制备抗菌药物、抑制细菌生长药物、防腐剂、动物饲料或化妆品前体的用途。
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