CN106471067B - 氮杂环丁烷取代的荧光化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的主题包括氮杂环丁烷取代的荧光化合物，其中所述化合物可用作探针、染料、标记物等。本发明公开的主题还包括包含所述化合物的试剂盒以及使用所述化合物来检测目标物质的方法。

Description

氮杂环丁烷取代的荧光化合物
相关申请
本申请要求于2014年4月1日提交的第61/973,795号美国临时专利申请和于2014年5月9日提交的第61/991,109号美国临时专利申请的权益，其全部公开内容通过引用并入于此。
技术领域
本发明公开的主题涉及荧光化合物。具体地，本发明公开的主题涉及氮杂环丁烷取代的多环化学荧光团以及其制备和使用方法。
背景技术
荧光显微术使活细胞内的特定分子成像成为可能。这种技术依赖于明亮、耐光的荧光染料对生物分子的精确标记。遗传编码的荧光团如绿色荧光蛋白(GFP)是荧光成像的主要基础，其允许标记遗传特异性。然而，这些蛋白质染料缺乏许多应用例如单分子成像实验所必需的光稳定性。在过去二十年中，已经开发了许多替代的标记策略，其将荧光蛋白的遗传特异性与小分子荧光团的良好的光物理学相结合。引人注目的替代选择包括FlAsH、酶基自标记标签(例如SnapTag和HaloTag)、亲电子配体-受体对(例如TMPTag和香豆素-PYP)和硫辛酸连接酶变体。自标记标签允许标记与不同合成荧光团融合的特定蛋白质融合物。自标记标签已使活细胞内的许多成像实验成为可能。
尽管化学染料的总集数量巨大，但是相对较少的化学染料表现出细胞内标记所需的细胞渗透性。因此，细胞内自标记标签配体的可用调色板被限制在基于香豆素和罗丹明骨架的经典的纯中性荧光团，其显示出膜渗透性和快速标记动力学，但不具有最佳的亮度和光稳定性。先前改进染料性能(例如Cy、Alexa Fluor)的工作涉及实质性修饰，例如结构刚性化和添加磺酸酯(或盐)基。通过这些努力得到了高极性、细胞不渗透的染料，其在体外或在细胞外部有用，但与活细胞的细胞内应用不相容。
尽管自标记标签与罗丹明染料相容，但是对于优化这类用于活细胞标记实验的荧光团没有进行多少工作。以前的努力集中在增加水溶性以及荧光亮度和光稳定性上，这通常是通过显著的结构修饰实现的。这种染料对于体外和细胞外应用起作用，但是极性太高以至于不能顺从地进入细胞。
因此，仍然需要容易合成并具有改善的亮度和适当的细胞渗透性的化合物。仍然需要可以在体内充当自标记标签的化合物。
发明内容
如在本文中体现和广泛描述的，本发明公开的主题一方面涉及用作荧光标记物的化合物、其制备方法、使用所述化合物成像一种或多种可能存在于活细胞中的目标物质的方法以及使用所述化合物的试剂盒。在一些实施方案中，本发明化合物是氮杂环丁烷-取代的已知荧光标记物的衍生物。在一些实施方案中，本发明的氮杂环丁烷取代的化合物相对于其原始母体化合物能够表现出更大的量子产率。
本发明公开的化合物的实施方案包括下式：
Figure GDA0002543877310000021
其中：
每个R独立地选自卤素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，所述烷基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；
Q选自CR(2)、NR、O、S、SiR(2)和Se；
W选自C和N；
X选自孤对电子、H、烷基、芳基、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，X任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；
Y选自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且
Z选自H、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环；
本发明公开的实施方案还包括下式的化合物：
Figure GDA0002543877310000031
其中：
每个R独立地选自卤素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；
Q选自CR(2)、NR、O、S、SiR(2)和Se；
W选自C和N；
M选自CR(2)、C(O)、SO2和PO2；
L选自O、S、NR和CN2，其中任选地L和W与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环；
U和V独立地选自H、烷基、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，烷基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代，或者其中U和V与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环；
Y选自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且
Z选自H、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环。
本发明公开的主题的实施方案还包括试剂盒。该试剂盒可包括本文所述的任何化合物以及可逆地或不可逆地结合所述化合物的结合元件。在一些实施方案中，结合元件包括蛋白质。在一些实施方案中，试剂盒包括具有下式的化合物：
Figure GDA0002543877310000051
其中：
每个R独立地选自卤素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；
Q选自CR(2)、NR、O、S、SiR(2)和Se；
W选自C和N；
X选自孤对电子、H、烷基、芳基、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，X任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；
Y选自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且
Z选自H、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环；以及
还包括可逆地或不可逆地结合所述化合物的结合元件。
在试剂盒的一些实施方案中，试剂盒包括具有下式的化合物：
Figure GDA0002543877310000061
其中：
每个R独立地选自卤素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；
Q选自CR(2)、NR、O、S、SiR(2)和Se；
W选自C和N；
M选自CR(2)、C(O)、SO2和PO2；
L选自O、S、NR和CN2，其中任选地L和W与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环；
U和V独立地选自H、烷基、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，烷基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代，或者其中U和V与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环；
Y选自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且
Z选自H、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环；以及
还包括可逆地或不可逆地结合所述化合物的结合元件。
本发明公开的主题的实施方案还包括用于成像、测量和/或检测目标物质的方法。在一些实施方案中，所述方法可包括将疑似或已知具有目标物质的样品与本文所述的任何化合物接触，然后检测来自化合物的发射光，所述发射光指示目标物质的存在。
在一些实施方案中，所述方法包括使样品与选择性结合目标物质的化合物接触，所述化合物具有以下化学式：
Figure GDA0002543877310000071
其中：
每个R独立地选自卤素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；
Q选自CR(2)、NR、O、S、SiR(2)和Se；
W选自C和N；
X选自孤对电子、H、烷基、芳基、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，X任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；
Y选自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且
Z选自H、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环；以及
检测来自所述化合物的发射光，所述发射光指示所述目标物质的存在。
在一些实施方案中，所述方法包括使样品与具有下式的化合物接触：
Figure GDA0002543877310000081
其中：
每个R独立地选自卤素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；
Q选自CR(2)、NR、O、S、SiR(2)和Se；
W选自C和N；
M选自CR(2)、C(O)、SO2和PO2；
L选自O、S、NR和CN2，其中任选地L和W与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环；
U和V独立地选自H、烷基、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，烷基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代，或者其中U和V与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环；
Y选自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且
Z选自H、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环；以及
检测来自所述化合物的发射光，所述发射光指示所述目标物质的存在。
对于本发明的另外的优点，一部分将在下面的描述中阐述，一部分将从描述中显而易见地或者可以通过本发明的实施得知。本发明的优点将通过在所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。应当理解，前面的一般性描述和以下详细描述都仅用于示例和解释，而不是对所要求保护的本发明的限制。
附图说明
在所附权利要求中具体阐述了本发明的主题的新特征。通过参考以下详细描述将更好的理解本发明公开的主题的特征和优点，所述详细描述提出了使用本发明的原理的示例性实施方案及其附图，其中：
图1为显示分子内扭转电荷转移(TICT)过程的Jabloński图。
图2为显示四甲基罗丹明和JF549的归一化吸收(abs)和荧光发射(fl)光谱的曲线图。
图3为四甲基罗丹明和JF549的归一化吸光度-介电常数(εr)图。
图4为来自表达HaloTag-H2B并用JF549-HaloTag配体孵育的经洗涤的活HeLa细胞的细胞核的共焦最大投影图像；比例尺＝5μm。
图5为显示用JF549-HaloTag配体或四甲基罗丹明-HaloTag配体标记的HaloTag-H2B分子间在亮度(n>4000)和轨迹长度(n>500)方面的比较的箱须图，其中十字形指示平均值，须线跨越10-90百分位数。
图6为表达HaloTag-H2B的并采用JF549-HaloTag配体标记的固定U2OS细胞的dSTORM荧光显微图像。平均定位误差为17.2nm，中值定位误差为14.1nm；比例尺＝5μm。
图7为表达HaloTag-H2B并采用TMR-HaloTag配体标记的固定U2OS细胞的dSTORM和宽场(插图)荧光显微图像。平均定位误差为19.2nm，中值定位误差为17.0nm；比例尺＝5μm。
图8显示了采用JF549-HaloTag配体(图6)和TMR-HaloTag配体(图7)的成像实验的定位误差归一化分布。
图9为表达HaloTag-H2B并采用JF549-HaloTag配体标记的活HeLa细胞的细胞核的dSTORM荧光显微图像；比例尺＝5μm。
图10为表达HaloTag-H2B并采用JF646-HaloTag配体标记的固定U2OS细胞核的dSTORM荧光显微图像。平均定位误差为11.1nm，中值定位误差为8.4nm；比例尺＝5μm。
图11为表达HaloTag-H2B并采用SiTMR-HaloTag配体标记的固定U2OS细胞的dSTORM荧光显微图像。平均定位误差为11.9nm，中值定位误差为9.0nm；比例尺＝5μm。
图12为显示了使用JF646-HaloTag配体(图10)和SiTMR-HaloTag配体(图11)的成像实验的定位误差归一化分布。
图13为表达HaloTag-微管蛋白并采用JF646-HaloTag配体标记的活HeLa细胞的宽场荧光显微镜图像。
图14为表达HaloTag-微管蛋白并采用JF646-HaloTag配体标记的活HeLa细胞的dSTORM显微图像。平均定位误差为9.23nm；中值定位误差为7.14nm。
图15为显示了宽场图像(图13)和dSTORM图像(图14)中作为行长函数的线扫描强度的图。
图16为不存在(-HT)和存在(+HT)过量HaloTag蛋白的情况下SiTMR-HaloTag配体(5μM)的吸光度谱图。
图17为不存在(-HT)和存在(+HT)过量HaloTag蛋白的情况下JF646-HaloTag配体(5μM)的吸光度谱图。
图18为活HeLa细胞的宽场荧光显微图像，该细胞采用H2B-HaloTag转染，用SiTMR-HaloTag配体(100nM)孵育，并且在没有经过中间洗涤步骤的情况下成像；虚线表示细胞边界；比例尺：10μm。
图19为活HeLa细胞的宽场荧光显微图像，该细胞采用H2B-HaloTag转染，用JF646-HaloTag配体(100nM)孵育，并且在没有经过中间洗涤步骤的情况下成像；虚线表示细胞边界；比例尺：10μm。
图20为图18中作为行长函数的线扫描强度图。
图21为图19中作为行长函数的线扫描强度图。
图22为表达HaloTag-H2B并采用100nM的JF646-HaloTag配体(顶行)或SiTMR-HaloTag配体(底行)孵育的未洗涤的活HeLa细胞的宽场荧光显微图像的实例。
图23为覆盖在HaloTag-H2B的dSTORM H2B图像上的、由JF549-SnapTag配体制备的SnapTag-TetR-JF549缀合物的单分子轨道透视图，所述HaloTag-H2B在活U2OS细胞的细胞核中采用JF646-HaloTag配体标记；比例尺＝5μm。
图24为H2B的dSTORM图像与活U2OS细胞中快速TetR扩散率(2-10μm2s-1；黄色)区域和慢TetR扩散率(<2μm2s-1；蓝色)区域的覆盖图。
图25为与HaloTag-H2B共定位(黑色)或不与HaloTag-H2B共定位(灰色)的SnapTag-TetR的表观扩散系数(Dapp)的归一化分布。
图26为显示活HeLa细胞中DRAQ5核染色荧光的宽场荧光显微图像，所述活HeLa细胞表达SnapTag-H2B并采用DRAQ5和Snap-Cell 430标记；比例尺＝50μm。
图27为显示活HeLa细胞中DRAQ5核染色荧光的宽场荧光显微图像，所述活HeLa细胞表达SnapTag-H2B并采用DRAQ5和氮杂环丁烷基-香豆素-TapTag配体标记；比例尺＝50μm。
图28为显示活HeLa细胞中采用Snap-Cell 430标记的SnapTag-H2B的荧光的宽场荧光显微图像，所述活HeLa细胞表达SnapTag-H2B并采用DRAQ5和Snap-Cell 430标记；比例尺＝50μm。
图29为显示活HeLa细胞中的氮杂环丁烷基-香豆素标记的SnapTag-H2B的荧光的宽场荧光显微图像，所述活HeLa细胞表达SnapTag-H2B并采用DRAQ5和氮杂环丁烷基-香豆素-SnapTag配体标记；比例尺＝50μm。
图30为显示当用Snap-Cell 430或氮杂环丁烷基-香豆素-TapTag配体(n＝50，误差棒，s.e.m。)标记时细胞中背景香豆素标记物之上的中值核荧光的定量图。
图31为用于合成本发明公开主题的实施方案的化合物的代表性合成方案。
图32为用于合成本发明公开主题的实施方案的化合物的代表性合成方案。
图33为用于合成本发明公开主题的实施方案的化合物的代表性合成方案。
图34为用于合成本发明的主题的实施方案的化合物的代表性合成方案。
图35为用于合成本发明的主题的实施方案的化合物的代表性合成方案。
图36为用于合成本发明的主题的实施方案的化合物的代表性合成方案。
图37为用于合成本发明的主题的实施方案的化合物的代表性合成方案。
图38为用于合成本发明的主题的实施方案的化合物的代表性合成方案。
具体实施方式
在本文中阐述了本发明公开主题的一个或多个实施方案的细节。在研究了本文中提供的信息之后，对本文中描述的实施方案以及其他实施方案的修改对于本领域普通技术人员将是显而易见的。本文中提供的信息，特别是所描述的代表性实施方案的具体细节，主要是为了清楚理解而提供，不应将其理解为不必要的限制。如果存在冲突，本文中包括定义在内的详细说明将控制这种情况的发生。
本发明公开的主题包括具有作为荧光团(例如荧光染料)的用途的化合物。本发明化合物可用作荧光探针以观察和表征特定物质的位置和/或浓度。就这一点而言，术语“探针”、“染料”、“标记物”等在本文中可互换使用，他们是指包含荧光团部分的化合物，所述荧光团部分对于结合元件具有选择性和/或结合至结合元件，而结合元件对目标物质具有选择性。探针能够发出发射光，其可以用于确定目标物质的存在和/或测量目标物质的量。在这方面，本发明公开的主题还包括使用本发明化合物及其中间体的方法以及制备这些化合物及其中间体的方法。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术科学术语具有与本公开主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所描述的方法、装置和材料类似或等同的任何方法、装置和材料可以用于本发明公开主题的实施或测试，现在仍要描述代表性的方法、装置和材料。
根据长期存在的专利法惯例，当在本申请(包括权利要求)中使用术语“一个”、“一种”和“所述”时，其是指“一个或多个”。因此，例如，提到“化合物”时，其包括多种这样的化合物，如此等等。
除非另有说明，在说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、性质(例如反应条件)等的所有数字应理解为其在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则本说明书和权利要求书中阐述的数值参数是近似值，其可以根据本发明公开的主题所寻求获得的期望的性质而变化。
当提及质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的值或量时，本文所使用的术语“约”意在涵盖与规定的量相比有些变化的范围，所述变化在一些实施方案中为±20％，在一些实施方案中为±10％，在一些实施方案中为±5％，在一些实施方案中为±1％，在一些实施方案中为±0.5％，并且在一些实施方案中为±0.1％，因为这些变化适于实施所公开的方法。
本文所使用的范围可以表示为从“约”一个具体值，和/或至“约”另一个具体值。还应理解本文公开了多个值，除了这些值本身之外，每个值还在本文中公开为“约”该特定值。例如，如果公开值“10”，则还公开了“约10”。还应当理解，两个特定单元之间的每个单元也被公开了。例如，如果公开了10和15，则11、12、13和14也被公开了。
本文使用的术语“吸收波长”是指能够被化合物吸收以便激发化合物发射光的光波长。被吸收光激发的化合物发射的光将具有“发射波长”。
本文所用的术语“衍生物”是指其结构衍生自母体化合物(例如，本文公开的化合物)结构的化合物，其结构与本文公开的化合物足够相似，并且基于该相似性，本领域技术人员将会预期它们将表现出与要求保护的化合物相同或相似的活性和功用，或者作为前体诱导与要求保护的化合物相同或相似的活性和功用。
本文所用的术语“蛋白质”是指包含20种蛋白质氨基酸中的若干的任何聚合物，而不管其大小。尽管“多肽”经常用于指较大的蛋白质，并且“肽”通常用于指小蛋白质，但是在本领域中，这些术语的使用是部分重叠的并有所不同。除非另有说明，本文所用的术语“蛋白质”是指肽、多肽和蛋白质。
术语“选择性结合”在本文中指的是原子、部分和/或分子优先接近或结合特定化合物的性质。在一些情况下，原子、部分和/或分子选择性地结合化合物上的特定位点，例如蛋白质分子上的活性位点。
术语“检测”在本文中用于指基于从本发明化合物发射的光观察、成像、指示目标物质的存在，以及测量目标物质等的行为。更具体地，在一些情况下，本发明化合物可以结合到目标物质，并且在暴露于吸收光时，将发出发射光。发射光的存在可以指示目标物质的存在，而对光强度的定量可以用于测量目标物质的浓度。
术语“目标物质”是指被本发明公开的化合物直接选择性结合的物质和/或被与本发明化合物结合的分子间接结合的物质。目标物质可包括但不限于蛋白质、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、底物、代谢物、抑制剂、药物、营养物、生长因子等。在一些实施方案中，目标物质是指整个分子，在其他实施方案中，目标物质是指分子上的位点，例如特定蛋白质上的结合位点。
本文所用的术语“取代的”预期包括有机化合物的所有允许的取代基。在宽泛的方面，允许的取代基包括有机化合物的非环状和环状、支链和非支链、碳环和杂环、以及芳族和非芳族取代基。示例性取代基包括例如下述的那些取代基。对于适当的有机化合物，允许的取代基可以是一个或多个以及相同的或不同的。为了达到本发明的目的，杂原子(例如氮)可以具有氢取代基和/或满足杂原子化合价的任何本文所述的允许的有机化合物取代基。本公开内容不旨在以任何方式受限于所允许的有机化合物的取代基。
此外，术语“取代”或“被...取代”包括隐含的条件，即该取代是根据被取代原子和取代基允许的化合价进行的，并且该取代产生稳定的化合物，例如不会自发通过诸如重排、环化、消除等进行转化的物质。除非另有说明，本文所述的所有化学基团包括未取代的和取代的变体。
在定义各种术语时，“A1”，“A2”，“A3”和“A4”在本文中用作表示各种特定取代基的通用符号。这些符号可以是任何取代基，不限于本文公开的那些，并且当它们在一种情况下被定义为某些取代基时，它们在另一种情况下可以定义为一些其他取代基。
当使用从左到右书写的常规化学式详细说明取代基时，它们同样包括由从右到左书写该结构而产生的化学上相同的取代基。例如，-CH2O-也包括-OCH2-。
应当理解，即使没有具体记载，本文提供的化学结构中的键的类型和位置也可以根据化合物中的取代基进行调整。例如，对于-X-，在X可以是C或N的情况下，-X-可以分别指-CH2-或-NH-，其中未示出N上的孤对电子。因此，即使没有具体说明，本文所述的化合物包括完成化学结构所需的任何氢原子、孤对电子等。
本文所用的术语“烷基”是1-24个碳原子的支链或非支链饱和烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。烷基可以是环状或非环状的。烷基可以是支链或非支链的。烷基还可以指取代或未取代的烷基。例如，烷基可以被一个或多个基团取代，所述基团包括但不限于任选取代的烷基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤素、羟基、硝基、甲硅烷基、磺基氧代或硫醇。“低级烷基”是含有1-6个(例如1-4个)碳原子的烷基。
在整个说明书中，“烷基”通常用于指未取代的烷基和取代的烷基；然而，本文也会通过确认烷基上的具体取代基来具体引用取代的烷基。例如，术语“卤代烷基”具体是指被一个或多个卤素(例如氟、氯、溴或碘)取代的烷基。术语“烷氧基烷基”具体是指被一个或多个烷氧基取代的烷基，如下所述。术语“烷基氨基”具体是指被一个或多个氨基取代的烷基，如下所述，等等。当在一种情况下使用“烷基”并在另一种情况下使用诸如“烷基醇”的具体术语时，这并不意味着术语“烷基”不是指诸如“烷基醇”等的具体术语。
这种习惯也用于本文所述的其他基团。也就是说，在术语例如“环烷基”是指未取代的和取代的环烷基部分的同时，在此之外可以在本文中具体确认取代部分。例如，特定的取代环烷基可以被称为例如“烷基环烷基”。类似地，取代烷氧基可以具体地称为例如“卤代烷氧基”，特定的取代烯基可以是例如“烯基醇”等。同样，使用通用术语(如“环烷基”)和具体术语(例如“烷基环烷基”)的做法并不意味着该通用术语不包括该具体术语。术语“烷基”包括“环烷基”。
本文所用的术语“环烷基”是由至少三个碳原子组成的非芳香碳基环。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、降冰片基等。术语“杂环烷基”是如上定义的一类环烷基，并且包括在术语“环烷基”的含义之内，其中环烷基的环中的至少一个碳原子被杂原子(例如但不限于氮、氧、硫或磷)取代。环烷基和杂环烷基可以是取代的或未取代的。环烷基和杂环烷基可以被一个或多个基团取代，包括但不限于本文所述的任选取代的烷基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤素、羟基、硝基、甲硅烷基、磺基氧代或硫醇。
在这一点上，本文所用的术语“杂环”是指单环和多环芳香或非芳香环体系，其中至少一个环成员不是碳。杂环包括吡啶、嘧啶、呋喃、噻吩、吡咯、异噁唑、异噻唑、吡唑、噁唑、噻唑、咪唑、噁唑(包括1,2,3-噁二唑、1,2,5-噁二唑和1,3,4-噁二唑)、噻二唑(包括1,2,3-噻二唑、1,2,5-噻二唑和1,3,4-噻二唑)、***(包括1,2,3-***、1,3,4-***)、四唑(包括1,2,3,4-四唑和1,2,4,5-四唑)、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪(包括1,2,4-三嗪和1,3,5-三嗪)、四嗪(包括1,2,4,5-四嗪)、吡咯烷、哌啶、哌嗪、吗啉、氮杂环丁烷、四氢吡喃、四氢呋喃、二噁烷等。
本文所用的术语“烷氧”或“烷氧基”是指通过醚键连接的烷基或环烷基；即“烷氧基”可以定义为-OA1，其中A1是如上所定义的烷基或环烷基。“烷氧基”还包括刚刚描述的烷氧基的聚合物；即，烷氧基可以是聚醚，例如-OA1-OA2或-OA1-(OA2)a-OA3，其中“a”是1-200的整数，A1、A2和A3是烷基和/或环烷基。
本文所用的术语“烯基”是具有2-24个碳原子的烃基，其结构式中含有至少一个碳-碳双键的。该术语包括线性和成环(如环烯基)基团。不对称结构如(A1A2)C＝C(A3A4)旨在包括E和Z异构体。这可以由本文中的其中存在不对称烯烃的结构式证明，或者其可以由键符号C＝C明确指示。烯基可以被一个或多个基团取代，该基团包括但不限于本文所述的任选取代的烷基、环烷基、烷氧基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、叠氮化物、硝基、甲硅烷基、磺基氧代或硫醇。
本文所用的术语“芳基”是包含任何碳基芳香基的基团，包括但不限于苯、萘、苯基、联苯、苯氧基苯等。术语“芳基”还包括“杂芳基”，杂芳基被定义为含有其环内引入至少一个杂原子的芳香基的基团。杂原子的实例包括但不限于氮、氧、硫和磷。同样，也包括在术语“芳基”中的术语“非杂芳基”被定义为包含不含杂原子的芳基的基团。芳基可以是取代的或未取代的。芳基可以被一个或多个基团取代，所述基团包括但不限于本文所述的任选地取代的烷基、环烷基、烷氧基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、叠氮化物、硝基、甲硅烷基、磺基氧基或硫醇。术语“联芳基”是一种特定类型的芳基并且包含在“芳基”的定义中。联芳基是指通过稠合环结构连接在一起的两个芳基(如在萘中)，或通过一个或多个碳-碳键连接(如在联苯中)。
本文所用的术语“环”是指取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。环包括称为稠环体系的稠环部分，其中环可以稠合到选自取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基中的一个或多个环的任意组合。环中的原子数通常由环中的成员数量来定义。例如，“5-8元环”是指有5-8个原子环绕排列。环可以任选地包括杂原子。术语“环”还包括包含多于一个“环”的环体系，其中每个“环”独立地如上定义。
本文所述的一些不饱和结构，例如包括环烷基和芳基的环结构，用虚键示出，以表示可能存在共振结构。具有虚键的结构旨在反映结构的每个可能的构型，但不一定意味着所有可能的结构都存在。应当理解，这种结构中的键的类型(例如，单键、双键)将根据结构中的原子以及结构是否被一个或多个另外的原子或部分取代而变化。
本文所用的术语“醛”由式-C(O)H表示。在本说明书中，“C(O)”是羰基(即C＝O)的简写符号。
本文所用的术语“胺基”或“氨基”由式NA1A2A3表示，其中A1、A2和A3可以独立地是氢或任选取代的烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基。在具体实施方案中，胺基是指NH2、NH(烷基)、NH(芳基)、N(烷基)2和N(芳基)2中的任一个。
本文所用的术语“羧酸”由式-C(O)OH表示。
本文所用的术语“酯”由式-OC(O)A1或-C(O)OA1表示，其中A1可以是本文所述的任选取代的烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基。本文所用的术语“聚酯”由式-(A1O(O)C-A2-C(O)O)a-或-(A1O(O)C-A2-OC(O))a-，其中A1和A2独立地可以是本文所述的任选取代的烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基，并且“a”是1-500的整数。“聚酯”用于描述通过具有至少两个羧酸基团的化合物与具有至少两个羟基的化合物之间的反应产生的基团。
术语“卤化物”或“卤素”是指选自氟、氯、溴和碘的至少一种卤素。
本文所用的术语“硫醇”由式-SH表示。
化合物
本发明公开的主题包括氮杂环丁烷取代的化合物。在某些实施方案中，氮杂环丁烷取代的化合物是包含供电子N,N-二烷基氨基基元的荧光化合物的修饰形式。在这样的实施方案中，原始母体化合物的N,N-二烷基被氮杂环丁烷替代。一些包含N,N-二烷基氨基基元的未修饰的荧光团倾向于非辐射衰变机制和/或表现出适度的量子产率。然而，使用氮杂环丁烷部分取代二甲基氨基的本发明化合物的实施方案可以减少或消除该非辐射衰变途径，并相对于相应的未被氮杂环丁烷取代的化合物增加荧光团的量子产率值。
由于具有增加的量子产率，本发明化合物的一些实施方案还表现出与相应的未被氮杂环丁烷取代的化合物相当或优于其的亮度和光稳定性。在一些实施方案中，具有改善的量子产率的化合物在生物成像实验中需要较低的照射功率，并且不太可能经历破坏性弛豫途径，导致较高的光稳定性。
本发明化合物的某些实施方案具有优异的和预料不到的性质。平面结构有利于呫吨染料和其他类似结构中荧光发射的产生。先前一直认为采用低级环(例如具有约3或4个碳的那些环)取代将损害化合物的平面结构。具体地，采用四元氮杂环丁烷环体系的修饰是高度应变的(26kcal mol-1)，并且直观地认为其与在许多荧光分子中发现的平面离域结构不相容。
本发明人发现本文所述的新的氮杂环丁烷取代令人惊讶地出人意料地保留甚至可以增强相应的未被氮杂环丁烷取代的化合物的荧光特性。
本发明的氮杂环丁烷取代的化合物的实施方案还包括不太容易进行分子内扭转电荷转移(TICT)的结构。这种令人惊讶和意想不到的特征提供了某些具有高量子产率的具体化合物。在某些情况下，其量子产率高于作为基础的未被氮杂环丁烷取代的化合物。
应当理解，本发明公开的氮杂环丁烷取代可以在包括已知的荧光团在内的多种荧光团上进行。在一些情况下，氮杂环丁烷取代允许保留基础荧光团和/或增强其有益性质。例如，本发明化合物的实施方案包括氮杂环丁烷取代的罗丹明化合物，其保持或增强未被氮杂环丁烷取代的罗丹明化合物的亮度、光稳定性和/或光不敏感性。
在化学荧光团的现存集合中，罗丹明染料是一个对使用遗传编码自标记标签的活细胞成像有用的类别。该功用源于罗丹明染料的亮度、光稳定性、对pH的不敏感性和可修饰结构。可以控制罗丹明的光谱特性以获得具有从蓝色到红外的最大吸收的染料。此外，罗丹明染料在“开放的”、两性离子的醌型与“闭合的”、亲脂性内酯形式之间平衡存在。这种动态两亲性使罗丹明染料成为活细胞标记技术的优良配体。该染料在没有洗涤剂或化学掩蔽基团的情况下有效地穿过细胞膜，并且过量的配体可以被快速洗掉。
在本发明公开的主题的一些实施方案中，提供了下式的化合物：
Figure GDA0002543877310000211
其中每个R独立地选自卤素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Q选自CR(2)、C(O)NR2、NR、O、S、SiR(2)和Se；W选自C和N；X选自孤对电子、H、烷基、芳基、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，X任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Y选自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且Z选自H、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环。
在一些实施方案中，其中Y和Z与它们所键合的原子一起形成5-7元环，所述5-7元环被选自N、O和S的一个或多个另外的杂原子取代，和/或被一个或多个选自卤素、CN、OH，O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基的取代基取代。在具体实施方案中，Y和Z与它们所键合的原子一起形成被未取代或取代的氮杂环丁烷基取代的5-7元环。
在本发明公开的主题的一些实施方案中，化合物具有如下化学式：
Figure GDA0002543877310000221
其中R’选自卤素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、C(O)NR2、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；在其他实施方案中，R’选自氮杂环丁烷部分(基团)，其未被取代或被一个或多个选自卤素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、C(O)NR2、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基的取代基取代。
在本发明公开的主题的一些实施方案中，化合物具有如下化学式：
Figure GDA0002543877310000231
在本发明公开的主题的一些实施方案中，化合物具有如下化学式：
Figure GDA0002543877310000232
在本发明公开的主题的一些实施方案中，化合物具有如下化学式：
Figure GDA0002543877310000233
在本发明公开的主题的一些实施方案中，化合物具有如下化学式：
Figure GDA0002543877310000241
在本发明公开的主题的一些实施方案中，化合物具有如下化学式：
Figure GDA0002543877310000242
在本发明公开的主题的一些实施方案中，化合物具有如下化学式：
Figure GDA0002543877310000243
在本发明公开的主题的一些实施方案中，化合物具有如下化学式：
Figure GDA0002543877310000244
在本发明公开的主题的一些实施方案中，化合物具有如下化学式：
Figure GDA0002543877310000251
在本发明公开的主题的一些实施方案中，X是取代的芳基。
在其他实施方案中，X也可以选自但不限于H、C、
Figure GDA0002543877310000252
在一些实施方案中，W是N，X是孤对电子。在一些实施方案中，X可以部分或全部包含能够将本发明化合物结合至如本文所述的结合元件的连接体。在其他实施方案中，X可部分或全部包含结合元件。本文所示的X的结构仅用于示例性目的，因为在一些实施方案中X取决于可用于与一个化合物连接的连接体、可用于与一个化合物连接的结合元件和/或通过化合物进行检测的目标物质。
在本发明公开的主题的一些实施方案中，化合物可以根据下式中的至少一种进行选择：
Figure GDA0002543877310000253
Figure GDA0002543877310000261
Figure GDA0002543877310000271
Figure GDA0002543877310000281
Figure GDA0002543877310000291
本发明公开的主题还包括本文所述的任何化合物的衍生物。
本文所述的化合物可含有一个或多个双键，因此可能产生顺/反(E/Z)异构体以及其他构象异构体。除非有相反的说明，本发明包括所有这些可能的异构体以及这些异构体的混合物。除非有相反的说明，具有仅表示为实线而不是楔形或虚线的化学键的化学式涵盖每种可能的异构体，例如每种对映异构体和非对映异构体，以及异构体的混合物，例如外消旋混合物或其中一个对映体过量的两个对映体的混合物。本文所述的化合物可以含有一个或多个不对称中心，因此可能产生非对映异构体和光学异构体。除非相反地说明，否则本发明包括所有这些可能的非对映异构体及其外消旋混合物、其基本纯净的拆分对映异构体、所有可能的几何异构体及其药学上可接受的盐。还包括立体异构体的混合物以及分离的特定立体异构体。在用于制备这些化合物的合成步骤中，或者在本领域技术人员已知的外消旋化或差向异构化方法的使用中，这些步骤的产物可以是立体异构体的混合物。
如本文所讨论的，应当理解本发明公开的氮杂环丁烷取代是可概括的，并且可应用于多种化合物。代表性化合物包括氮杂环丁烷取代的罗丹明衍生物、氮杂环丁烷取代的香豆素衍生物、氮杂环丁烷取代的对甲氨基酚衍生物、氮杂环丁烷取代的吖啶衍生物、氮杂环丁烷取代的噁嗪衍生物、氮杂环丁烷取代的萘二甲酰亚胺衍生物、氮杂环丁烷取代的碳罗丹明(carborhodamine)衍生物、氮杂环丁烷取代的硅罗丹明(silarhodamine)衍生物等。普通技术人员会辨认能够进行本发明公开的氮杂环丁烷取代的其他化合物。如上所述，本发明公开主题的这些和其他衍生物可以保留和/或增强相应的未被氮杂环丁烷取代的化合物的有益特性。例如，具有最小结构变化的氮杂环丁烷取代的化合物的实施方案可以保持原始未被氮杂环丁烷取代的化合物的细胞渗透性和细胞内标记效率。
此外，如本文所述，氮杂环丁烷部分可以是取代的或未取代的。下面表1描述了在氮杂环丁烷环上带有取代基的氮杂环丁烷-罗丹明，氮杂环丁烷基-碳罗丹明和氮杂环丁烷基-硅罗丹明的实施方案。应当理解，表1中描述的氮杂环丁烷部分可以并入本文所述的任何化合物中。
表1氮杂环丁烷基-罗丹明、氮杂环丁烷基-碳罗丹明和氮杂环丁烷基-硅罗丹明的实施方案的光谱数据。
Figure GDA0002543877310000311
除非另有说明，所有测量都是在10mM HEPES pH7.3的条件下进行的。
a在含有0.1％(v/v)三氟乙酸的三氟乙醇中测量的消光系数
b在含有0.1％(v/v)三氟乙酸的乙醇中测量的消光系数。
本发明化合物可具有宽范围的吸收和发射性质。由于本发明的氮杂环丁烷取代可以在多种化合物上进行，本发明的氮杂环丁烷取代的化合物的实施方案可以包括紫外至近红外光谱的吸收波长。本发明化合物的具体实施方案可包括选自约100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm或其间的任何值的吸收波长。在一些实施方案中，化合物包括大于约1000nm的吸收波长。一旦活化，本发明化合物可以发射可检测的发射光。发射光的波长可以根据基础化合物及取代情况而变化，并且在一些实施方案中，发射波长是约100nm至约1000nm的波长，包括约100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm或其间的任何值。
本领域普通技术人员还将理解，本发明化合物包含本发明荧光团的开放和闭合(例如内酯)形式。在一些情况下，具有酯取代基的本发明的氮杂环丁烷基荧光团可以通过酸或碱介导的条件去保护以产生具有羧酸柄的氮杂环丁烷染料。图33所示的方案说明了在闭合的“内酯”形式和具有羧酸柄的开放形式间转化的代表性荧光团。在其他实施方案中，化合物在暴露于吸收光时可从闭合形式转化为开放形式。因此，在一些实施方案中，本发明化合物可以被光活化或化学活化以在闭合和开放形式之间转化。本文所述的所有化合物包括每种荧光团的闭合形式和开放形式。
在一些实施方案中，本发明公开化合物的实施方案的开放形式和闭合形式可以由下式表示：
Figure GDA0002543877310000321
其中每个R独立地选自卤素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Q选自CR(2)、C(O)NR2、NR、O、S、SiR(2)和Se；W选自C和N；M选自CR(2)、C(O)NR2、C(O)、SO2和PO2；L选自O、S、NR、CN2和C(O)NR2，其中任选地L和W与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环；U和V独立地选自H、烷基、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、C(O)NR2、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，烷基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代，或者其中U和V与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环；Y选自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且Z选自H、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环。
在这样的化合物的一些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：
Figure GDA0002543877310000331
其中R’选自卤素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H或氮杂环丁烷基取代，所述氮杂环丁烷基未被取代或被H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、C(O)NR2、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基中的一个或多个取代。
在这方面，本发明公开的主题的代表性开放形式化合物具有如下化学式：
Figure GDA0002543877310000341
在一些实施方案中，本发明公开的化合物的闭合形式包括如下化学式：
Figure GDA0002543877310000342
在一些实施方案中，本发明公开的化合物的闭合形式包括如下化学式：
Figure GDA0002543877310000351
在一些实施方案中，U和V包括取代的芳基，并且在一些实施方案中，该化合物可以由下式表示：
Figure GDA0002543877310000352
其中X’选自H、OH、烷基、芳基、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2和SO3H。
在闭合形式化合物的某些实施方案中，化合物包括选自以下的化学式：
Figure GDA0002543877310000353
Figure GDA0002543877310000361
Figure GDA0002543877310000371
Figure GDA0002543877310000381
Figure GDA0002543877310000391
Figure GDA0002543877310000401
虽然为了说明的目的提供了上述结构，但是本领域普通技术人员在阅读本文后将理解本文公开的化合物的所有开放形式和闭合形式。
试剂盒
本发明公开的主题包括试剂盒，其包含与合适的结合元件包装在一起的本文所述的任何化合物。在一些情况下，结合元件在本文中被称为配体。结合元件可以可逆地和/或不可逆地结合化合物。在一些实施方案中，结合元件可以直接结合到化合物，而在其他实施方案中，结合元件间接结合到化合物。在一些实施方案中，化合物可以经由连接体间接结合至结合元件，其中在一些实施方案中，连接体包括未取代或取代的烷基等。试剂盒的一些实施方案还具有用于连接到本发明化合物的连接体。
结合元件通常可以选择性地结合感兴趣的分子或物质(即目标物质)。代表性结合元件包括但不限于氨基酸、蛋白质、抗体或其片段、抗原、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、药物、激素、脂质、合成聚合物、固体支持物、聚合物微粒、细胞、病毒、酶底物等，或病毒。结合元件可用于检测待观察和/或表征的分子或物质，可指示已发生特定事件和/或指示另一分子或物质(即目标物质)的存在。
在一些实施方案中，提供了包含根据本发明公开的主题的两种或更多种不同化合物的试剂盒。这些实施方案可以进一步具有一种或多种结合元件，其中所述化合物可以结合相同或不同的结合元件。在一些实施方案中，每一个化合物和/或结合元件可以选择性地结合不同的分子、颗粒、物质等。另外地或可选地，在一些实施方案中，试剂盒包含根据本发明公开的主题的两种或更多种不同的化合物，所述化合物具有不同的吸收波长和/或发射波长，因此可以在多重过程中实施。
使用方法
本发明公开的主题还包括使用本文所述的化合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括利用所述化合物作为酶活性的报道分子、荧光标记物、目标物质(分析物)的传感器、成像实验的试剂和/或超分辨显微术的成像剂。
本发明公开主题的一些实施方案包括用于检测目标样品的方法，其包括使样品与下式的化合物接触：
Figure GDA0002543877310000411
其中每个R独立地选自卤素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Q选自CR(2)、NR、O、S、SiR(2)和Se；W选自C和N；X选自孤对电子、H、烷基、芳基、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，X任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Y选自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且Z选自H、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环。
可选地或另外地，在用于检测目标样品的方法的一些实施方案中，所述方法包括使样品与下式的化合物接触的步骤：
Figure GDA0002543877310000421
其中：
每个R独立地选自卤素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，烷基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；Q选自CR(2)、NR、O、S、SiR(2)和Se；W选自C和N；M选自CR(2)、C(O)、SO2和PO2；L选自O、S、NR和CN2，其中任选L和W与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环；U和V独立地选自H、烷基、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，烷基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、C(O)NR2、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代，或者其中U和V与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环；Y选自H、CR(2)、C(O)NR2、NR、O和S；且Z选自H、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任选地被独立地选自N、O和S的一个或多个杂原子、卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环。
本发明公开的用于检测目标物质的方法还可以包括检测步骤，所述检测步骤包括检测来自化合物的发射光，所述发射光指示目标物质的存在。
在一些实施方案中，使用所述化合物的方法还包括通过将所述化合物暴露于包括吸收波长的吸收光来激发所述化合物。如本文所述，吸收光可以包括紫外光至近红外光。在具体实施方案中，吸收波长可以在约100nm至约1000nm的范围内，在200nm至约800nm的范围内和/或在约450nm至约650nm的范围内。在一些实施方案中，吸收波长为约100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm或1000nm。
在一些实施方案中，通过使用荧光光谱法或通过肉眼进行检测步骤。因此，在一些实施方案中，采用显微镜进行检测步骤。在一些实施方案中，如本领域普通技术人员会理解的，目标物质的存在可以指示特定生物功能的发生或不存在。在一些实施方案中，所述方法在活细胞和/或受试者中进行。
检测方法的一些实施方案包括使样品与对不同目标物质具有选择性的两个或更多个化合物的实施方案接触。用两种或更多种本发明公开的化合物检测两种或更多种目标物质的方法在本文中称为“多重”检测方法。
在一些本发明的多重方法中，使用两种或更多种探针检测两种或更多种不同的目标物质和/或一种目标物质的两个或更多个区域，其中每个探针都用本发明化合物的不同实施方案标记。本发明公开的化合物可用于多种目标物质的多重检测方法中。
在这点上，多重方法可包括使样品与根据本发明公开的主题的第一化合物和第二化合物接触。第一化合物可以对第一目标物质具有选择性，并且能够发射第一发射光，第二化合物可以对第二目标物质具有选择性，并且可以发射第二发射光。检测步骤包括检测指示第一目标物质存在的第一发射光和指示第二目标物质存在的第二发射光，然后检测来自化合物的第二发射光。第二发射光可以指示第二目标物质的存在。在一些实施方案中，所述发射波长和第二发射波长彼此不同。因此，该新方法提供了用于同时检测一种底物中的多种不同目标物质的有效手段。
合成方法
本发明公开的主题还包括生产如本文所述的化合物的方法。用于合成本发明公开的化合物的实施方案的方法通常包括一个或多个公知的合成步骤。虽然本文描述了用于合成本发明化合物的方法的某些实施方案，但合成方法不应限于本文所述的方法，因为合成方法可包括对本领域普通技术人员显而易见的任何方法。
在一些实施方案中，该方法包括在合成方法的后期形成化合物的C(芳基)-N(例如C(芳基)-氮杂环丁烷)键。在一些实施方案中，使用氮亲核体与荧光素二(三氟甲磺酸酯)之间的布赫瓦尔德-哈特维希交叉偶联。在一些实施方案中，该方法在布赫瓦尔德-哈特维希条件下使用Pd(OAc)2、BINAP和Cs2CO3在约100℃下甲苯中进行。在其他实施方案中，该方法采用具有活性联芳基配体XPhos的Pd2dba3以Cs2CO3为碱、二氧六环为溶剂，在约80℃至约100℃下进行。因此，与不同的N-烷基偶联配偶体进行的Pd催化交叉偶联代表了用于合成本发明化合物的方法的实施方案。
在一些实施方案中，通过直接胺化合成化合物如罗丹明染料可能是不实际的。对于至少这些化合物，其合成方法中可以使用氨基甲酸酯。用于合成本发明化合物的其他代表性方法在下面文献中进行了描述：Grimm等人，Synthesis of Rhodamines fromFluoresceins Using Pd-Catalyzed C-N Cross-Coupling，Org.Lett.13,6354-6357，(2011)，其通过引用并入本文。
此外，用于合成本发明公开化合物的实施方案的方法的非限制性列表在图31-38所示的代表性方案中进行了说明。
图31为用于制备代表性二溴荧光母素和荧光素二(三氟甲磺酸酯)的一般合成方案。具有羧酸取代基的二溴荧光母素和荧光素二乙酸酯可以通过酸催化的费歇尔酯化或通过与DMF的二叔丁基缩醛的反应形成酯而被保护。然后可以用碱水解荧光素二乙酸酯，产生的取代的荧光素可以用三氟甲磺酸酐转化为荧光素二(三氟甲磺酸酯)。
图32为用于制备代表性的碳荧光素二(三氟甲磺酸酯)和硅荧光素二(三氟甲磺酸酯)的一般合成方案。TBS保护的蒽酮和Si-蒽酮与芳基格氏试剂的反应可以获得TBS保护的碳荧光素和硅荧光素。通过TBAF介导的脱保护和随后的与三氟甲磺酸酐的反应可以得到碳荧光素二(三氟甲磺酸酯)和硅荧光素二(三氟甲磺酸酯)。
图33为用于制备代表性的氮杂环丁烷基罗丹明、氮杂环丁烷基碳罗丹明和氮杂环丁烷基硅罗丹明的一般合成方案。氮杂环丁烷与二溴荧光母素、荧光素二(三氟甲磺酸酯)、碳荧光素二(三氟甲磺酸酯)或硅荧光素二(三氟甲磺酸酯)的布赫瓦尔德-哈特维希钯催化C-N交叉偶联可直接得到氮杂环丁烷基荧光团。具有酯取代基的氮杂环丁烷基荧光团可以通过酸或碱介导的条件去保护以产生具有羧酸柄的氮杂环丁烷基染料。所述酸可以通过与DSC或TSTU反应进一步衍生为N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯，随后与胺反应以产生具有侧酰胺基的类似物。
图34为用于制备代表性氮杂环丁烷基对甲氨基酚的一般合成方案。在剩余的三氟甲磺酸酯部分水解时，氮杂环丁烷(1当量)与荧光素二(三氟甲磺酸酯)、碳荧光素二(三氟甲磺酸酯)或硅荧光素二(三氟甲磺酸酯)的布赫瓦尔德-哈特维希钯催化的C-N交叉偶联可提供氮杂环丁烷基对甲氨基酚。
图35为从氮杂环丁烷基罗丹明、氮杂环丁烷基碳罗丹明和氮杂环丁烷基硅罗丹明制备代表性荧光2-偶氮-1-二氢茚酮染料的一般合成方案。氮杂环丁烷基罗丹明与草酰氯反应，然后与(三甲基甲硅烷基)二重氮甲烷反应，得到2-偶氮-1-茚满酮。碱介导的酯取代基水解可以产生具有酸部分的2-偶氮-1-茚满酮，其可以通过与TSTU反应进一步衍生为N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯，并与胺反应以产生具有侧酰胺基的类似物。
图36为用于制备代表性氮杂环丁烷基香豆素的一般合成方案。香豆素三氟甲磺酸酯可以通过7-羟基香豆素与三氟甲磺酸酐或N-苯基-双(三氟甲磺酰亚胺)的反应合成。氮杂环丁烷与香豆素三氟甲磺酸酯的布赫瓦尔德-哈特维希钯催化C-N交叉偶联可产生氮杂环丁烷基香豆素。或者，氮杂环丁烷基苯酚可以通过溴苯酚与氮杂环丁烷的C-N交叉偶联来制备。然后氮杂环丁烷基苯酚的维尔斯迈尔-哈克甲酰化反应可以提供醛，醛又可以与丙二酸酯缩合得到氮杂环丁烷基香豆素。对于具有酯取代基的实例，碱介导的水解可以产生具有羧酸的氮杂环丁烷基香豆素。这种羧酸可以通过与TSTU反应进一步衍生成N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯，并与胺反应以产生具有侧酰胺基的类似物。
图37为用于制备代表性氮杂环丁烷基吖啶的一般合成方案。二氨基吖啶与酸在升高的温度下反应可以生成二羟基吖啶，然后二羟基吖啶可以与三氟甲磺酸酐反应以获得吖啶二(三氟甲磺酸酯)。然后可使吖啶二(三氟甲磺酸酯)与氮杂环丁烷进行布赫瓦尔德-哈特维希钯催化C-N交叉偶联，以制备氮杂环丁烷基吖啶。
图38为用于制备代表性的氮杂环丁烷基噁嗪的一般合成方案。吩噁嗪二(三氟甲磺酸酯)可以通过二羟基苯噁嗪与三氟甲磺酸酐的反应制备。二(三氟甲磺酸酯)与氮杂环丁烷进行布赫瓦尔德-哈特维希钯催化C-N交叉偶联，然后用DDQ氧化得到氮杂环丁烷基噁嗪。
普通技术人员会认识到本文所述的方法和方案仅为了说明性目的而提供，并且不旨在限制用于合成本发明公开的化合物的实施方案的反应或反应系列的范围。
实施例
通过以下具体但非限制性的实施例进一步说明本发明公开的主题。以下实施例可以包括代表在与本发明相关的开发和实验过程中的各个时间收集的数据的数据汇编。
实施例1
本实施例表征了结构改性以改善罗丹明染料的亮度和光稳定性，具体为一个新的氮杂环丁基助色团，其引起相对于母体染料的量子效率的增加。氮杂环丁烷基罗丹明染料易于合成，使其保留了母体染料的光谱性质、细胞渗透性和功用。使用商业软件包Spartan'10(版本1.1.0，Wavefunction)进行计算实验。
最简单的已知罗丹明荧光团—罗丹明110(表2)在蓝光(λmax＝497nm)中表现出最大吸收，具有高消光系数(ε＝7.6×104M-1cm-1)，发射绿光(λem＝520nm)并具有高量子产率
Figure GDA0002543877310000471
罗丹明的烷基化引起吸收波长和荧光发射波长的红移。例如，四甲基罗丹明(TMR)具有λmax/λem＝548/572nm和ε＝7.8×104M-1cm-1(表2)。光谱性质的这种位移伴随着量子产率的显着降低，其中TMR显示
Figure GDA0002543877310000472
这两种染料都用于商业自标记标签底物，并且可用于标记活细胞中的细胞内和细胞外蛋白质。
表2罗丹明110、四甲基罗丹明(TMR)和环大小为3-7的氮杂环状罗丹明的光谱数据。
Figure GDA0002543877310000481
除非另有说明，所有测量都是在10mM HEPES pH7.3的条件下进行的。
N,N,N',N'-四烷基罗丹明(如TMR)的低量子效率可以通过能量方面有利的分子内扭转电荷转移(TICT)状态(图1)来解释。在激发之后，从氮原子到呫吨环的电子转移导致吡嗪酰胺基氮和扭转的C芳基-N键。这种TICT状态迅速松弛而不发射光子，并且是罗丹明染料中非辐射衰变的主要途径。这种双自由基种类也可能发生不可逆的反应导致荧光团漂白。因此，不支持TICT的罗丹明衍生物应当显示出提高的量子效率、更长的荧光寿命和更高的光稳定性。
通过使用标准的从头算Hartree-Fock方法来估计平衡几何形状，并通过在能量最小化过程中省略来自结构的邻羧基以防止环合形成内酯形式，分析表2所示的结构中芳基碳-氮键(C芳基-N)的长度以及与氮相邻(ortho)的氢取代基和与氮位于同一碳上的(alpha)氢取代基之间的最小距离。这些值是分子经历TICT的倾向的参数。较短的C芳基-N值表示增加的双键特征和较小的采用扭曲构象的趋势。同样，较大的Ho-Hα值表明取代基之间较少的空间碰撞和较低的键旋转倾向。
氮杂环丙烷衍生物的计算结构含有折叠的氮杂环丙烷环，且氮与呫吨体系的平面分离，这与存在于三元环中的大环应变(27kcal mol-1)一致。其他罗丹明最小化为包含苯胺氮的基本上平面的结构，表明这些染料优先选择在荧光罗丹明中发现的扩展共轭。考虑到存在于氮杂环丁烷中的相对大的环应力(估计为26kcal mol-1)，氮杂环丁烷基罗丹明(JF549，实施例7)的投影结构令人惊讶，预计其将有利于锥形氮原子。JF549显示平面计算结构的最短的C芳基-N键长度(1.349埃)和最长的Ho-Hα距离(2.56埃)。另外，与N,N-二烷基苯胺(1-苯基氮杂环丁烷IP＝7.61eV；N,N-二甲基苯胺IP＝7.37eV)相比，N芳基氮杂环丁烷显示更高的IP值，表明电子从苯胺氮转移到呫吨环体系形成TICT状态需要更高的能量补偿。这些结果暗示JF549将更加不易发生TICT，因此表现出优于TMR荧光团(2)的荧光性质。
然后合成了表2的化合物并评价其荧光性质。使用布赫瓦尔德-哈特维希交叉偶由荧光素二(三氟甲磺酸酯)容易且有效地合成了罗丹明，并且此合成方法允许由荧光素制备化合物。需要相对高的催化剂负载(10％)以最小化三氟甲磺酸酯水解并确保高产率。JF549和更大的环结构是高度着色的极性化合物，其通过采用强溶剂***(CH2Cl2/CH3OH/NH3)的正相快速色谱法纯化。相比之下，氮杂环丙基罗丹明是无色、非极性分子，并且可以通过采用弱溶剂混合物(EtOAc/己烷)的正相色谱法纯化。
在水溶液中评价合成的化合物的光物理性质，将它们与已知的罗丹明110和四甲基罗丹明比较。数据表明氮杂环丙烷取代基中的环应变迫使氮杂环丙烷基罗丹明采用闭合的内酯形式。JF549(实施例7)和更大的环结构的λmax和λem值类似于具有增加的环大小的TMR，导致高达10nm的轻微红移。有趣的是，JF549和氮杂环庚烷衍生物显示比其他染料高约30％的消光系数。将苯胺氮并入简单的环状***是打算控制TICT状态形成中的许多结构参数。先前认为含有较小氮杂环(如氮杂环丙烷和氮杂环丁烷)的结构中的较高环应变妨碍了荧光呫吨结构所需的平面构型。
不同罗丹明染料的λmax、λem和ε对取代环大小的依赖性不太大，但是荧光寿命(τ)和量子产率
Figure GDA0002543877310000501
随环大小变化而变化(表2)。JF549表现出高量子产率值
Figure GDA0002543877310000502
和长荧光寿命(τ＝3.8ns)，其大于TMR的所述值(
Figure GDA0002543877310000503
τ＝2.2ns)，并且与母体罗丹明110的所述值相似(1；
Figure GDA0002543877310000504
τ＝3.3ns)。JF549也比吡咯烷衍生物亮60％，吡咯烷衍生物显示
Figure GDA0002543877310000505
和τ＝3.6ns。哌啶衍生物的荧光急剧下降(
Figure GDA0002543877310000506
和τ＝0.6ns)；吡咯烷和哌啶衍生物的寿命值与类似的荧光团的寿命值一致。相对于哌啶衍生物，氮杂环庚烷衍生物的值(即
Figure GDA0002543877310000507
和τ＝1.62ns)略高。
JF549在单光子激发下的改善亮度(表2)延伸到双光子激发，并且由保持了TMR的许多期望的性质的结构改变引起。例如，TMR和JF549的吸收光谱和发射光谱是可重叠的(图2)，并且所述染料对溶剂极性的灵敏度相当(图3)，表明其具有相似的细胞渗透性。
实施例2
本实施例描述了评价染料JF549作为细胞成像中标记物的性能的方法。从6-羧基荧光素衍生物开始合成F549-HaloTag配体(实施例21)。首先将6-羧基荧光素的二乙酸酯衍生物保护为叔丁酯。将乙酸酯基用NaOH皂化，并将该中间体三氟甲磺酸酯化以经两步得到6-叔羧基荧光素二(三氟甲磺酸酯)，产率69％。与氮杂环丁烷交叉偶联得到罗丹明，其被去保护以产生羧酸。用DSC处理所述羧酸，然后与HaloTag(O2)胺反应，得到JF549-HaloTag配体(实施例21)。该分子是商业TMR基HaloTag配体的直接类似物。值得注意的是，罗丹明染料在“开放的”、两性离子的醌型与“闭合的”、亲脂性内酯形式之间平衡存在。这种动态两亲性使得纯中性罗丹明例如罗丹明110、TMR和JF549成为活细胞标记技术有用的配体，因为染料在没有去污剂或化学掩蔽基团的情况下有效地穿过细胞膜，并且过量的配体可以被快速洗去。
将TMR和JF549HaloTag配体的标记动力学与新的Cy3 HaloTag配体进行比较，同时测量所得缀合物的亮度和光子产率。JF549配体在体外显示出与TMR配体相当的标记动力学和相对于其他染料增加的亮度。采用JF549配体孵育表达HaloTag-组蛋白2B(H2B)融合物的活细胞导致明亮的细胞核标记(图4)和低细胞质背景，证明JF549-HaloTag配体有效地穿过活细胞膜并选择性标记HaloTag蛋白。
使用少量配体(<50nM)的JF549和TMR配体孵育允许单分子成像，并允许对标记的HaloTag-H2B个体分子的荧光团亮度(光子/秒)和光稳定性(即轨道长度，s)进行评价。与TMR配体相比，JF549配体在亮度和光稳定性两方面有大的增加(图5)。用TMR配体标记的蛋白质显示平均光子/s＝1.1×104和平均轨道长度0.72s。JF549配体缀合物发射几乎两倍数目的光子数/s(1.9×104)并且持续时间约两倍长(平均轨道长度＝1.6s)。单分子亮度的这种改进扩展到直接随机光学重建显微术(dSTORM)实验，其中还原环境的使用使合成荧光团的可逆光开关成为可能。
这产生了采用的JF549配体(图6)或TMR配体(图7)的H2B的超分辨率图像(图8)，其分别具有14.1nm和17.0nm的中值定位误差(σ)。dSTORM可以在使用细胞还原环境来引发JF549标记物的光开关的活细胞内(图9)进行。因此，JF549在该光谱范围内在针对体外、固定细胞和活细胞中HaloTag缀合起作用。
实施例3
本实施例描述了将氮杂环丁烷基取代扩展至其他染料骨架，包括含有碳和硅原子的罗丹明的其他红移同构异素体。该实施例证明，氮杂环丁烷基取代可普遍适用于不同的荧光团骨架，并且相对于原始母体荧光团骨架能够增加亮度。
N,N-二烷基基元存在于许多经典荧光团骨架(表3)中，包括香豆素(例如香豆素461)、吖啶(例如吖啶橙)、对甲氨基酚、碳罗丹明、噁嗪(如噁嗪1)和硅罗丹明。已经提出TICT作为这些荧光***中非辐射衰变的主要贡献者导致适度的量子效率。与前述实施例中所述的罗丹明一样，Pd-催化的交叉偶联方法用于从易得到的芳基卤化物或芳基三氟甲磺酸盐开始将氮杂环丁烷基元安装在这些荧光团中。
表3N,N-二烷基(即二甲基氨基或二乙基氨基)部分被氮杂环丁烷环取代的荧光团骨架的实施方案的光谱数据
Figure GDA0002543877310000521
除非另有说明，所有测量都是在10mM HEPES pH7.3的条件下进行的。
a在含有0.1％(v/v)三氟乙酸的乙醇中测量的消光系数。
在所有情况下，氮杂环丁烷取代使量子产率增加，而对其他光谱性质没有实质性有害影响(表3)。香豆素461在水性缓冲液中显示λmax/λem＝372nm/470nm，ε＝1.8×104M-1cm-1和适中的
Figure GDA0002543877310000523
氮杂环丁烷基取代的化合物(实施例49)量子产率
Figure GDA0002543877310000522
增大五倍，并且吸光度最大值(λmax＝354nm)蓝移18nm。氮杂环丁烷取代的化合物的发射光谱和消光系数(λmax＝467nm，ε＝1.5×104M-1cm-1)与母体香豆素染料相似。7-(二乙基氨基)香豆素-3-羧酸(DEAC)显示λmax/λem＝410nm/471nm，ε＝3.5×104M-1cm-1，但是具有低量子产率
Figure GDA0002543877310000531
氮杂环丁烷取代的化合物(实施例51)显示出较短的吸收最大值(λmax＝387nm)、较小的消光系数(ε＝2.4×104M-1cm-1)和发射最大值(λem＝470nm)，其中氮杂环丁烷取代使量子产率提高几乎30倍
Figure GDA0002543877310000532
接着，吖啶和对甲氨基酚荧光团骨架被修饰。当在水溶液中测量时，经典荧光团吖啶橙具有
Figure GDA0002543877310000533
而氮杂环丁烷取代的化合物(实施例60)的亮度是原来的2.5倍，
Figure GDA0002543877310000534
两种吖啶的其他光谱性质相似。二甲基对甲氨基酚显示λmax/λem＝518nm/546nm，ε＝6.0×104M-1cm-1，
Figure GDA0002543877310000535
尽管用氮杂环丁烷代替N,N-二甲基氨基使量子产率增加四倍
Figure GDA00025438773100005313
二甲基对甲氨基酚的氮杂环丁烷取代对应物(实施例59)与二甲基对甲氨基酚具有相似的λmax、λem和ε值。
然后，关于更长波长的荧光团，TMR的含碳类似物在水性缓冲液(pH7.0)中显示λmax/λem＝606nm/626nm，ε＝1.21×105M-1cm-1，
Figure GDA0002543877310000536
(表3)。氮杂环丁烷基-碳罗丹明(实施例40)显示类似的吸收和发射最大值(λmax/λem＝608nm/631nm)以及消光系数(ε＝9.9×104M-1cm-1)，具有量子产率
Figure GDA0002543877310000537
染料噁嗪1在远红外中显示如下光谱性质：λmax/λem＝655nm/669nm、ε＝1.11×105M-1cm-1和相对低的
Figure GDA0002543877310000538
并且氮杂环丁烷取代(实施例61)产生小的蓝移(λmax/λem＝647nm/661nm)和略低的消光系数(ε＝9.9×104M-1cm-1)，使量子产率
Figure GDA0002543877310000539
提高3.4倍。最后，TMR的硅罗丹明的类似物(SiTMR；来自
Figure GDA00025438773100005310
G.等人，Nat.Chem.2013，5，132)显示λmax/λem＝643nm/662nm和
Figure GDA00025438773100005311
氮杂环丁烷取代的化合物(实施例30)给出相似的吸收和发射最大值(λmax/λem＝646nm/664nm)和更高的
Figure GDA00025438773100005312
由于硅罗丹明可能在水中采用无色形式，因此在酸性乙醇中测量消光系数，发现SiTMR的消光系数为ε＝1.41×105M-1cm-1，氮杂环丁烷取代的化合物的消光系数为ε＝1.52×105M-1cm-1。
实施例4
本实施例描述了使用氮杂环丁烷基-硅罗丹明的细胞成像。基于SiTMR的化合物是活细胞内SnapTag、HaloTag和其他蛋白质的有效标记物。相对于非氮杂环丁烷基母体化合物SiTMR，氮杂环丁烷基-罗丹明(实施例30)显示出优异的亮度(
Figure GDA0002543877310000541
表3)。在该实施例中描述的氮杂环丁烷基-硅罗丹明的实施方案具有λmax＝646，并且在本文中称为“JF646”。
为了在细胞成像实验中直接比较这两种染料，由新的硅荧光素前体合成氮杂环丁烷基-硅罗丹明(JF646-HaloTag配体，实施例35)和SiTMR的HaloTag配体(
Figure GDA0002543877310000542
G.等人，Nat.Chem.2013，5，132)。两种硅罗丹明配体是HaloTag-H2B的超分辨率dSTORM成像的优异标记物(图10和11)，分别显示8.4nm和9.0nm的中值定位误差(图12)。还对表达HaloTag-微管蛋白并采用JF646配体标记的活细胞进行了dSTORM。使用该标记物观察到高光子产率和低背景，产生中值σ＝7.1nm(图13-15)。
在与纯化的蛋白质反应中和活细胞成像实验中比较Halotag配体的色原性。SiTMR配体在与缓冲液中过量的HaloTag蛋白反应时显示6.8倍的增强(图16)。氮杂环丁烷基-硅罗丹明-HaloTag配体显示较低的背景，导致在相同条件下吸光度较大的增加(21倍)(图17)。
接下来，使用表达HaloTag-H2B融合物的细胞进行“无洗涤”成像实验。与两个配体中的任一配体(100nM)孵育然后直接进行宽场成像产生了使用SiTMR配体(图18)和JF646配体(图19)明亮标记的细胞核。SiTMR显示核外荧光(图20)，而JF646配体显示较低的非特异性染色(图21和22)。总的来说，这些结果显示已知的SiTMR配体可以被结构类似的JF646配体取代，以在超分辨率成像中实现改进的定位误差并且在常规荧光显微术中实现更低的背景。
实施例5
本实施例描述了在同一细胞中进行的多重单粒子追踪和超分辨率成像过程。鉴于JF549和JF646之间的光谱分离，在同一活细胞中在单分子水平上成像两种不同的蛋白质种类。
为了实现正交标记，制备JF549的SnapTag配体。HaloTag-H2B以及SnapTag酶和Tet阻遏物蛋白(SnapTag-TetR)的融合物被共表达并采用JF646-HaloTag配体(实施例35)和JF549-SnapTag配体(实施例22)分别标记。对JF549标记的个体TetR蛋白的轨迹进行成像，随后进行JF646-H2B缀合物的快速活细胞dSTORM实验(图23)。这种双色程序揭示了与核的染色质结构有关的快扩散DNA结合蛋白和慢扩散DNA结合蛋白各自的分区(图24)。然后绘制H2B共定位和非共定位的TetR轨迹的扩散系数直方图，此图显示TetR与H2B共定位程度比与非共定位位置的程度更大(图25)。
因此，本发明化合物可用于活细胞中的多色实验中，其中参与生物过程的几种组分可以在相同细胞内以分子精确度被追踪和定位。
实施例6
在本实施例中，将氮杂环丁烷基-香豆素标记物用于细胞成像。将商业SnapTag配体(即Snap Cell 430)的性能与由7-氮杂环丁烷基-香豆素-3-羧酸合成的新型氮杂环丁烷基衍生物(实施例52)进行比较。在相同的瞬时转染、标记和成像条件下，将表达H2B-SnapTag的细胞用红色荧光核染色剂DRAQ5和Snap Cell 430或氮杂环丁烷基配体染色。使用DRAQ5染色作为空间参照(图26和27)，测量由SnapTag配体标记的单个核的强度。采用Snap Cell 430配体孵育的细胞显示低荧光强度(图28)，然而用氮杂环丁烷基-香豆素SnapTag配体标记的细胞显示更亮的核标记(图29)。核强度的定量显示用氮杂环丁烷标记的细胞具有比用商业化合物标记的细胞高五倍的中值(图30)。
实施例7-61
以下实施例描述了本文所述化合物的具体实施方案，并且说明了本发明的氮杂环丁烷方法用于制备染料的灵活性。我们推测，可以通过探索在氮杂环丁烷的3位的不同取代模式进一步调整JF549的物理化学性质。例如，表1中所示的取代的氮杂环丁烷基-罗丹明具有相对高的ε值和量子产率值。
将用于光谱学的荧光和荧光分子配制为DMSO中的储备溶液，并稀释使得DMSO浓度不超过1％v/v。除非另有说明，磷酸盐缓冲液(PBS)的pH为7.4。
使用来自Starna Cells公司的1cm路径长度的3.5-mL石英比色皿或来自Hellma公司的1cm路径长度的1.0-mL石英微量比色皿进行光谱测量。除非另有说明，所有测量均在环境温度(22±2℃)下在10mM HEPES和pH 7.3的缓冲液中进行。在Cary Model 100光谱仪(Varian)上记录吸收光谱；消光系数(ε)的报告值是平均值(n＝3)。在Cary Eclipse荧光计(Varian)上记录荧光光谱。为了清楚起见，示出了归一化的光谱。
所有报告的量子产率值均是使用Quantaurus-QY光谱仪(C11374，Hamamatsu)在相同条件下测得。使用稀释样品(A<0.1)进行测量，并使用仪器软件进行自吸收校正。报告的值是平均值(n＝3)。
在光谱级二噁烷(Sigma-Aldrich)和milliQ H2O中进行二噁烷-H2O滴定。溶剂混合物含有0.01％v/v三乙胺以确保罗丹明染料为两性离子形式。使用石英96孔微板(Hellma)和FlexStation3酶标仪(Molecular Devices)在5μo样品上测量λmax处的吸光度值(n＝2)。
对于荧光寿命测量，将脉冲拾取器(型号350-160，ConOptics)置于激光束中以将脉冲频率从80MHz降低至20MHz。将样品(在50mM HEPES，pH7.2，H2O或CH3OH中稀释的2μ稀染料)在830nm激光波长和6mW激光功率下激发。发射的光由快速定时APD收集并且馈送到单光子计数板(TimeHarp200；PicoQuant)。定时脉冲从监测20MHz脉冲串的PIN二极管(DET01CFC；ThorLabs)获得。***的暂时脉冲响应是通过使用薄非线性晶体代替染料样品的激光脉冲的二次谐波的产生来确定。使用定制的MATLAB程序将寿命衰减数据拟合为单指数衰减函数。与文献值为4.1±0.1ns相比，使用该***测量的参比荧光染料的寿命值为4.025±0.015ns(R2＝0.99)(Magde，D.；Rojas，GE；Seybold，P.G.Photochem.Photobiol.1999，70，737)。
为了测量与HaloTag蛋白反应时HaloTag配体的荧光，在1mL石英比色皿中进行吸光度测量。把HaloTag蛋白用作75mM NaCl和50mM TRIS·HCl中的100μM溶液，pH为7.4且含有50％v/v甘油(TBS-甘油)。将JF646和SiTMR(5μM)的HaloTag配体溶解于含有0.1mg·mL- 1CHAPS且pH为7.3的10mM HEPES中。加入HaloTag蛋白(1.5当量)或相当体积的TBS-甘油空白的等分试样，将所得混合物孵育直至观察到一致的吸光度信号(～30分钟)。额外的HaloTag蛋白没有引起吸光度的增加(未显示)。吸光度扫描是平均值(n＝2)。
将HeLa细胞(ATCC)和U2OS细胞(ATCC)在补充有10％v/v胎牛血清(FBS；LifeTechnologies公司)、1mM GlutaMax(Life Technologies公司)和1mM丙酮酸钠(σ)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM；Life Technologies)中培养，并保持在37℃下潮湿的5％v/vCO2环境中。使这些细胞系经历Janelia细胞培养设备的常规支原体测试。使用HaloTag-H2B、HaloTag-微管蛋白、SnapTag-TetR或SnapTag-H2B在Amaxa Nucleofector(Lonza)中转染细胞。在成像实验之前，将转染的细胞转移到用Piranha溶液(浓H2SO4和30％v/v过氧化氢的比例为3:1v/v的混合物)清洁过的1号盖玻片(Warner Instruments)上。为了采用HaloTag或SnapTag配体标记活细胞，将配体加入到生长培养基中，并将样品孵育15分钟。对于共焦、宽场和dSTORM实验，标记浓度通常为100-500nM，对于单分子追踪实验，标记浓度为5-50nM。然后用PBS(1×)简单洗涤细胞，然后在DMEM-FBS中再孵育15分钟。成像前，细胞用PBS(3×)简单洗涤，并置于新鲜的DMEM-FBS中成像。在“无洗涤”实验中省略所有洗涤。对于核染色，将细胞在PBS中孵育5分钟(2×)，然后在含有5μ然DRAQ5(Cell Signaling)的PBS中孵育5分钟，随后用PBS(1×)简单洗涤。在所有成像实验期间，细胞被维持在由活细胞培养器(TOKAI HIT)提供的37℃的湿润的5％CO2 v/v环境中。
使用三个单独的***获得显微图像。使用具有LD C-APOCHROMAT40×/1.2W KorrM27 UV-VIS-IR物镜的Zeiss LSM 510META共聚焦显微镜来完成共焦显微术。在配备有下述设备的Nikon Eclipse Ti宽场落射荧光显微镜上进行宽场显微术、2D单分子追踪和超分辨率成像实验：100×,1.4NA油浸物镜(Nikon)、Lumencor光源、由声光可调谐滤波器(AAOpto-Electronic)控制的一组激光器(405nm/100mW，Coherent Cube；561nm/200mW，CoboltJive；633nm/140mW，Vortran Stradus)、两个滤光轮(Lambda 10-3；Sutter Instruments)、完美聚焦***(Nikon)和EMCCD摄像机(iXon3，Andor)。将发射滤光器(FF01 593/40或FF01676/37；Semrock)放置在用于JF549和JF646发射的相机的前面。使用多波段反射镜(405/488/561/633BrightLine四频带带通滤波器，Semrock)将激发激光束反射到物镜中。显微镜、照相机和硬件通过NIS-Elements软件(尼康)控制。在定制的三相机RAMM框架(ASI)显微镜上使用1.4NAPLAPON60×OSC物镜(Olympus)和300mm焦距镜筒透镜(LAO-300.0MellesGriot)来记录其他活细胞单超分辨率成像实验，得到100×的总放大率。采用NI-DAQ-USB-6363采集板(National Instruments)来实现Stradus 405-100激光器(Vortran)的频闪405nm激发，其也被用来控制Stradus 637-140激光器(Vortran)的637nm激光发射。2mm厚的四波段二向色(ZT 405/488/561/640rpx，色度)和带通发射滤光器(FF01-731/137-25，Semrock)过滤发射的光。用背照式EMCCD照相机(Andor Technology，Ixon Ultra DU-897U-CS0-EXF，17MHz EM放大器)检测荧光，其通过Micro-Manager(1.4.17)控制。
为了活细胞dSTORM成像，细胞被标记、洗涤并直接在DMEM-FBS中成像。为了得到固定的细胞制备物，细胞被标记、洗涤并在PBS缓冲液(pH＝7.5)中的4％多聚甲醛(ElectronMicroscopy Sciences)中固定。将细胞在密封的细胞室(Life Technologies)中成像，所述细胞室含有由补充有50mM巯基乙胺(Sigma-Aldrich)、10％w/v葡萄糖、0.5mg/mL葡萄糖氧化酶(Sigma-Aldrich)和28400U/mL过氧化氢酶(Sigma-Aldrich)的PBS组成的氮除气氧化还原缓冲液。在成像之前，JF549一经2kW·cm-2的激发光(561nm)照射就可以在黑暗状态下有效地“搁置”，然后通过低强度(～20Wcm-2)的蓝光(405nm)激活回荧光状态。使用14kW·cm-2的637nm激发光连续照射将JF646荧光团转化为主要暗态，之后观察到JF646荧光团的个别快速闪烁分子。这些实验在上述两个宽场显微镜***上进行，即Nikon Eclipse Ti落射荧光显微镜和具有ASI RAMM框架的定制的三摄像机显微镜。
基于多靶点追踪(MTT)算法(Serge,A.；Bertaux,N.；Rigneault,H.；Marguet,D.Nature Protocol Exchange 2008,doi:10.1038/nprot.2008.1128；Serge,A.；Bertaux,N.；Rigneault,H.；Marguet,D.Nat.Methods 2008,5,687)使用定制MATLAB程序得到点的定位(x,y)。对于每一帧，将单个荧光团的PSF拟合成二维高斯分布。使用以IGOR Pro(版本6.34A)编写的分析程序计算综合荧光强度并将其转换为光子计数。使用Mortensen等人(Mortensen,K.I.；Churchman,L.S.；Spudich,J.A.；Flyvbjerg,H.Nat.Methods2010,7,377)的方程式6计算局部化误差。采用Igor Pro v.3.34A运行的Dedecker等人(Dedecker,P.；Duwé,S.；Neely,R.K.；Zhang,J.J.Biomed.Opt.2012,17,126008)的软件包Localizer来实施超分辨率图像，Igor Pro v.3.34A其将检测的斑点的位置坐标叠加作为高斯掩模，此高斯掩模以拟合强度值作为幅度并以定位误差作为宽度。在相同的照明条件下在同一天记录用于比较两种不同荧光团配体的dSTORM实验数据。
在Nikon Eclipse Ti宽场落射荧光显微镜上记录双色单分子实验。我们首先使用激发强度为～1kWcm-2的561nm激光以100Hz的帧速率对SnapTag-TetR-JF549进行2D单分子追踪。在单粒子追踪实验完成后，我们立即在如上所述的dSTORM模式下成像HaloTag-H2B-JF646。在追踪-dSTORM实验之前和之后拍摄透射图像，并且采用互相关算法来计算图像漂移(Guizar-Sicairos,M.；Thurman,S.T.；Fienup,J.R.Opt.Lett.2008,33,156)。使用商业追踪软件DiaTrack(v.3.03，Semasopht)进行TetR的追踪分析，所述软件识别荧光粒子的强度斑点，并将其和与实验确定的点扩散函数匹配的2D高斯函数进行拟合。通过使用在IGORPro 6.34A中编写的追踪程序产生扩散图，根据在10毫秒的时间量程上的均方位移来计算在20nm×20nm x-y网格上评估的TetR迁移率的局部表观扩散。每当发现源自给定80nm网格节点内的两个或更多个分开的位移时，计算并绘制局部表观扩散系数。然后选择H2B簇作为超分辨图像中的500个最亮点。从该分析中，生成了驻留在H2B簇的320nm内至少10毫秒的所有轨迹的表观扩散系数的直方图。然后绘制H2B共定位和非共定位TetR轨迹的扩散系数的直方图。
实施例7
2-(3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000601
将荧光素二(三氟甲磺酸酯)(75mg，126μmol；来自Grimm，JB；Lavis，L.D.Org.Lett.2011,13,6354)、Pd2dba3(11.5mg，12.6μmol，0.1当量)、XPhos(18.0mg，37.7μmol，0.3当量)和Cs2CO3(115mg，352μmol，2.8当量)装入小瓶。将小瓶密封并抽真空/用氮气回填(3×)。加入二噁烷(1mL)，并再次用氮气(3×)冲洗反应。加入氮杂环丁烷(20.3μL，302μmol，2.4当量)后，将反应在100℃下搅拌18小时。然后将其冷却至室温，用MeOH稀释，沉积在硅藻土上，并浓缩至干燥。通过硅胶色谱法(0-10％MeOH(2M NH3)/CH2Cl2，线性梯度；采用硅藻土干法上样)纯化，得到标题化合物(49mg，95％)，其为紫色固体。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.03–7.96(m,1H),7.63(td,J＝7.4,1.3Hz,1H),7.58(td,J＝7.4,1.1Hz,1H),7.20–7.13(m,1H),6.56(d,J＝8.6Hz,2H),6.20(d,J＝2.3Hz,2H),6.09(dd,J＝8.6,2.3Hz,2H),3.91(t,J＝7.3Hz,8H),2.37(p,J＝7.2Hz,4H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ169.9(C),153.7(C),153.1(C),152.9(C),134.6(CH),129.4(CH),129.0(CH),127.8(C),125.0(CH),124.3(CH),107.9(C),107.8(CH),97.7(CH),52.2(CH2),16.8(CH2)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v三氟乙酸(TFA)添加剂；运行20min(分钟)；流速1mL/min；ESI；正离子模式；550nm处检测)；HRMS(ESI)C26H23N2O3[M+H]+的计算值411.1703，实验值411.1714。
实施例8
2-(3,6-二(3,3-二甲基氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000611
使用实施例7中所述的方法由荧光素二(三氟甲磺酸酯)和3,3-二甲基氮杂环丁烷盐酸盐制备标题化合物(86％，紫色固体)。1H NMR(MeOD,400MHz)δ8.11–8.06(m,1H),7.67–7.57(m,2H),7.23–7.20(m,1H),7.19(d,J＝9.2Hz,2H),6.56(dd,J＝9.1,2.2Hz,2H),6.49(d,J＝2.2Hz,2H),3.92(s,8H),1.39(s,12H)；13C NMR(MeOD,101MHz)δ173.1(C),160.2(C),158.7(C),158.2(C),140.8(C),134.9(C),132.9(CH),130.82(CH),130.77(CH),130.74(CH),130.2(CH),115.0(C),113.1(CH),95.5(CH),64.4(CH2),33.0(C),27.1(CH3)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；550nm处检测)；HRMS(ESI)C30H31N2O3[M+H]+的计算值467.2329，实验值467.2341。
实施例9
2-(3,6-二(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000612
使用实施例7中所述的方法由荧光素二(三氟甲磺酸酯)和3,3-二氟氮杂环丁烷盐酸盐制备标题化合物(91％，粉色固体)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.03–7.99(m,1H),7.66(td,J＝7.4,1.3Hz,1H),7.60(td,J＝7.4,1.1Hz,1H),7.17–7.14(m,1H),6.64(d,J＝8.6Hz,2H),6.30(d,J＝2.4Hz,2H),6.17(dd,J＝8.6,2.4Hz,2H),4.25(t,3JHF＝11.7Hz,8H)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-100.05(p,3JFH＝11.8Hz)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ169.6(C),153.3(C),152.6(C),151.3(t,4JCF＝2.9Hz,C),135.0(CH),129.7(CH),129.3(CH),127.2(C),125.1(CH),124.0(CH),115.8(t,1JCF＝274.6Hz,CF2),109.7(C),108.8(CH),99.4(CH),83.9(C),63.4(t,2JCF＝26.3Hz,CH2)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；525nm处检测)；HRMS(ESI)C26H19F4N2O3[M+H]+的计算值483.1326，实验值483.1336。
实施例10
2-(3,6-二(3-氟氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000621
使用实施例7中所述的方法由荧光素二(三氟甲磺酸酯)和3-氟氮杂环丁烷盐酸盐制备标题化合物(89％，粉色固体)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.01–7.95(m,1H),7.78(td,J＝7.5,1.2Hz,1H),7.71(td,J＝7.5,0.9Hz,1H),7.25–7.20(m,1H),6.52(d,J＝8.6Hz,2H),6.33(d,J＝2.3Hz,2H),6.24(dd,J＝8.6,2.3Hz,2H),5.49(dtt,2JHF＝57.6Hz,J＝6.0,3.1Hz,2H),4.26–4.13(m,4H),4.00–3.88(m,4H)；19F NMR(DMSO-d6,376MHz)δ-178.95(dtt,JFH＝57.4,24.2,20.9Hz)；13C NMR(DMSO-d6,101MHz)δ168.7(C),152.54(d,4JCF＝1.3Hz,C),152.47(C),151.8(C),135.4(CH),129.9(CH),128.6(CH),126.4(C),124.5(CH),123.9(CH),108.6(CH),107.8(C),98.0(CH),83.8(C),83.3(d,1JCF＝200.3Hz,CFH),59.2(d,2JCF＝23.7Hz,CH2)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；550nm处检测)；HRMS(ESI)C26H21F2N2O3[M+H]+的计算值447.1515,实验值447.1525。
实施例11
2-(3,6-二(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000631
使用实施例7中所述的方法由荧光素二(三氟甲磺酸酯)和3-甲氧基氮杂环丁烷盐酸盐制备标题化合物(83％，紫色固体)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.00–7.94(m,1H),7.77(td,J＝7.5,1.2Hz,1H),7.70(td,J＝7.5,0.9Hz,1H),7.25–7.20(m,1H),6.48(d,J＝8.6Hz,2H),6.26(d,J＝2.3Hz,2H),6.19(dd,J＝8.6,2.3Hz,2H),4.32(tt,J＝6.2,4.2Hz,2H),4.07(dd,J＝8.0,6.6Hz,4H),3.66(dd,J＝8.4,4.1Hz,4H),3.24(s,6H)；13C NMR(DMSO-d6,101MHz)δ168.7(C),152.8(C),152.5(C),151.9(C),135.4(CH),129.9(CH),128.5(CH),126.5(C),124.5(CH),123.9(CH),108.2(CH),107.2(C),97.5(CH),84.1(C),69.2(CH),58.3(CH2),55.4(CH3)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；550nm处检测)；HRMS(ESI)C28H27N2O5[M+H]+的计算值471.1914,实验值471.1926。
实施例12
2-(3,6-二(3-氰基氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000632
使用实施例7中所述的方法由荧光素二(三氟甲磺酸酯)和3-氮杂环丁烷甲腈盐酸盐制备标题化合物(85％，洋红色固体)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.03–7.98(m,1H),7.66(td,J＝7.4,1.3Hz,1H),7.60(td,J＝7.4,1.1Hz,1H),7.17–7.13(m,1H),6.62(d,J＝8.6Hz,2H),6.25(d,J＝2.3Hz,2H),6.12(dd,J＝8.6,2.4Hz,2H),4.25–4.18(m,4H),4.15–4.08(m,4H),3.60(tt,J＝8.5,6.2Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ169.6(C),153.2(C),152.5(C),151.9(C),135.0(CH),129.7(CH),129.3(CH),127.1(C),125.1(CH),124.0(CH),119.7(C),109.7(C),108.1(CH),98.7(CH),83.9(C),55.2(CH2),18.4(CH)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；550nm处检测)；HRMS(ESI)C28H21N4O3[M+H]+的计算值461.1608，实验值461.1628。
实施例13
2-(3,6-二(3-(二甲基氨基)氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000641
使用实施例7中所述的方法由荧光素二(三氟甲磺酸酯)和3-(二甲基氨基)氮杂环丁烷二盐酸化物制备标题化合物(80％，紫色固体)。1H NMR(MeOD,400MHz)δ8.10–8.05(m,1H),7.69–7.60(m,2H),7.24–7.19(m,1H),7.12(d,J＝9.0Hz,2H),6.56(dd,J＝9.0,2.2Hz,2H),6.53(d,J＝2.2Hz,2H),4.31–4.22(m,4H),4.01(dd,J＝10.5,5.1Hz,4H),3.39(tt,J＝7.0,5.1Hz,2H),2.27(s,12H)；13C NMR(MeOD,101MHz)δ172.8(C),157.9(C),157.1(C),147.7(C),138.7(C),138.4(C),132.5(CH),131.8(CH),130.8(CH),129.9(CH),129.3(CH),114.1(C),112.4(CH),96.3(CH),57.0(CH),56.6(CH2),42.0(CH3)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；550nm处检测)；HRMS(ESI)C30H33N4O3[M+H]+的计算值497.2547，实验值497.2561。
实施例14
2-(3,6-二(3-(甲氧基羰基)氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000651
使用实施例7中所述的方法由荧光素二(三氟甲磺酸酯)和氮杂环丁烷-3-羧酸甲酯盐酸盐制备标题化合物(79％，紫色固体)。1H NMR(MeOD,400MHz)δ8.09–8.03(m,1H),7.69–7.62(m,2H),7.24–7.17(m,1H),7.02(d,J＝8.9Hz,2H),6.48(dd,J＝8.9,2.2Hz,2H),6.45(d,J＝2.1Hz,2H),4.34(t,J＝9.0Hz,4H),4.25(dd,J＝9.0,5.9Hz,4H),3.77(s,6H),3.71(tt,J＝8.9,5.9Hz,2H)；13C NMR(MeOD,101MHz)δ174.4(C),172.6(C),157.0(C),156.5(C),141.6(C),136.7(C),135.8(C),132.7(CH),131.9(CH),130.9(CH),129.0(CH),128.5(CH),113.3(C),111.7(CH),96.8(CH),55.2(CH2),52.9(CH3),34.0(CH)；HRMS(ESI)C30H27N2O7[M+H]+的计算值527.1813，实验值527.1823。
实施例15
2-(3,6-二(3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000652
使用实施例7中所述的方法由荧光素二(三氟甲磺酸酯)和3-氮杂丁烷乙酸酯三氟乙酸甲酯制备标题化合物(67％，紫色固体)。1H NMR(MeOD,400MHz)δ8.10–8.05(m,1H),7.67–7.57(m,2H),7.21–7.18(m,1H),7.16(d,J＝9.1Hz,2H),6.54(dd,J＝9.1,2.2Hz,2H),6.48(d,J＝2.2Hz,2H),4.41–4.32(m,4H),3.97–3.88(m,4H),3.69(s,6H),3.26–3.13(m,2H),2.80(d,J＝7.7Hz,4H)；13C NMR(MeOD,101MHz)δ173.7(C),173.0(C),158.3(C),157.5(C),154.9(C),140.1(C),136.3(C),132.7(CH),131.1(CH),130.8(CH),130.4(CH),129.8(CH),114.5(C),112.7(CH),95.7(CH),57.5(CH2),52.2(CH3),38.5(CH2),27.3(CH)；HRMS(ESI)C32H31N2O7[M+H]+的计算值555.2126，实验值555.2132。
实施例16
2-(3,6-二(3-羧基氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000661
将2-(3,6-二(3-(甲氧基羰基)氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐(实施例14；40mg，76.0μ6.0)溶于MeOH(2.5mL)中，加入1M NaOH(304μ0，304NaOH，4当量)。将反应在室温下搅拌18小时后，用1M HCl(350μ5)酸化，并通过反相HPLC(10-50％MeCN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂)直接纯化得到28mg的标题化合物(60％，TFA盐)，其为红紫色固体。1H NMR(MeOD,400MHz)δ8.36–8.30(m,1H),7.84(td,J＝7.5,1.6Hz,1H),7.79(td,J＝7.6,1.5Hz,1H),7.40–7.36(m,1H),7.12(d,J＝9.2Hz,2H),6.66(dd,J＝9.2,2.2Hz,2H),6.61(d,J＝2.2Hz,2H),4.48(t,J＝9.6Hz,4H),4.39(dd,J＝9.9,5.9Hz,4H),3.72(tt,J＝9.0,5.8Hz,2H)；13C NMR(MeOD,101MHz)δ175.2(C),168.0(C),162.4(C),158.9(C),157.9(C),135.3(C),133.9(CH),132.6(CH),132.5(CH),131.5(CH),131.4(CH),115.4(C),113.8(CH),95.6(CH),55.3(CH2),33.9(CH)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–75％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；550nm处检测)；HRMS(ESI)C28H23N2O7[M+H]+的计算值499.1500，实验值499.1507。
实施例17
2-(3,6-二(3-羧甲基氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000671
使用实施例16中所述的方法由实施例15制备标题化合物(80％，红紫色固体，TFA盐)。1H NMR(MeOD,400MHz)δ8.35–8.30(m,1H),7.83(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.78(td,J＝7.6,1.5Hz,1H),7.40–7.35(m,1H),7.07(d,J＝9.2Hz,2H),6.62(dd,J＝9.2,2.2Hz,2H),6.56(d,J＝2.2Hz,2H),4.43(t,J＝9.6Hz,4H),4.05–3.96(m,4H),3.28–3.16(m,2H),2.78(d,J＝7.7Hz,4H)；13C NMR(MeOD,101MHz)δ175.1(C),167.9(C),161.7(C),158.8(C),158.0(C),135.4(C),133.8(CH),132.5(CH),132.3(CH),131.41(CH),131.40(CH),115.1(C),113.7(CH),95.3(CH),57.6(CH2),38.5(CH2),27.3(CH)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；550nm处检测)；HRMS(ESI)C30H27N2O7[M+H]+的计算值527.1813，实验值527.1815。
实施例18
4-(叔丁氧基羰基)-2-(3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000672
步骤1：将6-羧基荧光素二乙酸酯(1.39g，3.02mmol)在甲苯(6mL)中的悬浮液加热至80℃，在5分钟内滴加N,N-二甲基甲酰胺二叔丁基缩醛(4.34mL，18.1mmol，6当量)。在80℃下搅拌反应15分钟。冷却混合物至室温后，用饱和NaHCO3稀释并用CH2Cl2(2×)萃取。将合并的有机提取物干燥(MgSO4)、过滤和蒸发。通过快速色谱(0-20％EtOAc/己烷，线性梯度，恒定的40％v/v CH2Cl2)得到6-(叔丁氧基羰基)-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3',6'-二基二乙酸酯，其为无色固体(971mg，62％)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.26(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.07(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.73(dd,J＝1.2,0.8Hz,1H),7.12(dd,J＝2.1,0.4Hz,2H),6.84(dd,J＝8.7,2.1Hz,2H),6.80(dd,J＝8.7,0.5Hz,2H),2.32(s,6H),1.56(s,9H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ168.9(C),168.3(C),164.0(C),152.8(C),152.3(C),151.7(C),138.8(C),131.4(CH),129.4(C),129.1(CH),125.2(CH),125.1(CH),118.0(CH),116.0(C),110.6(CH),83.0(C),82.1(C),28.2(CH3),21.3(CH3)；HRMS(ESI)C29H25O9[M+H]+的计算值517.1493，实验值517.1495。
步骤2：向步骤1所得中间体(910mg，1.76mmol)的1：1THF/MeOH(20mL)的溶液中加入1M NaOH(4.23mL，4.23mmol，2.4当量)。将反应在室温下搅拌1小时。将所得的红橙色溶液用1N HCl(5mL)酸化，用水稀释，并用EtOAc(2×)萃取。有机物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩得到红色固体。将粗固体悬浮于CH2Cl2(15mL)中并冷却至0℃。加入吡啶(1.14mL，14.1mmol，8当量)和三氟甲磺酸酐(1.19mL，7.05mmol，4当量)，并移除冰浴。将反应在室温下搅拌1小时。随后用水稀释并用CH2Cl2(2×)萃取。将合并的有机萃取物干燥(MgSO4)，过滤并蒸发。进行硅胶色谱法(0-25％EtOAc/己烷，线性梯度)得到3-氧代-3',6'-二(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-6-羧酸叔丁酯，其为无色固体。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.28(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.11(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.75(dd,J＝1.2,0.7Hz,1H),7.32(d,J＝2.4Hz,2H),7.04(dd,J＝8.8,2.5Hz,2H),6.94(d,J＝8.8Hz,2H),1.57(s,9H)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-73.12(s)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ167.7(C),163.8(C),152.2(C),151.5(C),150.5(C),139.3(C),131.9(CH),130.1(CH),128.8(C),125.8(CH),124.9(CH),118.9(C),118.8(q,1JCF＝320.9Hz,CF3),118.0(CH),111.0(CH),83.3(C),80.5(C),28.2(CH3)；HRMS(ESI)C27H19F6O11S2[M+H]+的计算值697.0267，实验值697.0255。
步骤3：使用实施例7中所述的方法由步骤2中合成的二(三氟甲磺酸酯)制备标题化合物4-(叔丁氧基羰基)-2-(3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐(86％，深紫色固体)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.19(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),8.02(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.73(dd,J＝1.3,0.7Hz,1H),6.55(d,J＝8.6Hz,2H),6.21(d,J＝2.3Hz,2H),6.09(dd,J＝8.6,2.3Hz,2H),3.92(t,J＝7.3Hz,8H),2.38(p,J＝7.2Hz,4H),1.54(s,9H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ169.1(C),164.5(C),153.8(C),153.0(C),152.6(C),137.9(C),131.1(C),130.6(CH),129.0(CH),125.4(CH),125.0(CH),107.9(CH),107.4(C),97.6(CH),82.4(C),52.2(CH2),28.2(CH3),16.8(CH2)；HRMS(ESI)C31H31N2O5[M+H]+的计算值511.2227，实验值511.2253。
实施例19
4-羧基-2-(3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000691
取4-(叔丁氧基羰基)-2-(3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐(实施例18；70mg，0.137mmol)溶于CH2Cl2(2.5mL)，并加入三氟乙酸(0.5mL)。在室温下搅拌反应6小时。加入甲苯(3mL)。将反应混合物浓缩至干，然后与MeOH共沸三次，得到标题化合物(77mg，99％，TFA盐)，其为深红色粉末。分析HPLC和NMR表明该物质纯度>95％，并且在酰胺偶联之前不需要进一步纯化。1H NMR(MeOD,400MHz)δ8.40(dd,J＝8.2,0.6Hz,1H),8.37(dd,J＝8.2,1.5Hz,1H),7.94(dd,J＝1.5,0.6Hz,1H),7.06(d,J＝9.2Hz,2H),6.61(dd,J＝9.2,2.2Hz,2H),6.55(d,J＝2.2Hz,2H),4.31(t,J＝7.6Hz,8H),2.56(p,J＝7.6Hz,4H)；19FNMR(MeOD,376MHz)δ-75.32(s)；13C NMR(MeOD,101MHz)δ167.7(C),167.5(C),160.1(C),158.7(C),158.0(C),136.2(C),135.9(C),135.4(C),132.8(CH),132.25(CH),132.24(CH),132.19(CH),114.8(C),113.6(CH),95.2(CH),52.9(CH2),16.8(CH2)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；550nm处检测)；HRMS(ESI)C27H23N2O5[M+H]+的计算值455.1601，实验值455.1610。
实施例20
2-(3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)-4-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000701
将4-羧基-2-(3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐(实施例19；20mg，35.2μ5.2)与DSC(19.8mg，77.4μmol，2.2当量)在DMF(1.5mL)中合并。加入Et3N(14.7μ4，1067Lg1，3当量)和DMAP(0.4mg，3.52μ.52，0.1当量)后，将反应在室温下搅拌2小时。通过反相HPLC纯化粗反应混合物(10-95％MeCN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂)得到18.3mg标题化合物(78％，TFA盐)，其为深紫色固体。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.47(dd,J＝8.2,1.8Hz,1H),8.42(d,J＝8.2Hz,1H),8.11(d,J＝1.6Hz,1H),7.06(d,J＝9.1Hz,2H),6.60(d,J＝9.1Hz,2H),6.58–6.53(m,2H),4.26(t,J＝7.4Hz,8H),2.91(s,4H),2.44(p,J＝7.7Hz,4H)；分析HPLC:97.4％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；550nm处UV检测)；MS(ESI)C31H26N3O7[M+H]+的计算值552.2，实验值552.0。
实施例21
4-((2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-2-(3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000711
将4-羧基-2-(3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐(实施例19；10mg，17.6μ7.6)与DSC(9.9mg，38.7μ8.7，2.2当量)在DMF(1mL)中合并。加入Et3N(14.7μ4，1067g]I，6当量)和DMAP(0.2mg，1.76μ.76，0.1当量)后，在室温下搅拌反应1小时，同时避光。然后加入2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙胺(“HaloTag(O2)胺”，9.8mg，44.0μ4.0，2.5当量)的DMF(100μ0)溶液。将反应在室温下再搅拌4小时。随后用饱和NaHCO3稀释，并用CH2Cl2(2×)萃取。将合并的有机萃取物干燥(MgSO4)，过滤，沉积在硅藻土上，并真空浓缩。通过硅胶色谱法(0-10％MeOH/CH2Cl2，线性梯度，恒定的1％v/v AcOH添加剂；采用硅藻土干法上样)以及随后的反相HPLC(10-95％MeCN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂)得到8.5mg的标题化合物(62％，TFA盐)，其为暗红色固体。1H NMR(MeOD,400MHz)δ8.79(t,J＝5.4Hz,1H),8.39(d,J＝8.2Hz,1H),8.20(dd,J＝8.2,1.8Hz,1H),7.80(d,J＝1.6Hz,1H),7.07(d,J＝9.2Hz,2H),6.61(dd,J＝9.2,2.2Hz,2H),6.56(d,J＝2.2Hz,2H),4.31(t,J＝7.6Hz,8H),3.68–3.55(m,8H),3.53(t,J＝6.6Hz,2H),3.43(t,J＝6.5Hz,2H),2.56(p,J＝7.6Hz,4H),1.77–1.66(m,2H),1.56–1.27(m,6H)；19F NMR(MeOD,376MHz)δ-75.33(s)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；550nm处检测)；HRMS(ESI)C37H43ClN3O6[M+H]+的计算值660.2835，实验值660.2844。
实施例22
4-((4-(((2-氨基-9H-嘌呤-6-基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-2-(3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000721
将4-羧基-2-(3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)苯甲酸盐(实施例19；10mg，17.6μ7.6)与DSC(9.9mg，38.7μ8.7，2.2当量)在DMF(1mL)中合并。加入Et3N(14.7μ4，1067g84，6当量)和DMAP(0.2mg，1.76μ.76，0.1当量)后，将反应在室温下搅拌1小时，同时避光。然后加入6-((4-(氨基甲基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(“BG-NH2”11.9mg，44.0μ4.0，2.5当量)。将反应在室温下再搅拌2小时。通过反相HPLC(10-95％MeCN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂)纯化粗反应混合物得到11.5mg(80％，TFA盐)标题化合物，其为深红色固体。1H NMR(MeOD,400MHz)δ9.28(t,J＝5.8Hz,1H),8.39(d,J＝8.3Hz,1H),8.20(dd,J＝8.2,1.8Hz,1H),8.17(s,1H),7.81(d,J＝1.7Hz,1H),7.50(d,J＝8.1Hz,2H),7.40(d,J＝8.2Hz,2H),7.04(d,J＝9.2Hz,2H),6.58(dd,J＝9.1,2.2Hz,2H),6.54(d,J＝2.1Hz,2H),5.60(s,2H),4.63–4.55(m,2H),4.30(t,J＝7.6Hz,8H),2.56(p,J＝7.7Hz,4H)；19F NMR(MeOD,376MHz)δ-75.44(s)；分析HPLC:98.3％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；550nm处UV检测)；HRMS(ESI)C40H35N8O5[M+H]+的计算值707.2725，实验值707.2723。
实施例23
2-(3,6-二(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)-4-(叔丁氧基羰基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000731
使用实施例7中所述的方法由3-氧代-3',6'-二(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-6-羧酸叔丁酯(实施例18，步骤2)和3,3-二氟氮杂环丁烷盐酸盐制备标题化合物(84％，粉红色固体)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.21(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.04(dd,J＝8.0,0.8Hz,1H),7.73(dd,J＝1.2,0.8Hz,1H),6.61(d,J＝8.6Hz,2H),6.30(d,J＝2.4Hz,2H),6.17(dd,J＝8.6,2.4Hz,2H),4.25(t,3JHF＝11.7Hz,8H),1.55(s,9H)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-100.06(p,3JFH＝11.7Hz)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ168.8(C),164.3(C),153.3(C),152.6(C),151.4(t,4JCF＝2.9Hz,C),138.4(C),130.9(CH),130.2(C),129.3(CH),125.1(CH),125.0(CH),115.7(t,1JCF＝274.5Hz,CF2),109.1(C),108.9(CH),99.4(CH),84.3(C),82.7(C),63.4(t,2JCF＝26.3Hz,CH2),28.2(CH3)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；30–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；550nm处检测)；MS(ESI)C31H27F4N2O5[M+H]+的计算值583.2，实验值583.1。
实施例24
2-(3,6-二(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)-4-羧基苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000732
使用实施例19中所述的方法由实施例23制备标题化合物(93％，深粉色固体，TFA盐)。1H NMR(MeOD,400MHz)δ8.44(d,J＝8.3Hz,1H),8.40(dd,J＝8.2,1.6Hz,1H),7.99–7.96(m,1H),7.23(d,J＝9.1Hz,2H),6.83(d,J＝2.2Hz,2H),6.79(dd,J＝9.1,2.3Hz,2H),4.70(t,3JHF＝11.6Hz,8H)；19F NMR(MeOD,376MHz)δ-75.59(s,3F),-100.90(p,3JFH＝11.6Hz,4F)；13C NMR(MeOD,101MHz)δ167.6(C),167.3(C),159.1(C),157.7(t,4JCF＝3.9Hz,C),136.1(C),135.8(C),135.4(C),132.9(CH),132.7(CH),132.6(CH),132.1(CH),119.2(C),116.5(t,1JCF＝271.9Hz,CF2),116.1(C),115.2(CH),97.4(CH),64.2(t,2JCF＝29.1Hz,CH2)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；550nm处检测)；MS(ESI)C27H19F4N2O5[M+H]+的计算值527.1，实验值527.0。
实施例25
2-(3,6-二(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)-4-((2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000741
使用实施例21中所述的方法由实施例24制备标题化合物(62％，粉色固体)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.05(dd,J＝8.0,0.8Hz,1H),7.98(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.55(dd,J＝1.5,0.8Hz,1H),6.72(s,1H),6.62(d,J＝8.6Hz,2H),6.31(d,J＝2.4Hz,2H),6.17(dd,J＝8.6,2.4Hz,2H),4.26(t,3JHF＝11.7Hz,8H),3.69–3.57(m,6H),3.56–3.48(m,4H),3.40(t,J＝6.6Hz,2H),1.79–1.70(m,2H),1.54–1.48(m,2H),1.46–1.38(m,2H),1.37–1.29(m,2H)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-100.04(p,3JFH＝11.8Hz,4F)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；550nm处检测)；MS(ESI)C37H39ClF4N3O6[M+H]+的计算值732.2，实验值732.1。
实施例26
2-(3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)-4-(甲氧基羰基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000751
步骤1：将3',6'-二溴-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-6-羧酸(1.50g，2.99mmol；Woodroofe,C.C.；Lim,M.H.；Bu,W.；Lippard,S.J.Tetrahedron 2005,61,3097)悬浮于MeOH(50mL)中，加入H2SO4(293mg，2.99mmol，1当量)。将反应在回流下搅拌72小时。随后真空浓缩，所得残余物用饱和NaHCO3稀释，并用15％i-PrOH/CHCl3(2×)萃取。将合并的有机萃取物干燥(MgSO4)，过滤并蒸发。通过硅胶色谱(0-10％EtOAc/己烷，线性梯度，恒定的40％v/v CH2Cl2)得到1.49g(97％)3',6'-二溴-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-6-羧酸甲酯，其为白色固体。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.31(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.10(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.76(dd,J＝1.2,0.8Hz,1H),7.52(d,J＝1.9Hz,2H),7.20(dd,J＝8.5,1.9Hz,2H),6.68(d,J＝8.5Hz,2H),3.89(s,3H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ168.1(C),165.3(C),153.1(C),151.2(C),137.0(C),131.6(CH),129.24(C),129.21(CH),127.8(CH),125.7(CH),125.1(CH),124.6(C),120.7(CH),117.4(C),81.5(C),53.0(CH3)；MS(ESI)C22H13Br2O5[M+H]+的计算值514.9，实验值515.1。
步骤2：使用实施例7中描述的方法由步骤1中合成的溴化物制备标题化合物2-(3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)-4-(甲氧羰基)苯甲酸盐。1H NMR(MeOD,400MHz)δ8.24(dd,J＝8.1,1.7Hz,1H),8.12(dd,J＝8.1,0.4Hz,1H),7.83–7.80(m,1H),7.16(d,J＝9.2Hz,2H),6.56(dd,J＝9.2,2.2Hz,2H),6.48(d,J＝2.2Hz,2H),4.32–4.22(m,8H),3.90(s,3H),2.54(p,J＝7.6Hz,4H)；MS(ESI)C28H25N2O5[M+H]+的计算值469.2，实验值469.2。
实施例27
3',6'-二(氮杂环丁烷-1-基)-2-重氮基-3-氧代-2,3-二氢螺[茚-1,9'-呫吨]-6-羧酸甲酯
Figure GDA0002543877310000761
向2-(3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)呫吨鎓-9-基)-4-(甲氧基羰基)苯甲酸盐(实施例26；135mg，0.288mmol)的CH2Cl2(9mL)溶液中加入草酰氯(98μ8，1.15mmol，4当量)。室温下搅拌反应2小时后，将反应物浓缩至干。将残余物再溶于CH2Cl2(9mL)中，然后依次加入Et3N(50μ0，0.360mmol，1.25当量)和(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷(2.0M，溶于Et2O，252μ5，0.504mmol，1.75当量)。将反应在室温下搅拌90分钟，真空浓缩，并通过硅胶快速色谱(0-50％EtOAc/己烷，线性梯度；然后，0-25％EtOAc/甲苯，线性梯度)纯化两次得到40mg(28％)标题化合物，其为黄色固体。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.07(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.87(dd,J＝8.0,0.6Hz,1H),7.68(dd,J＝1.4,0.6Hz,1H),6.66(d,J＝8.5Hz,2H),6.18(d,J＝2.3Hz,2H),6.07(dd,J＝8.5,2.4Hz,2H),3.96–3.84(m,8H),3.82(s,3H),2.37(p,J＝7.2Hz,4H)；MS(ESI)C29H25N4O4[M+H]+的计算值493.2，实验值493.3。
实施例28
3',6'-二(氮杂环丁烷-1-基)-2-重氮基-3-氧代-2,3-二氢螺[茚-1,9'-呫吨]-6-羧酸2,5-二氧吡咯烷-1-基酯
Figure GDA0002543877310000762
步骤1：向3',6'-二(氮杂环丁烷-1-基)-2-重氮基-3-氧代-2,3-二氢螺[茚-1,9'-呫吨]-6-羧酸甲酯(实施例27；40mg，81.2μmol)在2:1MeOH/THF(6mL)中的溶液中氮气保护下加入1M NaOH(203μL，0.203mmol，2.5当量)。在室温下搅拌溶液2小时后，加入另外的1MNaOH(203μL，0.203mmol，2.5当量)。将反应在室温下搅拌24小时。随后用1M HCl(420μL)酸化，用水稀释，并用CH2Cl2(2×)萃取。将有机萃取物干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，得到3',6'-二(氮杂环丁烷-1-基)-2-重氮基-3-氧代-2,3-二氢螺[茚-1,9'-呫吨]-6-羧酸(37mg，95％)，其为黄色固体。MS(ESI)C28H23N4O4[M]+的计算值479.2，实验值479.3。
步骤2：将步骤1所得的酸(37mg，77.3μ7.3)与TSTU(35mg，0.116mmol，1.5当量)在DMF(2mL)中合并，并加入DIEA(40μ0，0.232mmol，3当量)。将反应在室温下搅拌1小时后，浓缩至干并沉积在硅藻土上。进行硅胶快速色谱法(10-100％EtOAc/己烷，线性梯度；采用硅藻土干法上样)，得到标题化合物3',6'-二(氮杂环丁烷-1-基)-2-重氮基-3-氧代-2,3-二氢螺[茚-1,9'-呫吨]-6-羧酸2,5-二氧吡咯烷-1-基酯，其为黄橙色固体(30mg，68％)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.16(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),7.93(dd,J＝8.0,0.6Hz,1H),7.75(dd,J＝1.4,0.6Hz,1H),6.66(d,J＝8.5Hz,2H),6.16(d,J＝2.3Hz,2H),6.09(dd,J＝8.5,2.4Hz,2H),3.90(t,J＝7.3Hz,8H),2.86(s,4H),2.37(p,J＝7.2Hz,4H)；MS(ESI)C32H26N5O6[M+H]+的计算值576.2，实验值576.3。
实施例29
3',6'-二(氮杂环丁烷-1-基)-N-(2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙基)-2-重氮基-3-氧代-2,3-二氢螺[茚-1,9'-呫吨]-6-甲酰胺
Figure GDA0002543877310000771
将3',6'-二(氮杂环丁烷-1-基)-2-重氮基-3-氧代-2,3-二氢螺[茚-1,9'-呫吨]-6-羧酸2,5-二氧吡咯烷-1-基酯(实施例28；15mg，26.1μ6.1)溶于DMF(1mL)中。加入2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙胺(“HaloTag(O2)胺”，11.7mg，52.2μ2.2，2当量)的DMF(250μ5)溶液，然后加入DIEA(22.7μ2，0.131mmol，5当量)。在室温下搅拌反应2小时后，将其浓缩至干，并通过硅胶色谱法(0-100％EtOAc/甲苯，线性梯度)纯化，得到标题化合物(15.9mg，89％)，其为黄色泡沫状物。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.86(dd,J＝7.9,0.6Hz,1H),7.79(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),7.43(dd,J＝1.4,0.6Hz,1H),6.66(d,J＝8.5Hz,2H),6.59(t,J＝5.1Hz,1H),6.16(d,J＝2.3Hz,2H),6.07(dd,J＝8.5,2.4Hz,2H),3.95–3.83(m,8H),3.64–3.48(m,10H),3.39(t,J＝6.6Hz,2H),2.37(p,J＝7.2Hz,4H),1.78–1.69(m,2H),1.55–1.48(m,2H),1.46–1.36(m,2H),1.36–1.27(m,2H)；MS(ESI)C38H43ClN5O5[M+H]+的计算值684.3，实验值684.4。
实施例30
2-(3,7-二(氮杂环丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅杂苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000781
步骤1：向小瓶中加入2-溴苯甲酸叔丁酯(309mg，1.20mmol，1.5当量)，密封并用氮气冲洗。将溴化物溶解在THF(2mL)中并将反应冷却至-15℃后，加入iPrMgCl·LiCl(1.3M的THF溶液，924μ2，1.20mmol，1.5当量)。将反应升温至-5℃并搅拌5小时。滴加3,7-二((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅杂苯-10(5H)-酮(400mg，0.802mmol；来自Egawa,T.；Koide,Y.；Hanaoka,K.；Komatsu,T.；Terai,T.；Nagano,T.Chem.Commun.,2011,47,4162)的THF(2mL)溶液。在-5℃下搅拌10分钟后，将反应混合物温热至室温并搅拌30分钟。随后用饱和NH4Cl淬灭，用水稀释，并用EtOAc(2×)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发。通过硅胶色谱法(0-20％Et2O/己烷，线性梯度)得到271mg(56％)3,7-二((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5,5-二甲基-3’H，5H-螺[二苯并[b，e]硅杂苯-10,1'-异苯并呋喃]-3'-酮，其为无色胶状物。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.97(dt,J＝7.5,0.9Hz,1H),7.66(td,J＝7.5,1.2Hz,1H),7.56(td,J＝7.5,0.9Hz,1H),7.35–7.29(m,1H),7.12(d,J＝2.7Hz,2H),6.85(d,J＝8.7Hz,2H),6.67(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),0.97(s,18H),0.62(s,3H),0.60(s,3H),0.19(s,12H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ170.5(C),155.3(C),154.0(C),137.8(C),137.2(C),134.0(CH),129.1(CH),128.6(CH),126.6(C),126.1(CH),125.1(CH),124.7(CH),121.2(CH),90.8(C),25.8(CH3),18.4(C),0.2(CH3),-1.5(CH3),-4.21(CH3),-4.23(CH3)；HRMS(ESI)C34H47O4Si3[M+H]+的计算值603.2777，实验值603.2771。
步骤2：在0℃下，向步骤1产物(194mg，0.322mmol)的THF(5mL)溶液中加入TBAF(1.0M的THF溶液，965μL，0.965mmol，3当量)。将反应在0℃下搅拌10分钟。随后在0℃下用饱和NH4Cl稀释，并用EtOAc(2×)萃取。将有机萃取物干燥(MgSO4)，过滤，蒸发，并沉积到硅胶上。通过快速色谱法(20-100％EtOAc/己烷，线性梯度，恒定的1％v/v AcOH添加剂；采用硅胶干法上样)得到3,7-二羟基-5,5-二甲基-3'H,5H-螺[二苯并[b,e]硅杂苯-10,1'-异苯并呋喃]-3'-酮(120mg，99％)，其为灰白色固体。1H NMR(MeOD,400MHz)δ7.95(d,J＝7.7Hz,1H),7.77(td,J＝7.6,1.1Hz,1H),7.65(td,J＝7.6,0.7Hz,1H),7.32(d,J＝7.7Hz,1H),7.13(d,J＝2.7Hz,2H),6.74(d,J＝8.7Hz,2H),6.65(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),0.61(s,3H),0.55(s,3H)；13C NMR(MeOD,101MHz)δ172.6(C),158.3(C),155.8(C),138.8(C),136.3(C),135.6(CH),130.4(CH),129.6(CH),127.4(C),126.6(CH),125.8(CH),121.1(CH),117.7(CH),92.9(C),0.2(CH3),-1.6(CH3)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；550nm处UV检测)；HRMS(ESI)C22H19O4Si[M+H]+的计算值375.1047，实验值375.1047。
步骤3：取步骤2所得的中间体(120mg，0.320mmol)溶于CH2Cl2(5mL)中并冷却至0℃。加入吡啶(207μL，2.56mmol，8.0当量)和三氟甲磺酸酐(216μL，1.28mmol，4.0当量)，并移除冰浴。将反应在室温下搅拌2小时。随后用水稀释并用CH2Cl2(2×)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。通过硅胶快速色谱法(0-30％EtOAc/己烷，线性梯度)得到172mg(84％)5,5-二甲基-3'-氧代-3'H,5H-螺[二苯并[b,e]硅杂苯-10,1'-异苯并呋喃]-3,7-二基二(三氟甲磺酸酯)，其为无色泡沫状物。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.04(dt,J＝7.7,0.9Hz,1H),7.77(td,J＝7.5,1.2Hz,1H),7.66(td,J＝7.5,0.8Hz,1H),7.57(dd,J＝2.4,0.5Hz,2H),7.38(dt,J＝7.6,0.7Hz,1H),7.185(AB of ABX,A＝2878.9,JAX＝0.3,B＝2871.0,JBX＝2.8,JAB＝8.9Hz,4H),0.75(s,3H),0.72(s,3H)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-73.30；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ169.2(C),151.8(C),149.5(C),144.3(C),139.3(C),134.8(CH),130.3(CH),129.2(CH),127.0(CH),126.5(CH),126.0(C),124.6(CH),122.8(CH),118.9(CF3,1JCF＝320.8Hz),88.7(C),0.1(CH3),-1.7(CH3)；HRMS(ESI)C24H17F6O8S2Si[M+H]+的计算值639.0033，实验值639.0030。
步骤4：使用实施例7中描述的方法由步骤3中合成的二(三氟甲磺酸酯)制备标题化合物2-(3,7-二(氮杂环丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅杂苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸盐(92％，灰白色固体)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.98–7.93(m,1H),7.63(td,J＝7.5,1.2Hz,1H),7.53(td,J＝7.5,0.9Hz,1H),7.32–7.28(m,1H),6.75(d,J＝8.7Hz,2H),6.66(d,J＝2.6Hz,2H),6.25(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),3.89(t,J＝7.2Hz,8H),2.36(p,J＝7.2Hz,4H),0.60(s,3H),0.58(s,3H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ170.7(C),154.3(C),151.0(C),137.1(C),133.7(CH),132.9(C),128.8(CH),128.0(CH),127.2(C),125.8(CH),124.8(CH),115.7(CH),112.3(CH),92.1(C),52.4(CH2),17.1(CH2),0.5(CH3),-1.5(CH3)；分析HPLC:98.7％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；650nm处检测)；HRMS(ESI)C28H29N2O2Si[M+H]+的计算值453.1993，实验值453.1998。
实施例31
2-(3,7-二(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅杂苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000811
使用实施例7种所述的方法，从5,5-二甲基-3'-氧代-3'H,5H-螺[二苯并[b,e]硅杂苯-10,1'-异苯并呋喃]-3,7-二基二(三氟甲磺酸酯)(实施例30，步骤3)和3-氟氮杂环丁烷盐酸盐(78％，灰白色固体)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.97(dt,J＝7.6,0.9Hz,1H),7.65(td,J＝7.5,1.2Hz,1H),7.55(td,J＝7.5,0.9Hz,1H),7.29(dt,J＝7.7,0.8Hz,1H),6.80(d,J＝8.7Hz,2H),6.70(d,J＝2.6Hz,2H),6.30(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),5.41(dtt,2JHF＝57.0Hz,J＝5.9,3.7Hz,2H),4.25–4.14(m,4H),4.04–3.91(m,4H),0.62(s,3H),0.60(s,3H)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-180.48(dtt,JFH＝57.0,23.9,18.2Hz)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ170.6(C),154.1(C),150.0(d,4JCF＝1.0Hz,C),137.2(C),133.93(C),133.86(CH),129.0(CH),128.1(CH),127.0(C),126.0(CH),124.7(CH),116.3(CH),112.9(CH),91.6(C),82.8(d,1JCF＝204.8Hz,CFH),59.6(d,2JCF＝23.8Hz,CH2),0.5(CH3),-1.4(CH3)；
分析HPLC:98.7％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；30–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；650nm处检测)；MS(ESI)C28H27F2N2O2Si[M+H]+的计算值489.2，实验值489.1。
实施例32
4-(叔丁氧基羰基)-2-(3,7-二(氮杂环丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅杂苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000821
步骤1：将2-溴对苯二甲酸(2.50g，10.2mmol)的甲苯(25mL)悬浮液加热至80℃，在15分钟内滴加N,N-二甲基甲酰胺二叔丁基缩醛(24.5mL，102mmol，10当量)。将反应在80℃下搅拌30分钟。冷却混合物至室温后，用饱和NaHCO3稀释，并用EtOAc(2×)萃取。将合并的有机萃取物用水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发。通过快速色谱(0-10％Et2O/己烷，线性梯度)得到2-溴对苯二甲酸二叔丁酯，其为无色胶状物(3.29g，90％)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.19(d,J＝1.4Hz,1H),7.92(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.67(d,J＝8.0Hz,1H),1.62(s,9H),1.60(s,9H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ165.4(C),163.8(C),138.0(C),135.1(C),134.9(CH),130.4(CH),128.1(CH),120.7(C),83.3(C),82.3(C),28.26(CH3),28.25(CH3)；HRMS(ESI)C16H21BrO4Na[M+Na]+的计算值379.0515，实验值379.0531。
步骤2：向小瓶中加入步骤1的产物(537mg，1.50mmol，1.5当量)，密封并用氮气冲洗。将溴化物溶解在THF(2.5mL)中并将反应冷却至-50℃后，加入iPrMgCl·LiCl(1.3M的THF溶液，1.16mL，1.50mmol，1.5当量)。将反应升温至-40℃并搅拌2小时。然后滴加3,7-二((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅杂苯-10(5H)-酮(500mg，1.00mmol；来自Egawa,T.；Koide,Y.；Hanaoka,K.；Komatsu,T.；Terai,T.；Nagano,T.Chem.Commun.,2011,47,4162)的THF(2.5mL)溶液。将反应混合物升温至室温并搅拌2小时。随后用饱和NH4Cl淬灭，用水稀释，并用EtOAc(2×)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发。通过硅胶色谱法(0-10％Et2O/己烷，线性梯度)得到213mg(30％)的3,7-二((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5,5-二甲基-3'-氧代-3'H,5H-螺[二苯并[b,e]硅杂苯-10,1'-异苯并呋喃]-6'-羧酸叔丁酯，其为无色固体。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.13(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),7.98(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.84(dd,J＝1.2,0.8Hz,1H),7.13(d,J＝2.7Hz,2H),6.93(d,J＝8.7Hz,2H),6.72(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),1.56(s,9H),0.98(s,18H),0.67(s,3H),0.59(s,3H),0.196(s,6H),0.194(s,6H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ170.1(C),164.3(C),155.4(C),155.0(C),137.5(C),136.9(C),136.8(C),130.2(CH),128.7(C),128.3(CH),125.9(CH),125.2(CH),125.1(CH),121.6(CH),90.6(C),82.5(C),28.2(CH3),25.8(CH3),18.4(C),-0.1(CH3),-0.7(CH3),-4.21(CH3),-4.23(CH3)；HRMS(ESI)C39H55O6Si3[M+H]+的计算值703.3301，实验值703.3311。
步骤3：在0℃下，向得自步骤2的产物(205mg，0.292mmol)的THF(5mL)溶液中加入TBAF(1.0M的THF溶液，1.17mL，1.17mmol，4当量)。在0℃下搅拌反应10分钟。随后用饱和NH4Cl稀释并用EtOAc(2×)萃取。有机萃取液用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，蒸发，得到橙色残余物。将粗中间体溶于CH2Cl2(5mL)中并冷却至0℃。加入吡啶(189μL，2.33mmol，8当量)和三氟甲磺酸酐(196μL，1.17mmol，4当量)，并移除冰浴。在室温下搅拌反应2小时。然后用水稀释并用CH2Cl2(2×)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。通过硅胶快速色谱法(0-20％EtOAc/己烷，线性梯度)得到209mg(97％)5,5-二甲基-3'-氧代-3,7-二(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-3'H,5H-螺[二苯并[b,e]硅杂苯-10,1'-异苯并呋喃]-6'-羧酸叔丁酯，其为无色固体。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.21(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.05(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.93–7.90(m,1H),7.58(d,J＝2.6Hz,2H),7.28(d,J＝8.9Hz,2H),7.22(dd,J＝8.9,2.7Hz,2H),1.58(s,9H),0.81(s,3H),0.71(s,3H)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-73.28(s)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ168.9(C),163.8(C),152.8(C),149.5(C),144.1(C),138.3(C),138.2(C),131.2(CH),128.8(CH),128.0(C),126.8(CH),126.6(CH),124.8(CH),123.2(CH),118.9(q,1JCF＝320.8Hz,CF3),88.6(C),83.1(C),28.2(CH3),-0.1(CH3),-0.9(CH3)；HRMS(ESI)C29H25F6O10S2Si[M+H]+的计算值739.0557，实验值739.0555。
步骤4：使用实施例7中所述的方法制备标题化合物4-(叔丁氧基羰基)-2-(3,7-二(氮杂环丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅杂苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸盐(91％，灰白色泡沫状物)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.11(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),7.95(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.82(dd,J＝1.2,0.8Hz,1H),6.82(d,J＝8.7Hz,2H),6.66(d,J＝2.6Hz,2H),6.29(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),3.90(t,J＝7.3Hz,8H),2.36(p,J＝7.2Hz,4H),1.54(s,9H),0.64(s,3H),0.58(s,3H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ170.3(C),164.5(C),155.4(C),151.0(C),137.2(C),136.2(C),132.4(C),129.9(CH),129.2(C),127.7(CH),125.6(CH),125.2(CH),115.6(CH),112.6(CH),91.9(C),82.3(C),52.3(CH2),28.2(CH3),17.0(CH2),0.2(CH3),-0.7(CH3)；HRMS(ESI)C33H37N2O4Si[M+H]+的计算值553.2517，实验值553.2529。
实施例33
4-羧基-2-(3,7-二(氮杂环丁-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅杂苯鎓-10-基)-10(5H)-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000841
使用实施例19中所述的方法，由实施例32制备标题化合物(99％，深蓝绿色固体，TFA盐)。1H NMR(MeOD,400MHz)δ8.30–8.23(m,2H),7.82–7.78(m,1H),6.90(d,J＝2.5Hz,2H),6.86(d,J＝9.2Hz,2H),6.33(dd,J＝9.2,2.5Hz,2H),4.27(t,J＝7.4Hz,8H),2.51(p,J＝7.6Hz,4H),0.60(s,3H),0.53(s,3H)；19F NMR(MeOD,376MHz)δ-75.45(s)；HPLC:>98.7％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；650nm处检测)；HRMS(ESI)C29H29N2O4Si[M+H]+的计算值497.1891，实验值497.1890。
实施例34
2(3,7-二(氮杂环丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅杂苯鎓-10-基)-10(5H)-基)-4(((2,5-二氧吡咯烷-1-基)氧基)羰基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000851
4-羧基-2-(3,7-二(氮杂环丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅杂苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸盐(实施例33；40mg，65.5μmol)与DSC(37mg，144μmol，2.2当量)在DMF(2.5mL)中合并。加入Et3N(55μL，393μmol，6当量)和DMAP(0.8mg，6.55μmol，0.1当量)后，将反应在室温下搅拌3小时。随后用10％w/v柠檬酸稀释并用EtOAc(2×)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。通过快速色谱法(0-50％EtOAc/甲苯，线性梯度)得到31mg(80％)标题化合物，其为黄绿色固体。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.27(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),8.07(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),8.00(dd,J＝1.3,0.7Hz,1H),6.74(d,J＝8.7Hz,2H),6.66(d,J＝2.6Hz,2H),6.30(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),3.91(t,J＝7.3Hz,8H),2.89(s,4H),2.37(p,J＝7.2Hz,4H),0.62(s,3H),0.56(s,3H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ169.4(C),169.0(C),161.1(C),155.5(C),151.2(C),136.5(C),131.7(C),131.6(C),130.7(CH),130.1(C),127.8(CH),126.8(CH),126.3(CH),115.8(CH),112.7(CH),92.4(C),52.3(CH2),25.8(CH2),17.0(CH2),0.3(CH3),-1.1(CH3)；HRMS(ESI)C33H32N3O6Si[M+H]+的计算值594.2055，实验值594.2069。
实施例35
4-((2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-2-(3,7-二(氮杂环丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅杂苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000861
4-羧基-2-(3,7-二(氮杂环丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅杂苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸盐(实施例33；30mg，49.1μmol)与DSC(28mg，108μ08g，2.2当量)在DMF(2mL)中合并。加入Et3N(41μ1，295。加入6，6当量)和DMAP(0.6mg，4.91μ.91，0.1当量)后，将反应在室温下搅拌1小时，同时避光。然后加入2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙胺(“HaloTag(O2)胺”，27mg，123μ23g，2.5当量)的DMF(250μL)溶液。将反应在室温下再搅拌2小时。随后用饱和NaHCO3稀释并用EtOAc(2×)萃取。将合并的有机萃取物用水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱法(10-100％EtOAc/甲苯，线性梯度)得到25mg(73％)标题化合物，其为蓝色泡沫状物。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.98(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.90(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.68(dd,J＝1.2,0.7Hz,1H),6.75(d,J＝8.7Hz,2H),6.74–6.68(m,1H),6.66(d,J＝2.6Hz,2H),6.26(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),3.89(t,J＝7.3Hz,8H),3.67–3.60(m,6H),3.56–3.53(m,2H),3.50(t,J＝6.7Hz,2H),3.39(t,J＝6.7Hz,2H),2.36(p,J＝7.2Hz,4H),1.78–1.68(m,2H),1.56–1.47(m,2H),1.44–1.35(m,2H),1.35–1.25(m,2H),0.63(s,3H),0.57(s,3H)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O,线性梯度,恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；650nm处UV检测)；HRMS(ESI)C39H49ClN3O5Si[M+H]+的计算值702.3125，实验值702.3137。
实施例36
4-((4-((2-氨基-9H-嘌呤-6-基)氧基)甲基)苄基)氨基甲酰基)-2-(3,7-二(氮杂环丁烷-1-基)二甲基二苯并[b,e]硅杂苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000871
4-羧基-2-(3,7-二(氮杂环丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅杂苯鎓-10-基-10(5H)-基)苯甲酸盐(实施例33；25mg，40.9μ0.9)与DSC(23.1mg，90.1μ0.1，2.2当量)在DMF(2mL)中合并。加入Et3N(34μ4，246。加入3，6当量)和DMAP(0.5mg，4.09μ.09，0.1当量)后，将反应在室温下搅拌1小时，同时避光。然后加入6-((4-(氨基甲基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(“BG-NH2”28mg，102μmol，2.5当量)。将反应在室温下再搅拌2小时。随后用饱和NaHCO3稀释，并用CH2Cl2(2×)萃取。将合并的有机萃取物干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱法(0-10％MeOH/EtOAc，线性梯度)得到24.7mg(80％)标题化合物，其为蓝色固体。1H NMR(MeOD,400MHz)δ8.02(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),7.99(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.82(s,1H),7.67–7.64(m,1H),7.46(d,J＝8.1Hz,2H),7.32(d,J＝8.2Hz,2H),6.73(d,J＝2.6Hz,2H),6.70(d,J＝8.7Hz,2H),6.32(dd,J＝8.7,2.6Hz,2H),5.51(s,2H),4.52(s,2H),3.87(t,J＝7.3Hz,8H),2.35(p,J＝7.1Hz,4H),0.58(s,3H),0.51(s,3H)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O,线性梯度,恒定的0.1％v/vTFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；650nm处UV检测)；HRMS(ESI)C42H41N8O4Si[M+H]+的计算值749.3015，实验值749.2971。
实施例37
2-(3,7-二(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅杂苯鎓-10-基-10(5H)-基)-4-(叔丁氧羰基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000881
使用实施例7中所述的方法，由5,5-二甲基-3'-氧代-3,7-二(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-3'H,5H-螺[二苯并[b,e]硅杂苯-10,1'-异苯并呋喃]-6'-羧酸叔丁酯(实施例32，步骤3)和3-氟氮杂环丁烷盐酸盐制备标题化合物(85％，灰白色固体)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.12(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),7.97(dd,J＝7.9,0.8Hz,1H),7.82(dd,J＝1.3,0.8Hz,1H),6.88(d,J＝8.7Hz,2H),6.70(d,J＝2.6Hz,2H),6.35(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),5.41(dtt,2JHF＝57.0,5.9,3.7Hz,2H),4.26–4.15(m,4H),4.05–3.93(m,4H),1.55(s,9H),0.67(s,3H),0.60(s,3H)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-180.48(dtt,JFH＝57.0,23.9,18.2Hz)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ170.2(C),164.4(C),155.1(C),150.0(d,4JCF＝1.2Hz,C),137.4(C),136.3(C),133.5(C),130.1(CH),129.0(C),127.8(CH),125.8(CH),125.1(CH),116.3(CH),113.3(CH),91.4(C),82.8(d,1JCF＝204.8,CFH),82.5(C),59.6(d,2JCF＝23.8Hz,CH2),28.2(CH3),0.17(CH3),-0.68(CH3)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；50–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；633nm处检测)；MS(ESI)C33H35F2N2O4Si[M+H]+的计算值589.2，实验值589.2。
实施例38
2-(3,7-二(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅杂苯鎓-10-基-10(5H)-基)-4-羧基苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000882
使用实施例19中所述的方法由实施例37制备标题化合物(80％，深蓝色固体，TFA盐)。1H NMR(MeOD,400MHz)δ8.25(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),8.11(d,J＝8.1Hz,1H),7.84(dd,J＝1.4,0.7Hz,1H),6.87(d,J＝2.6Hz,2H),6.83(d,J＝8.8Hz,2H),6.39(dd,J＝8.9,2.6Hz,2H),5.43(dtt,2JHF＝57.3,6.1,3.3Hz,2H),4.41–4.20(m,4H),4.16–4.01(m,4H),0.65(s,3H),0.56(s,3H)；分析HPLC:88.1％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；633nm处检测)；MS(ESI)C29H27F2N2O4Si[M+H]+的计算值533.2，实验值533.0。
实施例39
2-(3,7-二(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅杂苯鎓-10-基-10(5H)-基)-4-((2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000891
使用实施例35中所述的方法，由实施例38制备标题化合物(61％，蓝绿色固体)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.99(dd,J＝7.9,0.7Hz,1H),7.89(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.69(dd,J＝1.4,0.8Hz,1H),6.81(d,J＝8.7Hz,2H),6.78(s,1H),6.69(d,J＝2.6Hz,2H),6.36–6.26(m,2H),5.41(dtt,2JHF＝56.9,5.9,3.7Hz,2H),4.29–4.13(m,4H),4.06–3.91(m,4H),3.67–3.60(m,6H),3.58–3.53(m,2H),3.50(t,J＝6.6Hz,2H),3.40(t,J＝6.7Hz,2H),1.79–1.67(m,2H),1.54–1.47(m,2H),1.45–1.35(m,2H),1.35–1.24(m,2H),0.66(s,3H),0.59(s,3H)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-180.49(dtt,JFH＝56.9,23.9,18.2Hz)；分析HPLC:98.7％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；633nm处检测)；MS(ESI)C39H47ClF2N3O5Si[M+H]+的计算值738.3，实验值738.2。
实施例40
2-(3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000901
使用实施例7中所述的方法由碳荧光素二(三氟甲磺酸酯)(Grimm,J.B.；Sung,A.J.；Legant,W.R.；Hulamm,P.；Matlosz,S.M.；Betzig,E.；Lavis,L.D.ACSChem.Biol.2013,8,1303)制备标题化合物(88％，淡蓝色固体)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.00–7.95(m,1H),7.58(td,J＝7.4,1.4Hz,1H),7.53(td,J＝7.4,1.2Hz,1H),7.08–7.03(m,1H),6.58(d,J＝2.4Hz,2H),6.55(d,J＝8.5Hz,2H),6.20(dd,J＝8.6,2.4Hz,2H),3.90(t,J＝7.2Hz,8H),2.37(p,J＝7.2Hz,4H),1.82(s,3H),1.72(s,3H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ170.9(C),155.6(C),152.4(C),146.9(C),134.5(CH),128.94(CH),128.89(CH),127.4(C),125.0(CH),124.1(CH),120.6(C),110.4(CH),107.9(CH),88.4(C),52.4(CH2),38.6(C),35.7(CH3),32.3(CH3),17.0(CH2)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；600nm处检测)；HRMS(ESI)C29H29N2O2[M+H]+的计算值437.2224，实验值437.2236。
实施例41
2-(3,6-二(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000911
使用实施例7中所述的方法由碳荧光素二(三氟甲磺酸酯)(Grimm,J.B.；Sung,A.J.；Legant,W.R.；Hulamm,P.；Matlosz,S.M.；Betzig,E.；Lavis,L.D.ACSChem.Biol.2013,8,1303)和3,3-二氟氮杂环丁烷盐酸盐制备标题化合物(95％，灰白色固体)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.04–7.98(m,1H),7.60(td,J＝7.3,1.5Hz,1H),7.56(td,J＝7.3,1.3Hz,1H),7.04(s,1H),6.64(d,J＝2.8Hz,2H),6.63(d,J＝8.7Hz,2H),6.28(dd,J＝8.6,2.5Hz,2H),4.25(t,3JHF＝11.8Hz,8H),1.84(s,3H),1.74(s,3H)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-99.95(p,3JFH＝11.8Hz)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ170.6(C),155.2(C),150.1(t,4JCF＝2.7Hz,C),146.9(C),134.8(CH),129.3(CH),129.2(CH),127.0(C),125.2(CH),123.9(CH),122.4(C),115.9(t,1JCF＝274.6Hz,CF2),111.6(CH),109.2(CH),87.2(C),63.4(t,2JCF＝25.9Hz,CH2),38.6(C),35.6(CH3),32.5(CH3)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；30–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；600nm处检测)；MS(ESI)C29H25F4N2O2[M+H]+的计算值509.2，实验值509.1。
实施例42
4-(叔丁氧基羰基)-2-(3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000912
步骤1：向小瓶中装入2-溴对苯二甲酸二叔丁酯(实施例32，步骤1；1.48g，4.14mmol，2当量)，密封并用氮气冲洗。将溴化物溶解在THF(7mL)中并将反应冷却至-15℃后，加入iPrMgCl·LiCl(1.3M的THF溶液，3.19mL，4.14mmol，2当量)。将反应升温至-10℃并搅拌4小时。滴加3,6-二((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-10,10-二甲基蒽-9(10H)-酮(1.00g，2.07mmol；来自Grimm,J.B.；Sung,A.J.；Legant,W.R.；Hulamm,P.；Matlosz,S.M.；Betzig,E.；Lavis,L.D.ACS Chem.Biol.2013,8,1303)的THF(4mL)溶液。将反应混合物升温至室温并搅拌2小时。随后用饱和NH4Cl淬灭，用水稀释，并用EtOAc(2×)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发。通过硅胶色谱法(0-10％Et2O/己烷，线性梯度)得到245mg(17％)3,6-二((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-10,10-二甲基-3'-氧代-3'H,10H-螺[蒽-9,1'-异苯并呋喃]-6'-羧酸叔丁酯，其为无色固体。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.16(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.02(dd,J＝8.0,0.6Hz,1H),7.63–7.59(m,1H),7.09–7.05(m,2H),6.64–6.57(m,4H),1.81(s,3H),1.72(s,3H),1.54(s,9H),0.99(s,18H),0.22(s,12H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ169.9(C),164.4(C),156.5(C),155.5(C),147.0(C),138.1(C),130.3(CH),129.7(C),129.3(CH),125.1(CH),125.0(CH),124.0(C),119.2(CH),117.8(CH),87.0(C),82.5(C),38.2(C),35.0(CH3),33.2(CH3),28.2(CH3),25.8(CH3),18.4(C),-4.17(CH3),-4.19(CH3)；HRMS(ESI)C40H55O6Si2[M+H]+的计算值687.3537，实验值687.3533。
步骤2：向步骤1的产物(170mg，0.247mmol)的THF(5mL)溶液中加入TBAF(1.0M的THF溶液，990μL，0.990mmol，4当量)。将反应在室温下搅拌10分钟。随后用饱和NH4Cl稀释并用EtOAc(2×)萃取。有机萃取物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发得到橙色残余物。取粗中间体溶于CH2Cl2(5mL)中并冷却至0℃。加入吡啶(160μL，1.98mmol，8当量)和三氟甲磺酸酐(167μL，0.990mmol，4当量)，并移除冰浴。将反应在室温下搅拌2小时。然后用水稀释并用CH2Cl2(2×)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。通过硅胶快速色谱(0-20％EtOAc/己烷，线性梯度)得到159mg(89％)10,10-二甲基-3'-氧代-3,6-二(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-3'H,10H-螺[蒽-9,1'-异苯并呋喃]-6'-羧酸叔丁酯，其为无色固体。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.24(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.11(dd,J＝8.0,0.6Hz,1H),7.63–7.60(m,1H),7.56(d,J＝2.5Hz,2H),7.10(dd,J＝8.8,2.5Hz,2H),6.88(d,J＝8.8Hz,2H),1.91(s,3H),1.81(s,3H),1.56(s,9H)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-73.20(s)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ168.8(C),163.9(C),153.9(C),150.4(C),147.2(C),138.9(C),131.4(CH),131.1(C),130.3(CH),128.8(C),125.9(CH),124.7(CH),120.6(CH),119.8(CH),118.9(q,1JCF＝320.9Hz,CF3),84.3(C),83.1(C),39.0(C),34.8(CH3),33.2(CH3),28.2(CH3)；HRMS(ESI)C30H25F6O10S2[M+H]+的计算值723.0793，实验值723.0797。
步骤3：使用实施例7中描述的方法由步骤2中合成的二(三氟甲磺酸酯)制备标题化合物4-(叔丁氧基羰基)-2-(3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)苯甲酸盐(84％，蓝色固体)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.14(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.00(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.61(dd,J＝1.3,0.8Hz,1H),6.58(d,J＝2.3Hz,2H),6.54(d,J＝8.6Hz,2H),6.21(dd,J＝8.6,2.4Hz,2H),3.91(t,J＝7.2Hz,8H),2.38(p,J＝7.2Hz,4H),1.83(s,3H),1.73(s,3H),1.53(s,9H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ170.1(C),164.6(C),155.6(C),152.4(C),146.8(C),137.8(C),130.3(C),130.1(CH),128.9(CH),125.1(CH),124.8(CH),119.9(C),110.5(CH),108.0(CH),88.8(C),82.3(C),52.3(CH2),38.5(C),35.5(CH3),32.8(CH3),28.2(CH3),17.0(CH2)；HRMS(ESI)C34H37N2O4[M+H]+的计算值537.2753，实验值537.2768。
实施例43
4-羧基-2-(3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000941
使用实施例19中描述的方法由实施例42制备标题化合物(98％，深蓝色固体，TFA盐)。1H NMR(MeOD,400MHz)δ8.34(dd,J＝8.2,0.5Hz,1H),8.31(dd,J＝8.2,1.5Hz,1H),7.84(dd,J＝1.5,0.5Hz,1H),6.93(d,J＝9.1Hz,2H),6.82(d,J＝2.2Hz,2H),6.39(dd,J＝9.1,2.3Hz,2H),4.33(t,J＝7.6Hz,8H),2.55(p,J＝7.6Hz,4H),1.82(s,3H),1.70(s,3H)；19F NMR(MeOD,376MHz)δ-75.24(s)；13C NMR(MeOD,101MHz)δ167.9(C),167.5(C),165.4(C),158.0(C),156.8(C),139.3(C),137.6(CH),136.2(C),135.5(C),132.5(CH),132.4(CH),131.5(CH),121.8(C),111.9(CH),109.7(CH),52.9(CH2),42.8(C),35.6(CH3),32.0(CH3),16.8(CH2)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；600nm处检测)；HRMS(ESI)C30H29N2O4[M+H]+的计算值481.2127，实验值481.2120。
实施例44
4-((2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-2-(3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000942
使用实施例35中描述的方法由实施例43制备标题化合物(72％，深蓝色固体)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.02(dd,J＝8.0,0.6Hz,1H),7.94(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.42–7.40(m,1H),6.68–6.62(m,1H),6.57(d,J＝2.3Hz,2H),6.52(d,J＝8.6Hz,2H),6.20(dd,J＝8.6,2.4Hz,2H),3.91(t,J＝7.4Hz,8H),3.64–3.56(m,6H),3.55–3.48(m,4H),3.38(t,J＝6.6Hz,2H),2.37(p,J＝7.2Hz,4H),1.83(s,3H),1.77–1.68(m,2H),1.72(s,3H),1.56–1.47(m,2H),1.46–1.36(m,2H),1.36–1.28(m,2H)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μmC18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；600nm处UV检测)；HRMS(ESI)C40H49ClN3O5[M+H]+的计算值686.3361，实验值686.3375。
实施例45
2-(3,6-二(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)-4-(叔丁氧基羰基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000951
使用实施例1中所述的方法由10,10-二甲基-3'-氧代-3,6-二(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-3'H,10H-螺[蒽-9,1'-异苯并呋喃]-6'-羧酸叔丁酯(实施例42，步骤2)和3,3-二氟氮杂环丁烷盐酸盐制备标题化合物(93％，灰白色固体)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.16(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.02(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.60(dd,J＝1.2,0.8Hz,1H),6.65(d,J＝2.4Hz,2H),6.62(d,J＝8.6Hz,2H),6.29(dd,J＝8.6,2.5Hz,2H),4.26(t,3JHF＝11.7Hz,8H),1.85(s,3H),1.75(s,3H),1.53(s,9H)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-99.96(p,3JFH＝11.8Hz)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ169.9(C),164.4(C),155.3(C),150.1(t,4JCF＝2.7Hz,C),146.8(C),138.1(C),130.3(CH),129.9(C),129.2(CH),125.1(CH),124.9(CH),121.7(C),115.9(t,1JCF＝274.6Hz,CF2),111.8(CH),109.3(CH),87.5(C),82.5(C),63.4(t,2JCF＝26.0Hz,CH2),38.5(C),35.4(CH3),33.0(CH3),28.2(CH3)；MS(ESI)C34H33F4N2O4[M+H]+的计算值609.2，实验值609.3。
实施例46
2-(3,6-二(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)-4-羧基苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000961
使用实施例19中所述的方法由实施例45制备标题化合物(99％，深蓝色固体，TFA盐)。1H NMR(MeOD,400MHz)δ8.30(dd,J＝8.1,1.4Hz,1H),8.23–8.15(m,1H),7.69(s,1H),6.92(d,J＝2.1Hz,2H),6.79(d,J＝7.6Hz,2H),6.47(dd,J＝8.8,2.3Hz,2H),4.45(t,3JHF＝11.0Hz,8H),1.88(s,3H),1.76(s,3H)；19F NMR(MeOD,376MHz)δ-75.81(s,3F),-100.32(m,4F)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；30–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；600nm处检测)；MS(ESI)C30H25F4N2O4[M+H]+的计算值553.2，实验值553.1。
实施例47
2-(3,6-二(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)-4-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000962
使用实施例34中所述的方法由实施例46制备标题化合物(93％，黄色固体)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.32(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),8.14(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.74(dd,J＝1.3,0.8Hz,1H),6.65(d,J＝2.4Hz,2H),6.58(d,J＝8.6Hz,2H),6.31(dd,J＝8.6,2.5Hz,2H),4.26(t,3JHF＝11.7Hz,8H),2.88(s,4H),1.84(s,3H),1.73(s,3H)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-99.97(p,JFH＝11.7Hz)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ169.1(C),168.9(C),160.9(C),155.6(C),150.3(t,4JCF＝2.5Hz,C),146.9(C),132.0(C),131.3(CH),131.0(C),129.3(CH),126.2(CH),125.8(CH),120.9(C),115.9(t,1JCF＝274.5Hz,CF2),112.0(CH),109.4(CH),87.9(C),63.4(t,2JCF＝26.0Hz,CH2),38.5(C),35.5(CH3),32.8(CH3),25.8(CH2)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；30–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；600nm处检测)；MS(ESI)C34H28F4N3O6[M+H]+的计算值650.2，实验值650.1。
实施例48
2-(3,6-二(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)-10,10-二甲基蒽鎓-9-基-9(10H)-基)-4-((2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯甲酸盐
Figure GDA0002543877310000971
使用实施例35中描述的方法由实施例46制备标题化合物(54％，灰白色/青白色固体)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.04(dd,J＝8.0,0.5Hz,1H),7.93(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.44–7.40(m,1H),6.70–6.65(m,1H),6.64(d,J＝2.4Hz,2H),6.60(d,J＝8.6Hz,2H),6.28(dd,J＝8.6,2.4Hz,2H),4.25(t,3JHF＝11.7Hz,8H),3.66–3.57(m,6H),3.56–3.48(m,4H),3.39(t,J＝6.6Hz,2H),1.85(s,3H),1.79–1.70(m,5H),1.57–1.48(m,2H),1.46–1.37(m,2H),1.37–1.26(m,2H)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-99.94(p,3JFH＝11.8Hz)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；30–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；600nm处检测)；MS(ESI)C40H45ClF4N3O5[M+H]+计算值758.3，实验值758.2。
实施例49
7-(氮杂环丁烷-1-基)-4-甲基-2H-色烯-2-酮
Figure GDA0002543877310000981
向小瓶中加入4-甲基伞形酮三氟甲磺酸酯(300mg，0.973mmol；来自
Figure GDA0002543877310000982
J.；Antus,S.Z.Naturforsch.,B:J.Chem.Sci.2005,60,792)、RuPhos-G3-环钯配合物(41mg，0.049mmol，0.05当量)、RuPhos(23mg，0.049mmol，0.05当量)和K2CO3(188mg，1.36mmol，1.4当量)。将小瓶密封并抽真空/用氮气回填(3×)。加入二噁烷(8mL)，并再次用氮气(3×)冲洗反应。加入氮杂环丁烷(72μ洗，1.07mmol，1.1当量)后，在80℃下搅拌反应6.5小时。然后将其冷却至室温，沉积在硅藻土上，并浓缩至干。通过硅胶色谱法(0-30％EtOAc/己烷，线性梯度；用硅藻土干法上样)纯化得到(190mg，91％)标题化合物，其为黄色固体。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.38(d,J＝8.6Hz,1H),6.30(dd,J＝8.6,2.3Hz,1H),6.22(d,J＝2.3Hz,1H),5.97(q,J＝1.1Hz,1H),4.03–3.95(m,4H),2.44(p,J＝7.3Hz,2H),2.34(d,J＝1.1Hz,3H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ162.0(C),155.7(C),154.0(C),153.1(C),125.5(CH),110.4(C),109.5(CH),107.8(CH),97.2(CH),51.9(CH2),18.7(CH3),16.6(CH2)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/vTFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；350nm处检测)；HRMS(ESI)C13H14NO2[M+H]+的计算值216.1019，实验值216.1014。
实施例50
7-(氮杂环丁烷-1-基)-2-氧代-2H-色烯-3-羧酸乙酯
Figure GDA0002543877310000983
步骤1：向烧瓶中加入Pd(OAc)2(130mg，0.578mmol，0.05当量)，密封，抽真空/用氮气回填(3×)。加入甲苯(40mL)，然后依次加入3-溴苯酚(2.00g，11.6mmol)的甲苯(8mL)溶液、2,8,9-三异丁基-2,5,8,9-四氮杂-1-磷杂双环[3.3.3]十一烷(“Verkade”碱，396mg，1.16mmol，0.1当量)的甲苯(8mL)溶液和LiHMDS(1.0M的THF溶液，26.6mL，26.6mmol，2.3当量)。加入氮杂环丁烷(935μL，13.9mmol，1.2当量)后，在80℃下搅拌反应18小时。然后将其冷却至室温，沉积在硅藻土上，并浓缩至干。通过硅胶色谱法(0-35％EtOAc/己烷，线性梯度；用硅藻土干法上样)纯化得到灰白色固体3-(氮杂环丁烷-1-基)苯酚(1.44g，84％)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.05(t,J＝8.0Hz,1H),6.19(ddd,J＝8.0,2.4,0.8Hz,1H),6.04(ddd,J＝8.1,2.1,0.8Hz,1H),5.92(t,J＝2.3Hz,1H),4.77(s,1H),3.89–3.81(m,4H),2.34(p,J＝7.2Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ156.7(C),153.9(C),130.1(CH),105.1(CH),104.5(CH),99.0(CH),52.7(CH2),17.0(CH2)；HRMS(ESI)C9H12NO[M+H]+的计算值150.0913，实验值150.0915。
步骤2：将DMF(2mL)在氮气下冷却至0℃，滴加POCl3(500μL，5.36mmol，2当量)。然后移除冰浴，并将反应在室温下搅拌1小时。然后加入步骤1所得的苯酚(400mg，2.68mmol)的DMF(4mL)溶液。在室温下搅拌反应1小时后，小心地用饱和NaHCO3(～20mL)和EtOAc(～20mL)稀释并剧烈搅拌10分钟。将混合物用另外的水稀释并用EtOAc(2×)萃取。将合并的有机萃取物用水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。通过硅胶快速色谱法(0-40％EtOAc/己烷，线性梯度)纯化残余物得到230mg(48％)白色固体4-(氮杂环丁烷-1-基)-2-羟基苯甲醛。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ11.69(s,1H),9.50(s,1H),7.25(d,J＝8.5Hz,1H),5.94(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),5.75(d,J＝2.1Hz,1H),4.08–3.98(m,4H),2.43(p,J＝7.4Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ192.6(CH),164.4(C),156.6(C),135.5(CH),112.2(C),103.2(CH),95.6(CH),51.2(CH2),16.3(CH2)；HRMS(ESI)C10H12NO2[M+H]+的计算值178.0863，实验值178.0866。
步骤3：将来自步骤2的醛(175mg，0.988mmol)悬浮于EtOH(10mL)中。加入丙二酸二乙酯(301μ0，1.98mmol，2当量)和哌啶(29μ9，0.296mmol，0.3当量)，并将反应在回流下搅拌12小时。然后将其冷却至室温并静置12小时，在此期间从溶液中结晶出黄色固体。将混合物过滤，用EtOH洗涤滤饼并干燥，得到232mg(86％)标题化合物7-(氮杂环丁烷-1-基)-2-氧代-2H-色烯-3-羧酸乙酯，其为亮黄色结晶固体。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.39(s,1H),7.31(d,J＝8.6Hz,1H),6.26(dd,J＝8.6,2.2Hz,1H),6.09(d,J＝2.1Hz,1H),4.37(q,J＝7.1Hz,2H),4.10–4.02(m,4H),2.48(p,J＝7.4Hz,2H),1.38(t,J＝7.1Hz,3H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ164.2(C),158.13(C),158.12(C),155.2(C),149.5(CH),131.0(CH),109.4(C),108.39(C),108.36(CH),95.4(CH),61.2(CH2),51.4(CH2),16.3(CH2),14.5(CH3)；HRMS(ESI)C15H15NO4Na[M+Na]+计算值296.0893，实验值296.0900。
实施例51
7-(氮杂环丁烷-1-基)-2-氧代-2H-色烯-3-羧酸
Figure GDA0002543877310001001
取7-(氮杂环丁烷-1-基)-2-氧代-2H-色烯-3-羧酸乙酯(实施例50；65mg，0.238mmol)溶解在1:1THF/MeOH(8mL)中，并加入1M NaOH(476μ7，0.476mmol，2当量)。在室温下搅拌反应3小时。然后将其用1M HCl(500μ0)酸化，并将得到的黄色悬浮液过滤。将滤饼洗涤(水，EtOAc)并干燥，得到呈亮黄色固体的标题化合物(47mg，81％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ12.52(s,1H),8.59(s,1H),7.64(d,J＝8.7Hz,1H),6.42(dd,J＝8.7,2.2Hz,1H),6.23(d,J＝1.9Hz,1H),4.10–4.01(m,4H),2.39(p,J＝7.4Hz,2H)；13C NMR(DMSO-d6,101MHz)δ164.4(C),159.1(C),157.4(C),155.1(C),149.7(CH),131.7(CH),108.7(CH),108.0(C),107.6(C),94.7(CH),51.2(CH2),15.6(CH2)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；400nm处检测)；HRMS(ESI)C13H12NO4[M+H]+的计算值246.0761，实验值246.0770。
实施例52
N-(4-(((2-氨基-9H-嘌呤-6-基)氧基)甲基)苄基)-7-(氮杂环丁烷-1-基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲酰胺
Figure GDA0002543877310001011
将7-(氮杂环丁烷-1-基)-2-氧代-2H-色烯-3-羧酸(实施例51；6.0mg，24.5μ4.5)与TSTU(11.0mg，36.7μ6.7，1.5当量)在DMF(1mL)中合并。加入DIEA(21.3μ1，122μ22l，5当量)后，将反应在室温下搅拌1小时，同时避光。然后加入6-((4-(氨基甲基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(“BG-NH2”，9.9mg，36.7μ6.7，1.5当量)。将反应在室温下再搅拌2小时。通过反相HPLC(10-75％MeCN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂)纯化粗反应混合物得到11.5mg(77％，TFA盐)标题化合物，其为黄色固体。1H NMR(MeOD,400MHz)δ8.65(s,1H),8.31(s,1H),7.57–7.50(m,3H),7.41(d,J＝8.1Hz,2H),6.45(dd,J＝8.7,2.1Hz,1H),6.22(d,J＝2.0Hz,1H),5.64(s,2H),4.62(s,2H),4.15–4.06(m,4H),2.48(p,J＝7.4Hz,2H)；19F NMR(MeOD,376MHz)δ-75.44(s)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；400nm处检测)；HRMS(ESI)C26H24N7O4[M+H]+计算值498.1884，实验值498.1891。
实施例53
2-(7-(氮杂环丁烷-1-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙酸甲酯
Figure GDA0002543877310001021
步骤1：将7-羟基-4-甲基香豆素-3-乙酸甲酯(1.00g，4.03mmol；来自Franzini,R.M.；Kool,E.T.Chembiochem 2008,9,2981)、N-苯基-二(三氟甲磺酰亚胺)(1.58g，4.43mmol，1.1当量)和DIEA(912μ1，5.24mmol，1.3当量)在MeCN(20mL)中合并，并在室温下搅拌18小时。将反应混合物浓缩至干，并将所得残余物通过硅胶快速色谱法(0-50％EtOAc/己烷，线性梯度)纯化得到灰白色固体2-(4-甲基-2-氧代-7-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-2H-色烯-3-基)乙酸甲酯(1.41g，92％)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.73(d,J＝8.8Hz,1H),7.29(d,J＝2.4Hz,1H),7.26(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),3.76(s,2H),3.73(s,3H),2.44(s,3H)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-73.08(s)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ170.2(C),160.4(C),153.0(C),150.5(C),147.9(C),126.7(CH),121.0(C),120.5(C),118.8(q,1JCF＝321.0Hz,CF3),117.6(CH),110.5(CH),52.6(CH3),33.0(CH2),15.7(CH3)；HRMS(ESI)C14H11F3O7SNa[M+Na]+计算值403.0070，实验值403.0081。
步骤2：将来自步骤1的三氟甲磺酸酯(300mg，0.789mmol)、RuPhos-G3-环钯配合物(33mg，0.039mmol，0.05当量)、RuPhos(18mg，0.039mmol，0.05当量)和K2CO3(153mg，1.10mmol，1.4当量)。将小瓶密封并抽真空/用氮气回填(3×)。加入二噁烷(5mL)，并再次用氮气冲洗反应(3×)。加入氮杂环丁烷(58μL，0.868mmol，1.1当量)后，将反应在80℃下搅拌4小时。然后将其冷却至室温，用CH2Cl2稀释，沉积在硅藻土上，并浓缩至干。通过硅胶色谱法(0-50％EtOAc/己烷，线性梯度，恒定的40％v/v CH2Cl2；用硅藻土干燥上样)纯化得到标题化合物2-(7-(氮杂环丁烷-1-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙酸甲酯(210mg，93％)，其为浅黄色固体。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.42(d,J＝8.7Hz,1H),6.32(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),6.22(d,J＝2.3Hz,1H),4.03–3.94(m,4H),3.70(s,3H),3.69(s,2H),2.43(p,J＝7.3Hz,2H),2.33(s,3H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ171.4(C),162.4(C),154.6(C),153.7(C),149.8(C),125.7(CH),113.7(C),110.7(C),108.0(CH),97.0(CH),52.2(CH3),51.9(CH2),32.8(CH2),16.6(CH2),15.3(CH3)；HRMS(ESI)C16H17NO4Na[M+Na]+计算值310.1050，实验值310.1068。
实施例54
2-(7-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙酸甲酯
Figure GDA0002543877310001031
向小瓶中加入2-(4-甲基-2-氧代-7-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-2H-色烯-3-基)乙酸甲酯(实施例53，步骤1；240mg，0.631mmol)、RuPhos-G3-钯环配合物(26mg，0.032mmol，0.05当量)、RuPhos(15mg，0.032mmol，0.05当量)、K2CO3(218mg，1.58mmol，2.5当量)和3,3-二氟氮杂环丁烷盐酸盐(84mg，0.694mmol，1.1当量)。将小瓶密封并抽真空/用氮气回填(3×)。加入二噁烷(4mL)，并用氮气(3×)再次冲洗反应物。然后将混合物在80℃下搅拌24小时。随后将其冷却至室温，用CH2Cl2稀释，沉积在硅藻土上，并浓缩至干。通过硅胶色谱法(0-40％EtOAc/己烷，线性梯度，恒定的40％v/v CH2Cl2；用硅藻土干法上样)纯化得到标题化合物(158mg，77％)，其为灰白色固体。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.50(d,J＝8.7Hz,1H),6.41(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),6.34(d,J＝2.4Hz,1H),4.32(t,3JHF＝11.7Hz,4H),3.71(s,3H),3.71(s,2H),2.36(s,3H)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-100.14(p,3JFH＝11.6Hz)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ171.1(C),161.9(C),154.3(C),151.5(t,4JCF＝3.2Hz,C),149.4(C),126.1(CH),115.5(t,1JCF＝274.6Hz,CF2),115.4(C),112.3(C),109.0(CH),98.9(CH),63.3(t,2JCF＝26.8Hz,CH2),52.3(CH3),32.8(CH2),15.4(CH3)；HRMS(ESI)C16H15F2NO4Na[M+Na]+的计算值346.0861，实验值346.0872。
实施例55
2-(7-(氮杂环丙烷-1-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙酸
Figure GDA0002543877310001041
将2-(7-(氮杂环丁烷-1-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙酸甲酯(实施例53；190mg，0.661mmol)溶于1:1THF/MeOH(8mL)中，并加入1M NaOH(1.32mL，1.32mmol，2当量)。在室温下搅拌反应24小时后，用1M HCl(1.40mL)酸化，用水稀释，并用EtOAc(2×)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。将所得残余物用CH2Cl2/己烷研磨，过滤并干燥得到164mg(91％)标题化合物，其为浅黄色固体。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ12.33(s,1H),7.58(d,J＝8.8Hz,1H),6.40(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),6.25(d,J＝2.3Hz,1H),3.94(t,J＝7.3Hz,4H),3.52(s,2H),2.36(p,J＝7.3Hz,2H),2.30(s,3H)；13C NMR(DMSO-d6,101MHz)δ171.8(C),161.2(C),153.7(C),153.4(C),149.5(C),126.2(CH),113.6(C),109.7(C),108.0(CH),96.1(CH),51.5(CH2),32.5(CH2),16.0(CH2),14.9(CH3)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；350nm处检测)；HRMS(ESI)C15H15NO4Na[M+Na]+的计算值296.0893，实验值296.0909。
实施例56
2-(7-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙酸
Figure GDA0002543877310001042
使用实施例55中描述的方法由实施例54制备标题化合物(93％，白色固体)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ12.37(s,1H),7.67(d,J＝8.7Hz,1H),6.58(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),6.51(d,J＝2.3Hz,1H),4.42(t,3JHF＝12.3Hz,4H),3.55(s,2H),2.33(s,3H)；19F NMR(DMSO-d6,376MHz)δ-98.45(p,3JHF＝12.4Hz)；13C NMR(DMSO-d6,101MHz)δ171.7(C),161.0(C),153.3(C),151.7(t,4JCF＝3.2Hz,C),149.3(C),126.4(CH),116.4(t,1JCF＝272.9Hz,CF2),115.1(C),111.3(C),109.6(CH),98.6(CH),62.8(t,2JCF＝26.1Hz,CH2),32.6(CH2),14.9(CH3)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；350nm处检测)；HRMS(ESI)C15H13F2NO4Na[M+Na]+的计算值332.0705，实验值332.0714。
实施例57
2-(7-(氮杂环丁烷-1-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure GDA0002543877310001051
向2-(7-(氮杂环丁烷-1-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙酸(实施例55；75mg，0.274mmol)和TSTU(124mg，0.412mmol，1.5当量)的DMF(4mL)溶液中加入DIEA(96μL，0.549mmol，2当量)。将反应在室温下搅拌4小时。随后用10％w/v柠檬酸稀释并用EtOAc(2×)萃取。将合并的有机萃取物用水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱法(0-50％EtOAc/CH2Cl2，线性梯度)得到84mg(83％)标题化合物，其为浅黄色固体。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.43(d,J＝8.7Hz,1H),6.31(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),6.21(d,J＝2.3Hz,1H),4.02(s,2H),4.02–3.96(m,4H),2.81(s,4H),2.44(p,J＝7.3Hz,2H),2.38(s,3H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ169.0(C),166.4(C),162.0(C),154.7(C),154.0(C),151.3(C),125.9(CH),111.2(C),110.3(C),108.1(CH),96.9(CH),51.8(CH2),29.8(CH2),25.7(CH2),16.6(CH2),15.5(CH3)；HRMS(ESI)C19H18N2O6Na[M+Na]+的计算值393.1057，实验值393.1065。
实施例58
2-(7-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure GDA0002543877310001061
使用实施例57中描述的方法由实施例56制备标题化合物(82％，白色固体)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ7.71(d,J＝8.8Hz,1H),6.59(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),6.53(d,J＝2.3Hz,1H),4.43(t,3JHF＝12.3Hz,4H),4.03(s,2H),2.79(s,4H),2.40(s,3H)；19F NMR(DMSO-d6,376MHz)δ-98.49(p,3JFH＝12.3Hz)；13C NMR(DMSO-d6,101MHz)δ170.0(C),166.5(C),160.6(C),153.5(C),152.1(t,4JCF＝3.2Hz,C),151.2(C),126.7(CH),116.4(t,1JCF＝272.8Hz,CF2),112.1(C),110.9(C),109.8(CH),98.5(CH),62.8(t,2JCF＝26.2Hz,CH2),29.5(CH2),25.4(CH2),15.1(CH3)；HRMS(ESI)C19H16F2N2O6Na[M+Na]+的计算值429.0869，实验值429.0876。
实施例59
2-(6-(氮杂环丁烷-1-基)-3-氧代-3H-呫吨-9-基)苯甲酸
Figure GDA0002543877310001062
步骤1：向小瓶中加入荧光素二(三氟甲磺酸酯)(500mg，0.838mmol)，Pd2dba3(38mg，0.042mmol，0.05当量)，XPhos(60mg，0.126mmol，0.15当量)和Cs 2CO 3(382mg，1.17mmol，1.4当量)。将小瓶密封并抽真空/用氮气回填(3×)。加入二噁烷(4mL)，并用氮气(3×)再次冲洗反应。加入氮杂环丁烷(57μL，0.838mmol，1当量)后，将反应在80℃下搅拌2小时。然后将其冷却至室温，沉积在硅藻土上，并浓缩至干。通过硅胶色谱法(0-35％EtOAc/己烷，线性梯度；用硅藻土干法上样)纯化得到3'-(氮杂环丁烷-1-基)-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-6'-基三氟甲磺酸酯(125mg，30％)，其为灰白色固体。MS(ESI)C24H17F3NO6S[M+H]+的计算值504.1，实验值504.2。
步骤2：将步骤1的产物(72mg，0.143mmol)溶于1:1THF/MeOH(5mL)中，并加入1MNaOH(286μ8，0.286mmol，2当量)。室温下搅拌反应6小时后，将反应物浓缩至干。残余物通过反相HPLC(10-95％MeCN/H2O，线性梯度，用恒定的0.1％v/v TFA添加剂)纯化，得到40mg(58％)标题化合物2-(6-(氮杂环丁烷-1-基)-3-氧代-3H-呫吨-9-基)苯甲酸，其为亮橙色固体。1H NMR(MeOD,400MHz)δ8.36–8.30(m,1H),7.85(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.81(td,J＝7.6,1.5Hz,1H),7.43–7.38(m,1H),7.16(d,J＝9.3Hz,1H),7.15(d,J＝9.0Hz,1H),7.08(d,J＝2.3Hz,1H),6.93(dd,J＝9.0,2.3Hz,1H),6.74(dd,J＝9.3,2.2Hz,1H),6.64(d,J＝2.2Hz,1H),4.44–4.35(m,4H),2.58(p,J＝7.7Hz,2H)；13C NMR(MeOD,101MHz)δ168.4(C),168.0(C),161.0(C),159.9(C),159.1(C),157.9(C),135.7(C),134.0(CH),133.1(CH),132.42(CH),132.40(CH),132.1(C),131.7(CH),131.2(CH),118.0(CH),117.1(C),116.4(C),115.9(CH),103.3(CH),95.1(CH),53.4(CH2),16.7(CH2)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；500nm处检测)；HRMS(ESI)C23H18NO4[M+H]+的计算值372.1230，实验值372.1230。
实施例60
3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)吖啶
Figure GDA0002543877310001071
步骤1：在微波小瓶中将盐酸原黄素(250mg，1.02mmol)悬浮于水(1mL)中，加入浓H2SO4(450μ5)。将密封的混合物在微波中在195℃下加热8小时。将棕色悬浮液用水稀释并过滤；将所得滤饼用水洗涤并干燥，得到粗制3,6-二羟基吖啶，其为红棕色固体(260mg)。然后将3,6-二羟基吖啶(260mg，1.23mmol)悬浮于CH2Cl2(5mL)中。加入吡啶(796μ9，9.85mmol，8当量)和三氟甲磺酸酐(828μ2，4.92mmol，4当量)，在室温下搅拌反应2小时。随后用水稀释并用CH2Cl2(2×)萃取。将合并的有机萃取物干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。通过硅胶快速色谱法(0-30％EtOAc/己烷，线性梯度)纯化得到303mg(63％，2步)吖啶-3,6-二基二(三氟甲磺酸酯)，其为灰白色固体。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.93(s,1H),8.19–8.13(m,4H),7.54(dd,J＝9.2,2.4Hz,2H)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-73.10(s)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ151.1(C),149.5(C),137.0(CH),131.2(CH),125.7(C),121.4(CH),120.8(CH),119.0(q,1JCF＝321.0Hz,CF3)；HRMS(ESI)C15H8F6NO6S2[M+H]+的计算值475.9692，实验值475.9689。
步骤2：将来自步骤1的二(三氟甲磺酸酯)(200mg，0.421mmol)、Pd(OAc)2(19mg，0.084mmol，0.2当量)、BINAP(79mg，0.126mmol，0.3当量)和Cs2CO3(384mg，1.18mmol，2.8当量)。将小瓶密封并抽真空/用氮气回填(3×)。加入甲苯(2.5mL)，并再次用氮气(3×)冲洗反应。加入氮杂环丁烷(68μL，1.01mmol，2.4当量)后，将反应在100℃下搅拌18小时。然后将其冷却至室温，用MeOH稀释，沉积在硅藻土上，并浓缩至干。通过硅胶色谱(0-10％MeOH(2MNH3)/CH2Cl2，线性梯度；用硅藻土干法加样)纯化，得到标题化合物3,6-二(氮杂环丁烷-1-基)吖啶(89mg，73％)，其为红橙色固体。1H NMR(MeOD,400MHz)δ8.44(s,1H),7.74(d,J＝9.0Hz,2H),6.78(dd,J＝9.0,2.2Hz,2H),6.57(d,J＝2.0Hz,2H),4.08(t,J＝7.3Hz,8H),2.47(p,J＝7.3Hz,4H)；13C NMR(MeOD,101MHz)δ156.0(C),144.2(CH),143.1(C),132.6(CH),118.1(C),114.1(CH),91.4(CH),52.3(CH2),17.0(CH2)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；500nm处检测)；HRMS(ESI)C19H20N3[M+H]+的计算追290.1652，实验值290.1650。
实施例61
3,7-二(氮杂环丁烷-1-基)吩噁嗪-5-鎓三氟乙酸盐
Figure GDA0002543877310001091
步骤1：取Amplex Red(449mg，1.75mmol)溶于CH2Cl2(45mL)中并冷却至0℃。加入吡啶(1.14mL，14.0mmol，8.0当量)和三氟甲磺酸酐(1.17mL，6.98mmol，4.0当量)，并移除冰浴。将反应在室温下搅拌3小时。随后用水稀释并用CH2Cl2(2×)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。通过硅胶快速色谱(0-35％EtOAc/己烷，线性梯度)得到836mg(92％)10-乙酰基-10H-吩噁嗪-3,7-二基二(三氟甲磺酸酯)，其为灰白色固体。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.58–7.54(m,2H),7.14–7.09(m,4H),2.35(s,3H)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-73.15(s)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ168.9(C),151.0(C),147.4(C),129.1(C),126.3(CH),118.8(q,1JCF＝320.9Hz,CF3),117.2(CH),111.1(CH),23.0(CH3)；HRMS(ESI)C16H10F6NO8S2[M+H]+的计算值521.9747，实验值521.9748。
步骤2：将来自步骤1的二(三氟甲磺酸酯)(150mg，0.288mmol)、Pd2dba3(26mg，0.029mmol，0.1当量)、XPhos(41mg，0.086mmol，0.3eq)和Cs2CO3(262mg，0.806mmol，2.8当量)装入小瓶中。将小瓶密封并抽真空/用氮气回填(3×)。加入二噁烷(4mL)，并用氮气(3×)再次冲洗反应。加入氮杂环丁烷(47μL，0.691mmol，2.4当量)后，将反应在80℃下搅拌4小时。然后将其冷却至室温，沉积在硅藻土上，并浓缩至干。通过硅胶色谱法(5-50％EtOAc/己烷，线性梯度；用硅藻土干法上样)纯化得到1-(3,7-二(氮杂环丁烷-1-基)-10H-吩噁嗪-10-基)乙酮(91mg，94％)，其为无色固体。MS(ESI)C20H22N3O2[M+H]+的计算值336.2，实验值336.2。
步骤3：将来自步骤2的中间体(63mg，0.189mmol)溶于CH2Cl2(11.7mL)和水(1.3mL)的混合物中并冷却至0℃。加入DDQ(47mg，0.207mmol，1.1当量)，并将反应在室温下搅拌2.5小时。加入第二部分的DDQ(21mg，0.094mmol，0.5当量)，将反应物再搅拌30分钟。将混合物蒸发，再溶于MeCN中，沉积在硅藻土上，并浓缩至干。通过硅胶色谱法(0-15％MeOH/CH2Cl2，线性梯度，恒定的1％v/v AcOH添加剂；用硅藻土干法上样)以及随后的反相HPLC(10-95％MeCN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂)得到38mg(50％)标题化合物3,7-二(氮杂环丁烷-1-基)吩噁嗪-5-鎓三氟乙酸盐，其为深蓝色固体。1H NMR(MeOD,400MHz)δ7.72(d,J＝9.3Hz,2H),6.92(dd,J＝9.3,2.4Hz,2H),6.50(d,J＝2.4Hz,2H),4.43(t,J＝7.7Hz,8H),2.60(p,J＝7.7Hz,4H)；19F NMR(MeOD,376MHz)δ-75.45(s)；13C NMR(MeOD,101MHz)δ158.0(C),150.3(C),135.4(CH),135.3(C),116.4(CH),95.1(CH),53.7(CH2),16.6(CH2)；分析HPLC:>99％纯度(4.6mm×150mm 5μm C18柱；5μL注射；10–95％CH3CN/H2O，线性梯度，恒定的0.1％v/v TFA添加剂；运行20min；流速1mL/min；ESI；正离子模式；650nm处检测)；HRMS(ESI)C18H18N3O[M]+的计算值292.1444，实验值292.1439。
在本文中，提及了各种参考文献。包括以下所列的参考文献在内的所有这些参考文献通过引用并入本文：
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通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。
应当理解，在不脱离本文所公开的主题的范围的情况下，可以改变本发明公开主题的各种细节。此外，前面的描述仅仅是为了说明，而不是为了限制。

Claims (25)

1.下式的化合物：
Figure FDA0002747963030000011
其中：
每个R独立地选自卤素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，所述烷基任选地被卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；
Q选自CR(2)、NR、O、S、SiR(2)和Se；
W选自C和N；
X选自孤对电子、H、烷基、芳基、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，X任选地被卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；
Y选自H、CR(2)、NR、O和S；且
Z选自H、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，所述烷基和芳基任选地被卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环，
其中烷基是1-24个碳原子的支链或非支链饱和烃基，
其中胺基独立地选自NH2、NH(烷基)、NH(芳基)、N(烷基)2和N(芳基)2，
并且其中所述化合物不包括7-(氮杂环丁烷-1-基)吩噻嗪-3-酮和7-(氮杂环丁烷-1-基)-1,9-二甲基-吩噻嗪-3-酮。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中Y和Z与它们所键合的原子一起形成5-7元环，所述5-7元环被一个或多个选自卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基的取代基取代。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中Y和Z与它们所键合的原子一起形成被未取代或取代的氮杂环丁烷基取代的5-7元环。
4.根据权利要求1所述的化合物，其化学式如下：
Figure FDA0002747963030000021
其中R’选自卤素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，所述烷基任选地被卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代。
5.根据权利要求1所述的化合物，其化学式如下：
Figure FDA0002747963030000022
其中R’选自未取代的氮杂环丁烷基或被下述取代基中的一个或多个取代的氮杂环丁烷基：卤素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基。
6.根据权利要求1所述的化合物，其化学式如下：
Figure FDA0002747963030000031
7.根据权利要求1所述的化合物，其化学式如下：
Figure FDA0002747963030000032
8.根据权利要求1所述的化合物，其化学式如下：
Figure FDA0002747963030000033
9.根据权利要求1所述的化合物，其化学式如下：
Figure FDA0002747963030000034
10.根据权利要求1所述的化合物，其化学式如下：
Figure FDA0002747963030000041
11.根据权利要求1所述的化合物，其化学式如下：
Figure FDA0002747963030000042
12.根据权利要求1所述的化合物，其化学式如下：
Figure FDA0002747963030000043
13.根据权利要求1所述的化合物，其化学式如下：
Figure FDA0002747963030000044
14.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中X是取代的芳基。
15.根据权利要求1所述的化合物，其中X选自：
H、CH3、
Figure FDA0002747963030000051
Figure FDA0002747963030000052
16.根据权利要求1所述的化合物，其中X选自H和孤对电子。
17.选自下述化学式的化合物：
Figure FDA0002747963030000053
Figure FDA0002747963030000061
18.试剂盒，其包括：
下式的化合物：
Figure FDA0002747963030000062
其中：
每个R独立地选自卤素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，所述烷基任选地被卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；
Q选自CR(2)、NR、O、S、SiR(2)和Se；
W选自C和N；
X选自孤对电子、H、烷基、芳基、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，X任选地被卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；
Y选自H、CR(2)、NR、O和S；且
Z选自H、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，烷基和芳基任选地被卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环，
其中烷基是1-24个碳原子的支链或非支链饱和烃基，并且
其中胺基独立地选自NH2、NH(烷基)、NH(芳基)、N(烷基)2和N(芳基)2；以及
可逆地或不可逆地结合所述化合物的结合元件。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述结合元件包括蛋白质。
20.用于检测目标物质的方法，其包括：
使样品与下式的化合物接触：
Figure FDA0002747963030000071
其中：
每个R独立地选自卤素、H、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H和烷基，所述烷基任选地被卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；
Q选自CR(2)、NR、O、S、SiR(2)和Se；
W选自C和N；
X选自孤对电子、H、烷基、芳基、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H，X任选地被卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COO-、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和/或SO3H取代；
Y选自H、CR(2)、NR、O和S；且
Z选自H、卤素、CN、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2、SO3H、芳基和烷基，所述烷基和芳基任选地被卤素、OH、O(烷基)、O(芳基)、SH、S(烷基)、S(芳基)、胺基、NO2、CHO、COOH、COO(烷基)、COO(芳基)、PO3H2和SO3H取代，或者其中Z和Y与它们所键合的原子一起形成取代的或未取代的5-7元环，
其中烷基是1-24个碳原子的支链或非支链饱和烃基，并且
其中胺基独立地选自NH2、NH(烷基)、NH(芳基)、N(烷基)2和N(芳基)2；以及
检测来自所述化合物的发射光，所述发射光指示所述目标物质的存在。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述目标物质选自蛋白质、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、底物、代谢物、抑制剂、药物、营养物、生长因子、脂蛋白及其组合。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述检测步骤采用显微镜进行。
23.根据权利要求20所述的方法，其进一步包括将所述化合物暴露于具有100nm至1000nm波长的吸收光的步骤。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述接触步骤和所述检测步骤在活细胞中进行。
25.根据权利要求20所述的方法，其中：
所述化合物包括第一化合物和第二化合物；
所述第一化合物对第一目标物质具有选择性并且能够发射第一发射光；
所述第二化合物对第二目标物质具有选择性并且能够发射第二发射光，且
所述检测步骤包括检测指示第一目标物质存在的第一发射光和指示第二目标物质存在的第二发射光。
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