CN106434678A - 一个青春型精神***症关联基因 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一个与青春型精神***症的发生密切相关的关联基因，即位于11q23的DRD2基因，由于该基因的单核苷酸多态性rs1800497碱基C突变为T，从而与青春型精神***症的易感性相关联，rs1800497碱基为T的个体为青春型精神***症的易感人群，rs1800497碱基为C的个体为不易发生青春型精神***的人群，DRD2基因及其编码的蛋白对阐明青春型精神***症遗传学机制及建立基因诊断方法，指导青春型精神***症诊断、预防、开发新型治疗药物有重要指导意义。

Description

一个青春型精神***症关联基因
技术领域
本发明涉及一个与精神***症有显著关联的易感基因，具体涉及到一个与青春型精神***症显著关联的易感基因。
背景技术
精神***症(schizophrenia)是一种慢性、严重性、致残性脑病，严重危害人体健康。是精神类疾病中最严重的一种精神疾病，2009年根据柳叶刀调查显示，我国的精神***症患者人数近1000万。精神***症需要终身治疗，治疗成本高昂，据统计，美国2002年精神***症的治疗总成本达627亿美元，其中直接成本227亿美元，因***而早夭和家属因照顾患者而导致的损失等为324亿美元，且精神***症具有高致残性，大多数精神***症患者会终身残留某些症状，需要终身治疗，由于精神***症的严重性和慢性化，对患者、家庭及社会影响很大，消耗大量公共资源，因此精神***症已经给社会和家庭带来严重的负担。
精神***症在男性、女性中的发病率几乎相同，但男性发生较早，发生在***晚期和成年早期，约在15-25岁起病，而此阶段正是构筑人生道路的关键时期，女性主要在20-35岁起病。患者有幻觉、妄想、自发运动增多等阳性症状，有情感冷漠、言语减退、社交退缩等阴性症状，同时有认知功能缺损，抑郁，社会职业功能损害等认知损伤等症状。
根据精神***症不同临床表现、发病形式、临床特点、病程、治疗方案、治疗反应及预后等因素，可以把精神***分为单纯型、偏执型、青春型、紧张型、未分化型及残留型。
青春型精神***症在精神***症患者中，比例约占20％左右；常发病于***，急骤，病程发展较快，症状显著，内容荒谬。其临床表现以兴奋冲动、异常古怪及意向倒错为主，精神症状丰富易变，情感喜怒无常。以阳性症状为主的青春型，早期治疗效果较好。
一个世纪以来，人们对精神***症的生理、生化、影像、药物治疗以及社会家庭、环境等方面观察，对精神疾病的发病机理做出了各种假说和判断，随着科技进步，人们越来越认识到基因缺陷是许多严重精神疾病产生的重要原因，当人们遇到环境压力时，那些携带疾病易感基因的人比不携带易感基因的人更可能患精神卫生疾患，经调查研究，精神***症是遗传度很高的多基因病，主要呈现家族聚集，一旦一个家族成员患病，这个家庭的其他成员携带的易感基因远远高于正常人，需要进行有效的预防与治疗，在科技日益发展的今天如何对待精神***症，如何从遗传角度检测易感基因以及个体的疾病易感性，从而进行进一步风险预测和诊断，药物开发，成为广大科技人员和医疗卫生人员面临的严峻问题，尽管国内外易感基因研究开展多年，但是进展缓慢，只有少数关于鉴定遗传易感基因的报道，但是没有具体针对某种类型的精神***症的检研究，国际上把精神***症分为五种类型，每种类型涉及的易感基因都不一样，不能笼统的用一种或者几种基因把这五种类型都鉴定，这样必然专一性差。而且即使诊断出精神***症，但是不知道是哪种类型的精神***症，对后续的治疗缺乏指导意义。
利用遗传标记对治病基因进行检测，是近几年来发展的技术。遗传标记，即在染色体上有一段特异DNA序列片段，且有多态性，在世世代代传递中，遵循规律为分离、独立分配和连锁规律，因此可获得遗传物质传递信息。遗传标记可以把基因组分为不同区域，通过连锁和关联分析可获得致病基因所在染色体区域，可对该病基因进一步进行克隆。对于各种不同疾病，寻找致病基因和分析是研究的关键之一。
第三代遗传标记—SNP(single nucleotide polymorphism)指基因组中某特定核苷酸的位置上会存在两种或两种以上的不同碱基，在群体中最小等位基因频率≥1％。人类的基因组中多数SNP位点仅存在2种等位基因，所以通常SNP会指在特定位置上，某一核苷酸出现双等位基因的改变。SNP是人类基因组计划走向应用的非常重要方法。主要因为SNP提供一个非常有力的工具，用于高危人群的发现、疾病易感基因的鉴定、药物设计和基础生物学研究等。因为人类大量存在SNP位点，提供了更多的机会发现基因与疾病间的关系。通过SNP发现疾病相关基因的突变要比家系等研究容易。某些SNP并不是致病基因，但它可能与某些相邻的致病基因连锁，也同样为重要标记。
最近全基因组扫描结果提示，11号染色体与青春型精神***症易感性相关联，但至今在该染色体区域内未发现确定特异的与青春型精神***症相关的易感基因。本发明第一次揭示青春型精神***症的关联基因，为青春型精神***症的深入研究和防治，诊断、治疗提供了新的思路。
发明内容
本发明的目的是在11号染色体区域内揭示青春型精神***症的关联基因，从而通过该易感基因遗传特性提出一种判定青春型精神***症易感人群的方法，从而满足本领域对于正确识别青春型精神***症易感基因的需求，以利于指导青春型精神***症的诊断、预防、治疗。
发明人通过研究结果表明，11号染色体DRD2基因位于11q23，Gene ID:1813，序列长度为65.6kb，全称是多巴胺D2受体基因，是青春型精神***症的易感基因，通过对DRD2基因的SNP位点：rs1800497，进行分析，结果显示，rs1800497与青春型精神***症高度相关，rs1800497碱基为T的个体为青春型精神***症的易感人群。
DRD2基因编码多巴胺受体D2亚型，属于G蛋白偶联的受体，抑制了腺苷酸环化酶活性，使得cAMP水平降低，由于DRD2基因调控失调，引起D2受体表达异常，从而使得大脑中某些区域的多巴胺功能紊乱，导致精神青春型精神***症的发生。
DRD2基因在脑内豆状核、尾状核、嗅球、及伏隔核中表达最高，rs1800497碱基为T的个体出现典型症状(幻觉、妄想、思维障碍和精神性失语)的可能性升高，为青春型精神***症的易感人群。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
1、一个青春型精神***症关联基因，是位于11q23单核苷酸多态性rs1800497碱基C突变为T的DRD2基因。
具体的说，本发明是用以下技术方案实现的：
一种检测青春型精神***症的DRD2易感基因rs1800497的核苷酸序列，为序列表SEQ ID No.3所示核苷酸序列。该核苷酸序列位于GNB1L基因，其变异位点，以字母“R"表示，
所述的单核苷酸多态性位点rs1800497的基因型为C时，受试者的易感性最低，携带T等位基因时候，受试者的易感性升高。
其研究过程包括如下步骤：
1、通过查阅文献、利用计算机互联网及生物信息学获取各方面精神***症候选基因研究，在11号染色体通过连锁不平衡分析方法进行单个核苷酸多态性(SNP)连锁不平衡分析，通过NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapviewer)数据库，获得DRD2基因，并通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP，http://snp.cshl.org/数据库，搜索出符合其条件的候选基因SNPs。
2、然后本研究以320例青春型精神***症和380例健康对照为研究对象。所有研究对象均为中国汉族人，并且精神***症患者要符合ICD-10和CCMD-II-R的诊断标准。
3、在征得受试者知情同意的情况下，采集外周静脉血，采用Promega(USA)液体纯化提取DNA试剂盒，提取基因组DNA。通过测OD260、OD280的值，再通过公式计算DNA的纯度和含量。DNA纯度＝OD260/OD280。
4、依据相应的碱基序列合成引物，设计引物：
ACGTTGGATGTGTGCAGCTCACTCCATCCT(SEQ ID No.1)
ACGTTGGATGCAACACAGCCATCCTCAAAG(SEQ ID No.2)
5、PCR扩增目的片段
应用以上引物进行PCR扩增，PCR反应体系为20ul，其中含10mM Tris-HCl(PH8.4)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，200uM dNTP，上下游引物各0.4uM，Taq聚合酶1U，DNA模板30-50ng，PCR扩增条件为：1、94℃5min，2、96℃45s，60℃60s，72℃60s 3个循环，3、95℃45s，59℃65s，72℃60s 5个循环，4、94℃45s，57℃60s，72℃60s，32个循环，5、72℃10min，取PCR产物5ul用1.5％琼脂糖凝胶电泳，以DNAmarker为分子量标准品，扩增。
6、限制性内切酶酶切鉴定基因型
酶切反应体系为20ul，其中10ulPCR产物，限制性内切酶TaqI 0.5ul，酶切缓冲液2ul，置37℃度温箱4小时，经3％琼脂糖凝胶电泳，根据酶切图谱判定基因型。
7、结果判定
rs1800497碱基为(T)的个体为精神***症易感人群。
进一步的，在上述方法中，从待测样品中得到的核苷酸序列的方法还包括荧光定量PCR、变性高效液相色谱、限制性片段长度多态性或连接酶检测、基因测序。
由于基因多态性，导致限制性内切酶酶切位点改变、消失或产生新的位点，若用某中限制性内切酶酶切基因组DNA，则酶切后产生与正常基因组不同长度的DNA片段，经用酶切检测，可检测到这些条带位置和大小。聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)方法原理为：在设计PCR扩增实验时，引物位于基因多态性部位的两侧，将目的基因扩增，使其易于检测，由于多态性引起已有的限制性内切酶位点改变，则可先用相应的限制性内切酶切扩增产物，再进行琼脂糖凝胶电泳观察，根据产物片度大小和数量，与正常对照做出对比。
本发明通过上述实验，建立Pedigree基因分析数据库，应用拟合优度卡方检验和传递不平衡检验，应用UNPHASED分析软件进行单倍体传递卡方检验，利用GraphPadprism分析数据。
传递不平衡检验显示，SNP与青春型精神***症显著关联(P<0.001).利用PCR-RFLP技术，检测到rs1800497碱基为(T)与青春型精神***症临床症状总分相关(P<0.05)。DAD2的rs1800497(T)与青春型精神***症阳性症状、认知功能、阴性症状相关(P<0.05)。
应用在线遗传统计SHEsis软件计算基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律；分析候选基因SNPs位点与精神***症的关联性；分析基因各个位点之间连锁不平衡程度及单倍型；应用MDR软件分析基因-基因间的交互作用；应用GraphPadprism软件分析候选基因SNPs位点与精神***症临床症状。
本发明通过大样本的统计分析，研究了DRD2基因序列的rs1800497多态性位点在青春型精神***症患者的等位基因频率，并根据基因型在患病子女中的传递情况，进行传递不平衡检验和单体型分析，结果发现，全部样本的基因型分布和等位基因频率均符合Hardy-Weinburg平衡，经过Bonferroni矫正，传递不平衡检验分析有显著的统计学差别，通过大样本实验进行了论证。
根据本发明由DRD2基因碱基突变特性判定青春型精神***症的易感人群的方法，可对未表现出临床症状的人群进行如下方法的筛查，rs1800497碱基为C的不易发生青春型精神***症。rs1800497碱基为T的易发生青春型精神***症。对于青春型精神***症易感人群在日常生活中尽量要减少诱发因素，如环境中的刺激；同时青春型精神***症具有发病急，进程快等特点，因此早期诊断后，要及时治疗，有此类病的家庭，千万不要讳疾忌医，致使病情日渐恶化、迁延，造成难以康复的结果。此病以药物治疗为主，辅之以心理治疗。对此病及早进行防治，是本发明的一个重要用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
1、本发明创造性找到青春型精神***症关联基因，精神***症根据不同临床表现、发病形式、临床特点、病程、治疗方案、治疗反应及预后等因素，可以分为单纯型、偏执型、青春型、紧张型、未分化型及残留型。目前的研究只泛泛针对精神***症的易感基因进行检测，但是不同类型的精神***症所涉及的易感基因是不同的，如果不对某种类型的疾病进行特异检测，必然特异性差，检测效果不好。
2、青春型精神***症在精神***症患者中，比例约占20％左右；常发病于***，急骤，病程发展较快，症状显著，内容荒谬，对青春型精神***症患者的早期检测尤为重要，早期检测，早期治疗可以有效抑制病程进展，治疗效果好。
3、本发明的试剂盒操作简单，属于本领域人员能轻松实现的操作，能轻松实现。
具体实施方式
实施例1
1、选择候选基因和SNPs
本发明人查阅文献、利用计算机互联网及生物信息学获取各方面精神***症候选基因研究，在11号染色体通过连锁不平衡分析方法进行单个核苷酸多态性(SNP)连锁不平衡分析，通过NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapviewer)数据库，获得DRD2基因，并通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP，http://snp.cshl.org/数据库，搜索出符合其条件的候选基因SNPs。其入选标准：1、已有相关文献进行报道；
2、位点最小等位基因频率应大于10％；3、所选SNPs必须能够符合引物设计软件的要求；4、所选位点不能影响基因分型实验
2、材料与方法
2.1研究对象
本发明以320例青春型精神***症和380例健康对照(身体健康，无躯体疾病，无家族遗传性疾病史，无精神疾病史，无药物滥用)为研究对象。所有研究对象均为中国汉族人，并且自愿签订伦理委员会批准的知情同意书。
2.2青春型精神***症的入组和排除标准
2.2.1入组标准
(1)符合青春型精神***症诊断标准，PANSS评分≥60分；
(2)年龄15-25岁，病程不超过24个月，未服用过任何抗精神病药物；
(3)自愿参加并签署知情同意书。
2.2.2排除标准
(1)诊断为非青春型精神***症患者；
(2)明确中枢神经***疾病，如中风、帕金森和癫痫等
(3)严重躯体疾病，如感染、糖尿病和高血压等；
2.3诊断标准和量表评定
2.3.1诊断标准
(1)国际疾病***标准第10版：精神***诊断标准(ICD-10)；
(2)《中国精神病分类与诊断标准》(第2版)修订本精神***症标准
(CCMD-2-R)；
(3)所有病例均符合上述两个诊断标准，才能入组。
2.3.2精神病状态量表评定
由2名经过培训的精神科医生同时对病人进行PANSS评分。
PANSS包括阳性症状分量表、阴性症状分量表和一般病理分量表。参与评定量表的2名医生均经过PANSS量表一致性培训。
2.3.3认知功能量
重复性成套神经心理状态测验(RBANS)是一个简明的、由单人操作的测验，目前是国际上常用的认知评定工具，包括12个分测验，可以概括成5组神经心理状态：即刻记忆(immediate memory)、注意(attention)、视觉广度(visuospatial/constructional)、语言(language)和延迟记忆(delayed memory)。由经过培训的检查者操作，完成整个检测一般需要时间20-30分钟，张保华等人已经将RBANS翻译成汉语版，并测试了精神***症患者和正常人组RBANS的信度和效度，结果表明该量表是一个信度、效度较好且简短易行的评定认知功能的量表。
3、血液和临床资料收集
受试者在认真阅读、理解、并自愿签署伦理委员会批准的项目知情同意书后，取外周静脉血5ml，-20度保存至提取基因组DNA。收集精神***症患者年龄、性别、家族史、民族和文化程度、首次入院和确诊时间、临床症状、认知功能等和疾病相关的资料；正常人收集一般人口学资料及认知功能评定量表。
3.1基因组DNA提取
采用专门提取DNA试剂盒，提取外周血的白细胞中全基因组的DNA。操作步骤如下：血液解冻、标记1.5mlEppendorf离心管→细胞裂解液900uL加入离心管中→加入解冻后全血200uL后，混匀，常温下作用20min，并颠倒4-6次→10,000rpm离心时间4min，去除上清，然后振荡，使沉淀物再次悬浮→300uL核裂解液，然后轻轻地振荡，使其混匀，再37℃水浴30min→RNA降解酶1.5μL，振荡混匀，水浴15min，37℃→蛋白沉淀液100uL，轻弹管底，常温作用20min→12,000rpm离心4min，将上清液转移到已加入异丙醇300uL的离心管中，20min轻轻颠倒→12,000rpm离心4min，弃上清，加70％乙醇300uL，轻轻摇匀→12,000rpm离心4min，弃上清，将离心管倾斜倒置，等待凉干→DNA溶解液100uL混匀，水浴1h，65℃(或4℃过夜)，DNA在离心管中已制备完毕。
3.2基因组DNA质量检测
取1-2μL基因组DNA原液，通过琼脂糖电泳方法检测所提取DNA样品是否满足PCR-ALFP和Sequenom的质量标准要求；亮色字体表示该DNA样本符合基因分型技术要求；红色字体(无样本或样本量极少)表示该DNA不符合基因分型技术要求，需要予以重新提取。
3.3基因组DNA含量和纯度的检测
用NanoDrop-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计准确测定每份样本DNA含量和OD比值(A260/A230、A260/A280)。A260/A230比值低：小分子杂质或残存的盐污染，若过高有未知的杂质。比值(A260/A280)低：蛋白或者苯酚有残留所致；比值(A260/A280)比值高：RNA有残留所致；通常A260/A280≈1.8代表样本DNA是纯净的
3.4设计引物
扩增DRD2基因rs1800497多态性的引物分别为：
ACGTTGGATGTGTGCAGCTCACTCCATCCT
ACGTTGGATGCAACACAGCCATCCTCAAAG
3.5PCR扩增目的片段
应用以上引物进行PCR扩增，PCR反应体系为20ul，其中含10mM Tris-HCl(PH8.4)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，200uM dNTP，上下游引物各0.4uM，Taq聚合酶1U，DNA模板30-50ng，PCR扩增条件为：1、94℃5min，2、96℃45s，60℃60s，72℃60s 3个循环，3、95℃45s，59℃65s，72℃60s 5个循环，4、94℃45s，57℃60s，72℃60s，32个循环，5、72℃10min，取PCR产物5ul用1.5％琼脂糖凝胶电泳，以DNAmarker为分子量标准品，扩增。
3.6限制性内切酶酶切鉴定基因型
酶切反应体系为20ul，其中10ulPCR产物，限制性内切酶TaqI 0.5ul，酶切缓冲液2ul，置37℃度温箱4小时，经3％琼脂糖凝胶电泳，根据酶切图谱判定基因型。
酶切接过：rs1800497(C)能被限制性内切酶TaqI切开，rs1800497(T)不能被切开。
4、结果判定
rs1800497碱基为(T)的个体为精神***症易感人群。
该位点共检测320例青春型精神***症患者，380例健康正常对照受试者；rs1800497位点为二态SNP；经酶切检测，在群体中出现不同的基因型结果。采用在线遗传统计SHEsis软件分别分析患者、和健康对照受试者的基因型和等位基因频率，SNPs的基因型频率分布均符合H-W平衡，说明该研究的抽样群体符合H-W平衡。检测rs1800497位点基因型和青春型精神***症患者认知功能的相关性，结果显示与阳性症状、阴性症状、认知有显著差异(P<0.05)。说明该位点为易感基因。
实施例2
1、研究对象
本发明以确诊的50例青春型精神***症和50例健康对照(身体健康，无躯体疾病，无家族遗传性疾病史，无精神疾病史，无药物滥用)为研究对象。所有研究对象均为中国汉族人，并且自愿签订伦理委员会批准的知情同意书。
2、血液和临床资料收集
受试者在认真阅读、理解、并自愿签署伦理委员会批准的项目知情同意书后，取外周静脉血5ml，-20度保存至提取基因组DNA。收集精神***症患者年龄、性别、家族史、民族和文化程度、首次入院和确诊时间、临床症状、认知功能等和疾病相关的资料；正常人收集一般人口学资料及认知功能评定量表。
3、基因组DNA提取
采用专门提取DNA试剂盒，提取外周血的白细胞中全基因组的DNA。操作步骤如下：血液解冻、标记1.5mlEppendorf离心管→细胞裂解液900uL加入离心管中→加入解冻后全血200uL后，混匀，常温下作用20min，并颠倒4-6次→10,000rpm离心时间4min，去除上清，然后振荡，使沉淀物再次悬浮→300uL核裂解液，然后轻轻地振荡，使其混匀，再37℃水浴30min→RNA降解酶1.5μL，振荡混匀，水浴15min，37℃→蛋白沉淀液100uL，轻弹管底，常温作用20min→12,000rpm离心4min，将上清液转移到已加入异丙醇300uL的离心管中，20min轻轻颠倒→12,000rpm离心4min，弃上清，加70％乙醇300uL，轻轻摇匀→12,000rpm离心4min，弃上清，将离心管倾斜倒置，等待凉干→DNA溶解液100uL混匀，水浴1h，65℃(或4℃过夜)，DNA在离心管中已制备完毕。
4、基因组DNA质量检测
取1-2μL基因组DNA原液，通过琼脂糖电泳方法检测所提取DNA样品是否满足PCR-ALFP和Sequenom的质量标准要求；亮色字体表示该DNA样本符合基因分型技术要求；红色字体(无样本或样本量极少)表示该DNA不符合基因分型技术要求，需要予以重新提取。
5、基因组DNA含量和纯度的检测
用NanoDrop-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计准确测定每份样本DNA含量和OD比值(A260/A230、A260/A280)。A260/A230比值低：小分子杂质或残存的盐污染，若过高有未知的杂质。比值(A260/A280)低：蛋白或者苯酚有残留所致；比值(A260/A280)比值高：RNA有残留所致；通常A260/A280≈1.8代表样本DNA是纯净的
6、设计引物
扩增DRD2基因rs1800497多态性的引物分别为：
ACGTTGGATGTGTGCAGCTCACTCCATCCT
ACGTTGGATGCAACACAGCCATCCTCAAAG
7、PCR扩增目的片段
应用以上引物进行PCR扩增，PCR反应体系为20ul，其中含10mM Tris-HCl(PH8.4)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，200uM dNTP，上下游引物各0.4uM，Taq聚合酶1U，DNA模板30-50ng，PCR扩增条件为：1、94℃5min，2、96℃45s，60℃60s，72℃60s 3个循环，3、95℃45s，59℃65s，72℃60s 5个循环，4、94℃45s，57℃60s，72℃60s，32个循环，5、72℃10min，取PCR产物5ul用1.5％琼脂糖凝胶电泳，以DNAmarker为分子量标准品，扩增。
8、限制性内切酶酶切鉴定基因型
酶切反应体系为20ul，其中10ulPCR产物，限制性内切酶TaqI 0.5ul，酶切缓冲液2ul，置37℃度温箱4小时，经3％琼脂糖凝胶电泳，根据酶切图谱判定基因型。
酶切结果：rs1800497(C)能被限制性内切酶TaqI切开，rs1800497(T)不能被切开。
9、结果判定
rs1800497碱基为(T)的个体为青春型精神***症易感人群。rs1800497碱基为(C)的个体为非青春型精神***症易感人群
患病组和对照组准确率分别达到94％、96％
实施例3
1、研究对象
本发明以确诊的40例青春型精神***症和40例健康对照(身体健康，无躯体疾病，无家族遗传性疾病史，无精神疾病史，无药物滥用)为研究对象。所有研究对象均为中国汉族人，并且自愿签订伦理委员会批准的知情同意书。
2、血液和临床资料收集
受试者在认真阅读、理解、并自愿签署伦理委员会批准的项目知情同意书后，取外周静脉血5ml，-20度保存至提取基因组DNA。收集精神***症患者年龄、性别、家族史、民族和文化程度、首次入院和确诊时间、临床症状、认知功能等和疾病相关的资料；正常人收集一般人口学资料及认知功能评定量表。
3、基因组DNA提取
采用专门提取DNA试剂盒，提取外周血的白细胞中全基因组的DNA。操作步骤如下：血液解冻、标记1.5mlEppendorf离心管→细胞裂解液900uL加入离心管中→加入解冻后全血200uL后，混匀，常温下作用20min，并颠倒4-6次→10,000rpm离心时间4min，去除上清，然后振荡，使沉淀物再次悬浮→300uL核裂解液，然后轻轻地振荡，使其混匀，再37℃水浴30min→RNA降解酶1.5μL，振荡混匀，水浴15min，37℃→蛋白沉淀液100uL，轻弹管底，常温作用20min→12,000rpm离心4min，将上清液转移到已加入异丙醇300uL的离心管中，20min轻轻颠倒→12,000rpm离心4min，弃上清，加70％乙醇300uL，轻轻摇匀→12,000rpm离心4min，弃上清，将离心管倾斜倒置，等待凉干→DNA溶解液100uL混匀，水浴1h，65℃(或4℃过夜)，DNA在离心管中已制备完毕。
4、基因组DNA质量检测
取1-2uL基因组DNA原液，通过琼脂糖电泳方法检测所提取DNA样品是否满足PCR-ALFP和Sequenom的质量标准要求；亮色字体表示该DNA样本符合基因分型技术要求；红色字体(无样本或样本量极少)表示该DNA不符合基因分型技术要求，需要予以重新提取。
5、基因组DNA含量和纯度的检测
用NanoDrop-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计准确测定每份样本DNA含量和OD比值(A260/A230、A260/A280)。A260/A230比值低：小分子杂质或残存的盐污染，若过高有未知的杂质。比值(A260/A280)低：蛋白或者苯酚有残留所致；比值(A260/A280)比值高：RNA有残留所致；通常A260/A280≈1.8代表样本DNA是纯净的
6、设计引物
扩增DRD2基因rs1800497多态性的引物分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2：
ACGTTGGATGTGTGCAGCTCACTCCATCCT
ACGTTGGATGCAACACAGCCATCCTCAAAG
7、PCR扩增目的片段
应用以上引物进行PCR扩增，PCR反应体系为20ul，其中含10mM Tris-HCl(PH8.4)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，200uM dNTP，上下游引物各0.4uM，Taq聚合酶1U，DNA模板30-50ng，PCR扩增条件为：1、94℃5min，2、96℃45s，60℃60s，72℃60s 3个循环，3、95℃45s，59℃65s，72℃60s 5个循环，4、94℃45s，57℃60s，72℃60s，32个循环，5、72℃10min，取PCR产物5ul用1.5％琼脂糖凝胶电泳，以DNAmarker为分子量标准品，扩增。
8、测序判定基因型
PCR产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，凝胶成像***观察合格后送华大基因测序部进行测序验证。
9、结果判定
rs1800497碱基为(T)的个体为青春型精神***症易感人群。rs1800497碱基为(C)的个体为非青春型精神***症易感人群。
患病组和对照组准确率分别达到96％、98％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (1)

1.一个青春型精神***症关联基因，是位于11q23，单核苷酸多态性rs1800497碱基C突变为T的DRD2基因。
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