CN106434994A - 一种快速检测绵羊肺炎支原体的方法 - Google Patents

一种快速检测绵羊肺炎支原体的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106434994A
CN106434994A CN201611082202.0A CN201611082202A CN106434994A CN 106434994 A CN106434994 A CN 106434994A CN 201611082202 A CN201611082202 A CN 201611082202A CN 106434994 A CN106434994 A CN 106434994A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lamp
reaction
primer
sheep
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201611082202.0A
Other languages
English (en)
Inventor
乔军
孟庆玲
田路路
卢海亭
乔梦凡
贡莎莎
陈诚
李重阳
孟丹
于伟伟
陈创夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shihezi University
Original Assignee
Shihezi University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shihezi University filed Critical Shihezi University
Priority to CN201611082202.0A priority Critical patent/CN106434994A/zh
Publication of CN106434994A publication Critical patent/CN106434994A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种快速检测绵羊肺炎支原体的方法，根据所检测绵羊肺炎支原体的基因序列设计LAMP引物；确立LAMP可视化方法的反应体系，并对LAMP反应条件进行优化；采集涂擦绵羊鼻腔分泌物，制取DNA模板溶液，用最优反应体系和反应条件进行检测。本发明针对现有方法检测绵羊肺炎支原体需要专业仪器和实验室等缺点，限制了这些诊断方法在临床上的推广使用，建立可视化LAMP快速检测方法来检测MO，具有很高的特异性和敏感性，为绵羊MO感染的临床诊断提供了一个快速、简便、准确的检测方法。

Description

一种快速检测绵羊肺炎支原体的方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种采用可视化方式进行快速检测绵羊肺炎支原体的方法。
背景技术
绵羊支原体肺炎又被称为绵羊传染性胸膜肺炎是由绵羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumoniae，MO)引起绵羊和山羊患间质性、非典型性肺炎、化脓性肺炎。
自从Mackay等1963年在绵羊上首次报道以来，绵羊支原体肺炎已在世界范围内广泛流行。MO不仅感染绵羊和山羊，同时也会造成其他反刍动物(如大角羊)的感染。近年来，在我国新疆、甘肃、内蒙古、青海、陕西、宁夏、辽宁、江苏、四川、云南等多个养羊业发达的省区均有绵羊支原体肺炎的发生和流行的报道，该病严重影响着养羊业的健康发展，危害日趋加重，给我国养羊业造成巨大的经济损失。
MO属于柔膜体纲，支原体目，支原体科，支原体属的一种。MO是一种缺乏细胞壁、呈高度多形性、能通过滤菌器的最小原核细胞型微生物。由于其基因组较小，生物合成及代谢能力有限，细胞需要的很多营养物质需要从外界摄取，因此对该病原的分离培养条件要求较高。
目前有关MO的诊断方法主要集中在病原的分离鉴定、血清学检测、分子生物学检测等方面。
然而，由于MO的培养比较困难并且生长速度缓慢，通过细菌学方法从病料中分离比较困难。目前，常用的血清学检测主要包括：补体结合试验(CFT)、生长或代谢抑制试验、间接血细胞凝集试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和斑点免疫渗滤试验等。
CFT采用的是糖脂抗原，与动物组织可能出现交叉反应，给鉴别诊断带来困难，且操作繁琐在临床诊断中很少应用；生长或代谢抑制试验虽然特异性强、敏感性高、适用于制备支原体抗血清时进行效价测定以及支原体的血清学分析，但该方法不能区分IgM和IgG的抗体类型。
IHA可检测MO抗体，但敏感性和特异性均不高。间接ELISA的特异性、敏感性、稳定性和重复性较高，但只能检测MO抗体，不能直接检测病原。
PCR方法敏感、快速但依赖于昂贵复杂的精密仪器，难以在条件较差的基层推广普及使用。
除此之外，上述检测方式普遍需要专业仪器和实验室，限制了这些诊断方法在临床上的推广使用。因此，本领域迫切需要研发可以推广应用的具有较高敏感性和特异性的检测绵羊肺炎支原体方法。
发明内容
本发明主要目的是提供一种釆用环介导等温扩增(LAMP)技术建立的MO感染的可视化快速检测方法。
本发明所述的快速检测绵羊肺炎支原体的方法，是通过以下过程实现的：
A、根据所检测绵羊肺炎支原体的基因序列设计LAMP引物；
B、确立LAMP可视化方法的反应体系，并对LAMP反应条件进行优化；
C、采集涂擦绵羊鼻腔分泌物，将采集到的绵羊鼻腔分泌物，制取DNA模板溶液，用步骤B所得反应体系和反应条件进行检测。
步骤A所设计的LAMP引物包括一对内引物与一对外引物，扩增目的基因片段长度为188bp。
上述LAMP引物的序列分别为：
内引物：FIP——CCTACCAACTAACTAAAAAATGGGGGTGC
BIP——GATTGAGATACGGCCCGTAGGAG TCTGG
外引物：F3——AAGGAGCCTTTAAAGCTC
B3——GCAGCAGTAAGGAATAT
上述步骤B确立LAMP可视化方法的反应体系具体操作为：以每20-30μL LAMP反应体系为份，内引物(FIP、BIP)各1-1.5μmol/L，外引物(F3、B3)各0.1-0.3μmol/L，dNTP 1.0-1.5mmoI/L 2.5μL，MgSO4 7-10mmol/L，Betaine 0.7-1mol/L 1-3μL，l0×Bst DNA聚合酶缓冲液，8U的Bst DNA聚合酶0.8-1.2μL，煮沸后的MO菌液1-3μL，用纯水补足至25-30μL，反应条件：在55-65℃的反应温度，间隔1-2℃递增，各温度均反应0.5-1.5h，最后75-85℃作用3-8min终止反应。
进一步地，上述步骤B所述优化后LAMP反应条件为：反应温度60-65℃，Mg2+浓度为7-9mmol/L、dNTP浓度为1.0-1.5mmol/L、甜菜碱Betaine浓度0.6-1mol/L，内外引物浓度比为5-7:1，反应时间为30-90min。
进一步地，所述步骤C的具体操作为：用灭菌棉拭子涂擦绵羊鼻腔分泌物，置于灭菌的离心管中，共采集至少5个养羊场绵羊鼻拭子样品共60份以上，低温运送至实验室进行检测，含有灭菌棉拭子的离心管中加入1ml灭菌的生理盐水，充分振荡混合，取处理后的液体置于容器中，10000-14000r/min离心1-3min，灭菌蒸馏水洗涤两次以上，最后用200-400μL TE缓冲液悬浮，隔水煮沸10-20min，7000-10000r/min离心10-20min，取上清，即DNA模板溶液，用所建立的MO可视化LAMP反应对临床样品进行检测，统计检测方法的检测结果。
本发明通过釆用环介导等温扩增(LAMP)技术可视化快速检测MO核酸。针对MO的髙保守特异性序列16S rDNA，设计4条LAMP引物，对Mg2+浓度、反应温度、dNTP浓度等多种反应条件进行优化后，确立了LAMP可视化方法的反应体系。利用本发明所设计的LAMP引物，分别对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特菌、表皮葡萄球菌、沙门氏菌等多种致病菌和临床样本的检测，证实所建立的MO LAMP可视化检测方法具有很高的特异性和敏感性，为绵羊MO感染的临床诊断提供了一个快速、简便、准确的检测方法。
附图说明
图1是本发明实施例LAMP可视化检测结果示意图；
其中分别对应的DNA片段为：1、金黄色葡萄球菌；2,4、绵羊肺炎支原体；3、大肠杆菌；5、沙门氏菌。
图2是本发明实施例LAMP特异性试验结果示意图；
其中分别对应的DNA片段为：1、金黄色葡萄球菌；2、大肠杆菌；3、枯草芽孢杆菌；4、单核细胞增生李斯特菌；5、表皮葡萄球菌；6、沙门氏菌；7、绵羊肺炎支原体。
图3是本发明实施例LAMP敏感性试验结果示意图；
其中：M表示蛋白分子量标准
1、表示菌液稀释倍数10-1；2、表示菌液稀释倍数10-2；3、表示菌液稀释倍数10-3；4、表示菌液稀释倍数10-4；5、表示菌液稀释倍数10-5；6、表示菌液稀释倍数10-6；7、表示菌液稀释倍数10-7；8、表示菌液稀释倍数10-8；
具体实施方式
本实施例以新疆维吾尔自治区牧场绵羊为标本，无菌培养并收集绵羊Eg头节，其他原材料通过购买试剂盒等所得。
1、LAMP引物的设计
根据MO 16S rDNA序列，运用DNAMAN软件进行序列比对，筛选出MO高度保守的序列作为扩增的靶序列。
按照LAMP技术的引物设计原理及反应原理，在Primer ExplorerV4软件***设计产生的多对引物对，并筛选出合适的引物对进行引物合成。本研究所设计的引物对包括一对内引物(FIP-BIP)与一对外引物(F3-B3)，扩增目的基因片段长度为188bp，引物名称及序列见表1。
表1 LAMP特异性引物名称及序列
3LAMP及PCR反应体系
本实验所建立的25μL LAMP反应体系中，内引物(FIP、BIP)各1.2μmol/L，外引物(F3、B3)各0.2μmol/L，dNTP 1.2mmoI/L 2.5μL，MgSO4 8mmol/L，Betaine 0.8mol/L2μL，l0×Bst DNA聚合酶缓冲液，8U的Bst DNA聚合酶1μL，煮沸后的MO菌液2μL，用超纯水补足至25μL。反应条件：在55-65℃的反应温度，间隔1℃递增，各温度均反应1h，最后80℃作用5min终止反应PCR反应是所建立的LAMP反的灵敏度及方法对比参照。PCR反应所扩增靶基因为MO16S rDNA，扩增上游引物F：5’-ATGGTAGTTAAAGTTGGTATTAACG-3’，下游引物R：5’-TTATTTAGCGATTTTTGCAAAGTAC-3’，产物大小在320bp左右。PCR反应体系共25μL，包括上下游引物各5mmol/L，2×Taq MasterMix，2μL模板DNA，超纯水补足至25μL。反应条件：95℃预变性5min，94℃变性60s，58℃退火60s，72℃延伸35s，35个循环，72℃延伸10min。10℃保存。
4LAMP反应的操作程序
配制好的LAMP反应液在63℃的恒温水浴锅内反应60min，随后在80℃的水浴锅中灭活5min终止反应。反应完成后，肉眼观察反应管内液体的独度变化，并通过高速离心后观察管底有无白色焦憐酸盐沉淀，也可判断是否发生扩增反应。同吋，扩增产物与6×loadingbuffer混匀后进行2％琼脂糖凝胶电泳，70V电压50min后使用紫外凝胶成像***获得电泳结果，根据有无梯形条带及条带的亮度，可了解LAMP反应的扩增效率。
5LAMP反应体系的条件优化
在常规LAMP反应体系和反应条件的基础上，针对扩增不同引物及n的基闲的LAMP扩增反应，对反应温度，Mg2+、dNTP、Betaine浓度，内外引物浓度比及反应时间等主要反应条件进行优化，获得最佳反应体系。
5.1最佳Mg2+浓度的选择
调整MgSO4的加入Mg2+，使反应体系中的Mg2+浓度分别为1.0mmo 1/L，2.0mmol/L、4.0mmol/L、6.0mmoI/L、8.0mmol/L、10.0mmol/L、12.0mmol/L(阴性对照组的Mg2+浓度为8.0mmol/L)，根据扩增产物的电泳结果，筛选出最佳Mg2+浓度。
5.2最佳反应温度的蹄选
将温度依次设计为55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃(阳性对照管的反度为64℃)进行扩增，选择扩增效率最高的温度为实验的最佳反应温度。试验证实，在63℃所产生的梯形条带最为明显、亮度最大，引物二聚体最少，因此此选择63℃作为本试验所建立的LAMP反应的最优反应温度。
5.3最佳dNTP浓度的筛选
调整LAMP体系中dNTP的加入量，使体系中dNTP浓度依次为0.4mmol/L、0.6mmoI/L、0.8mmoI/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L，1.6mmol/L、1.8mmol/L和2.0mmol/L(阴性对照管的dNTP浓度为1.4mmol/L)进行扩增，从中选择能够保证扩增效率最高的dNTP的最小需耍量。经试验验证，1.2mmol/L为所建立LAMP反应的dNTP最优反应浓度。
5.4内外引物浓度比筛选
保持外引物F3/B3的浓度不变，终浓度始终为0.2μmol/L，以此为实验站础进行内引物FIP/BIP浓度的调整。调整LAMP体系中内引物FIP/BIP的添加量，使内引物FIP/BIP与外引物F3/B3的终浓度配比依次为2:1、4:1、6:1、8:1、10:1、12:1(阴性对照管中的内外引物浓度比为8:1)，选择扩地效果域高的内外引物配比浓度。经试验证实，所建立LAMP反应的最佳内外引物浓度比定为6:1。
5.5甜菜碱Betaine浓度对LAMP反应的影响
在反应体系中Betaine浓度梯度依次设置为0.0mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6moI/L、0.8mol/L、1.0mol/L(阳性对照管中Betaine浓度为0.8mol/L)，从中优化出域合适的甜菜碱Betaine的工作浓度。经试验证实，0.8mol/L的甜菜碱Betaine为最优反应浓度。
5.6反应时间对LAMP反应的影响
将扩增反应反应吋问依次设定为：10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min(阳性对照的反应吋问为60min)，判断完成LAMP反应的最短吋问。经试验证实，最适反应时间为60min。
6LAMP扩增产物的分析
6.1LAMP扩增产物的眼观结果分析
LAMP扩增反应完成后，在每管反应液中分别加入100×SYBR Green I 1μL，在可见光下直接用肉眼观察，根据反应管内液体的颜色变化来判断反应结果。若反应液变成绿色则为结果阳性，反应液变成棕色为结果阴性。用便携式紫外灯照射，若反应管有荧光则判为阳性结果，否则为阴性(图1)。
6.2LAMP扩增产物的凝胶成像分析
在LAMP反应体系的条件优化阶段，为准确比对不同条件下LAMP反应的扩增效率，需耍对LAMP扩增产物进行凝胶电泳。电泳吋，取2LAMP扩增产物与6X loading buffer按5：1比例均勾泥合后进行2％琼胎糖凝胶电泳，70V电泳50min后使用紫外凝胶成像***照胶分析电泳结果。扩增反应产物经琼脂糖电泳，均出现了预期的阶梯式条带。
7LAMP特异性试验
对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，单核细胞增生李斯特菌、表皮葡萄球茼、沙门氏菌进行基因组DNA提取，以提取DNA为模板，按照上述最佳反应条件，配制25μL可视化LAMP检测体系反应液，进行LAMP方法的特异性检测。结果金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌、表皮葡萄球茼、沙门氏菌扩增结果均为阴性(图2)，证实建立的LAMP方法具有很高的特异性。
8LAMP敏感性试验
将培养至对数生长期的MO，按照可视化LAMP的最佳反应体系及反应条件进行扩增，确定出最低检测极限。结果采用LAMP进行检测时，菌液浓度稀释倍数为10-7的模板仍可以扩增得到阶梯式的条带，根据菌液CCU(菌液变色单位)来计算，建立的检测MO LAMP方法可以检测到10个CCU/ml(图3)。
9临床样本的检测
用灭菌棉拭子涂擦得到绵羊鼻腔分泌物，置于灭菌的10ml离心管中，共采集新疆地区5个养羊场绵羊鼻拭子样品共60份，低温运送至实验室进行检测。在含有灭菌棉拭子的离心管中加入1ml灭菌的生理盐水，充分振荡混合。取处理后的液体，置于Eppendorf中，12000r/min离心2min，
灭菌蒸馏水洗涤两次，最后用300μL TE缓冲液悬浮，隔水煮沸15min，8 000r/min离心15min，取上清，即DNA模板溶液。用所建立的MO可视化LAMP反应、传统分离培养(用KM2培养基)和PCR方法对临床样品进行检测，统计三种检测方法的检测结果，根据公式计算LAMP可视化方法与传统细菌分离培养及PCR法的敏感性、特异性及符合率。结果如表2所示，传统的细菌分离培养阳性样品为20份，阴性为40份；PCR检测阳性样品为22份，阴性为38份；LAMP检测阳性样品为22份阴性为38份。经分析，LAMP检测方法与细菌培养的符合率为90.91％，与PCR检测结果的符合率为100％，表明LAMP可视化检测方法具有高度的敏感性、特异性及符合率。
表2 LAMP对绵羊临床样本的检测结果
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
<110> 石河子大学
<120>细粒棘球蚴多表位融合诊断抗原蛋白、制备方法及其应用
<141>
<160> 3
<210> 1
<211> 155
<212> 氨基酸序列
<213> 细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus.）
<220>
<221> misc_feature
<223> Eg-meAg1蛋白氨基酸序列
<400> 1
MVVKKRWGELRDFFRNDGPGTGNCDQGKAQSANVTGGPGDDGLTSTSRSVMKMFGEVKYFFERDPLGQKVVDL
LEELGPGTQAITAPDLTTPYPSSGPGRDFFRSDPLGQKGPGKFTEKPKREWRGPGLEEEDEDDLKGPGIETPR
AGKKESTVM
<210> 2
<211> 468
<212> 核苷酸序列
<213> Eg-meAg1蛋白基因（密码子未优化）
<220>
<221> misc_feature
<223>Eg-meAg1蛋白基因核苷酸序列
<400> 1
ATGGTGGTAAAAAAAAGATGGGGTGAACTTCGAGACTTCTTTAGAAATGATGGCCCGGGCACTGGCAATTGTG
ATCAAGGAAAAGCACAAAGTGCCAATGTGACAGGAGGCCCGGGCGATGATGGCCTCACCTCGACGTCGAGGAG
TGTGATGAAAATGTTTGGCGAAGTGAAGTACTTCTTCGAACGTGATCCGTTGGGTCAGAAAGTGGTTGACCTC
TTAGAGGAACTGGGCCCGGGCACCCAGGCAATTACTGCTCCAGACCTGACAACCCCATATCCCAGTTCTGGCC
CGGGCCGGGACTTCTTTAGAAGTGATCCACTGGGTCAAAAAGGCCCGGGCAAGTTTACTGAGAAGCCTAAACG
GGAATGGCGCGGCCCGGGCCTGGAAGAAGAAGATGAGGATGATTTAAAGGGCCCGGGCATTGAGACACCGCGC
GCTGGCAAGAAGGAAAGCACTGTAATGTAA
<210> 3
<211> 468
<212>核苷酸序列
<213> Eg-meAg1蛋白基因（密码子优化后）
<220>
<221> misc_feature
<223> Eg-meAg1蛋白基因核苷酸序列
<400> 1
ATGGTGGTAAAAAAACGTTGGGGTGAACTTCGTGACTTCTTTCGTAATGATGGCCCGGGCACTGGCAATTGTG
ATCAAGGAAAAGCACAAAGTGCCAATGTGACAGGAGGCCCGGGCGATGATGGCCTCACCTCGACGTCGCGTAG
TGTGATGAAAATGTTTGGCGAAGTGAAGTACTTCTTCGAACGTGATCCGTTGGGTCAGAAAGTGGTTGACCTC
TTAGAGGAACTGGGCCCGGGCACCCAGGCAATTACTGCTCCAGACCTGACAACCCCATATCCGAGTTCTGGCC
CGGGCCGGGACTTCTTTCGTAGTGATCCACTGGGTCAAAAAGGCCCGGGCAAGTTTACTGAGAAGCCTAAACG
GGAATGGCGCGGCCCGGGCCTGGAAGAAGAAGATGAGGATGATTTAAAGGGCCCGGGCATTGAGACACCGCGC
GCTGGCAAGAAGGAAAGCACTGTAATGTAA

Claims (6)

1.一种快速检测绵羊肺炎支原体的方法，其特征在于，是通过以下过程实现的：
A、根据所检测绵羊肺炎支原体的基因序列设计LAMP引物；
B、确立LAMP可视化方法的反应体系，并对LAMP反应条件进行优化；
C、将采集到的绵羊鼻腔分泌物，制取DNA模板溶液，用步骤B所得反应体系和反应条件进行检测。
2.如权利要求1所述的快速检测绵羊肺炎支原体的方法，其特征在于，步骤A所设计的LAMP引物包括一对内引物与一对外引物，扩增目的基因片段长度为188bp。
3.一种如权利要求2所述的快速检测绵羊肺炎支原体的方法，其特征在于，所述LAMP引物的序列分别为：
内引物：FIP——CCTACCAACTAACTAAAAAATGGGGGTGC
BIP——GATTGAGATACGGCCCGTAGGAG TCTGG
外引物：F3——AAGGAGCCTTTAAAGCTC
B3——GCAGCAGTAAGGAATAT 。
4.如权利要求1～3任一项所述的快速检测绵羊肺炎支原体的方法，其特征在于，步骤B确立LAMP可视化方法的反应体系具体操作为：以每20-30μL LAMP反应体系为份，内引物(FIP、BIP)各1-1.5μmol/L，外引物(F3、B3)各0.1-0.3μmol/L，dNTP1.0-1.5mmoI/L 2.5μL，MgSO4 7-10mmol/L，Betaine 0.7-1mol/L 1-3μL，l0×Bst DNA聚合酶缓冲液，8U的Bst DNA聚合酶0.8-1.2μL，煮沸后的MO菌液1-3μL，用纯水补足至25-30μL，反应条件：在55-65℃的反应温度，间隔1-2℃递增，各温度均反应0.5-1.5h，最后75-85℃作用3-8min终止反应。
5.如权利要求4所述的快速检测绵羊肺炎支原体的方法，其特征在于，步骤B所述优化后LAMP反应条件为：反应温度60-65℃，Mg2+浓度为7-9mmol/L、dNTP浓度为1.0-1.5mmol/L、甜菜碱Betaine浓度0.6-1mol/L，内外引物浓度比为5-7:1，反应时间为30-90min。
6.如权利要求1～5任一项所所述的快速检测绵羊肺炎支原体的方法，其特征在于，所述步骤C的具体操作为：用灭菌棉拭子涂擦绵羊鼻腔分泌物，置于灭菌的离心管中，共采集至少5个养羊场绵羊鼻拭子样品共60份以上，低温运送至实验室进行检测，含有灭菌棉拭子的离心管中加入1ml灭菌的生理盐水，充分振荡混合，取处理后的液体置于容器中，10000-14000r/min离心1-3min，灭菌蒸馏水洗涤两次以上，最后用200-400μL TE缓冲液悬浮，隔水煮沸10-20min，7000-10000r/min离心10-20min，取上清，即DNA模板溶液，用所建立的MO可视化LAMP反应对临床样品进行检测，统计检测方法的检测结果。
CN201611082202.0A 2016-11-30 2016-11-30 一种快速检测绵羊肺炎支原体的方法 Pending CN106434994A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611082202.0A CN106434994A (zh) 2016-11-30 2016-11-30 一种快速检测绵羊肺炎支原体的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611082202.0A CN106434994A (zh) 2016-11-30 2016-11-30 一种快速检测绵羊肺炎支原体的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106434994A true CN106434994A (zh) 2017-02-22

Family

ID=58223774

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611082202.0A Pending CN106434994A (zh) 2016-11-30 2016-11-30 一种快速检测绵羊肺炎支原体的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106434994A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107142331A (zh) * 2017-07-14 2017-09-08 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种用于检测绵羊肺炎支原体的引物和探针
CN109666752A (zh) * 2019-02-02 2019-04-23 广西壮族自治区兽医研究所 一种检测绵羊肺炎支原体的实时定量lamp引物组及试剂盒
CN111118183A (zh) * 2020-01-19 2020-05-08 石家庄海关技术中心 检测绵羊肺炎支原体的实时荧光raa引物和探针、试剂盒及其使用方法
CN112760392A (zh) * 2020-11-17 2021-05-07 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测绵羊肺炎支原体的特异性pcr引物及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102634602A (zh) * 2012-05-10 2012-08-15 贵州大学 绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒及制备、使用方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102634602A (zh) * 2012-05-10 2012-08-15 贵州大学 绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒及制备、使用方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张双翔: "绵羊肺炎支原体LAMP检测方法的建立及初步应用", 《中国兽医学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107142331A (zh) * 2017-07-14 2017-09-08 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种用于检测绵羊肺炎支原体的引物和探针
CN109666752A (zh) * 2019-02-02 2019-04-23 广西壮族自治区兽医研究所 一种检测绵羊肺炎支原体的实时定量lamp引物组及试剂盒
CN111118183A (zh) * 2020-01-19 2020-05-08 石家庄海关技术中心 检测绵羊肺炎支原体的实时荧光raa引物和探针、试剂盒及其使用方法
CN112760392A (zh) * 2020-11-17 2021-05-07 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测绵羊肺炎支原体的特异性pcr引物及应用
CN112760392B (zh) * 2020-11-17 2021-08-27 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测绵羊肺炎支原体的特异性pcr引物及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100580091C (zh) 人与动物共患结核病荧光pcr快速诊断试剂盒
CN106434994A (zh) 一种快速检测绵羊肺炎支原体的方法
CN101144775B (zh) 细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒
CN103045761B (zh) 用于检测感染性眼病致病微生物的试剂盒及检测方法
Sharawi et al. Isolation, Serological and Real time PCR diagnosis of Peste Des Petites Ruminants virus in naturally exposed Arabian Gazelle in Saudi Arabia.
CN104928260B (zh) 一种牛传染性鼻气管炎病毒ibrv-jn03分离株及其应用
WO2023045426A1 (zh) 柯萨奇病毒a16型毒株及其免疫原性组合物和应用
CN102094080A (zh) 一种同时检测三类镰刀菌毒素的快速分子检测方法与应用
CN112176080B (zh) 特异性检测剑麻紫色卷叶病植原体的巢式pcr引物组、试剂盒及检测方法
CN106434935A (zh) 鉴定猪多杀性巴氏杆菌和/或副猪嗜血杆菌组合物和方法
CN104946753A (zh) 用于牛支原体检测的特异性引物对、检测试剂盒及其使用方法和应用
CN104004842A (zh) 一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重pcr引物组及检测方法
CN101974633B (zh) 一种定量检测微囊藻的方法及其专用标准品
CN103789442B (zh) 一种实时fret-pcr和巢式pcr检测和分型立克次氏体的引物、探针及试剂盒
CN111690551A (zh) 一种用于布鲁氏菌的分离纯化培养与鉴定方法
CN109811073A (zh) 双重pcr早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用
CN110195096A (zh) 一种用于检测血流感染致病菌的样本处理方法
CN104313163B (zh) 一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型、3型和6型三重pcr检测方法、试剂盒及其应用
CN1952174A (zh) 特异检测牛疱疹病毒ⅰ型的lux荧光引物和核酸扩增方法
CN104032000B (zh) 一种蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒
CN101736088A (zh) 一种鸭感染里默氏杆菌病和大肠杆菌病的快速鉴别诊断方法
CN101353699A (zh) 空肠弯曲杆菌的聚合酶链反应检测方法
CN111304342A (zh) 一种鉴别布鲁氏菌猪种s2疫苗株与其他种属野毒株的pcr试剂盒及其使用方法
CN201107259Y (zh) 细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒
CN104388575B (zh) 一种多重pcr鉴别分枝杆菌病原核酸的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170222