CN106442973A - 食品安全领域真菌毒素多参数定量检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于食品安全领域的真菌毒素快速检测的多参数法检定试剂盒。通过真菌毒素检测中不同参数与真菌毒素检测卡的共同应用，操作简单易行，能快速、准确地测定不同样品中的不同类型真菌毒素的准确含量，如：玉米及其副产物、谷物、面粉、麸皮、豆粕、棉粕、花生粕、玉米胚芽粕、菜籽粕、配合料、浓缩料等，对食品安全有着重要意义。

Description

食品安全领域真菌毒素多参数定量检测试剂盒

技术领域

本发明提供了食品安全领域的多参数法准确测定真菌毒素含量的快速检测试剂盒，本发明属于生物检测工程技术领域。

背景技术

真菌毒素(mycotoxin)是由某些真菌在生长过程中产生的一系列具有不同化学结构的有毒次级代谢产物。目前已知的真菌毒素种类有300多种，其中约有30余种真菌毒素对人类和动物都有强毒性，部分真菌毒素表现为诱导基因突变、产生致癌性，以及特定器官的毒性等；主要真菌毒素包括：黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮及其衍生物类毒素、呕吐毒素伏马毒素等。真菌毒素可广泛污染食物、农作物及其制品等，易引起食用者中毒，造成重大经济损失，据***粮农组织(FAO)资料，全球每年约有25％的农作物遭受真菌毒素的污染，约有2％的农作物因污染严重而失去营养和经济价值，造成的直接和间接损失达数百亿美元。

现有的真菌毒素检测方法主要包括：薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法等。

薄层层析法检测真菌毒素时，检测试剂用量大、操作繁琐、组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测，应用较少。

精密仪器分析法主要包括色谱法、质谱法及串联质谱联用等方法，优点为灵敏度高，准确性好，缺点是仪器昂贵，样品前处理过程繁琐，样品的纯度要求高，环境和检测人员要求高，检测成本高，不适用于现场快速检测和推广。如专利“CN 103713065 B一种同时检测多种真菌毒素的方法”所述，应用液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)，通过同位素内标稀释法准确测定样品中多种真菌毒素，同位素的应用对检测人员同样有一定的健康损害。

近年来，免疫学分析法在测定真菌毒素中的应用越来越广泛，主要源于免疫学分析法的敏感、特异、稳定、简便等优点。

免疫学分析法中的酶联免疫方法(ELISA)在检测过程中，需要添加毒素标准品，增加了检测人员被毒素污染的风险，同时需要绘制标准曲线，计算过程较复杂，耗时较长，不适宜现场快速检测。如专利“CN 104569407 A一种真菌毒素检测数据库的构建方法、真菌毒素检测方法、试剂盒及装置”所述，虽然对标准曲线、标准品有所改进，但仍需求建立一个庞大的真菌检测数据库，同时应用单个标准品进行。

免疫学分析法中的胶体金标检测技术，具有肉眼判读结果，检测成本低，分析时间短等优点也有较为广泛的应用和专利技术申请，但胶体金检测由于肉眼判读，存在难于准确定量，灵敏度低，检测单一等诸多缺点。

此外，由于样品的复杂性，如：玉米及其副产物、谷物、面粉、麸皮、豆粕、棉粕、花生粕、玉米胚芽粕、菜籽粕、配合料、浓缩料等，对多种真菌毒素的准确测量具有较大的干扰性及不确定性，而对于不同复杂样品中的真菌毒素准确测量的参数卡及应用，在现有的方法及专利技术中均无相应记载。

因此，有必要提供一种能简便、快速、准确定量测量样品中真菌毒素的参数卡及包含参数卡的真菌毒素检测试剂盒。

发明内容

为了解决现有技术问题的不足，本发明提供了一种食品安全领域的多参数法准确测定真菌毒素含量的快速检测试剂盒及应用，所述试剂盒包括参数卡和真菌毒素含量的快速检测试剂，该方法能准确、快速、定量测定样品中真菌毒素，并能通过不同样品类型的参数卡自动计算，准确获得不同样品中的真菌毒素的准确含量。

本发明提供了一种用于食品安全领域的定量测定不同类型样品中真菌毒素含量的固相免疫层析分析法的检测试剂盒，所述试剂盒包括参数卡和固相免疫层析分析法的检测试剂。

在本发明的一个优选的实验方案中，所述参数卡内包含有不同的样品类型的数据信息，用于真菌毒素定量测定时，自动计算不同样品类型中的真菌毒素的准确含量。

在本发明的一个优选的实验方案中，所述固相免疫层析分析法的真菌毒素检测试剂，其特征在于所述固相免疫层析分析法的检测试剂是基于免疫层析分析原理制备而成，具体包括卡壳、背板、支撑板，所述支撑板经真菌毒素抗原及对应抗体标记和/或包被，所述支撑板选自硝酸纤维素膜、玻纤、吸水纸及其等效材料。

在本发明的一个优选的实验方案中，所述参数卡优选以卡式、条式、或芯片式提供；芯片式包括内置芯片和芯片卡两种形式。

在本发明的一个更优选的实验方案中，所述参数卡通过适配荧光免疫分析仪直接独立使用，在真菌毒素定量测定时自动计算不同样品类型中的真菌毒素的准确含量，无需使用真菌毒素相应的纯品标准物质定标或者校正，操作简便，对操作者具有很好的保护作用。

在本发明的一个更优选的实验方案中，所述参数卡包括的不同样品类型，包括但不限于以下主要样品类型：麸皮、膨化玉米、豆粕、棉粕、花生粕、玉米胚芽粕、菜籽粕、配合料、浓缩料、玉米及其副产物、谷物、面粉等。

在本发明的一个更优选的实验方案中，所述参数卡中的每张参数卡信息至少包含，如：麸皮、膨化玉米、豆粕、棉粕、花生粕、玉米胚芽粕、菜籽粕、配合料、浓缩料、玉米及其副产物、谷物、面粉等不同样品的至少一种样品信息。

在本发明的一个优选的实验方案中，所述真菌毒素包括但不限于已知的300余种真菌毒素及30余种对人类和动物都有强毒性的真菌毒素。

在本发明的一个更优选的实验方案中，所述真菌毒素包括：黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮及其衍生物类毒素、呕吐毒素、伏马毒素的至少一种。

在本发明的一个优选的实验方案中，所述固相免疫层析分析法为上转发光免疫层析法、荧光免疫层析法、胶体金免疫层析法、乳胶免疫层析法等固相免疫层析分析法中的任一种。

在本发明的一个优选的实验方案中，真菌毒素检测试剂盒用于食品安全领域不同样品中的不同类型的真菌毒素的准确定量测定。

在本发明的一个更优选的实验方案中，所述不同样品中的不同类型的真菌毒素的准确定量测定时间为20分钟以下。

与现有技术相比，本发明的益处在于提供了一种包括参数卡的多参数法准确测定真菌毒素含量的快速检测试剂盒及应用，该方法能准确、快速、定量测定样品中真菌毒素，并能通过不同样品类型的参数卡自动计算，准确获得不同样品中的真菌毒素的准确含量；本发明中通过多参数的应用，首次对不同样品，如：玉米及其副产物、谷物、面粉、麸皮、豆粕、棉粕、花生粕、玉米胚芽粕、菜籽粕、配合料、浓缩料等样品中的多种真菌毒素的准确、定量测定，对食品安全的真菌毒素检测有着重要意义。

具体实施方式

以下实施案例，对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所述的实施案例仅用于解释本发明，并不限定发明范围。除有特殊说明外，本发明所用原辅材料，包括真菌毒素抗原及对应抗真菌毒素抗原的抗体，均来自成熟的、商品化的原辅材料。

本发明提供了一种食品安全领域的多参数法准确测定真菌毒素含量的快速检测试剂盒及应用，为更好的解释本发明，优选以上转发光免疫层析分析法进行解释本发明，以下上转发光免疫层析分析法实施案例仅用于更好的解释本发明，不作为本发明的限制条件。

上转发光免疫层析分析法与荧光免疫层析法、胶体金免疫层析法、乳胶免疫层析法等均属于固相免疫层析分析技术，其不同点在于固相标记颗粒物不同，如上转发光免疫层析法的UCP颗粒、胶体金免疫层析法的胶体金颗粒，乳胶免疫层析法的乳胶颗粒，在相同原辅料条件下，以上所述方法具备相似的工艺过程及检测步骤，但上转发光免疫层析技术的灵敏度、特异性高于其他方法，且能准确定量分析，因此选用上转发光免疫层析分析法实施案例更好的解释本发明，但不作为本发明的限制条件。

实施案例1：

1、基于上转发光免疫层析法的真菌毒素含量快速检测参数卡的制备：

本实施案例中基于上转发光免疫层析法的真菌毒素含量快速检测参数卡的制备方法仅为更好的解释参数卡的制备方式，不作为参数卡的制备及使用的限定方式。

根据对已知样品，如：玉米及其副产物、谷物、面粉、麸皮、豆粕、棉粕、花生粕、玉米胚芽粕、菜籽粕、配合料、浓缩料等样品类型、特性等进行分析总结，经过本公司大量的一手研究数据对不同样品中不同真菌毒素的回收率、灵敏度、特异性、均一性、适用性等进行分析，获得参数卡的参数计算数据，实验研究和分析方法如无特殊说明均是采用常规成熟方法进行。通过参数编译软件将参数录入参数卡中，参数卡可以制备成和真菌毒素检测试剂外观形式相同的检测试剂条模式，也可以以内置芯片的模式将芯片植入真菌毒素检测卡的内部。

基于上转发光免疫层析法的真菌毒素含量快速检测参数卡，根据上述分析方法，依据不同的样品类型，主要制备成如表1的不同分类形式，所述真菌毒素选用黄曲霉毒素B1，用于更好的解释本发明，不作为本发明对真菌毒素的限制条件。

表1：黄曲霉毒素B1快速检测参数卡分类表

实施案例2：

本实施案例中提供了一种食品安全领域的多参数法准确测定真菌毒素含量的快速检测试剂的制备方式，该制备方法仅为更好的解释本发明，不作为多参数法准确测定真菌毒素含量的快速检测试剂的制备及使用的限制条件。

如无特殊说明，本实施案例中基于上转发光免疫层析技术的多参数法准确测定真菌毒素含量的快速检测试剂的制备方法均来源于本公司专利技术“CN 1690711 B基于上转换发光技术免疫层析试纸条”中的制备方法及其优化方法。

本实施案例中提供了一种食品安全领域的多参数法准确测定真菌毒素含量的快速检测试剂的制备，所述真菌毒素选用黄曲霉毒素B1用于更好的解释本发明，不作为本发明对真菌毒素的限制条件。

1、基于上转发光免疫层析技术包被工艺：

该包被工艺仅为更好的解释本发明，不作为包被材料的制备及使用的限制条件。

表2：黄曲霉毒素B1包被工艺基础配方表

类别	基础配方
		检测线T(AFB1抗原)	1.0mg/mL
质控线C(羊抗鼠)	0.25mg/mL
		T线包被缓冲液	0.05M PB(pH7.4)+150mM NaCl
C线包被缓冲液	0.01M PB(pH7.2)
		辅材	NC膜、吸水纸、PVC板

按照表2中的配方，将分别含有AFB1抗原的检测线T和含有羊抗鼠的质控线的T线包被液和C线包被液分别用全自动划膜机划在贴在PVC板上硝酸纤维素(NC)膜上，其中PVC板在底部起支撑作用，并且在NC膜的上面在靠近质控线的一端还帖有吸水纸贴。

将已经包被的NC膜放在室温、湿度小于等于30％的洁净生产厂房内晾干，晾干时间不少于15h，将晾干的NC膜放入加干燥剂的铝箔袋内密封保存备用。

2、基于上转发光免疫层析技术标记工艺：

该标记工艺仅为更好的解释本发明，不作为标记材料的制备及使用的限制条件。

表3：黄曲霉毒素B1标记工艺主要原辅料清单：

标记开始前将20％BSA,标记抗体，放置于常温平衡。

颗粒准备：取UCP醛基颗粒50mg，加入1ml去离子水，超声30s，吹吸使UCP颗粒重悬并达到均匀状态，转移至50ml标记瓶内；再加入1ml去离子水，超声10s，吹吸均匀转移至三角瓶；向标记瓶内补加水至总体积为10ml；摇晃混匀后超声120秒。

标记工艺：在超声的状态下，取AFB1抗体50μl迅速加到标记瓶中，混匀10分钟。

封闭工艺：标记搅拌时间结束后，在标记瓶中加入50μl 20％BSA进行封闭，封闭5分钟。

离心：封闭结束后，4℃离心，以12000rpm转速离心30min，弃掉上清液，保留沉淀。

标记工作垫制备：取1.0ml结合物保存液，加入上述沉淀中，使UCP颗粒重悬，得到浓缩的UCP–AFB1结合物，加入50ml结合物冻干液，混匀，然后按照80-120μl/cm²均匀涂布在20cm×29cm大小的玻璃纤维上，放入冻干机内，参照冻干机使用操作规程抽真空冻干，冻干时间不少于10小时。抽真空结束后，将结合物垫从冻干机中取出，立即放入装有干燥剂的自封袋中，再套一层铝箔袋，密封保存备用。

3、基于上转发光免疫层析技术的真菌毒素含量快速检测试剂的制备

将标记工作垫在洁净生产厂房内裁切成0.5-1cm宽，小心的黏贴在已经包被的NC膜上，黏贴位置在吸水纸的对应一端，制备成检测大板，放入装有干燥剂的铝箔袋，密封保存备用。

将检测大板按照卡壳的规格裁切成0.3-0.6cm的宽度，装入相应的卡壳内，扣好卡壳，将卡壳放入装有干燥剂的铝箔袋，密封保存，即完成黄曲霉毒素B1快速检测试剂的制备。

将黄曲霉毒素B1快速检测试剂与黄曲霉毒素B1参数卡组装成成品，即得黄曲霉毒素B1多参数定量检测试剂盒(上转发光法)，试剂盒主要组分为：黄曲霉毒素B1检测卡(40T)、说明书1份、黄曲霉毒素B1样品稀释液(40mL/瓶，共1瓶)、黄曲霉毒素B1参数卡(3个，参数卡1、2、3)。

实施案例3：

本发明提供了一种食品安全领域的多参数法准确测定真菌毒素含量的快速检测试剂的使用方法，为更好的及解释本发明，本实施案例中提供了一种食品安全领域的多参数法准确测定黄曲霉毒素B1含量的快速检测试剂的使用方法，该使用方法主要用于不同样品中黄曲霉毒素B1的准确含量的测定，检测样品包括：麸皮、膨化玉米、豆粕、棉粕、花生粕、玉米胚芽粕、菜籽粕、配合料、浓缩料、玉米及其副产物、谷物、面粉、其他食品原料等。

以下黄曲霉毒素B1含量的快速检测试剂的使用方法主要用于更好的解释本发明的使用及应用，不作为本发明应用的限制条件。

主要检测步骤如下：

1、样本前处理：

取具有代表性的样品，使用研磨机研磨，使至少75％的研磨样品能够通过20目筛网，彻底混合并对样品二次取样。

准确称取3.0g研磨样品于50mL的离心管中，加入15mL样品提取液，用涡旋仪或者摇床充分震荡5min。

震荡结束后，移取1.0mL-1.5mL的提取液至干净的离心管中，4000rpm离心2min，取100μL上清液，加入到300μL样品稀释液中，混匀备用，(如果混合后液体呈浑浊状态，可以重复离心，以4000rpm离心2min后，取上清液进行检测)。

2、检测步骤

将上转发光免疫分析仪开机，预热15min，根据样本类型，***本批次产品对应的且与样本类型一致的参数卡进行校参。

打开检测卡的铝箔袋包装，水平放置。

用移液器吸取100μL经过前处理的待测样品加入检测卡的加样孔中，开始计时15min。

15min后，点击“手动测量”进入“输入ID界面”，点击“确定”后依照界面信息扫描测试卡底部条形码，扫描成功后将测试卡***上转发光免疫分析仪进行测量。

定量检测结果显示在仪器屏幕上，同时可按打印键获得纸质检测报告。

实施案例4：

本发明提供了一种食品安全领域的多参数法准确测定真菌毒素含量的快速检测试剂的使用方法，为更好的及解释本发明，本实施案例中提供了一种食品安全领域的多参数法准确测定黄曲霉毒素B1含量的快速检测试剂的检测结果及性能指标，该检测结果及性能指标主要用于不同样品中黄曲霉毒素B1的准确含量的测定，检测样品包括：麸皮、膨化玉米、豆粕、棉粕、花生粕、玉米胚芽粕、菜籽粕、配合料、浓缩料、玉米及其副产物、谷物、面粉、其他等。

以下黄曲霉毒素B1含量的快速检测试剂的检测结果及性能指标主要用于更好的解释本发明的使用及应用，不作为本发明应用的限制条件。

主要性能指标如表4：

表4：黄曲霉毒素B1多参数定量检测试剂盒(上转发光法)产品性能指标

上述实施案例描述了本发明的优选实施案例，如前所述，应当理解为对本发明的解释，而非局限于本发明实施案例披露的形式，不应看做是对其他实施例的排除，而可以用于各种其他形式的组合、修改，并能够在本发明的构思范围内改动。本领域人员所进行的改动和变化在本发明构思及范围内的，都应在本发明所附权利要求保护范围内。

Claims (7)

1.一种用于食品安全领域的定量测定不同类型样品中真菌毒素含量的固相免疫层析分析法的检测试剂盒，所述试剂盒包括参数卡和固相免疫层析分析法的真菌毒素检测试剂。

2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其中所述参数卡内包含有不同的样品类型的数据信息，用于真菌毒素定量测定时自动计算不同样品类型中的真菌毒素的含量。

3.如权利要求1所述的检测试剂盒，其中所述固相免疫层析分析法的真菌毒素检测试剂基于免疫层析原理制备而成，其具体包括卡壳、背板、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜、吸水纸；其中所述硝酸纤维素膜经真菌毒素抗原及对应抗体包被，所述玻璃纤维膜分布由经真菌毒素对应抗体标记的示踪颗粒。

4.如权利要求1或2所述的检测试剂盒，其中所述参数卡通过适配荧光免疫分析仪直接独立使用，在真菌毒素定量测定时自动计算不同样品类型中的真菌毒素的含量。

5.如权利要求1或2所述的检测试剂盒，其中所述不同样品类型选自麸皮、膨化玉米、豆粕、棉粕、花生粕、玉米胚芽粕、菜籽粕、配合料、浓缩料、玉米及其副产物、谷物、面粉中的至少一种。

6.如权利要求1所述的检测试剂盒，所述真菌毒素包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮及其衍生物类毒素、呕吐毒素和伏马毒素中的至少一种。

7.如权利要求1-3任一项中所述的检测试剂盒，其中所述固相免疫层析分析法包括上转发光免疫层析法、荧光免疫层析法、胶体金免疫层析法和乳胶免疫层析法中的至少一种。